Rilevamento degli ormoni sessuali nella pellicola lacrimale umana utilizzando saghi immunoenzimatici legati

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato di saggio immunosorbente legato a enzimi (ELISA) per rilevare e quantificare 17β-estradiolo e testosterone nel liquido lacrimale umano raccolto tramite tubi microcapillari. Questo approccio consente una misurazione minimamente invasiva dei livelli di ormone lacrimale.

Abstract

La pellicola lacrimale è un fluido complesso e multistrato essenziale per mantenere la salute della superficie oculare, la chiarezza visiva e la protezione contro patogeni e fattori di stress ambientali. Composto principalmente da lipidi, liquido acquoso, proteine solubili e mucine, serve non solo a lubrificare e proteggere l'occhio, ma anche come prezioso mezzo diagnostico per disturbi della superficie oculare come la secchezza oculare (DED). Gli ormoni sessuali, inclusi androgeni ed estrogeni, sono noti per influenzare la composizione del film lacrimale, ma la misurazione di questi ormoni nel liquido lacrimale è limitata dal basso volume di campioni e da difficoltà tecniche. Questo protocollo descrive un metodo passo dopo passo per adattare i kit ELISA (immunosorbente associato a enzimi) commercialmente disponibili per rilevare e quantificare 17β-estradiolo e testosterone nelle lacerazioni basale raccolte tramite tubi microcapillari. Il flusso di lavoro incorpora strategie ottimizzate di raccolta dei campioni, diluizione e preparazione dei saggi per consentire l'analisi di campioni lacrimali a basso volume. Il protocollo dimostra la fattibilità e la riproducibilità della rilevazione ormonale nel fluido lacrimale utilizzando metodi ELISA adattati. I risultati rappresentativi sono derivati da campioni pilota aggregati e sono destinati a illustrare le prestazioni del saggio piuttosto che differenze biologiche. Questo approccio potrebbe supportare studi futuri che indagano il liquido lacrimale come matrice per la misurazione ormonale nella ricerca sulla superficie oculare.

Introduzione

La pellicola lacrimale svolge ruoli fondamentali nel proteggere, nutrire e lubrificare la superficie^{oculare 1}. Ha uno spessore di circa 2–5,5 μm e un volume di 3–10 μL, con un tasso di ricambio di 1–2 μL al minuto su un occhio^{sano 2,3}. Le ghiandole lacrimali secernono la componente acquosa delle lacrime, ricca di acqua, elettroliti, proteine e fattori antimicrobici, mentre le ghiandole di Meibomio producono lipidi che rallentano l'evaporazione del film lacrimale, e le cellule calice congiuntivali rilasciano mucine che supportano la lubrificazione della superficie^{oculare 4}. La produzione di lacrime avviene in due modi principali: 1) secrezione basale, che mantiene un film lacrimale stabile su una superficie oculare sana, e 2) secrezione riflessa, scatenata da stimoli come irritazione, emozioni o luci intense. La composizione biochimica differisce tra i due, il che può influenzare il metodo utilizzato per raccogliere le lacrime per^{l'analisi 5,6}. Le lacrime basale generalmente contengono concentrazioni più elevate di proteine e lipidi che supportano la stabilità del film lacrimale e la salute corneale, mentre le lacrime riflesse tendono ad avere un volume acquoso più elevato e sono più diluite per arrossare gli irritanti e proteggere la superficie^{oculare 7,8,9}.

Poiché le lacrime servono a modulare l'infiammazione, difendersi dai patogeni e fornire nutrienti alla cornea^{avascolare 1}, sono diventate un punto focale per la ricerca sui^{biomarcatori 10}. Le lacrime rappresentano un'alternativa minimamente invasiva e relativamente conveniente al prelievo di sangue per monitorare i cambiamenti fisiologici, in particolare quelli che si verificano vicino al sito della^{malattia 8}. Per catturare questi dati con precisione, una corretta raccolta è^{essenziale 10}. I tubi microcapillari in vetro sono ampiamente utilizzati per campionare le lacerazioni basale perché permettono la raccolta con irritazione minima e diluizione delle^{lacrime 5}. Questo metodo riduce al minimo il rischio di stimolare la lacerazione riflessa, che può alterare la composizione della^{lacrima 9,11}, posizionando attentamente il tubo per evitare il contatto con la congiuntiva bulbare e il margine della palpebra. Utilizzando questo approccio, i ricercatori possono ottenere lacerazioni basale non diluite che riflettono lo stato fisiologico della superficie oculare. Questo garantisce che il campione rimanga un mezzo affidabile per quantificare analiti sensibili, come gli ormoni^{sessuali 10,12}. Tuttavia, il volume limitato ottenuto presenta sfide analitiche per i saghi biochimici a valle. La raccolta delle lacrime basale tramite tubi microcapillari produce tipicamente pochi microlitri per campione, limitando la compatibilità con i saghi standard.

