Un modello completo di ratti per la valutazione delle vie di trasporto epatico attraverso campionamenti simultanei di linfatica e vascolo sanguigna

Sommario

Questo protocollo sperimentale descrive un modello di ratto canulato con canulazione dei dotti linfatici epatici che consente una valutazione diretta e quantitativa del drenaggio linfatico e vascolare epatico. Il modello consente il campionamento simultaneo di sangue linfatico epatico e sistemico per indagare il trasporto epatico, il metabolismo e la segnalazione immunitaria, supportando studi sulla farmacocinetica dei farmaci e sulla biologia specifica del fegato.

Abstract

Il fegato è un centro metabolico e immunologico centrale che elabora nutrienti, xenobiotici e mediatori immunitari circolanti. Le sostanze raggiungono gli epatociti e altre cellule epatiche tramite i capillari sinusoidali che ricevono il sangue dall'intestino tramite la vena porta e dalla circolazione sistemica tramite l'arteria epatica. Il filtrato plasmatico dai capillari sinusoidali drena nello spazio di Disse, dove può subire una trasformazione metabolica, partecipare alla sorveglianza immunitaria o fluire nei vasi linfatici formando linfa epatica. Il prelievo di linfa e sangue epatico può aiutare a consentire un'analisi dettagliata del trasporto epatico, dei processi metabolici e dell'attività immunitaria. Viene descritto un modello chirurgico su ratto che consente il campionamento simultaneo del flusso linfatico epatico e del sangue sistemico attraverso tre siti di cannellazione distinti: dotto linfatico epatico, arteria carotide e vena giugulare. Le canulazioni linfache e arteriose epatiche permettono un campionamento continuo, mentre la cannula della vena giugulare può essere utilizzata per l'idratazione continua e il supporto dei liquidi o per la raccolta venosa, permettendo il confronto tra sangue arterioso e venoso. Una canulazione efficace produce flussi linfatici epatici di circa 0,1 mL/h nei ratti anestetizzati, permettendo un prelievo linfatico continuo fino a 8 ore mentre si effettuano simultaneamente prelievi arteriosi e venosi del sangue. Questa configurazione consente un confronto diretto tra il sangue arterioso sistemico e il flusso linfatico epatico, consentendo un esame completo del trasporto e della liberazione epatica, nonché dei processi di segnalazione metabolica e immunitaria. Per estendere ulteriormente il modello, al termine della procedura può essere effettuato un campionamento terminale dell'arteria epatica e della vena porta, per consentire un confronto diretto tra afflusso epatico, uscita e drenaggio linfatico. In definitiva, queste tecniche offrono una piattaforma versatile per valutare i processi epatici, inclusi farmaci farmacologici, flusso e metabolismo dei nutrienti, e risposte specifiche del fegato, sotto varie condizioni fisiopatologiche.

Introduzione

Il fegato è un organo metabolico e immunologico centrale responsabile dell'elaborazione dei nutrienti, della disintossicazione xenobiotica e della sorveglianza immunitaria. Il fegato è il più grande organo produttore di linfa nel corpo. Studi su mammiferi di grandi dimensioni suggeriscono che contribuisce tra il 25% e il 50% del flusso linfatico^{totale 1,2}. Nei roditori, gli studi di cannulazione indicano che circa il 10%–20% del flusso linfatico toracico totale ha origine dal^{fegato 3,4}. La linfa epatica ha origine dal plasma filtrato attraverso l'endotelio fenestrato dei capillari sinusoidali all'interno del parenchima epatico. Questo filtrato si raccoglie nello spazio di Disse, un compartimento interstiziale tra epatociti e cellule endoteliali sinusoidali. Il filtrato passa quindi attraverso lo spazio del Mall nei capillari linfatici portali che convergono in vasi raccoglitori che drenano verso l'ilo epatico e la cisterna^{chili 5,6}.

Il sistema linfatico epatico è anatomicamente suddiviso in reti porta, subcapsulare e sublobolare ^6,7. Recenti studi di imaging volumetrico dimostrano che i linfonici epatici formano una rete altamente ramificata dipendente dal fattore di crescita endoteliale vascolare C (VEGF-C), in gran parte confinata ai trattori porta. Questa rete è composta prevalentemente da capillari linfatici che drenano retrogradamente verso la vena porta. D'altra parte, i linfatici subcapsulari e sublobulari, distribuiti rispettivamente lungo la superficie epatica e nelle regioni venose centrali, sono ulteriori vie di drenaggio. L'imaging post-mortem umano ha ulteriormente rivelato una densa rete di vasi linfatici lungo le vene epatiche, indicando che i linfonici venosi periportal ed epatico regolano congiuntamente il flusso linfatico⁸.

La linfa epatica rappresenta un ultrafiltrato derivato dal plasma che riflette sia i processi metabolici che^{immunitari 9,10}. Le analisi biochimiche dimostrano che la linfa epatica contiene albumina, lipoproteine, citochine e metaboliti derivati dall'attività parenchimale^{epatica 3,4,6}, coerente con il profilo proteomico generale del liquido linfatico riportato in altri^{tessuti 10}. I primi studi hanno dimostrato che la linfa epatica contiene classi distinte di lipoproteine, con le lipoproteine ad alta densità (HDL) che rappresentano una frazione dominante, coerente con il ruolo centrale del fegato nella sintesi e rimodellazione^{dell'HDL 11}. In particolare, studi più recenti hanno mostrato che la linfa epatica è arricchita in HDL ed esteri del colesterolo rispetto a quella mesenterica, evidenziando il suo contributo distintivo al traffico lipidico e al trasporto inverso del^{colesterolo 3}. Inoltre, la linfa epatica funge da condotto immunologico, trasportando mediatori immunitari, cellule presentanti antigeni e vescicole extracellulari che collegano i microambienti epatici con l'immunità^{sistemica 9}.

Le alterazioni nella formazione e nel drenaggio della linfa epatica sono caratteristiche chiave della malattia epatica. Nella cirrosi e nell'ipertensione portale, una pressione sinusoidale elevata provoca un aumento di più volte della produzione linfatica, portando a linfangiectasia, fibrosi e ascite una volta superata la capacità di drenaggio. La lesione cronica del fegato favorisce anche la linfangiogenesi dipendente da VEGF-C/VEGFR-3, con un rimodellamento linfatico eccessivo o anomalo che contribuisce all'infiammazione epatica, all'edema e all'accumulo di^{lipidi 9,12}. Inoltre, nella malattia steatotica epatica associata a disfunzioni metaboliche (MASLD) e nel carcinoma epatocellulare, è stato dimostrato che l'aumento della densità linfatica epatica è correlato con la progressione della malattia e la^{metastasi 13,14}.

