Isolamento e caratterizzazione degli esosomi derivati dalle cellule staminali della polpa dentale attraverso i passaggi cellulari

Summary

Questo protocollo delinea un flusso di lavoro standardizzato per isolare e caratterizzare esosomi derivati dalle cellule staminali della polpa dentale (DPSC) attraverso i passaggi, consentendo una valutazione riproducibile della qualità degli esosomi e dell'attività funzionale per applicazioni rigenerative.

Abstract

Le cellule staminali della polpa dentale (DPSC) rappresentano una fonte accessibile e clinicamente rilevante di cellule staminali mesenchimate, e i loro esosomi derivati sono emersi come promettenti vescicole bioattive per applicazioni senza cellule nell'ingegneria tissutale e nella medicina rigenerativa. Tuttavia, i metodi riproducibili e standardizzati per isolare e validare funzionalmente gli esosomi derivati da DPSC restano limitati, in particolare per quanto riguarda la variabilità introdotta durante l'espansione cellulare attraverso i passaggi. Qui descriviamo un flusso di lavoro completo, standardizzato e basato su kit per l'isolamento e la purificazione degli esosomi da un mezzo condizionato al DPSC, compatibile con la pratica di laboratorio di routine. Questo metodo consente un recupero costante di vescicole intatti, adatte alla caratterizzazione morfologica, molecolare e funzionale utilizzando tecniche comunemente disponibili. L'identità dell'esosoma viene valutata in base alla morfologia, alla distribuzione delle dimensioni e all'espressione dei marcatori, mentre l'attività biologica viene analizzata tramite un saggio infiammatorio in vitro definito. Per esaminare gli effetti correlati ai passaggi, gli esosomi derivati da diversi passaggi DPSC vengono confrontati utilizzando questa lettura funzionale, fornendo un quadro pratico per valutare la consistenza durante l'espansione cellulare. Integrando isolamento, purificazione, caratterizzazione e validazione funzionale in un unico flusso di lavoro, questo protocollo offre un approccio riproducibile e scalabile per generare esosomi derivati dal DPSC funzionalmente validati per la ricerca sui biomateriali e applicazioni rigenerative.

Introduction

Gli esosomi derivati dalle cellule staminali mesenchimali fungono da mediatori cruciali della comunicazione intercellulare e dimostrano un significativo potenziale terapeutico nei campi dell'ingegneria tissutale e della medicina rigenerativa. Gli esosomi sono vescicole di diametro 30–150 nm, capaci di fornire molecole bioattive e regolare varie funzioni nelle cellule riceventi, come proliferazione, differenziazione e risposta^{immunitaria 1,2}. Tra le varie fonti di cellule staminali mesenchimali (MSC), le cellule staminali della polpa dentale (DPSC) sono di particolare interesse per la loro facile accessibilità, la robusta capacità proliferativa, il basso rischio tumorigeno e le minime preoccupazioni^{etiche 3,4,5}. Gli esosomi derivati dalle DPSC (DPSC-Exos) contengono un repertorio diversificato di carichi funzionali, inclusi proteine, mRNA e microRNA, permettendo loro di mantenere molte delle proprietà biologiche delle loro cellule genitori. Studi precedenti hanno dimostrato che DPSC-Exos può promuovere l'angiogenesi, la riparazione neurale, la rigenerazione ossea e risposte antinfiammatorie. Oltre ai loro ruoli nell'ingegneria tissutale, gli esosomi sono sempre più riconosciuti come importanti regolatori nell'oncogenesi e nella terapia oncologica, contribuendo alla rimodellazione del microambiente tumorale, alla resistenza ai farmaci e all'evasione^{immunitaria 6}. Gli esosomi derivati dalle MSC, inclusi quelli provenienti dai DPSC, possiedono capacità intrinseche di orientamento tumorale e proprietà immunomodulatorie, posizionandoli come promettenti veicoli di nuova generazione per la somministrazione mirata di farmaci antitumorali o come agenti immunoterapeutici privi di cellule. Bypassando diverse limitazioni associate alle terapie cellulari, DPSC-Exos si è affermato come un promettente componente bioattivo acellulare per applicazioni^rigenerative 7,8,9,10,11,12.

