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Articolo di ricerca
Questo studio ha confermato l'effetto terapeutico della Decoction di Shengxian Quyu sull'insufficienza cardiaca attraverso esperimenti su animali. Cromatografia liquida a ultra-performance, spettrometria di massa e analisi di farmacologia a rete hanno identificato potenziali bersagli e meccanismi terapeutici.
La decoczione di Shengxian Quyu (SXQY) è stata suggerita come una potenziale strategia terapeutica per l'insufficienza cardiaca (IC), ma i suoi meccanismi terapeutici rimangono poco chiari. Questo studio ha indagato gli effetti terapeutici e i meccanismi sottostanti della SXQY nell'IC. Un modello di HF su ratto è stato indotto da costrizione aortica trasversa (TAC) e trattato con SXQY. La funzione cardiaca è stata valutata tramite ecocardiografia transtoracica, e la struttura miocardica e la fibrosi sono state valutate utilizzando ematossilina ed eosina e la colorazione tricroma di Masson. I campioni di siero sono stati analizzati tramite metabolomica non mirata utilizzando cromatografia liquida ultra-performante–spettrometria di massa tandem. I componenti che entrano nel sangue sono stati mappati ai bersagli, e i bersagli intersecanti correlati all'HF sono stati analizzati tramite analisi di rete di interazione proteina-proteina (PPI), seguiti da analisi Gene Ontology e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). SXQY migliorò significativamente la funzione cardiaca nei ratti TAC, come dimostrato dalla diminuzione del diametro interno del ventricolo sinistro nella diastole e dello spessore della parete posteriore del ventricolo sinistro nella diastole e dall'aumento della frazione di eiezione del ventricolo sinistro, alleviando anche l'ipertrofia miocardica, l'infiammazione e la fibrosi. Sono stati identificati in totale 563 composti di ingresso nel sangue (367 prototipi e 196 metaboliti), con 5 composti attivi chiave identificati nel database dei Sistemi di Farmacologia della Medicina Tradizionale Cinese corrispondenti a 63 bersagli. L'analisi della rete ha rivelato 44 geni sovrapposti, con Formononetina, Timosaponina BII e Sinensetina come componenti centrali, e PTGS2, PPARG e HSP90AA1 come obiettivi centrali. L'analisi PPI ha inoltre identificato geni chiave tra cui ESR1, PTGS2, PPARG, HSP90AA1, JUN e altri 15 geni. L'analisi KEGG ha indicato che SXQY agisce principalmente tramite Ca2+, fosfatidilinositolo 3-chinasi chinasi B, adenosina monofosfato ciclico e vie correlate all'infiammazione e agli ormoni. In conclusione, SXQY esercita effetti protettivi contro l'IC migliorando la funzione cardiaca e attenuando il rimodellamento miocardico attraverso meccanismi multicomponenti, multibersaglio e multipercorso.
L'insufficienza cardiaca (IC) è una sindrome clinica caratterizzata da un compromesso otturamento ventricolare e capacità di eiezione dovuto ad anomalie strutturali o funzionali cardiache, che dà origine a una costellazione di segni e sintomiclinici 1. Essendo lo stadio terminale di varie malattie cardiache, l'IC compromette significativamente la qualità della vita dei pazienti e provoca un'elevata mortalità e frequenti ricoveri ospedalieri, imponendo così un notevole carico di malattia sia alle famiglie che allasocietà 2,3. Nella gestione clinica, la farmacoterapia per l'IC costituisce la base e la pietra angolare del trattamento, comprendendo principalmente classi chiave di farmaci come diuretici, inibitori del sistema renina-angiotensina, beta-bloccanti, antagonisti dei recettori mineralocorticoidi e inibitori del cotrasportatore sodio-glucosio2 3,4,5,6 . Sebbene questi farmaci abbiano parzialmente migliorato la prognosi dei pazienti con IC, ciascuno di essi presenta alcune limitazioni ed effetti avversi, come disturbi elettrolitici, bradicardia e infezioni delle vieurinarie. Pertanto, le terapie farmacologiche per l'IC richiedono ancora ulteriori indagini.