Nonostante il ruolo fisiologico e clinico centrale della linfa epatica, essa rimane poco studiata e poco esplorata nella ricerca sperimentale, principalmente a causa delle difficoltà tecniche nell'isolare la linfa epatica pura. I modelli di raccolta linfa toracica e mesenterica sono stati descritti più ampiamente, ma questi forniscono solo un'intuizione indiretta sui meccanismi di trasporto epatico. Una limitazione nel campo è stata affrontata sviluppando un modello di canulazione linfatica epatica per ratti, che ha permesso la raccolta diretta della^{linfa 4} epatica. Con questo approccio, è stato dimostrato che la maggior parte dell'assorbimento linfatico delle proteine terapeutiche somministrate per via endovenosa avviene nel fegato e nel mesenterio. Questi risultati evidenziano la linfa epatica come via chiave per lo scambio macromolecolare tra il sangue e il sistema linfatico, con importanti implicazioni per la farmacocinetica e la distribuzione delle terapie^{biologiche 4}.

Per colmare le lacune residue, il presente studio descrive un modello completo su ratti che consente il campionamento simultaneo del sangue linfatico epatico e sistemico tramite la cannulazione del dotto linfatico epatico, dell'arteria carotide e della vena giugulare. Questo approccio consente la valutazione in tempo reale del trasporto e dello scambio di soluti tra compartimenti interstiziali e sistemici epatici, fornendo una solida piattaforma sperimentale per indagare il trasporto epatico, il metabolismo, la segnalazione immunitaria e la disposizione dei farmaci in condizioni fisiologiche e patologiche. Il modello comprende anche un campionamento opzionale terminale dell'arteria epatica e della vena porta per consentire il confronto diretto tra afflusso ed uscita epatica e drenaggio linfatico.

Figura 1. Schema del modello multi-cannulation per campioni simultanei linfatici e di sangue. Un modello completo di canulazione che illustra il campionamento simultaneo dall'arteria carotide, vena giugulare, arteria epatica, dotto linfatico epatico e vena porta. (A) L'arteria carotide viene cannulata per un prelievo intermittente di sangue. (B) La vena giugulare esterna viene cannulata per un'infusione continua di soluzione salina per mantenere l'idratazione e compensare la perdita di liquidi durante il campionamento. (C) L'arteria epatica comune, che corre parallela al dotto linfatico epatico, viene cannulata per il prelievo terminale di sangue. (D) Il dotto linfatico epatico viene canulato per una raccolta continua della linfa. (E) La vena porta è accessibile tramite puntura ad ago per il prelievo terminale di sangue. Le procedure mostrate in (A), (B) e (D) vengono eseguite prima del campionamento terminale, seguite da (C) campionamento dell'arteria epatica e successivamente (E) campionamento della vena porta. Abbreviazioni: EJV, vena giugulare esterna; CA, arteria carotide; SVC, vena cava superiore; IVC, vena cava inferiore; Ao, aorta; CHA, arteria epatica comune; HL, dotto linfatico epatico; ML, dotto linfatico mesenterico; SMA, arteria mesenterica superiore; PV, vena porta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono gli animali sono state esaminate e approvate dal Comitato Etico Animale dell'Istituto Monash di Scienze Farmaceutiche (ID Etico #46283) e sono state condotte in stretta conformità con le linee guida del Consiglio Australiano e Neozelandese per la Cura degli Animali nella Ricerca e l'Insegnamento (ANZCCART) e con il Codice Australiano per la Cura e l'Uso degli Animali a Scopi Scientifici (National Health and Medical Research Council, Australia)¹⁵.

Modelli animali: sono stati utilizzati maschi o femmine albini superiore Rattus norvegicus, o ratti Sprague–Dawley (SD) con un peso di 250–350 g. Gli animali sono stati ottenuti da fornitori autorizzati per animali da laboratorio (Monash Animal Research Platform) e ospitati in gabbie ventilate individualmente a temperatura controllata (22 ± 2 °C) e con un ciclo chiaro-buio di 12 ore, con libero accesso a cibo e acqua prima della sperimentazione. Gli animali sono stati acclimatati per almeno una settimana prima dell'intervento chirurgico per minimizzare la variazione fisiologica legata allo stress.

Viene descritto un modello di canulazione del dotto linfatico epatico, dell'arteria carotide e della vena giugulare che consente il prelievo simultaneo del sangue linfatico e sistemico. Un campionamento opzionale terminale dell'arteria epatica e della vena porta può essere effettuato sotto anestesia per un'analisi comparativa dell'afflusso epatico e dell'uscita linfatica. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparativi il giorno prima dell'intervento

1. Incolla il ratto durante la notte se necessario per il protocollo sperimentale specifico. Assicurati sempre l'accesso gratuito all'acqua.
2. Prepara soluzione salina sterile per infusione endovenosa durante la raccolta linfatica. Determinare il volume richiesto in base alla durata della raccolta (tipicamente 3–5 ore) e a una velocità di infusione suggerita di 1,5–3,0 mL/h per sostituire la perdita di liquidi dovuta a prelievo di linfa e sangue, così come le perdite fisiologiche come il ritiro di urina.
3. Prepara tre cannule in polietilene per la cannula dei dotti linfatici epatici, dell'arteria carotide e della vena giugulare come segue:
   1. Dotto linfatico epatico
      1. Taglia una cannula di diametro esterno (O.D.) di 0,8 mm, diametro interno (I.D.) di 0,5 mm a 30–35 cm. Assicurati che la lunghezza permetta la raccolta senza tensione.
      2. Smussare la punta di inserimento a circa 45° con una lama chirurgica sterile per facilitare l'inserimento.
   2. Arteria carotide
      1. Taglia una cannula O.D. di 0,8 mm e 0,5 mm di diametro diametrale fino a 20–30 cm. Segna circa 2–2,5 cm dall'estremità interna per indicare la profondità di inserimento.
   3. Vena giugulare
      1. Taglia una cannula di 0,8 mm di diametro diametrale, 0,5 mm di diametro diametrale o 0,96 mm di diametro permanente, 0,58 mm di diametro interiore fino a 50 cm o più. Segna 1–1,5 cm dall'estremità interna per la profondità di inserimento. Assicurati che la lunghezza possa raggiungere la pompa d'infusione senza tensione.
4. Prepara una soluzione anticoagulante composta dallo 0,1% di EDTA in acqua sterile o da 20 IU/mL di eparina in soluzione salina sterile.
5. Riempi una siringa da 1 mL con una soluzione anticoagulante e attacca un ago da 25G alle cannule O.D. da 0,8 mm oppure un ago da 23G alle cannule O.D. da 0,96 mm.
6. Risciacquo ogni cannula con circa tre volte il suo volume interno, assicurandosi che non rimangano bolle d'aria.
7. Tieni le cannule piene di anticoagulante e tappate con l'ago e la siringa collegate tutta la notte. Il pre-ammollo con un anticoagulante minimizza la formazione di coaguli.
8. Prepara tubi di raccolta per sangue e linfa. Aggiungere la soluzione anticoagulante per raggiungere una concentrazione finale di 1 mg/mL EDTA o 10 IU/mL di eparina dopo la raccolta del campione.