La superficie oculare umana è sempre più riconosciuta come tessuto bersaglio per gli ormoni^{sessuali 13,14}. Le evidenze a sostegno di ciò includono la rilevazione di trascritti di mRNA per recettori androgeni (AR), recettori degli estrogeni (ER) e recettori del progesterone (PR) nelle cellule acinar delle ghiandole lacrimali e di Meibomio, così come nelle cellule epiteliali della cornea, congiuntiva e delle cellule goblet^{congiuntivali 15}. Inoltre, in questi tessuti sono stati identificati mRNA che codificano enzimi steroidogenici, suggerendo la capacità di convertire localmente precursori steroidei in ormoni sessuali biologicamente^attivi. Ciò indica un potenziale per la sintesi ormonale in situ sulla superficie oculare e solleva una questione cruciale sul fatto che questi ormoni vengano secreti nel film lacrimale a livelli rilevabili.

Le evidenze attuali suggeriscono che gli ormoni sessuali sono fondamentali per mantenere l'omeostasi della superficie oculare, anche se i meccanismi molecolari precisi restano ancora in fase di^{indagine 13,14}. Gli androgeni, come il testosterone, sembrano stimolare la secrezione lipidica e sopprimere l'infiammazione; Di conseguenza, la carenza di androgeni è ampiamente riconosciuta come un fattore che causa l'occhio secco^evaporativo 13,14,17. Al contrario, il ruolo degli estrogeni è più sfumato e dipendente dal^contesto 13,14,18. Sebbene coinvolte nella modulazione della composizione e del volume lacrimale, le fluttuazioni estrogeniche, come quelle che si verificano durante la menopausa, la gravidanza o l'uso di contraccettivi orali, sono frequentemente associate a secrezione acquosa compromessa, ridotta stabilità della pellicola lacrimale e infiammazione della superficie^{oculare 19,20}. Di conseguenza, gli individui che sperimentano questi squilibri ormonali rappresentano una popolazione a rischio elevato di sviluppare la malattia oculare secca (DED⁾13,14,20.

Nonostante queste evidenze, monitorare lo stato ormonale nei pazienti con DED rimane una sfida. In particolare, non è ancora stabilito se i livelli ormonali sierici sistemici riflettano accuratamente i livelli ormonali locali^{nell'occhio 21}. Questa distinzione è fondamentale perché è stato dimostrato che i tessuti della superficie oculare possiedono recettori per gli ormoni sessuali e l'espressione di enzimi steroidogeni che supportano la sintesi locale e il metabolismo degli steroidi^{sessuali 16}. Questa capacità intracrina suggerisce che le concentrazioni ormonali locali nel film lacrimale possano differire significativamente dai livelli^{sierici circolanti 13}. Pertanto, è necessaria una misurazione diretta della concentrazione ormonale nel liquido lacrimale per comprendere meglio gli effetti ormonali locali sulla superficie oculare. Tuttavia, tali misure sono tecnicamente complesse a causa del piccolo volume di campioni di lacrima disponibili per l'analisi. Tecniche analitiche avanzate come la cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) sono state utilizzate per quantificare gli ormoni nel sangue e nei fluidi lacrimali ad alta sensibilità, ma questo metodo richiede strumenti specializzati e competenze tecniche che potrebbero non essere facilmente accessibili a tutti i^{ricercatori 21,22.}

Il saggio immunosorbente legato agli enzimi (ELISA) è una tecnica ampiamente affermata per la rilevazione e quantificazione di proteine, anticorpi e ormoni. Per l'analisi di piccole molecole come gli steroidi sessuali, questo protocollo utilizza un formato di legame competitivo. In questo metodo, l'ormone non marcato presente nel campione lacrimale compete con un analogo ormonale marcato da enzimi per un numero limitato di siti di legame degli anticorpi. A causa di questa competizione, l'intensità del segnale, misurata come densità ottica, è inversamente proporzionale alla concentrazione dell'ormone nel campione; Di fatto, un segnale più basso indica una concentrazione più elevata dell'ormone^{bersaglio 23,24}.