La Medicina Tradizionale Cinese (MTC) ha accumulato una vasta esperienza clinica nella gestione a lungo termine dell'IC. Con l'accento sulla regolazione olistica e sull'intervento multitarget, offre un approccio distintivo altrattamento 8. Negli ultimi anni, numerosi studi controllati randomizzati (RCT) hanno dimostrato l'efficacia terapeutica delle formule erboristiche cinesi per HF 9,10,11,12,13,14,15. Il decocto Shengxian Quyu (SXQY) ha già iniziato a sottoporsi a rigorosi RCT per confermarne l'efficacia terapeutica, ma i suoi meccanismi terapeutici specifici richiedono ancora un'indagine più approfonditae approfondita 16. La farmacologia di rete, come disciplina emergente che integra biologia dei sistemi, polifarmacologia e analisi computazionale, offre uno strumento potente per chiarire i meccanismi olistici d'azione delle formule erboristichecinesi 17,18,19. Pertanto, questo studio utilizza una strategia integrata che combina metabolomica non mirata e farmacologia di rete per identificare i componenti assorbiti nel sangue di SXQY e chiarire i suoi potenziali meccanismi terapeutici. Questo lavoro mira a fornire una base per l'applicazione clinica successiva di SXQY.
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Tutte le procedure sperimentali sono state esaminate e approvate dal Comitato per l'Etica e il Benessere Animale dell'Ospedale dell'Amicizia Cina–Giappone (approvazione n. zryhyy21-23-01-09) e sono state condotte in conformità con i principi di sostituzione, riduzione e perfezionamento per minimizzare l'uso e la sofferenza degli animali. I ricercatori che effettuavano l'acquisizione e l'analisi dei dati (incluse misurazioni ecocardiografiche e valutazione istologica) erano ciechi rispetto all'allocazione dei gruppi.
Preparazione del campione SXQY
SXQY è composto dai seguenti componenti erboristici: Astragalus membranaceus (Huangqi) (30 g), Codonopsis pilosula (Dangshen; 20 g), Cornus officinalis (Shanyurou; 15 g), Sparganium stoloniferum (Sanleng; 12 g), Curcuma zedoaria (Erzhu; 15 g), Cimicifuga heracleifolia (Shengma; 10 g), Bupleurum chinense (Chaihu; 10 g), Platycodon grandiflorus (Jiegeng; 10 g), Anemarrhena asphodeloides (Zhimu; 15 g) e Leonurus japonicus (Yimu; 15 g), con un peso totale di erba grezza di 152 g per prescrizione. Tutti i materiali erboristici venivano acquistati dal Dipartimento di Farmacia dell'Ospedale dell'Amicizia Cina–Giappone e autenticati da un farmacista capo secondo i metodi standard di identificazione farmacognostica. Clinicamente, SXQY viene somministrato a una dose di una prescrizione (152 g) al giorno. Assumendo un peso corporeo medio adulto di 70 kg, la dose corrispondente per l'uomo è di 2,17 g (erba grezza)/kg. Basandosi sulla normalizzazione della superficie corporea tra umani e ratti, la dose equivalente per ratti è stata calcolata a 13,67 g (erba grezza)/kg. Per la preparazione del decocto, una prescrizione di SXQY è stata ammollata in acqua distillata con un rapporto di 10 mL per grammo di erbe grezze (v/v, basato sul volume iniziale di solvente senza regolazione dopo l'ammollo) per 1 ora, seguita da bollitura con mantello riscaldante elettrico e mantenuta a 100°C sotto ebollizione continua per 1 ora. L'estratto veniva poi filtrato attraverso garze (poro di 200–300 μm). Il residuo è stato poi estratto altre due volte in condizioni identiche. I filtrati aggregati sono stati concentrati a pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante a 60°C fino a un volume finale di 111 mL, ottenendo una concentrazione di 1,37 g (farmaco grezzo)/mL. La decoction concentrata è stata nuovamente filtrata attraverso garze (poro da 200–300 μm) e conservata a 4°C e utilizzata entro 24–48 ore. Per la somministrazione, la soluzione veniva utilizzata direttamente e il volume di gvage veniva calcolato sulla base della concentrazione di 1,37 g/mL, risultando in un volume di somministrazione di circa 10 mL/kg per raggiungere la dose obiettivo di 13,67 g/kg.