2. Preparativi immediatamente prima dell'intervento chirurgico

1. Risciacquo tutte le cannule con anticoagulante per confermare la patenza. Assicurati che non ci siano bolle d'aria.
2. Indurre anestesia nel ratto con il 5% di isoflurano in ossigeno a 1 L/min in una camera di induzione.
3. Monitorare la respirazione e assicurarsi che la frequenza sia ridotta a circa 1,5 respiri al secondo (circa 90 respiri/minuto), indicando una profondità anestetica adeguata.
   ATTENZIONE: L'isoflurano è un anestetico volatile e dovrebbe essere utilizzato all'interno di un sistema anestetico correttamente ventilato o di una cappa per minimizzare l'esposizione sul lavoro.
4. Trasferire il ratto su un cuscinetto chirurgico riscaldato (37°C) e mantenere l'anestesia con l'1–3% di isoflurano nell'ossigeno somministrato a 0,4–0,6 L/ min tramite un cono nasale.
5. Confermare una profondità anestetica adeguata in assenza di riflessi corneali e di pizzicamento delle dita dei piedi. Mantieni l'anestesia durante tutto l'intervento chirurgico e il periodo di raccolta linfa.
   NOTA: L'anestesia continua è essenziale per prevenire il dolore durante l'intervento e per evitare lo sblocco della cannula dovuto al movimento.
6. Radere le regioni chirurgiche, inclusi il quadrante addominale destro (dalla linea mediana al fianco destro, circa 2 cm sotto la gabbia toracica) e la regione clavicolare destra o sinistra.
7. Disinfettare tutte le aree chirurgiche utilizzando clorexidina allo 0,5% seguita da etanolo al 70%.

3. Canulazione dell'arteria carotide

NOTA: La canulazione dell'arteria carotide può essere eseguita prima o dopo la canulazione della vena giugulare.

1. Mantieni la stessa posizione dorsale e incisione cervicale.
2. Posiziona un piccolo supporto (ad esempio, una siringa da 3 mL) sotto il collo per sollevare la regione carotide.
   NOTA: Questo passaggio è opzionale.
3. Separare i muscoli del collo per esporre l'arteria carotide circa 1 cm sotto la superficie cutanea.
4. Isola l'arteria usando una pinza curva dell'iride. Identificare e separare delicatamente il nervo vago adiacente per prevenire danni al nervo.
5. Posiziona le pinze Graefe dritte sotto l'arteria per occludere il flusso sanguigno e infila due suture di seta 4-0 sotto. Lega saldamente la sutura prossimale (cranica).
6. Fai una piccola incisione sulla superficie dell'arteria.
7. Solleva delicatamente il lembo del vaso con la punta della pinza della lente per stabilizzare il lumen del vaso per l'inserimento della cannula.
8. Inserire la cannula alla profondità pre-marcata di 2–2,5 cm. Aspettati un leggero riflusso di riposto; Se eccessivi, occludi nuovamente e pulisci prima di procedere.
   ATTENZIONE: La puntura e la canulazione vascolare coinvolgono strumenti affilati e devono essere eseguiti con attenzione per prevenire lesioni accidentali.
9. Confermare la corretta posizione prelevando delicatamente un piccolo volume di sangue e infondendo la soluzione anticoagulante nella cannula senza sentire resistenza o notare gonfiore sottocutaneo.
10. Fissa la cannula con punti di sutura e sigilla l'estremità esterna con un tappo.
11. La procedura può essere interrotta brevemente dopo la canulazione dell'arteria carotide mantenendo l'anestesia.
12. Chiudi la ferita sul collo con punti sterili. Una panoramica dell'isolamento dell'arteria carotide e della cannulazione riuscita è mostrata nella Figura 2.

Figura 2: Canulazione dell'arteria carotide. (A) I muscoli accoppiati del collo che fiancheggiano l'arteria carotide (frecce arancioni). La ghiandola salivare (frecce blu) è incollata in modo cranico. (B) L'arteria carotide esposta si trova a circa 1 cm sotto la superficie cutanea. La ghiandola salivare (frecce blu) è incollata in modo cranico. (C) Configurazione chirurgica prima dell'inserimento della cannula, che mostra l'occlusione del flusso sanguigno con pinze Graefe dritte e due suture di seta che isolano l'arteria, con l'estremità superiore legata. (D) Circa 2 cm della cannula vengono inseriti con successo nell'arteria carotide (frecce gialle). La cannula dell'arteria carotide è indicata dalle frecce verdi. (E) La canulazione riuscita dell'arteria carotide è stata confermata prelevando sangue nella cannula. (F) Tre punti di sutura (taglia 4-0) sono legati attorno all'arteria carotide e alla cannula per la fissazione (frecce viola). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Cannulazione della vena giugulare

1. Posiziona il ratto in posizione dorsale reclinata con il collo esteso e la testa leggermente rivolta a sinistra.
2. Identifica la vena giugulare sopra la clavicola dalla sua posizione e dal flusso sanguigno visibile. Eseguire un'incisione obliqua di 1–1,5 cm dalla clavicola verso la trachea.
3. Dissezionare in modo diretto il tessuto sottocutaneo per esporre la vena.
4. Separare la vena dal tessuto connettivo circostante usando pinze curbate dell'iride. Confermare l'isolamento passando una pinza sotto la vena.
5. Posizionare due suture di seta 4-0 sotto la vena a ciascuna estremità del segmento esposto. Lega saldamente la sutura cranica (superiore) per occludere il flusso sanguigno.
6. Per prevenire il riflusso di sangue, posiziona una pinza Graefe dritta sotto la vena e appoggia le manici su una siringa o un supporto.
7. Fai una piccola incisione (~1 mm) sulla parte superiore della vena, a un terzo lungo il segmento isolato usando forbici per l'iride.
8. Solleva delicatamente il lembo del vaso con la punta della pinza della lente per stabilizzare il lumen del vaso per l'inserimento della cannula.
9. Inserisci la punta della cannula nell'incisione usando la pinza dell'iride e avanzala fino alla profondità già segnata (1–1,5 cm).
10. Rilascia l'occlusione una volta che la cannula è stabilizzata per permettere il flusso sanguigno.
    NOTA: Mantieni una presa stabile per prevenire il riflusso venoso. Se si verifica un'emorragia, ri-occluse immediatamente e pulisci il campo prima di procedere.
11. Confermare la corretta posizione prelevando delicatamente un piccolo volume di sangue e infondendo la soluzione anticoagulante nella cannula senza sentire resistenza o notare gonfiore sottocutaneo.
12. Fissare la cannula con punti di sutura sia all'estremità prossimale che a quella distale.
13. Occludi temporaneamente il tubo esterno, rimuovi la siringa e sigilla la cannula con un tappo.
14. Copri l'incisione con garze umidite con soluzione salina calda finché la canulazione dell'arteria carotidea non è completata. Immagini rappresentative dell'isolamento e della cannulazione della vena giugulare sono mostrate nella Figura 3.