ELISA offre diversi vantaggi pratici per la quantificazione mirata. È conveniente e tecnicamente accessibile, permettendo l'implementazione in ambienti standard di laboratorio senza la necessità di strumenti specializzati. Inoltre, ELISA facilita lo screening ad alto rendimento in formati a lastre a 96 pozzi con una preparazione minima del campione, offrendo sia efficienza temporale sia alta^{riproducibilità 23}. Tuttavia, i kit ELISA disponibili in commercio sono tipicamente ottimizzati per campioni biologici di maggior volume come siero o plasma, e le loro prestazioni in campioni lacrimali a basso volume non sono ben definite. Per affrontare questa limitazione, il protocollo incorpora strategie ottimizzate di diluizione e gestione del campione per consentire la rilevazione degli ormoni all'interno dell'intervallo di sensibilità del saggio.

In questo studio, presentiamo un protocollo visualizzato che adatta i kit ELISA disponibili commercialmente per la rilevazione e quantificazione di 17β-estradiolo e testosterone in campioni lacrimali umani a basso volume raccolti utilizzando tubi microcapillari di vetro. Questo protocollo enfatizza modifiche pratiche nella raccolta del campione, nella gestione e nella preparazione del saggio per consentire la misurazione riproducibile degli ormoni da volumi lacrimali limitati. Questo lavoro si concentra sull'istituzione di un flusso di lavoro fattibile per applicare la metodologia ELISA esistente all'analisi dei fluidi straplati. Questo approccio potrebbe servire da base per futuri studi che indagano i livelli ormonali locali sulla superficie oculare.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dall'Indiana University Institutional Review Board (IRB#1908362633) e il consenso scritto informato di tutti i partecipanti è stato ottenuto prima della raccolta del campione.

1. Collezione di film lacrimali

1. Preparazione
   1. Determina il volume di strappo da raccogliere, tenendo presente che sono necessarie 2 repliche per l'affidabilità statistica dei risultati ELISA.
   2. Prepara un tubo microcentrifuga da 1,5 mL per la conservazione della pellicola lacrimale.
   3. Seleziona tubi microcapillari appropriati per raccogliere le lacrime. Consiglio di iniziare con 3,33 μL o 5 μL e di cambiare a una dimensione più piccola se si raccoglie da un volume minore di lacrime sulla superficie oculare.
   4. Prepara una lampadina a spremuta in gomma fornita con il kit per tubi microcapillari, per facilitare il trasferimento del liquido lacrimale in un tubo microcentrifuga.
2. Collezione Lacrime
   1. Istrui il giocatore a guardare dritto davanti a sé o leggermente verso l'alto.
   2. Posizionare delicatamente l'apertura del tubo microcapillare nel menisco di lacerazione vicino al canso laterale per raccogliere le lacerazioni basali.
   3. Minimizza il contatto con la congiuntiva bulbare e il margine della palpebra per evitare il più possibile la lacerazione riflessa.
   4. Riempi il tubo di strappi finché non è pieno.
   5. Se sono necessarie più sessioni di prelievo, programmate le sessioni entro 24 ore di distanza e in orari simili durante la giornata per minimizzare la variabilità dei livelli ormonali.
3. Stoccaggio delle lacrime
   1. Occluse il foro sulla parte superiore della lampada di gomma a spremuta e poi inserisci il tubo microcapillare nella lampadina, posizionando prontamente l'estremità aperta all'interno del tubo della microcentrifuga per far scorrere le lacrime fuori dal tubo microcapillare. Potrebbe essere necessario comprimere ulteriormente il bulbo per estrarre quanta più possibile la parte del campione di lacrima dal tubo microcapillare.
   2. Chiudi il tappo del tubo della microcentrifuga per evitare l'evaporazione.
   3. Fai girare il tubo usando un dispositivo microcentrifuga da banco a 2.000 × g per 3–5 secondi per lasciare il campione sul fondo del tubo prima della conservazione.
   4. Conserva a -80 °C per preservare la stabilità dell'analita prima dell'analisi.