Modello animale
Diciotto maschi di 8 settimane di ratti Sprague–Dawley (SD) sono stati alloggiati in un ambiente condizionato standard (23°C ± 2°C, 50 ± 5% di umidità relativa e un ciclo di 12 ore chiaro/buio) con libero accesso a cibo e acqua. Gli animali sono stati assegnati casualmente a tre gruppi (n = 6 per gruppo) utilizzando una tabella dei numeri casuali: un gruppo operato da simulazione (Sham), un gruppo di costrizione aortica trasversale (TAC) e un gruppo trattato con SXQY (SXQY). I ratti nei gruppi trattati con TAC e SXQY sono stati anestetizzati con inalazione di isoflurano (induzione 4%, mantenimento 2%) e posti in posizione supina su una borsa termica termostatica mantenuta a 37°C. L'anestesia adeguata è stata confermata dall'assenza di risposte riflesse al pizzicamento della zampa, insieme a una frequenza respiratoria stabile e all'assenza di movimento spontaneo. Una pomata oftalmica è stata applicata su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione corneale. Dopo l'intubazione endotracheale, gli animali sono stati collegati a un ventilatore per piccoli animali con un volume tidale di 4–6 mL per 200 g di peso corporeo, una frequenza respiratoria di 70 respiri al minuto e un rapporto ispiratorio/espiratorio di 1:1.
Tutte le procedure chirurgiche sono state eseguite in condizioni asettiche. Gli strumenti chirurgici sono stati sterilizzati tramite autoclaving e l'area operatoria è stata preparata radendo e disinfettando con povidone–iodio seguiti dal 70% di etanolo. Dopo la preparazione del sito chirurgico, è stata effettuata un'incisione cutanea toracica sinistra e i muscoli pettorali maggiori e minori sono stati smembrati in modo semplicemente per esporre le costole. È stata creata un'incisione orizzontale di circa 1,0 cm nel secondo o terzo spazio intercostale adiacente al bordo sternale sinistro. I vasi sanguigni e la fascia sono stati separati in modo brusco, e il timo è stato delicatamente ritirato per esporre completamente l'arco aortico.
L'arco aortico è stato sollevato con cura tra l'arteria innominata destra e l'arteria carotide comune sinistra usando pinze curve sterili, e sotto è stata passata una sutura di seta 2-0. Un ago curva con punta smussata e calibro 16 (diametro esterno 1,6 mm) veniva modificato manualmente smussando la punta e piegandola a una curvatura appropriata prima dell'uso, seguita da una sterilizzazione con autoclaviatura. L'ago curvo con punta smussa preparato veniva poi posizionato parallelo all'arco aortico, dopodiché la sutura veniva legata saldamente sia intorno all'aorta che all'ago. L'ago fu immediatamente rimosso per creare una costrizione standardizzata e il timo fu riposizionato. Dopo aver confermato l'assenza di sanguinamento attivo, la parete toracica e la pelle sono state chiuse a strati. Dopo l'intervento, la ventilazione meccanica è stata proseguita per circa 10 minuti fino al ripristino della respirazione spontanea, come indicato da una frequenza respiratoria stabile e regolare e dalla capacità di mantenere una respirazione spontanea senza supporto ventilatorio. A questo punto, il tubo endotracheale è stato rimosso. Gli animali operati da simulazione hanno subito le stesse procedure chirurgiche, tranne che l'arco aortico non è stato legato.
Dopo l'intervento, il sito dell'incisione è stato disinfettato e gli animali sono stati messi in gabbie di recupero pulite per ridurre il rischio di infezione. I ratti venivano poi rimandati alla struttura per animali per il recupero e l'alloggio di routine. L'analgesia è stata somministrata con buprenorfina (0,05 mg/kg, sottocutanea). I ratti sono stati osservati ogni 12 ore durante le prime 72 ore per segni di dolore, disagio o complicazioni chirurgiche, tra cui mobilità ridotta, piloerezione, postura anomala, respirazione difficile o deiscenza della ferita.