Figura 3: Canulazione della vena giugulare. (A) La vena giugulare (contorno nero tratteggiato) si trova appena sotto la pelle sopra la clavicola. La cannula dell'arteria carotide consolidata può essere osservata vicino alla vena giugulare (frecce verdi). (B) La vena giugulare è isolata da due suture di seta; l'estremità superiore viene legata. (C) Circa 1 cm della cannula viene inserito con successo nella vena giugulare (frecce gialle). La cannula della vena giugulare è indicata dalle frecce blu; La cannula dell'arteria carotide è indicata dalle frecce verdi. (D) Tre punti (taglia 4-0) sono legati attorno alla vena giugulare e alla cannula per la fissazione (frecce viola). Canulazione riuscita della vena giugulare confermata tramite iniezione salina liscia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Cannulazione del dotto linfatico epatico

1. Posizionare il ratto in posizione dorsale sdraiata sotto un microscopio chirurgico.
2. Effettuare un'incisione orizzontale della pelle di 4–5 cm dalla linea mediana al fianco destro, circa 1,5–2 cm sotto la gabbia toracica (Figura 4A, B).
3. Ritrai la pelle e fai incisioni corrispondenti nei muscoli obliqui esterni e interni.
4. Cauterizza o lega qualsiasi vaso sanguigno grande incontrato per prevenire una perdita eccessiva di sangue.
5. Riposizionare delicatamente gli organi usando cotton cotton fioc inumidi con soluzione salina: sposta il fegato verso il diaframma, lo stomaco a sinistra e l'intestino tenue verso il basso.
6. Mantieni gli organi retratti con garze imbevbite di soluzione salina. Il sito dell'incisione e la posizione dell'organo sono illustrati nella Figura 4C.
7. Identificare il dotto linfatico epatico (diametro ~0,6 mm) utilizzando i punti di riferimento anatomici consolidati. Il dotto corre parallelo e leggermente caudale all'arteria epatica, situato medialmente al rene destro e adiacente alla vena cava inferiore.
8. Osserva l'aspetto del dotto linfatico epatico. Appare tipicamente traslucido e stretto.
9. Distinguere il dotto linfatico epatico dal dotto linfatico mesenterico, che è più grande e solitamente appare opaco o bianco a causa del contenuto di chilomicron. Il dotto linfatico mesenterico può quindi fungere da punto di riferimento anatomico per aiutare nell'identificazione del dotto linfatico epatico situato a livello cranico.
10. Rimuovere il tessuto connettivo che sovrasta il dotto linfatico e la vena cava utilizzando forze Graefe linee.
11. Crea un passaggio sotto la vena cava inserendo le pinze Graefe dritte attraverso il letto adiposo sotto il rene destro. Avanza finché le punte non emergono sul lato opposto sotto la vena cava, parallela al dotto linfatico epatico.
12. Impugna l'estremità esterna della cannula preparata con la pinza Graefe dritta e tirala attraverso il tunnel creato sotto la vena cava finché la punta non emerge dal lato opposto.
13. Utilizzando la pinza emostica Halsted-Mosquito, piega la punta di un ago da 25G a circa 90°. Utilizzando l'ago piegato, perforare il dotto linfatico epatico sul lato destro (più vicino all'operatore).
    ATTENZIONE: Fai attenzione quando maneggia aghi affilati durante la puntura dei dotti linfatici per prevenire lesioni accidentali.
14. Assicurati che la cannula sia piena di soluzione anticoagulante senza bolle d'aria. Inserire l'estremità smussata di circa 2 mm nel condotto.
15. Osserva l'estremità esterna della cannula per il flusso linfatico (~ 100 μL/h). Se non si osserva alcun flusso, si aggiusta o si reinserisce la canula.
16. Una volta confermato il flusso linfatico, tappare la cannula prima di applicare una piccola goccia di adesivo veterinario per fissare il sito di inserimento. Una volta asciugato, confermare il flusso linfatico attraverso il tubo.
17. Rimuovere la garza e riportare gli organi nelle loro posizioni originali.
18. Posiziona il tubo di raccolta contenente la soluzione anticoagulante sotto l'uscita della cannula. Conferma che la linfa scorre a gocce nel tubo.
19. Chiudi la parete addominale suturando sequentemente gli strati obliquo interno, esterno e cutaneo. L'identificazione e la cannulazione riuscita del dotto linfatico epatico sono mostrate nella Figura 5.
    NOTA: Dopo una canulazione epatica dei dotti linfatici riuscita, la procedura può essere brevemente interrotta mentre anestesia e idratazione vengono mantenute prima di iniziare la raccolta linfatica.

Figura 4: Esposizione ai dotti linfatici epatici. (A) Punto di riferimento anatomico che indica 1,5–2 cm sotto la gabbia toracica destra per l'incisione. (B) Incisione attraverso la pelle e i muscoli addominali, esponendo gli organi interni. (C) Organi riposizionati per esporre il dotto linfatico epatico. Il fegato è spostato verso il diaframma, lo stomaco a sinistra dell'animale e l'intestino tenue è ripiegato verso il basso. Il dotto linfatico epatico si trova tra l'arteria epatica (freccia verde) e l'arteria mesenterica (freccia blu). A sinistra: fegato; SI: intestino tenue; IVC: vena cava inferiore; RK: rene destro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Identificazione e cannulazione dei dotti linfatici epatici. (A) Le strutture linfatiche e arteriose possono essere osservate dopo il riposizionamento degli organi e prima della rimozione del tessuto congiuntivo circostante. L'arteria epatica (frecce verdi) si trova a livello cranico rispetto al dotto linfatico epatico adiacente (frecce gialle). Il dotto linfatico mesenterico (frecce viola) si trova sopra l'arteria mesenterica (contorno punteggiato nero). Queste strutture sono perpendicolari alla vena cava inferiore. IVC: vena cava inferiore; RK: rene destro. (B) Il dotto linfatico epatico (frecce gialle) può essere visualizzato chiaramente dopo la rimozione del tessuto conlettivo circostante. Il dotto linfatico epatico corre parallelo all'arteria epatica (contorno tratteggiato verde) e cranicalmente in relazione al dotto linfatico mesenterico (frecce viola) e all'arteria mesenterica (contorno nero tratteggiato). (C) La nunula (frecce bianche) viene inserita nel dotto linfatico epatico (frecce gialle) tramite la piccola puntura effettuata nel dotto linfatico (frecce arancioni). Il dotto linfatico mesenterico (frecce blu) può essere visualizzato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Periodo post-operatorio