Nonostante questi vantaggi, la traduzione della ricerca DPSC-Exo in un uso sperimentale o clinico riproducibile rimane una sfida. Una delle principali limitazioni è la mancanza di protocolli unificati e standardizzati per l'isolamento e la purificazione degli esosomi. Gli approcci attualmente utilizzati includono ultracentrifugazione¹³, ultrafiltrazione, precipitazione, cromatografia a esclusione di dimensioni e cattura per^{immunoaffinità 14,15}. Tra questi metodi, la precipitazione a base di polimeri offre vantaggi pratici, tra cui un'elevata capacità di produzione, compatibilità con un'ampia gamma di volumi di campione e semplicità operativa, rendendola adatta a studi che coinvolgono grandi numeri di campioni o requisiti di scala^{16, 17, 18}. Analisi comparative di diversi metodi di isolamento, in particolare riguardo alla resa proteica e al rapporto particella-proteina, sono state ampiamente documentate^{in letteratura 19}. Tuttavia, l'influenza del numero di passaggio DPSC sulle caratteristiche e sull'attività biologica degli esosomi derivati non è stata sufficientemente affrontata, rappresentando una lacuna importante per la standardizzazione e il controllo qualità della produzione DPSC-Exo.

Per affrontare queste limitazioni tecniche, questo studio presenta un protocollo standardizzato basato su kit per isolare e purificare esosomi da un mezzo condizionato da DPSC. Oltre alla caratterizzazione fisica e molecolare, il protocollo incorpora un test funzionale per valutare l'attività antinfiammatoria degli esosomi derivati da diversi passaggi DPSC, consentendo una valutazione comparativa della consistenza dipendente dal passaggio nella qualità e funzione degli esosomi. Il flusso di lavoro è progettato per un'implementazione semplice in laboratori dotati di strutture standard per la coltura cellulare e la biologia molecolare. Si basa su kit commerciali per ridurre la variabilità inter-sperimentale e può essere facilmente scalato per soddisfare diverse esigenze sperimentali. Per minimizzare la variabilità da donatore a donatore, i DPSC vengono isolati dai singoli denti e espansi indipendentemente invece di essere aggregati da più donatori. Questo protocollo è particolarmente utile per i ricercatori che cercano di generare esosomi derivati dal DPSC validati funzionalmente per applicazioni a valle, inclusi la guarigione delle ferite, l'ingegneria del tessuto osseo e gli studi di immunomodulazione, dove la coerenza batch a batch è essenziale. Nel complesso, fornisce un quadro pratico e standardizzato per la produzione di esosomi derivati dal DPSC da utilizzare nell'ingegneria tissutale e nella ricerca in medicina rigenerativa.

Protocol

Questo studio è stato condotto in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki e approvato dai comitati etici istituzionali. I tessuti della polpa dentale umana sono stati prelevati da terzi molari o premolari ortodontici raccolti presso l'Ospedale di Stomatologia di Ningbo secondo le linee guida etiche istituzionali (Protocollo n. NBKQYY2025LS-04; data di approvazione: 30 maggio 2025). I tessuti cutanei umani sono stati prelevati da campioni di prepuzio scartati durante procedure di circoncisione di routine presso il Dipartimento di Urologia dell'Ospedale Popolare Affiliato dell'Università di Ningbo, in conformità con le linee guida etiche istituzionali (Protocollo n. 2024104; data di approvazione: 30 ottobre 2024). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i donatori o dai loro tutori legali prima della raccolta del campione.