Tre giorni dopo l'intervento, i ratti del gruppo trattato con SXQY sono stati somministrati per via orale con 1 mL/100 g di peso corporeo del decocto SXQY per 9 settimane. Nel frattempo, i ratti nei gruppi a simulazione e TAC ricevevano un volume uguale (1 mL/100 g di peso corporeo) di acqua distillata tramite gavage.
Ecocardiografia transtoracica
Al termine del periodo di trattamento, in tutti i gruppi veniva eseguita l'ecocardiografia transtoracica. I ratti sono stati anestetizzati tramite inalazione di isoflurano e posizionati in posizione supina su una piattaforma di imaging dedicata. La parte anteriore del torace è stata accuratamente rasata e ricoperte con un generoso strato di gel per ultrasuoni. L'imaging a ultrasuoni è stato effettuato utilizzando un sistema ultrasonico ad alta risoluzione per piccoli animali dotato di un trasduttore ad alta frequenza (18–40 MHz) in modalità B e M. Il trasduttore era posizionato delicatamente sull'area coperta di gel, con una profondità impostata a 12,29 mm e un guadagno di 22 dB; La messa a fuoco è stata regolata per ottimizzare la qualità dell'immagine. Sono state acquisite immagini e loop video per analisi quantitative successive. Sono stati misurati il diametro interno del ventricolo sinistro della diastole terminale (LVIDd) e lo spessore della parete posteriore del ventricolo sinistro alla diastole terminale (LVPWd), mentre la frazione di eiezione del ventricolo sinistro (LVEF) è stata calcolata utilizzando la formula di Teichholz basata sulle misurazioni della modalità M. Per ogni parametro, le misurazioni sono state mediate su 3–5 cicli cardiaci consecutivi. Tutte le acquisizioni e analisi ecocardiografiche sono state eseguite da un operatore certificato con formazione formale in ecocardiografia, in conformità con i protocolli ecocardiografici standardizzati.
Raccolta e trattamento dei campioni
Dopo l'ecografia, i ratti sono stati anestetizzati con isoflurano. Gli animali venivano posti in posizione supina e la cavità toracica veniva aperta per esporre il cuore. I cuori venivano rapidamente estanciati, sciacquati in soluzione salina fredda tamponata con fosfato e sezionati lungo il piano sagittale. I tessuti cardiaci sono stati immediatamente fissati con paraformaldeide al 4% a 4°C per 24 ore, seguiti da disidratazione tramite una serie di etanolo gradato (70%, 80%, 90%, 95% e 100%) per 1 ora a ogni fase, durante la quale i tessuti sono diventati gradualmente traslucidi senza un restringimento evidente. I campioni venivano eliminati nello xilene, infiltrati con paraffina fusa a 60°C per 3 ore e lasciati solidificarsi a temperatura ambiente (RT; 20°C–25°C). I blocchi di tessuto cardiaco incorporati in paraffina sono stati tagliati e sezionati a uno spessore di 4–6 μm utilizzando un microtomo. Le sezioni venivano fatte galleggiare su un bagno d'acqua mantenuto a 45°C, montate su vetrini di vetro e asciugate durante la notte a 37°C–40°C. I vetrini venivano conservati presso RT in condizioni di bassa umidità e utilizzati entro 1 settimana per la colorazione istologica.
Colorazione con ematossilina ed eosina (HE)
Le sezioni immerse in paraffina sono state processate come segue. Le sezioni venivano prima deparaffinate per immersione nello xilene I, II e III per 5 minuti ciascuna, seguite da idratazione tramite una serie di etanolo anidro I e II e soluzioni di etanolo classificate (95%, 90%, 80%, 70% e 50%) per 5 minuti ciascuna, e infine sciacquate in acqua distillata, senza residui di cera visibili. Le sezioni sono state poi colorate con ematossilina Harris per 5 minuti e risciacquate sotto acqua corrente del rubinetto per 1–2 minuti. La differenziazione è stata effettuata in soluzione acido-alcolica per circa 1–2 secondi, con l'endpoint determinato tramite ispezione visiva quando lo sfondo appariva pallido mentre la colorazione nucleare rimaneva chiaramente definita. A questo seguì l'inverniscatura in acqua a 37°C–45°C e lo sciacquaggio con acqua distillata. Successivamente, le sezioni venivano controcolorate con eosina solubile in alcool per 40 secondi, lavate con acqua distillata, disidratate tramite etanolo gradato, ripulite nello xilene e infine montate con resina neutra.