1. Immediatamente dopo una cannula linfatica epatica riuscita, iniziare la reidratazione infondendo soluzione salina sterile a 1,0–2,0 mL/h attraverso la cannula della vena giugulare.
2. Mantieni l'infusione durante tutta la raccolta linfatica. In alternativa, la reidratazione può essere effettuata tramite una cannula gastrica o duodenale, permettendo di riservare la cannula della vena giugulare per il prelievo venoso di sangue se necessario.
3. Mantenere l'animale sotto anestesia su un assorbente chirurgico riscaldato (37°C) per tutto il periodo di prelievo.
4. Monitorare la frequenza respiratoria e la profondità anestetica durante tutto l'esperimento osservando i modelli respiratori e le risposte riflesse, mantenendo l'anestesia isoflurana tramite un cono nasale.
5. L'idratazione è stata mantenuta tramite infusione salina continua (1,0–2,0 mL/h) tramite la cannula della vena giugulare.
6. Per minimizzare i disturbi fisiologici, il volume totale di sangue raccolto prima del campionamento terminale è stato limitato al <10% del volume sanguigno circolante stimato, in conformità con le linee guida etiche istituzionali sugli animali.
7. Raccogli continuamente la linfa epatica in tubi contenenti anticoagulanti. Sostituire i tubi di raccolta ogni ora o secondo necessità.
8. Raccogliere campioni di sangue arterioso in momenti temporali designati:
   1. Occludi temporaneamente il tubo esterno e fissa una siringa vuota.
   2. Preleva sangue finché il tubo non è riempito.
   3. Sostituire la siringa con una fresca per la raccolta del campione e prelevare circa 100–200 μL di sangue arterioso in ogni momento di prelievo designato.
   4. Risciacqua la cannula con una soluzione anticoagulante dopo ogni prelievo.
   5. Sigilla la cannula con un tappo.
9. Dopo la raccolta del campione, procedere al campionamento terminale dell'arteria epatica e della vena porta, oppure eliminare umanamente il ratto con pentobarbitone al sodio (>100 mg/kg) tramite la carotide o la cannula giugulare.

7. Campionamento terminale dell'arteria epatica e della vena porta

1. Al termine della raccolta di linfa e sangue, mantenere l'anestesia profonda e garantire una respirazione stabile prima di procedere con il campionamento vascolare terminale.
2. Riaprire con attenzione l'incisione addominale per esporre la cavità addominale superiore.
3. Ritrae delicatamente il fegato verso il diaframma, lo stomaco a sinistra e l'intestino tenue verso il basso utilizzando una garza inumidita con soluzione salina per rivelare il dotto linfatico epatico cannulato.
4. Identifica l'arteria epatica, che corre parallela e caudale al dotto linfatico epatico.
   NOTA: L'arteria appare più piccola e pallida della vena porta e presenta un flusso più pulsatile.
5. Prepara una cannula in polivinile O.D. 0,61 mm e 0,28 mm I.D., pre-riempita con soluzione anticoagulante e priva di bolle d'aria.
6. Utilizzando una pinza dell'iride curva, isola un breve segmento dell'arteria epatica e posiziona una sutura di seta 4-0 sotto.
7. Solleva delicatamente l'arteria e posiziona una seconda sutura distale rispetto alla prima. Legare la sutura distale per controllare il riflusso lasciando la sutura prossimale non legata per una chiusura successiva.
8. Utilizzando microforbici a punta fine, realizza una piccola incisione trasversale (circa 0,5 mm) nella parete dell'arteria tra le suture.
9. Sollevare delicatamente la lembo del vaso con la punta della pinza Dumont per stabilizzare il lumen del vaso per l'inserimento della cannula.
10. Inserisci l'estremità smussata della cannula in polivinile nell'apertura e avanza di circa 2–3 mm.
11. Fissa la cannula legando la sutura prossimale sia attorno al vaso che alla canula.
12. Conferma la corretta posizione osservando il flusso sanguigno pulsatile nella cannula o aspirando delicatamente una piccola quantità di sangue arterioso rosso brillante.
13. Raccogliere 0,5–1 mL di sangue in un tubo pre-etichettato contenente anticoagulante.
14. Dopo il prelievo, si ritira la cannula e si ottiene l'emostasi stringendo entrambe le suture. L'esposizione dell'arteria epatica e la procedura di canulazione sono illustrate nella Figura 6.
15. Identifica la vena porta, che corre medialmente e perpendicolare all'arteria epatica. La vena porta ha un diametro maggiore e una colorazione più scura rispetto all'arteria epatica.
16. Inserisci un ago da 23G o 25G su una siringa da 1 mL pre-risciacquata con soluzione anticoagulante.
17. Inserire il bisello a ago nella vena porta con un angolo basso (circa 20°–30°) per evitare il collasso o la lacerazione del vaso.
18. Aspira delicatamente il volume sanguigno richiesto.
19. Poiché la puntura della vena porta è terminale, si uccide umanamente l'animale immediatamente dopo la raccolta del campione somministrando >100 mg/kg di pentobarbitone sodico tramite la carotide o la cannula giugulare mentre l'animale rimane sotto anestesia profonda. La localizzazione della vena porta e il metodo di campionamento terminale sono mostrati nella Figura 7.
    ATTENZIONE: Il pentobarbitone sodio è una sostanza controllata e deve essere maneggiato e somministrato in conformità con le normative istituzionali e le procedure di sicurezza appropriate.
20. Confermare la morte per cessazione della respirazione e dell'attività cardiaca prima dello smaltimento delle carcasse, in conformità con il Codice Australiano per la Cura e l'Uso degli Animali a Scopi Scientifici (NHMRC)¹⁵ e le linee guida ANZCCART.