1. Isolamento degli esosomi derivati dalle cellule staminali della polpa dentale

1. Isolamento, cultura e identificazione dei DPSC
   1. Raccolta e trasporto di campioni
      1. Prescolare i terzi molari umani intatti da donatori di età tra 18 e 25 anni o i premolari da donatori di età tra 12 e 16 anni dopo l'estrazione ortodontica.
      2. Immediatamente inserire i denti estratti in soluzione salina fosfatata tamponata (PBS) pre-raffreddata, integrata con 100 U/mL di penicillina-G e 100 μg/mL di estreptomicina.
      3. Trasportare i campioni in laboratorio a 4 °C e processare entro 6 ore dall'estrazione.
   2. Esposizione della polpa dentale e dissociazione dei tessuti
      1. Immergi nel 70% di etanolo per 30 secondi; lavare tre volte con 1× PBS contenente il 3% di P/S (30 secondi ciascuno). Rimuovere con cura i residui di tessuto gengivale e parodontale dalla superficie del dente utilizzando forbici sterili o un bisturi.
      2. Avvolgi il dente in garze sterili, poi spacca con cura la corona con un martello sterilizzato per esporre la camera della polpa.
      3. Separare delicatamente il tessuto polpetare dalla dentina, tritarlo in piccoli frammenti (<1^{mm 3}) usando lame chirurgiche sterili.
      4. Trasferire i frammenti di tessuto in un tubo centrifuga da 1,5 mL contenente una soluzione digertiva di 2,5 mg/mL Dispase II e 2,5 mg/mL di collagenasi tipo I.
      5. Incubare la miscela a 37 °C in incubatore per 30–45 minuti con una delicata agitazione.
         NOTA: La durata della digestione enzimatica è stata determinata in base al volume e al grado di omogeneizzazione del tessuto polpae dentale.
   3. Terminazione della digestione e coltura cellulare primaria
      1. Interrompi la digestione enzimatica aggiungendo un volume uguale di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con siero fetale bovino (FBS) al 10%.
      2. Centrifuga la sospensione cellulare a 200 × g per 5 minuti per mettere in pellet le cellule e i frammenti di tessuto.
      3. Scartare il sovrantantante e risospendere il pellet in 1 mL di mezzo colturale completo (α-MEM con FBS al 20%, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di estreptomicina).
      4. Semina le cellule e gli espianti risospesi in una ciotola di coltura da 60 mm e aggiungi il mezzo di coltura completo a un volume finale di 5 mL.
      5. Incubare le cellule a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂.
   4. Mantenimento cellulare e sottocoltura
      1. Rinnova il mezzo di coltura ogni 2–3 giorni.
      2. Monitora le cellule ogni giorno.
         NOTA: I DPSC primari migreranno tipicamente dagli espianti tissutali e raggiungeranno l'80–90% di confluenza entro 7–14 giorni.
      3. Per la sottocoltura, si staccano le cellule usando acido tripsina-etilendediamina-tetraacetico (EDTA) allo 0,05% quando raggiungono l'80–90% di confluenza.
         ATTENZIONE: La tripsina è un irritante. Indossa l'attrezzatura di protezione individuale adeguata, inclusi guanti e occhiali di sicurezza.
      4. Cellule a passaggio in un rapporto di 1:3 utilizzando il mezzo di coltura completo (con FBS del 20%).
      5. Usa i DPSC nei passaggi 2, 4 e 6 per tutti gli isolamenti e i saggi funzionali a valle.
   5. Caratterizzazione dei DPSC tramite citometria a flusso
      1. Distacca i DPSC nel passaggio desiderato usando tripsina-EDTA allo 0,05%, neutralizza con un mezzo di coltura completo e raccoglie la sospensione cellulare.
      2. Centrifuga a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente e scarta il soprandatante. Risospendi la pellet cellulare nel PBS e conta le cellule. Regola la densità cellulare a circa 1 × 10⁶ cellule/mL.
      3. Aliquota 100 μL della sospensione cellulare in ogni tubo di citometria a flusso. Incubare le cellule con anticorpi coniugati con fluorocromo contro CD44, CD90, CD105, CD45, CD19 e CD14 con una diluizione di 1:100 in PBS per 30 minuti a 4 °C al buio.
      4. Lavare le celle aggiungendo 1 mL di PBS a ogni provetta, seguita da centrifugazione a 300 × g per 5 minuti. Scartare con cura il sovrandanante e risospendere il pellet cellulare in 300–500 μL di PBS per l'analisi.
      5. Includere anticorpi di controllo isotipo appropriati a concentrazioni corrispondenti per ciascun fluorocromo per consentire la correzione di fondo e il gating.
      6. Analizzare i campioni utilizzando un citometro di flusso dotato di laser e filtri appropriati per i fluorocromi selezionati. Acquisire almeno 10.000 eventi per campione.
      7. Eseguire analisi dei dati utilizzando software di citometria a flusso. Innanzitutto, celle valide a gate basate sulla diffusione diretta (FSC) e sulla dispersione laterale (SSC) per escludere i detriti. Poi applica il cingolo per i doppietti per rimuovere i doppietti.
      8. Determinare l'espressione dei marcatori confrontando l'intensità di fluorescenza con i relativi controlli isotipo per definire popolazioni positive e negative.
2. Isolamento e purificazione di DPSC-Exos
   1. Preparazione del mezzo condizionato
      1. Coltivare DPSC in un piatto di coltura da 10 cm fino a raggiungere il 70–80% di confluenza.
      2. Rimuovi il substrato esausto e poi lava delicatamente il monostrato della cellula due volte con PBS preriscaldato.
      3. Aggiungi 10 mL di mezzo intero integrato con FBS al 10% di esosomi depauperati.
      4. Ulteriori incubazioni della coltura a 37 °C fino a raggiungere il 90–100% (un processo che di solito supera le 24 ore).
   2. Raccolta di mezzo condizionato
      NOTA: Tieni tutti i passaggi successivi sul ghiaccio o a 4 °C.
      1. Trasferisci il mezzo condizionato su un tubo centrifuga.
      2. Centrifuga il mezzo a 4 °C e 3.000 × g per 10 minuti per rimuovere celle e detriti grandi.
      3. Trasferire con cura il sovrantato in un nuovo tubo centrifuga senza disturbare il pellet.
      4. Centrifugare il soprannatante a 4 °C e 10.000 × g per 10 minuti per pelletare particelle più piccole e corpi apoptotici.
      5. Filtra il surnante attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm in un tubo centrifuga pulito da 50 mL.
      6. Processare immediatamente il mezzo chiarificato per l'isolamento dell'esosoma, o aliquota, e conservarlo a -80 °C.