Colorazione in massone
Le sezioni incorporate in paraffina sono state deparaffinate sequenzialmente in xilene I, II e III per 5 minuti ciascuna, seguite da idratazione tramite etanolo anidro I e II e soluzioni di etanolo classificate (95%, 90%, 80%, 70% e 50%) per 5 minuti ciascuna, e infine risciacquate in acqua distillata. Le sezioni sono state immerse allo 0,5% di acido acetico (preraffreddato a 4°C) per 1 secondo, seguite da una colorazione con la soluzione di fucsina di un kit commerciale di colorazione trichrome di Masson's per 10 minuti, seguita da differenziazione in acido fosfomolilobdico per 5 minuti e controcolorazione con blu anilina per 3 minuti. Tutti i reagenti erano componenti dello stesso kit commerciale e venivano utilizzati secondo le istruzioni del produttore. Dopo la colorazione, le sezioni venivano risciacquate tre volte in acido acetico pre-raffreddato a 4°C (circa 30 secondi per risciacquo), disidratate tramite etanolo classificato, ripulite nello xilene e montate con resina neutra.
Raccolta di campioni di siero per l'analisi metabolomica
Sei ratti SD maschi di 8 settimane sono stati ospitati nelle stesse condizioni di quelli dell'esperimento in vivo sopra citato. Gli animali sono stati assegnati casualmente a un gruppo trattato con SXQY e a un gruppo di controllo del veicolo (acqua distillata; n = 3 per gruppo) utilizzando un metodo di randomizzazione generata al computer. I ratti del gruppo SXQY sono stati somministrati per via orale a una dose di 1 mL/100 g di peso corporeo, mentre il gruppo di controllo del veicolo ha ricevuto un volume uguale di acqua distillata. Dopo sette giorni di garvaga giornaliera, l'ultima dose del settimo giorno è stata raddoppiata. Dopo l'ultima amministrazione, gli animali venivano digiunati per 12 ore. I ratti sono stati anestetizzati con isoflurano fino a quando la perdita del riflesso di ritiro del pedale non è stata confermata come indicatore di un'anestesia adeguata. I campioni di sangue sono stati prelevati dal plesso venoso retro-orbitale utilizzando tubi capillari sterili e immediatamente trasferiti in tubi microcentrifughe da 1,5 mL senza anticoagulanti. Il sangue intero veniva poi lasciato a RT per 1 ora e centrifugato a 1000 × g per 15 minuti a 4°C per ottenere il siero. Quando è apparsa una netta separazione tra lo strato siero superiore trasparente e il coagulo, il siero soprandanante è stato aspirato con cura e trasferito in tubi puliti per microcentrifuga. I campioni di siero venivano conservati a −80°C fino all'analisi dei componenti sanguigni che entravano.
Pretrattamento campione per l'analisi metabolomica
I campioni di siero venivano scongelati sul ghiaccio dopo la rimozione dalla stoccazione a −80°C e brevemente miscelati con vortici (10 s) per garantire l'omogeneità. Un aliquota di 100 μL di siero è stato trasferito in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL, seguito dall'aggiunta di 500 μL di solvente di estrazione (20% acetonitrile–metanolo contenente 2-cloro-L-fenilalanina come standard interno a una concentrazione finale di 1 μg/mL) per indurre la precipitazione proteica. La miscela è stata vortexata vigorosamente per 3 minuti e centrifugata a 12.000 × g per 10 minuti a 4°C. Una porzione di 470 μL del surnante risultante veniva trasferita in un nuovo tubo ed evaporata fino a diventare secca utilizzando un evaporatore di azoto sotto un flusso di azoto basso e controllato. Dopo la ricostituzione in 200 μL di metanolo-acqua al 70% e vortice per 1 minuto, i campioni sono stati centrifugati a 12.000 × g per 10 minuti a 4°C, e 180 μL del soprandanante chiarificato sono stati trasferiti in fiale autocampionatore per l'analisi cromatografia liquida–spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS).