Figura 6: Identificazione e canulazione dell'arteria epatica. (A) Esposizione dell'arteria epatica (frecce verdi). L'arteria epatica si trova adiacente al dotto linfatico mesenterico (contorno nero punteggiato) e perpendicolare alla vena cava inferiore. IVC: vena cava inferiore; L: fegato. (B) Isolamento dell'arteria epatica tramite pinze curve. (C) Inserimento riuscito (frecce viola) della cannula in polivinile da 0,61 mm × 0,28 mm (frecce arancioni) nell'arteria epatica (frecce verdi), fissata con suture di seta 4-0 per il prelievo terminale di sangue arterioso. Il dotto linfatico mesenterico (contorno nero tratteggiato) può essere visualizzato. PV: vena porta. (D) Dopo che la cannula è stata fissata, la sua pervigenza viene confermata facendo prelevare sangue nella cannula. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Identificazione della vena porta e campionamento terminale. (A) La vena porta (indicata dall'ago 25G) si trova tra l'arteria epatica (contorno bianco tratteggiato) e il dotto biliare (contorno nero tratteggiato). La vena porta appare più grande e più scura dell'arteria epatica ed è accessibile sotto anestesia profonda per la raccolta di sangue terminale. PV: vena portale; IVC: vena cava inferiore; A sinistra: fegato; SI: intestino tenue; RK: rene destro. (B) Inserimento riuscito dell'ago da 25G nella vena porta (contorno nero tratteggiato) per il campionamento terminale venoso del sangue. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

L'approccio chirurgico descritto nella sezione Protocollo consente un'identificazione chiara del dotto linfatico epatico, situato medialmente al rene destro e parallelo alle arterie celiaca ed epatica, come già^{riportato 4}. Anatomia rappresentativa e cannulazione sono mostrate nella Figura 5. La canulazione riuscita è confermata dall'immediata comparsa di liquido linfatico trasparente a leggermente torbido, privo di contaminazione da chilomicroni lattiginosi, suggerendo una minima miscelazione con la linfa mesenterica. Questa osservazione è coerente con le caratteristiche riportate della linfa^{epatica 3}. L'identificazione della linfa epatica si basava sulla sua posizione anatomica rispetto all'arteria epatica e alla vena cava inferiore, nonché sul suo aspetto caratteristico e chiaro, in contrasto con l'aspetto tipicamente opaco o latteoso della linfa mesenterica.

Il flusso linfatico epatico dovrebbe rimanere stabile per tutto il periodo di raccolta, con una velocità media di circa 0,1 mL/^{h 3,4,11}. Il flusso linfatico epatico rimane tipicamente più stabile per circa 2–3 ore dopo la canulazione in condizioni anestesiate, anche se periodi di raccolta più lunghi (fino a ~6–8 ore) possono essere realizzabili in condizioni sperimentali ottimali. I valori rappresentativi del flusso linfatico riportati negli studi^{precedenti 4} sono riassunti nella Tabella 1. Il flusso linfatico epatico è generalmente inferiore a quello riportato per i flussi dei dotti linfatici mesenterici e toracici nei ratti anestesiati.

Siti linfatici (stato di coscienza)	Portata linfatica media (mL/h)
Linfa toracica (cosciente)	1,74 ± 0,33
Linfa toracica (anestetizzata)	0,65 ± 0,10
Linfofa mesenterica (anestetizzata)	0,45 ± 0,11
Linfa epatica (anestetizzata)	0,12 ± 0,02

Tabella 1: Velocità medie di flusso linfatico (mL/h) attraverso canulazioni toraciche, mesenteriche ed epatiche nei ratti coscienti e anestetizzati. I dati sono presentati come media ± SEM per n = 3–5 ratti. Adattato dalla Tabella 3 in Yadav et al. (2018)⁴.

Gli esiti rappresentativi che illustrano il trasporto linfatico delle macromolecole sono mostrati nella Figura 8. Questi esempi dimostrano come il modello possa essere utilizzato per valutare il recupero linfatico dopo la somministrazione endovenosa di macromolecole terapeutiche, tra cui circa 60 kDa interferone pegilato α2a (IFN-PEG40), circa 31 kDa interferone pegilato α2b (IFN-PEG12) e l'anticorpo monoclonale trastuzumab, suggerendo che il fegato sia un importante sito di estravasazione e accesso linfatico per terapie^{macromolecolari 4}.

Figura 8: Recupero linfatico di terapie macromolecolari somministrate per via endovenosa in linfa toracica, mesenterica ed epatica. La percentuale totale di dose recuperata nella linfa toracica, mesenterica ed epatica dopo la somministrazione endovenosa di interferoni PEGylati di diverse dimensioni molecolari (IFN-PEG12 e IFN-PEG40) e di un anticorpo monoclonale (trastuzumab). I dati rappresentano la media ± SEM del recupero della dose in 8 ore. Adattato da Yadav et al. (2018)⁴. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il modello consente inoltre una profilazione dettagliata delle lipoproteine della linfa^{epatica 3}. Analisi rappresentative della composizione dei lipidi linfatici sono mostrate nella Figura 9. Rispetto alla linfa toracica e mesenterica, la linfa epatica presenta un contenuto lipidico totale marcatamente inferiore ma concentrazioni proteiche comparabili a quelle di altre fonti linfatiche. L'analisi delle lipoproteine della linfa epatica evidenzia il ruolo unico del fegato nel traffico lipidico e nel trasporto inverso del colesterolo. I dati rappresentativi sulla composizione lipidica sono riassunti nella Tabella 2. La linfa epatica HDL è arricchita di esteri colesterilici, la linfa mesenterica HDL è prevalentemente ricca di trigliceridi e la linfa toracica HDL contiene un contenuto relativamente più alto di fosfolipidi. Queste differenze composizionali indicano ruoli distinti di ciascuna fonte linfatica nel metabolismo e nel trasporto lipidico.

	%wt/wt
Frazioni	Fosfolipidi	Colesterolo libero	Estere colesterilico	Trigliceridi
Linfa mesenterica
D-HDL	20 ± 3	1 ± 0	5 ± 1	16 ± 1
L-HDL	21 ± 4	2 ± 0	8 ± 2	23 ± 5
Linfa epatica
D-HDL	24 ± 1	3 ± 0	12 ± 3	8 ± 1
L-HDL	23 ± 1	6 ± 1	13 ± 2	14 ± 2
Linfa toracica
D-HDL	25 ± 1	1 ± 0	7 ± 0	11 ± 3
L-HDL	29 ± 1	2 ± 0	11 ± 1	11 ± 0
Plasma
D-HDL	29 ± 2	2 ± 0	20 ± 3	2 ± 0
L-HDL	36 ± 6	2 ± 0	18 ± 3	4 ± 1

Tabella 2: Composizione lipidica delle frazioni di lipoproteine ad alta densità (D-HDL) e leggere (L-HDL) isolate dalla linfa mesenterica, epatica e toracica, e dal plasma. I valori rappresentano la percentuale in peso (% peso/peso) di fosfolipidi, colesterolo libero, estere colesterilico e trigliceridi rispetto alla frazione lipidica totale. I dati sono presentati come media ± SEM. Adattato dalla Tabella 1 in Gracia et al. (2020)³.