         NOTA: Il mezzo condizionato chiarificato può essere conservato a -80 °C per diversi mesi. Evita cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.
   3. Isolamento degli esosomi tramite precipitazione a base di polimeri
      1. Scongelare il mezzo condizionato chiarificato su ghiaccio se è stato congelato.
      2. In un tubo sterile su ghiaccio, si combina il mezzo con una soluzione di concentrazione di esosomi a un rapporto di volume 4:1 (ad esempio, mezzo 20 mL: soluzione da 5 mL). Vortice la miscela per 1 minuto per assicurarne l'omogeneità.
      3. Lasciare la miscela indisturbata a 4 °C per 16–18 ore per permettere la precipitazione degli esosomi.
         NOTA: Il tempo di incubazione può essere adeguatamente esteso per potenzialmente aumentare la resa, ma non deve superare le 24 ore.
      4. Centrifugare la miscela a 4 °C e 10.000 × g per 75–80 minuti per pelletare gli esosomi. Aspirare con cura e scartare il surnatante senza disturbare il pellet.
      5. Centrifuga di nuovo il tubo a 4 °C e 10.000 × g per 2 minuti. Rimuovi eventuali residui di soprandanzante con una pipetta.
      6. Risospendere il pellet esosomico in 1x PBS (utilizzare 200 μL di PBS per 20 mL di mezzo condizionato).
      7. Trasferire la risospensione in un nuovo tubo centrifuga da 1,5 mL e centrifugare a 4 °C e 12.000 × g per 2 minuti, mantenendo il sovrantante, arricchito con particelle esosoma (ripeti se necessario).
   4. Purificazione degli esosomi
      1. Applicare la sospensione dell'esosoma a una colonna di filtro per purificazione degli esosomi posta in un tubo di raccolta.
      2. Centrifuga la colonna a 4 °C e 3.000 × g per 10 minuti.
      3. Raccogli il liquido di passaggio dal fondo del tubo di raccolta. Questo liquido contiene gli esosomi purificati.
   5. Conservazione di esosomi purificati
      1. Aliquota la sospensione purificata degli esosomi in volumi monouso adatti agli esperimenti a valle.
      2. Conserva le aliquote a -80 °C.
         NOTA: L'aliciolazione è fondamentale per evitare cicli ripetuti di congelamento-disgelo, che possono degradare l'integrità degli esosomi e l'attività biologica.
   6. Caratterizzazione e identificazione dei DPSC-Exo
      1. Eseguire analisi morfologiche tramite microscopia elettronica a trasmissione (TEM) come descritto nei passaggi 1.2.6.2–1.2.6.6.
      2. Usa una pipetta, preleva 10 μL del campione di sospensione dell'esosoma preparato e lo immergi su Parafilm pre-preparato. Posiziona la griglia di rame rivestita di formvar/carbonio, lato film rivolto verso il basso, sulla goccia, lasciandola adsorbire naturalmente per 10–15 minuti.
      3. Usa una striscia di carta filtrante per rimuovere il liquido in eccesso e lascialo asciugare all'aria per un attimo.
      4. Usa una pipetta, preleva 10 μL di soluzione acida fosfotongstica al 2% e immergilo sul Parafilm. Inverti la griglia che ha completato il passaggio di adsorbimento in modo che il lato del film sia rivolto verso la soluzione di colorazione, e lascia riposare per 3–5 minuti.
      5. Usa una striscia di carta filtrante per assorbire il liquido in eccesso e lascia asciugare la griglia sotto una lampada a incandescenza.
      6. Osserva e cattura immagini utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione.
      7. Eseguire analisi della distribuzione delle dimensioni e della concentrazione tramite analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA) come descritto nei passaggi 1.2.6.8–1.2.6.12.
      8. Risciacqua la camera del campione tre volte con acqua ultrapura.
      9. Calibrare lo strumento utilizzando perle standard di polistirolo da 100 nm secondo le istruzioni del produttore. Procedere con le misurazioni dopo la calibrazione riuscita del successo.
      10. Risciacquo la camera del campione con 1× PBS.
      11. Diluire il campione di esosoma in 1× PBS (diluizione 1:500) e caricarlo nella camera del campione. Monitorare il movimento delle particelle in tempo reale utilizzando il software dello strumento.
      12. Raccogli dati e genera il relativo rapporto di analisi.
      13. Identificare i marcatori proteici tramite analisi Western blot come descritto nei passaggi 1.2.6.14–1.2.6.24.
      14. Lisare campioni di esosoma utilizzando un tampone di lisi proteica specifico per esosoma e quantificare la concentrazione proteica tramite un saggio di acido bicinconinico (BCA).
      15. Prepara gel risolutivi e impilati. Carica quantità uguali di proteine per via e aggiungi 5 μL di marcatore proteico a ogni gel.
      16. Eseguire l'elettroforesi a una tensione costante di 80 V fino a quando il fronte del colorante raggiunge il gel risolvente, poi aumentare a 120 V e continuare fino a raggiungere il fondo del gel.
      17. Taglia una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) alla dimensione appropriata e attivala lasciandola in ammollo nel metanolo per 5 minuti.
      18. Prepara un tampone di trasferimento composto da 25 mM di Tris base, 192 mM di glicina e metanolo al 20% (v/v) (pH = 8,3). Bilanciare tutti i componenti di trasferimento nel buffer di trasferimento.
      19. Assemblare il sandwich di trasferimento nel seguente ordine dal catodo all'anodo: spugna – carta filtrante – gel – membrana PVDF – carta filtrante – spugna. Rimuovere eventuali bolle d'aria ed eseguire il trasferimento proteico a corrente costante di 300 mA.
      20. Dopo il trasferimento, risciacqua brevemente la membrana PVDF con soluzione salina Tris-buffer con 0,1% Tween20 (TBST) e blocca con latte scremato al 5% per 1 ora a temperatura ambiente con una lieve agitazione.
      21. Incubare la membrana con anticorpi primari (ad esempio, anti-CD63 e anti-TSG101) diluiti nel 5% di latte scremato durante la notte a 4 °C con lievi scuoti. Lava la membrana tre volte con TBST per 5 minuti ciascuna.
      22. Incubare con l'anticorpo secondario appropriato a temperatura ambiente per 30 minuti, seguiti da tre lavaggi con TBST (5 min ciascuno).
      23. Preparare una nuova soluzione di lavoro elettrochemiluminescenza (ECL) (miscelare le soluzioni A e B con un rapporto 1:1), applicare alla membrana e rilevare i segnali utilizzando un sistema di imaging chemiluminescenze.