2. Saggio sul testosterone

1. Prepara gli standard di testosterone, segui il protocollo
   1. Segui il protocollo del kit, assicurati che siano disponibili reagenti e attrezzature per preparare standard, controlli e campioni di testosterone.
   2. Ricostituisci lo standard di testosterone con acqua deionizzata o distillata per ottenere una soluzione standard di 100 ng/mL. Assicurati una completa ricostituzione e lascia riposare per almeno 15 minuti.
   3. Prepara il testosterone standard il giorno della sperimentazione.
   4. Preparare 6 tubi microcentrifughe per lo standard, con 900 μL di diluente calibratore nel tubo da 10 ng/mL e 400 μL nei tubi rimanenti.
   5. Pipettare 100 μL di soluzione di stock nel primo tubo (tubo da 10 ng/mL), mescolare accuratamente e cambiare la punta della pipetta per il trasferimento successivo.
   6. Pipetta 200 μL del primo tubo (tubo da 10 ng/mL) nel tubo successivo (3,33 ng/mL), mescola accuratamente, cambia la punta della pipetta per il trasferimento successivo e ripeti il passaggio fino all'ultimo tubo (0,041 ng/mL).
   7. Nota: Dopo aver completato tutti i passaggi, dovrebbero esserci 7 concentrazioni di standard. Il diluente calibratore funge da standard zero (0 ng/mL). Ogni standard preparato è più che sufficiente per due repliche.
2. Prepara i controlli del testosterone: bassa, media e alta concentrazione
   1. Ricostituire ogni fiala con il volume di acqua deionizzata o distillata indicato nel certificato di analisi (COA) del kit di controllo
   2. Diluire ogni controllo a 2 volte nel diluente calibratore prima di usarlo nel test
3. Prepara i campioni
   1. Rimuovi i campioni di lacrima da -80 °C e mettili sul ghiaccio per farli scongelare.
   2. Una volta che i campioni sono completamente scongelati, centrifuga brevemente i campioni strappati per assicurarsi che tutti i campioni siano sul fondo dei tubi a temperatura ambiente per 3–5 secondi.
   3. Miscelare 20 μL di campione con 80 μL di diluente calibratore per ottenere un volume totale di 100 μL per replica.
   4. Pianifica due repliche per l'esperimento per affidabilità e pozzi di legame non specifico (NSB) per il controllo in background.
   5. Nota: Ogni campione viene analizzato in pozzi duplicati. Pertanto, sono necessari 40 μL di campione lacrimale per ogni partecipante per eseguire il saggio, mescolando con 160 μL di diluiente calibratore per ottenere un volume totale di 200 μL.
4. Procedura del saggio
   1. Preparare tutti i reagenti, gli standard di lavoro, i campioni di strappo e i controlli.
   2. Rimuovere i pozzi in eccesso dal telaio della micropiastra e ripristinarli nel pacchetto di disidratanti a 4 °C.
   3. Aggiungere 50 μL di Soluzione Primaria per Anticorpi (di colore blu) a ciascun pozzo, esclusi quelli designati per i pozzi NSB. Copri il piatto con della carta stagnola.
   4. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 1 ora su un microplate shaker orizzontale orbitale (orbita 0,12") impostato a 500 ± 50 giri/min o alla posizione più vicina disponibile.
   5. Prepara un tampone di lavaggio sufficiente per un totale di 8 lavaggi, 400 μL/pozzo/lavaggio (4 lavaggi prima e 4 lavaggi dopo la fase di incubazione di 3 ore).
   6. Aspira il contenuto di ogni pozzo e lava la piastra 4 volte con il tampone di lavaggio.
   7. Aggiungere 100 μL di diluente calibratore ai pozzi NSB e zero pozzi standard.
   8. Aggiungere 100 μL di campioni di tearing standard, di controllo e preparati ai pozzi designati.
   9. Aggiungi 50 μL di Coniugato di Testosterone in ogni pozzo e mescola accuratamente pipettando.
   10. Incubare a temperatura ambiente per 3 ore su un micropiastra oscillante orizzontale (orbita 0,12") impostato a 500 ± 50 giri/min o alla posizione più vicina disponibile.
   11. Aspira ogni pozzo e lava 4 volte usando il tampone di lavaggio.
   12. Prepara la soluzione del substrato immediatamente prima dell'uso mescolando il Reagente Color A e il Reagente B al rapporto 1:1. Allocare 200 μL per pozzo. Aspirazione completa del residuo di wash buffer prima dell'aggiunta del substrato.
   13. Aggiungi 200 μL di soluzione di substrato in ciascun pozzo entro 15 minuti dalla preparazione. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente sul piano di lavoro. Proteggi dalla luce coprendo con carta stagnola.
   14. Aggiungere 50 μL di Soluzione Stop a ciascun pozzo nello stesso ordine della Soluzione Substrate. Mescola accuratamente ogni pozzo e il colore dovrebbe cambiare dal blu al giallo.
   15. Misura la densità ottica a 450 nm e 560 nm entro 30 minuti dall'aggiunta della Soluzione Stop utilizzando un lettore di micropiastre.
   16. Nota: Le istruzioni del produttore raccomandano una lunghezza d'onda di riferimento di 540 nm o 570 nm. In questo protocollo, una lunghezza d'onda di 560 nm veniva utilizzata come opzione più vicina disponibile sul lettore di microplacche, per la correzione del segnale di fondo e le imperfezioni ottiche.
5. Calcolo
   1. Si sottrae la densità ottica misurata a 560 nm (lunghezza d'onda di riferimento) dalla densità ottica misurata a 450 nm.
   2. Sottrai la densità ottica media NSB da ogni singola lettura di standard, campioni e controlli, poi calcoli la media delle misurazioni duplicate.
   3. Genera una curva standard adattando i dati utilizzando il modello logistico a quattro parametri (4PL).
   4. Determina le concentrazioni di testosterone interpolando i valori del campione dalla curva standard.
   5. Regolare le concentrazioni calcolate applicando un fattore di diluizione di 5 per tenere conto della diluizione del campione 1:5.
   6. Verifica la misura calcolando il coefficiente di variazione (CV) tra repliche che non dovrebbe superare il 20%.
      1. Nota: %CV = (SD/media) × 100