Figura 9: Composizione proteica e lipidica della linfa mesenterica, epatica e toracica. Contenuto proporzionale di proteine e lipidi totali nella linfa mesenterica, epatica e toracica. Il contenuto lipidico include fosfolipidi (PL), trigliceridi (TG), esteri colesterilici (CE) e colesterolo libero (FC), espressi come percentuale di peso lipidico rispetto al peso totale di proteine e lipidi. I dati sono presentati come media ± SEM. Adattato da Gracia et al. (2020)³. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

La canulazione dei dotti linfatici epatici è una procedura tecnicamente difficile, anche per i microchirurghi esperti. Diversi passaggi critici possono aumentare la probabilità di preservare l'integrità dei dotti linfatici e di raggiungere un flusso linfatico stabile. Quando si identifica e si isola il dotto linfatico epatico (passaggi del protocollo 5.7-5.10), il primo passo consiste nel rimuovere il tessuto connettivo e il grasso che si trovano sopra il dotto linfatico mesenterico e la vena cava vicino al dotto linfatico epatico. Il dotto linfatico epatico è traslucido e fragile rispetto al dotto linfatico mesenterico più spesso e opaco e può essere facilmente rotto se maneggiato direttamente. Il dotto linfatico mesenterico funge da utile punto di riferimento anatomico, poiché la pulizia del tessuto sovrastante rivela il dotto linfatico epatico situato superiormente. Poiché il dotto linfatico epatico presenta spesso pieghe o curvatura, l'operatore dovrebbe selezionare un punto di cannulazione lungo un segmento retto e orientare la cannula parallelamente al corso naturale del dotto per minimizzare il rischio di occlusione o lacerazione (step 5.11-5.14).

La canulazione stessa è il fattore più critico per il successo. Dopo aver perforato il condotto (passo 5.13), l'accesso intraluminale può essere confermato visivamente inserendo la punta della pinza nell'apertura e assicurandosi che una sola parete del recipiente sovrappone lo strumento. La presenza di due muri opposti indica una foratura attraversante. Una volta confermato l'accesso intraluminale, la cannula può essere avanzata in modo fluido lungo il condotto con lo stesso angolo. Bisogna prestare attenzione a evitare danni alla vascolarizzazione adiacente, poiché l'esanguinamento nel campo può introdurre sangue nella cannula della raccolta linfatica, contaminando il campione e aumentando notevolmente il rischio di formazione di coaguli. Dopo aver stabilito il flusso linfatico (passo 5.15), l'estremità raccoglitrice della cannula deve essere tappata e l'adesivo veterinario deve essere applicato con attenzione per impedirne l'ingresso nel lume. La cannula deve anche essere controllata per eventuali bolle d'aria, poiché l'aria intrappolata aumenta la contropressione e può ostacolare il flusso linfatico. Poiché la linfa epatica si genera sotto bassa pressione di propulsione, l'estremità raccoglitrice della cannula dovrebbe sempre essere posizionata sotto il livello del sito chirurgico per facilitare il drenaggio per gravità.

La canulazione epatica dei dotti linfatici è indicata dall'immediato inizio del flusso linfatico. Una volta stabilita, la linfa epatica scorre tipicamente a circa 0,1 mL/h, con un output stabile per diverse ore. La portata può variare a seconda dell'anatomia, della fisiologia e delle condizioni sperimentali dell'animale. Ad esempio, la linfa è stata raccolta sotto anestesia isoflurana in questo protocollo. L'anestesia isoflurana può influenzare parametri fisiologici rilevanti per la funzione linfatica, e condizioni sperimentali che coinvolgono l'anestesia dovrebbero quindi essere considerate nell'interpretazione dei tassi di formazione^{linfatica 16}. La canulazione dei dotti linfatici epatici richiede laparotomia e delicata manipolazione microchirurgica dei vasi linfatici addominali, e pertanto la raccolta linfa da ratti coscienti non è fattibile in questo modello. Studi precedenti che hanno confrontato il trasporto linfatico in condizioni anestesiate e coscienti o utilizzando diversi regimi anestetici hanno dimostrato che l'anestesia può influenzare modestamente i tassi di flusso linfatico assoluto ma non altera sostanzialmente i modelli complessivi di trasporto^{linfatico 4}. Pertanto, i valori del flusso linfatico ottenuti in questo modello devono essere interpretati nel contesto di condizioni sperimentali anestetizzate.

Una riduzione graduale o una cessazione del flusso durante la raccolta è più spesso causata dalla formazione di coaguli all'interno della cannula, derivante da contaminazione del sangue o deposizione di fibrina. Il flusso può talvolta essere ripristinato localizzando e pizzicando delicatamente la cannula con pinze sottili per frammentare meccanicamente il coagulo, oppure aspirando delicatamente attraverso l'estremità raccolta della cannula per spostare l'ostruzione. Se l'ostruzione è confinata alla parte esterna, la cannula può essere tagliata prossimamente al coagulo e ricollegata a un tubo nuovo usando un connettore sterile in silicone. Se il coagulo si forma nel sito della canulazione, di solito è necessaria una nuova cannulazione. In tali casi, si può tentare con grande attenzione la rimozione dell'adesivo per evitare la rottura del dotto o dei vasi sanguigni adiacenti. L'emostasi deve essere raggiunta prima di tentare nuovamente la canulazione, poiché anche una lieve perdita di sangue nella cannula favorisce notevolmente la coagulazione del sistema linfatico a bassa pressione.

Anche i fattori fisiologici influenzano il flusso e la pervalenza linfatica. Il flusso linfatico epatico nei ratti è intrinsecamente più lento rispetto al flusso mesenterico o toracico, anche in condizioni basali^17,18. Inoltre, l'anestesia generale può ridurre il flusso linfatico in altri circuiti linfatici rispetto ai ratti coscienti e liberi¹⁹. Poiché la canulazione linfatica epatica richiede anestesia e laparotomia, questi fattori probabilmente contribuiscono ai flussi relativamente bassi e alla maggiore tendenza a coagulare osservati durante raccolte prolungate. Mantenere l'idratazione attraverso la vena giugulare o la cannula gastrointestinale durante la raccolta aiuta a stabilizzare il flusso linfatico e a ridurre la formazione di coaguli. In questo modello, il flusso linfatico epatico stabile è tipicamente raggiungibile per 2–3 ore, dopo le quali il flusso può deteriorarsi e la coagulazione è più probabile. Tuttavia, in condizioni sperimentali ottimali, la raccolta linfa può essere mantenuta per periodi più lunghi, con una durata massima fino a ~8 ore^{segnalata 4}.

L'inclusione del campionamento di arterie epatiche e vena porta (Figura 6 e Figura 7) amplia l'applicabilità del modello permettendo un confronto diretto tra afflusso epatico, efflusso linfatico e circolazione sistemica. Questo passaggio terminale consente la valutazione simultanea del trasporto microvascolare epatico e della clearance interstiziale all'interno di un singolo animale. Tali confronti forniscono preziose informazioni sulla distribuzione dei soluti tra i compartimenti vascolare e linfatico epatico, in particolare per macromolecole di grandi dimensioni o composti lipofili che dipendono dalla diffusione interstiziale.