2. Isolamento e coltura dei cheratinociti epidermici primari della pelle umana

1. Raccolta e trasporto di campioni
   1. Ottieni campioni di tessuto del prepuzio da donatori maschi sani presso l'Ospedale Popolare Affiliato dell'Università di Ningbo.
   2. Inserire immediatamente il tessuto estratto del prepuzio in PBS a 4 °C integrato con 100 U/mL di penicillina-G e 100 μg/mL di estreptomicina.
   3. Trasportare i campioni in laboratorio a 4 °C e processare entro 6 ore.
2. Preparazione asettica e frammentazione tissutale
   1. Immergi il tessuto nel 70% di etanolo per 30 secondi a 3 minuti.
      NOTA: Regolare il tempo di immersione in base alla dimensione del tessuto per la disinfezione iniziale.
   2. Utilizzando forbici sterili o bisturi, dissezionare e rimuovere il grasso sottocutaneo e il tessuto connettivo dal campione di tessuto lavato.
   3. Tagliarlo in piccoli frammenti (dimensione del frammento <1^{mm 3}) usando lame chirurgiche sterili.
      NOTA: Tritare 3–4 campioni di tessuto richiede tipicamente meno di 15 minuti. Aggiungi una piccola quantità di PBS durante la tritazione se il tessuto appare secco.
   4. Trasferire la suspense di tessuto tritato in un tubo centrifugo da 50 mL contenente una soluzione digertiva di 2,5 mg/mL di Collagenasi Tipo I e 2,5 mg/mL di Dispasi II. Aggiungi 10–20 mL di soluzione digertiva per ogni pezzo di tessuto tritato.
   5. Incubare la miscela in un incubatore a 37 °C per 60 minuti. Mantieni un'agitazione delicata a 80 × g, oppure agita vigorosamente il tubo a mano ogni 20 minuti.
3. Digestione secondaria e trattamento con DNasi
   1. Aggiungi lo 0,25% di tripsina-EDTA alla miscela digeritiva con un rapporto di volume 1:5. Incubare il tubo a 37 °C per 25 minuti con una leggera agitazione.
      ATTENZIONE: La tripsina è un irritante. Indossa l'attrezzatura di protezione individuale adeguata, inclusi guanti e occhiali di sicurezza.
   2. Aggiungere la soluzione di DNasi I (10 mg/mL) alla miscela con un rapporto di 10 μL per mL del volume totale di digestione. Incubare a 37 °C per 5 minuti con una leggera agitazione.
4. Terminazione della digestione e coltura cellulare primaria
   1. Ferma la digestione enzimatica aggiungendo un volume uguale di DMEM integrato con il 10% di FBS.
   2. Triturare accuratamente la miscela pipettando su e giù circa 20 volte per dissocere i frammenti di tessuto. Filtrare la sospensione della cella attraverso un filtro a celle da 100 μm in un nuovo tubo centrifuga da 50 mL.
   3. Centrifuga la sospensione cellulare a 200 × g per 5 minuti per pelletare cellule e frammenti di tessuto.
   4. Scartare il sovrantantante e risospendere il pellet in 1 mL di mezzo colturale completo (α-MEM con FBS al 20%, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di estreptomicina).
   5. Semina le cellule e le piantanti risospese in una teglia di coltura da 10 cm e aggiungi il mezzo di coltura completo a un volume finale di 6 mL.
   6. Incubare le cellule a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂.
      NOTA: Integrare le colture di cheratinociti con Y-27632 a una concentrazione finale di 5 μM durante la coltura.
5. Mantenimento cellulare e sottocoltura
   1. Rinnova il mezzo di coltura ogni 2–3 giorni.
   2. Monitora le cellule ogni giorno.
      NOTA: I cheratinociti epidermici primari della pelle migreranno tipicamente dagli espianti tissutali e raggiungeranno una confluenza dell'80-90% entro 10-14 giorni.
   3. Per la sottocoltura, si staccano le cellule usando lo 0,05% di tripsina-EDTA quando raggiungono l'80–90% di confluenza.
      ATTENZIONE: La tripsina è un irritante. Indossa l'attrezzatura di protezione individuale adeguata, inclusi guanti e occhiali di sicurezza.