Un aliquota di 200 μL di campione SXQY è stato poi trasferito in un tubo centrifuga pre-etichettato da 1,5 mL. La soluzione standard interna di estrazione veniva aggiunta a ciascun campione con un rapporto di volume di 1:1 (v/v). La miscela è stata miscelata in vortice per 15 minuti e centrifugata a 12.000 × g per 3 minuti a 4°C. Il surnatante risultante veniva accuratamente raccolto e filtrato attraverso una membrana microporosa di 0,22 μm, ottenendo un filtrato trasparente senza particelle visibili. Il filtrato è stato trasferito in fiale autocampionatore e conservato a 4°C prima dell'analisi a ultra-prestazioni LC-MS/MS (UPLC–MS/MS).
Preparazione di soluzioni standard interne
La soluzione standard interna (2-cloro-L-fenilalanina) è stata preparata sciogliendo 1 mg dello standard di riferimento in 1 mL di metanolo-acqua al 70% (v/v), ottenendo una concentrazione di 1.000 μg/mL. Questa soluzione standard veniva ulteriormente diluita con lo stesso solvente per ottenere una soluzione standard interna funzionante con una concentrazione finale di 1 ppm, che veniva preparata frescamente, conservata a 4°C e utilizzata entro 48–72 ore.
Condizioni UPLC–MS/MS
La separazione cromatografica veniva eseguita utilizzando un sistema UPLC accoppiato a uno spettrometro di massa tandem. La separazione è stata ottenuta su una colonna C18 mantenuta a 40°C, con una portata di 0,35 mL/min e un volume di iniezione di 4 μL. La fase mobile era composta da acqua ultrapura contenente acido formico (A) allo 0,1% (v/v) e acetonitrile contenente acido formico (B) allo 0,1% (v/v). L'eluzione gradiente è stata applicata come segue: 5% B a 0,0 min; aumentato linearmente al 25% B a 2,0 min, 35% B a 3,0 min, 60% B a 5,0 min e 99% B a 6,0 min; è rimasto al 99% B per 1,5 minuti; è tornato al 5% B a 7,6 min; e si è equilibrata al 5% B fino a 10,0 min.
La rilevazione della spettrometria di massa veniva effettuata utilizzando uno spettrometro di massa ad alta risoluzione dotato di una sorgente di ionizzazione elettrospray che operava in modalità ionica positiva e negativa. Le tensioni di spruzzatura erano impostate a 3500 V in modalità positiva e 3200 V in modalità negativa. Il gas di guaina e il gas ausiliario erano impostati rispettivamente a 30 e 5 unità arbitrarie (definite dallo strumento). La temperatura del tubo di trasferimento ionico e quella del vaporizzatore sono state mantenute rispettivamente a 320°C e 300°C. Le scansioni MS complete sono state acquisite su un intervallo m/z di 84–1250 con una risoluzione di 35.000 con un obiettivo di controllo automatico del guadagno (AGC) di 1,0 × 106, seguite dall'acquisizione MS/MS dipendente dai dati (top 10) con una risoluzione di 17.500 con un target AGC di 2,0 × 105 e una finestra di isolamento di 1,0–1,5 m/z. Venivano applicate energie di collisione normalizzate a gradini di 30, 40 e 50. I 10 ioni precursori più intensi sono stati selezionati per la frammentazione con una durata di esclusione dinamica di 3 s.
Elaborazione dei dati grezzi
I dati grezzi della spettrometria di massa venivano convertiti in formato mzML utilizzando ProteoWizard. Per garantire l'affidabilità analitica, sono stati preparati campioni di controllo qualità (QC) aggregati miscelando volumi uguali di tutti i campioni siero. I campioni di QC sono stati iniettati a intervalli regolari (un'iniezione QC ogni 5–10 campioni analitici) durante l'analisi UPLC–MS/MS per monitorare la stabilità dello strumento, la coerenza dei tempi di ritenzione e la riproducibilità del segnale. La riproducibilità è stata valutata sulla base della deviazione standard relativa delle intensità di picco nei campioni di QC.