Nonostante queste sfide, il modello della canulazione linfatica epatica rimane una tecnica preziosa e informativa. Il fegato contribuisce con una quota significativa del flusso linfatico totale del corpo, mentre la linfa epatica contiene proteine e altri componenti che provengono dal liquido interstiziale epatico. Campionando la linfa che drena direttamente dal fegato, questo modello consente di analizzare molecole e cellule che escono dal fegato prima di essere diluite dalla linfa mesenterica e sistemica nel dotto toracico. L'analisi biochimica della linfa epatica fornisce informazioni sul metabolismo interstiziale epatico e sui processi di trasporto^{lipidici 12,20}. Questo integra le informazioni ottenute dal sangue porta o sistemico, che integra gli effetti del metabolismo epatico e dello scambio extraepatico. È importante sottolineare che questa configurazione, che combina canulazioni linfatica epatica, arterie carotide e venosa giugulare, consente una valutazione dinamica dei gradienti di soluti tra efflusso epatico e flusso vascolare, offrendo una visione più completa del trasporto e della liberazione epatica.

Studi precedenti che utilizzano questo modello dimostrano che il campionamento della linfa epatica consente la valutazione del recupero linfatico delle terapie macromolecolari e il confronto del trasporto di soluti tra linfa epatica e circolazione sistemica. Insieme, la canulazione linfatica epatica, il campionamento vascolare concomitante e il profiling biochimico forniscono una solida piattaforma sperimentale per lo studio delle dinamiche microvascolari e interstiziali epatiche. Il modello consente la valutazione simultanea del trasporto epatico, del metabolismo, dell'elaborazione lipidica e della segnalazione immunitaria, e può essere adattato per indagare cambiamenti in condizioni fisiopatologiche come MASLD o infiammazione epatica.

In conclusione, questo modello chirurgico raffinato, che integra accesso linfatico epatico, arterioso epatico e venoso portale, offre un approccio completo e riproducibile per esaminare le vie di trasporto epatiche. Permette il confronto diretto tra afflusso vascolare, efflusso interstiziale e drenaggio linfatico, supportando studi che forniscono una comprensione meccanicistica del trasporto specifico del fegato, del metabolismo e dei processi farmacocinetici. Inoltre, la possibilità di campionare la linfa epatica offre un'opportunità unica per studiare il traffico di cellule immunitarie e antigeni provenienti dal fegato, offrendo preziose informazioni sulla sorveglianza immunitaria epatica, l'infiammazione e i meccanismi di tolleranza.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anticoagulant solution (EDTA 0.1%)	Invitrogen	AM9261	Previene la formazione di coaguli nelle cannula e nei campioni raccolti
Anticoagulant solution (Heparin 20 IU/mL)	Pfizer	00409-2723-01	Previene la formazione di coaguli nelle cannula e nei campioni raccolti
Chlorhexidine (0.5%)	McFarlane Medical	12120-OR	Usato per la disinfezione del sito chirurgico
Collection tubes (microcentrifuge)	Greiner Bio-One	616201	Usato per la raccolta di linfa e sangue
Cotton gauze	Winc Australia	18874125	Usato per la manipolazione degli organi e il mantenimento dell'umidità
Cotton swabs	Pacific Laboratory	1005199	Usato per il riposizionamento degli organi durante la chirurgia
Curved iris forceps	Macquarie Medical Systems	TTP5002-5	Usato per l'isolamento dei vasi e la manipolazione dei tessuti
Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-35	Usato per aprire e stabilizzare il lume del vaso dell'arteria epatica per l'inserimento della cannula
Ethanol (70%)	Ajax	AJA214-2.5PL	Usato per la disinfezione del sito chirurgico
Halsted-Mosquito hemostat forceps	Fine Science Tools	13009-12	Usato per piegare l'ago 25G per la puntura del dotto linfatico epatico
Heated surgical pad (37 °C)	Ratek	IC-WT1	Mantiene la temperatura corporea durante la chirurgia
Induction chamber	Darvall	1859	Usato per l'induzione iniziale dell'anestesia
Infusion pump	Adelab Scientific	NE-300	Fornisce infusione controllata di soluzione salina tramite cannula
Iris scissors	Stark Medical	E-AC985-11	Usato per incisioni della pelle e dei muscoli
Isoflurane	Provet Pty Ltd	ISOF07	Anestetico inalatorio usato per l'induzione e il mantenimento dell'anestesia
Kelman-McPherson lens forceps	ProSciTech	TY-1301	Usato per aprire e stabilizzare il lume del vaso della vena giugulare e dell'arteria carotidea per l'inserimento della cannula
Needle (23G × 1")	Livingstone	DN23GX1.0LV	Usato per la puntura della vena porta e il prelievo di sangue
Needle (25G × 1")	Livingstone	DN25GX1.0LV	Usato per il lavaggio della cannula e la puntura del dotto linfatico epatico
Nose cone anesthesia system	Darvall	7885	Mantiene l'anestesia durante la chirurgia
Oxygen supply with flowmeter	BOC	400NE	Gas vettore per l'anestesia con isoflurano
Polyethylene cannula (0.8 mm O.D., 0.5 mm I.D.)	Microtube Extrusions	PE8050	Usato per la cannulazione dell'arteria carotidea, della vena giugulare e del dotto linfatico epatico
Polyvinyl cannula (0.61 mm O.D., 0.28 mm I.D.)	Microtube Extrusions	PIV6128	Usato per la cannulazione dell'arteria epatica
Silk sutures (4-0)	SMI AG	SM8015	Usato per fissare i vasi e le cannula
Sodium pentobarbitone	Lyppard Australia Pty Ltd	LETH250	Usato per l'eutanastia (>100 mg/kg)
Sterile saline (0.9% NaCl)	FreeFlex	K690531	Usato per la reidratazione e il lavaggio
Straight Graefe forceps	Fine Science Tools	11150-10	Usato per l'isolamento delicato dei vasi
Surgical microscope	Zeiss	Stemi 2000-CS	Usato per la visualizzazione durante la cannulazione del dotto linfatico epatico
Surgical sterile blades (for scalpel use)	Livingstone	SBLDCL15	Usato per smussare le punte delle cannula durante la preparazione
Syringe (1 mL)	Terumo	19032-TE	Usato per il lavaggio delle cannula
Syringe (3 mL)	Terumo	19048-TE	Usato per il prelievo di sangue
Syringe (30 mL)	Terumo	19034-TE	Usato per l'infusione di soluzione salina
Vannas scissors	Fine Science Tools	91500-09	Usato per incisioni vascolari
Veterinary tissue adhesive	3M	1469SB	Usato per fissare la cannula del dotto linfatico epatico