3. Saggio sull'estradiolo

1. Preparare standard, controlli e campioni per l'estradiolo
   1. Segui il protocollo del kit, assicurati che reagenti e attrezzature siano disponibili per preparare standard, controlli e campioni.
   2. Lascia che tutti i reagenti e i materiali raggiungano la temperatura ambiente prima dell'uso.
   3. Prepara un reagente fresco il giorno dell'esperimento.
   4. Standard e controllo sono pronti all'uso. Applica solo la quantità richiesta per il test attuale per minimizzare la contaminazione e limitare i cambiamenti di temperatura ripetuti durante la maneggiazione.
   5. Assicurarsi che siano preparati sei standard (n. 0–5), con lo Standard 0 che rappresenta 0 pg/mL, e includere un campione di controllo fornito con il kit.
   6. Scongelare i campioni congelati da -80 °C mettendoli sul ghiaccio.
   7. Centrifuga i campioni di strappo per assicurarti che tutti siano sul fondo del tubo.
2. Procedura del saggio
   1. Rimuovi i pozzi in eccesso dalla micropiastra e ripristinali nel pacchetto di disidratanti a 4 °C.
   2. Aggiungi 20 μL di standard, controlli e campioni nei pozzi.
   3. Nota: ogni standard e campione dovrebbe essere analizzato con 2 repliche.
   4. Per garantire una distribuzione omogenea, miscela accuratamente tutti gli standard, i controlli e i campioni immediatamente prima di pipettare nei pozzi.
   5. Aggiungere 160 μL di 17 beta Estradiolo-HRP Coniugato nei pozzi di prova.
   6. Lascia un pozzo per il substrato.
   7. Copri il pozzo con carta stagnola prima di metterlo nell'incubatore. La soluzione nei pozzi può evaporare nella carta stagnola.
   8. Incubare a 37 °C per 2 ore.
   9. Prepara il tampone di lavaggio con una soluzione di lavaggio 10X durante il periodo di incubazione.
   10. Quando l'incubazione è completata, rimuovere la carta di alluminio e aspirare il liquido dai pozzi.
   11. Lava ogni pozzo 3 volte con il tampone di lavaggio. Lascia ammollare > 5 secondi in ogni ciclo di lavaggio.
   12. Aggiungi 100 μL di Soluzione di Substrato TMB in tutti i pozzi.
   13. Copri tutto il piatto con della carta stagnola e incuba a temperatura ambiente per esattamente 30 minuti.
   14. Aggiungere 100 μL di Stop Solution in tutti i pozzi nello stesso ordine e alla velocità della precedente TMB Substrate Solution.
   15. Scuoti delicatamente la micropiastra e il reagente passa dal blu al giallo.
   16. Misura l'assorbanza a 450 nm entro 30 minuti dall'aggiunta della soluzione Stop.
3. Calcolo
   1. Sottrai l'assorbenza del pozzo vuoto dalle letture di tutti gli standard, campioni e controlli per correggere le imperfezioni del segnale di fondo e ottiche.
   2. Calcola la media delle misurazioni duplicate.
   3. Generare una curva standard di miglior adattamento utilizzando la logistica a quattro parametri (4PL).
   4. Determina la concentrazione di estradiolo interpolando i valori del campione dalla curva standard.
   5. Verifica la misura calcolando il coefficiente di variazione (CV) tra repliche che non dovrebbe superare il 20%.
      1. Nota: %CV = (SD/media) × 100.