3. Verifica funzionale della funzione antinfiammatoria degli esosomi provenienti da diversi passaggi

1. Semina e preparazione delle cellule
   1. Semina cheratinociti epidermici a una densità di 1,5 × 10⁵ cellule per pozzo in una piastra a 12 pozzi. Aggiungi 1 mL di mezzo completo in ogni pozzo e coltura le cellule per 24 ore.
   2. Quando la confluenza cellulare raggiunge circa il 70%, aspira con cura il mezzo, lava delicatamente il monostrato cellulare due volte con PBS preriscaldato a 1×.
2. Stimolazione infiammatoria e trattamento degli esosomi
   1. Indurre un modello cellulare psoriasiforme, stimolare le cellule con la miscela di citochine proinfiammatorie "M5" (contenente IL-1α, IL-17A, IL-22, Oncostatina M e TNF-α, ciascuna a una concentrazione finale di 10 ng/mL).
   2. Per i gruppi di trattamento, co-incubare le cellule stimolate con DPSC-Exos (50 μg per pozzo).
   3. Per il gruppo controllo negativo (NC), aggiungere un volume equivalente di PBS invece degli esosomi.
      NOTA: Eseguire tutte le stimolazioni e i trattamenti in un mezzo privo di Y-27632 per escludere la sua potenziale interferenza con le vie di segnalazione infiammatorie.
3. Raccolta di campioni e analisi qRT-PCR (confronto funzionale tra passaggi)
   1. Prelevare le cellule ed estrarre l'RNA dopo 24 ore di trattamento.
   2. Analizza l'espressione del principale marcatore infiammatorio IL-23A.
      1. Confrontare gli effetti inibitori sull'espressione di IL-23A tra i gruppi di trattamento con esosomi derivati da diversi passaggi (P2, P4 e P6) utilizzando qRT-PCR per valutare le variazioni dipendenti dal passaggio nella funzione degli esosomi.
      2. Eseguire qRT-PCR utilizzando le seguenti condizioni di ciclaggio: denaturazione iniziale a 95 °C per 3 minuti, seguita da 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 10 secondi e ricottura/estensione a 60 °C per 30 secondi.
      3. Eseguire un'analisi della curva di fusione da 65 °C a 95 °C per confermare la specificità di amplificazione.
         NOTA: Sequenze di innesco: Umano-IL-23A (avanti: 5'-GAAGAGGGAGATGAAGAGAC-3', retro: 5'-TATCCGATCCTAGCAGCTTC-3'); Umano-H36B4 (avanti: 5'-GCAATGTTGCCAGTGTCTGT-3', retro: 5'-GCCTTGACCTTTTCAGCAAG-3')

Results

Identificazione e caratterizzazione delle cellule staminali della polpa dentale
Le cellule staminali pulpare dentale primarie (DPSC) isolate utilizzando il protocollo descritto hanno mostrato una crescita stabile e una tipica morfologia mesenchimale durante l'espansione in vitro. Come mostrato nella Figura 1, i DPSC nei passaggi 2, 4 e 6 mostravano una popolazione omogenea di cellule a forma di fuso, simili a ...