4. Analisi dei dati usando R e RStudio

1. Installa R e RStudio e installa i pacchetti richiesti elencati nella Tabella dei Materiali prima di eseguire l'analisi dei dati.
2. Importare misurazioni di densità ottica per standard, controlli e campioni nel software di analisi.
3. Pre-elaborando i dati applicando una correzione della lunghezza d'onda come specificato dal saggio. Poi sottrai valori vuoti o NSB e calcoli la media delle misurazioni duplicate.
4. Adattare una curva standard utilizzando un modello di regressione logistica a quattro parametri (4PL) con concentrazione come variabile indipendente e densità ottica come variabile di risposta.
5. Eseguire l'adattamento delle curve in R utilizzando la funzione drm() dal pacchetto drc, con il modello specificato come fct = LL.4() per la regressione 4PL, con dati di concentrazione e densità ottica in input.
6. Verifica la qualità dell'adattamento della curva (ad esempio, R² > 0,99 o buona ondata accettabile) prima di interpretare le concentrazioni del campione.
7. Calcolare le concentrazioni ormonali tramite previsione inversa utilizzando la funzione ED() basata sulla curva standard adattata, specificando la dose effettiva corrispondente ai valori di densità ottica campionati basandosi sul modello adattato.
8. Regolare le concentrazioni calcolate applicando il fattore di diluizione appropriato (ad esempio, ×5 per una diluizione 1:5).
9. Riportate le concentrazioni ormonali finali nelle unità appropriate (ad esempio, ng/mL o pg/mL), assicurando la coerenza con la curva standard, ed esportare i dati processati per ulteriori analisi o visualizzazioni.

Risultati

Studio pilota del film lacrimale

In totale 20 donne (45–63 anni) sono state incluse in questo studio. La classificazione della DED si basava sui sintomi e su almeno un segno clinico di DED. In particolare, tutti i partecipanti alla DED avevano un punteggio dell'Indice di Malattia della Superficie Oculare (OSDI) > 12 e almeno un occhio con un tempo di rottura della lacrima fluoresceina (TBUT) di < 5 secondi o punteggio di colorazione corneale c...

Discussione

La raccolta e l'analisi delle lacrime permettono un facile accesso per la valutazione scientifica dello stato della superficie oculare e l'identificazione di potenziali^{biomarcatori 10,22}. Il nostro protocollo descrive l'adattamento riuscito dei metodi ELISA comunemente usati per analizzare campioni di film lacrimale per gli ormoni sessuali. Abbiamo sviluppato questo metodo per affrontare la limitazione primaria dell'analisi delle...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
17 beta Estradiol ELISA Kit	Abcam	ab108667
Carta stagnola	Reynolds Wrap	10900000154	Qualsiasi carta stagnola disponibile per la cucina per proteggere i reagenti dalla luce
Microcapillre tubo 3,33 µL	Drummond	1-000-0033	Include una spugna per il trasferimento del fluido
Microcapillre tubo 5 µL	Drummond	1-000-0050	Include una spugna per il trasferimento del fluido
Dispositivo per microcentrifugazione	Benchmark Scientific	C1012
Tubi per microcentrifugazione da 1,5 mL	Fisher	05-408-129
Lettore di micropiastre	Promega	GM3000
Agitatore orbitale per micropiastre	Labnet International Inc.	S2030-1000-B
Lingua R per computer	Posit Software, PBC (ex RStudio Inc.)	Versione R 4.5.1	Scarica il linguaggio R prima di Rstudio attraverso https://cran.r-project.org/
Software RStudio	Posit Software, PBC (ex RStudio Inc.)	RStudio 2023.06.1 Build 524 "Mountain Hydrangea"	https://posit.co/downloads/
Pacchetti R "drc", "ggplot2", "patchwork", "ggpp", "dplyr", "readr", "tidyr", "writexl"	Posit Software, PBC (ex RStudio Inc.)		Installa il pacchetto in Rstudio
Kit di controllo del testosterone	R&D Parameter	QC165	Venduto separatamente dal kit ELISA (KGE010)
Kit ELISA per testosterone	R&D Parameter	KGE010