Discussion

Il protocollo standardizzato descritto in questo studio fornisce un quadro riproducibile per l'isolamento delle cellule staminali della polpa dentale (DPSC), la produzione di esosomi derivati dalla DPSC (DPSC-Exos) e la validazione funzionale di queste vescicole attraverso più passaggi cellulari. La discussione di seguito evidenzia considerazioni procedurali critiche, strategie di ottimizzazione, limitazioni metodologiche e la rilevanza più ampia di questo flusso di lavoro per la ricerca...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soluzione di tripsina-EDTA allo 0,05%	Gibco	25300054	Grazie alla sua forza digestiva, la tripsina è ampiamente utilizzata per la dissociazione cellulare, il passaggio di colture cellulari di routine e la dissociazione dei tessuti primari.
Piatto per colture cellulari e tissutali da 100 mm	Biofil	TCD010100	Superficie trattata/non trattata sterile e Non pirogenico DNasi/RNasi
Perle da 100 nm PS	Thermo Fisher	3100A	Prima di condurre esperimenti di analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA), lo strumento deve essere calibrato utilizzando uno standard con una dimensione della particella nota con precisione (100 nm).
Tubo centrifugo conico sfuso da 15 mL	KIRGEN	KG2611	Sterili, RNasi/Dnasi e pirogeni
Griglia di rame Formvar rivestita al carbonio a 200 mesh	Zhongjing  Scientific  Strumenti	AZH200	Supporta campioni di esosomi per l'imaging TEM. Il rivestimento Formvar-carbon migliora l'adesione e la conducibilità del campione, mentre la griglia a 200 mesh offre un'area aperta adeguata per una distribuzione uniforme delle particelle e un'imaging stabile.
37 & deg; C Incubatore	Thermo Scientific	51032877	L'incubatore a CO2 a 37 gradi offre un ambiente ideale in vitro.
Tubo centrifugo conico sfuso da 50 mL	KIRGEN	KG2811	Sterili, RNasi/Dnasi e pirogeni
Anticorpo anti-CD63 [MX-49.129.5]	Abcam	ab193349	L'anticorpo anti-CD63 [MX-49.129.5] (ab193349) è un anticorpo monoclonale topino che rileva CD63 in  Western Blot, citometria di flusso (intra), citometria di flusso, IHC-P, ICC/IF. Adatto per  Umano.
Anticorpi anti-TSG101 [EPR7130(B)]	Abcam	ab125011	L'anticorpo anti-TSG101 [EPR7130(B)] (ab125011) è un anticorpo monoclonale del coniglio che rileva TSG101 in  Western Blot, citometria di flusso (intra), citometria di flusso, IHC-P, ICC/IF. Adatto per  Umano, Topo, Topo.
Contatore automatico delle celle	Countstar	IC1000	Contatore automatico per un conteggio rapido e preciso delle celle
Kit per il test proteico BCA	Beyotime	P0012	Hanno una buona relazione lineare nell'intervallo di concentrazione da 50 - 2000 e mu; g/ml.
Centrifuga da banco	BIORIDGE	TD5	Centrifuga da banco per una separazione rapida ed efficiente dei campioni in ambito di laboratorio
Cabinet di sicurezza biologica	Thermo Scientific	1379	L'Armadietto di Sicurezza Biologica è un dispositivo di contenimento sterile che protegge operatori, campioni e ambienti da rischi biologici filtrando patogeni trasportati dall'aria e prevenendo la contaminazione incrociata durante lavori microbiologici.
Piastra di coltura cellulare, 12-pozzo	Eppendorf	0030721110	Coltura tissutale trattata, con coperchio, fondo piatto Sterile, privo di pirogni rilevabili, RNasi e DNasi, umano e Bact. DNA Non citotossico
Piastra di coltura cellulare, 96 pozzi	NEST	701001 0714B	Coltura tissutale trattata, polistirene, non pirogenico, sterile
Salvataggio delle celle	NCM	C40100	Mezzo di congelamento cellulare senza siero, privo di proteine animali
Collagenasi, Tipo I, polvere	Gibco	17100017	La collagenasi è una proteasi che taglia il legame tra un amminoacido neutro (X) e la glicina nella sequenza Pro-X-Gly-Pro, che si trova con alta frequenza nel collagene.
Dispase II, polvere	Gibco	17105041	La dispasi II (proteasi neutra) è un'amino-endopeptidasi che idrolizza i legami peptidici N-terminali dei residui di amminoacidi non polari.
Eagle Medium Modificato di Dulbecco	Gibco & nbsp;	C11995500BT	[+]4,5g/L D-Glucosio [+]L-Glutammina [+]110mg/L Piruvato di Sodio
Kit di trascrizione inversa Evo M-MLV	AG	AG11707	Un reagente dedicato alla trascrizione inversa per RT-PCR in tempo reale. Utilizza la trascridasi inversa Evo M-MLV con forte capacità di estensione, consentendo una sintesi efficiente del cDNA in un breve periodo di tempo.
Soluzione di concentrazione degli esosomi	Umibio	UR52111	Estrarre esosomi dal soprandante cellulare
Siero bovino fetale impoverito con esosomi	Umibio	UR50202	Il siero fetale bovino privo di esosomi è stato ottenuto filtrando il siero fetale bovino sano raccolto sterilmente, e ≥ Il 99% degli esosomi endogeni nel siero bovino fetale è stato rimosso. Aveva la stessa velocità di crescita cellulare e morfologia del siero bovino fetale prima della lavorazione.
Siero fetale bovino, qualificato, Australia	Gibco	10099141	Livello di emoglobina:   ≤ 30 mg/dL (livelli di routine e le; 25 mg/dL)
Human-H36B4	Sangon Biotech	SB002	Attaccante: 5'-GCAATGTTGCCAGTGTGTGT-3'; Retro: 5'-GCCTTGACCTTTTCAGCAAG-3'
Umano-IL-23A	Sangon Biotech	SB002	Attaccante: 5'-GAAGAGGGAGATGAAGAGAC-3'; Retro: 5'-TATCCGATCCTAGCAGCTTC-3'
Microscopio biologico invertito	Leica	DMI1	Osserva direttamente le cellule o i tessuti viventi che aderiscono alle pareti dei contenitori come fiaschette di coltura e piastre di Petri.
Mezzo Essenziale Minimo	Gibco & nbsp;	C12571500BT	[+]L-Glutamina [+]Ribonucleosidi [+]Ossiribonucleosidi
Kit rapido di estrazione RNA NcmSpin	NCM	M5106	Questo kit può estrarre rapidamente l'RNA totale da fino a 3.000.000 di cellule e fino a 10 mg di tessuto.
Penicillina-Streptomicina	NCM	C100C5	Contiene 10.000 unità/ml di penicillina e 10.000 microgrammi/ml di estreptomicina. È stato filtrato per rimuovere i batteri e può essere utilizzato direttamente per la coltura cellulare. Previene efficacemente la contaminazione batterica delle cellule.
PerfectStart Green qPCR SuperMix	TransGen	AQ601-02-V2	Un colorante fluorescente che si lega alla scanalatura minore di tutto il DNA a doppio filamento ed emette luce verde all'eccitazione. Durante l'amplificazione PCR, si incorpora nel DNA appena amplificato, causando un aumento della fluorescenza. Durante la fase di denaturazione, i filamenti di DNA si separano, rilasciando il colorante e causando una significativa diminuzione del segnale di fluorescenza.
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Viva Cell Biosciences	C3582-0500	La sua funzione è mantenere il pH del mezzo entro l'intervallo fisiologico e mantenere l'equilibrio della pressione osmotica sia all'interno che all'esterno della cellula.
Acido fosfotongstico	Solarbio	G1870	Utilizzato come colorazione negativa per la preparazione del campione TEM.
Bagni d'acqua SW	Julabo	(DIN 12876-1)I	Intervallo di temperatura di lavoro da +20 a +99,9 ° C
Filtro a siringa, 0,22 e mu; m/33 mm, PES	Beyotime	FF362	DNasi/RNasi senza DNasi legame proteico basso non pirogenico avvolti singolarmente
Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)	HITACHI	HT7700	Utilizzato per immagini ad alta risoluzione della morfologia delle nanoparticelle, inclusi gli esosomi. Funzionava a una tensione di accelerazione di 80– 100 kV per visualizzare i campioni colorati negativamente e confermare la dimensione, la forma e l'integrità strutturale delle particelle.
ZetaView_Particle Metrix	Particle Metrix	PMX-120	Utilizzato per misurare la dimensione delle particelle, la concentrazione, il potenziale Zeta e le proprietà di fluorescenza delle nanoparticelle.