Il rilevamento dei picchi, la correzione dei tempi di ritenzione e l'allineamento dei picchi venivano eseguiti utilizzando il pacchetto XCMS. Le caratteristiche con un tasso di assenze superiore al 50% all'interno di qualsiasi gruppo sono state escluse da ulteriori analisi. La correzione della deriva del segnale è stata successivamente applicata alle aree di picco utilizzando un metodo di normalizzazione basato su regressione vettoriale di supporto (SVR) implementato nel software statistico R, utilizzando modellazione basata su QC per correggere la deriva del segnale durante la corsa analitica.
L'identificazione dei metaboliti è stata effettuata confrontando le caratteristiche corrette con una libreria standard di riferimento interna (contenente circa 5.000 composti con dati spettrali sia MS1 che MS2; proprietari e non pubblici), oltre a database spettrali pubblici tra cui Human Metabolome Database (HMDB), Metabolite and Tandem Mass Spectrometry Database (METLIN), MassBank e Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS). basata su un corrispondenza di massa accurata, allineamento temporale di ritenzione e somiglianza spettrale MS/MS. L'abbinamento di massa è stato eseguito utilizzando una tolleranza di ±25 ppm per ioni precursori (MS1) e frammenti (MS2), con una tolleranza di tempo di ritenzione di ±6 s. Per la ricerca in libreria, è stata applicata una tolleranza di ±25 ppm agli ioni precursori (Q1) e ±50 ppm ai frammenti MS/MS, con un punteggio minimo di corrispondenza MS/MS di 0,3. Solo i metaboliti con un punteggio di identificazione comprensivo superiore a 0,5 sono stati trattenuti per l'identificazione non mirata. Il punteggio finale è stato calcolato come una somma ponderata di punteggi corrispondenti a frammenti (0,1), avanti (0,3) e inversi (0,6). I dati acquisiti in modalità ionizzazione positiva e negativa sono stati fusi a livello di composto. Per le annotazioni duplicate, veniva selezionata la voce con la maggiore fiducia nell'identificazione e il punteggio più alto. Le annotazioni finali venivano compilate in un file di annotazione dei metaboliti.
Criteri per l'identificazione dei composti assorbiti
I componenti assorbiti del prototipo sono stati definiti come composti rilevati nell'estratto SXQY e nel gruppo trattato con SXQY, con tempi di ritenzione corrispondenti entro una tolleranza di ±0,1 min. Inoltre, questi composti dovevano mostrare un'area di picco nel gruppo trattato con SXQY almeno il doppio rispetto a quella del gruppo di controllo del veicolo o essere assente dai campioni di controllo del veicolo.
I metaboliti assorbiti sono stati identificati utilizzando un diverso insieme di criteri. Questi composti non sono stati rilevati nell'estratto SXQY ma erano presenti nel gruppo trattato con SXQY. Le loro caratteristiche di spettrometria di massa dovevano essere coerenti con trasformazioni metaboliche caratteristiche, inclusa l'idrossilazione (Δm/z = +15,9949 Da) e la demetilazione (Δm/z = −14,0157 Da). Inoltre, l'area di picco nel gruppo trattato con SXQY doveva essere almeno il doppio superiore rispetto a quella del gruppo di controllo del veicolo, basandosi sulle aree di picco normalizzate dopo la correzione della deriva del segnale, altrimenti il segnale corrispondente doveva essere non rilevabile nei campioni di controllo del veicolo.
Recupero di geni assorbiti relativi ai composti
I componenti che entrano nel sangue sono stati esaminati nel Database e Piattaforma di Analisi dei Sistemi di Farmacologia della Medicina Tradizionale Cinese (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.ph; consultato nel gennaio 2026). I composti documentati nel TCMSP sono stati selezionati come candidati bioattivi basandosi su soglie farmacocinetiche stabilite di biodisponibilità orale ≥ 30% e somiglianza farmacologica ≥ 0,1821. I presunti bersagli corrispondenti ai composti ritenuti furono successivamente recuperati e tutti gli identificatori del bersaglio furono standardizzati come simboli genici ufficiali utilizzando il databaseUniProt 22.
Recupero di bersagli correlati a malattie e geni di intersezione
I geni correlati all'HF sono stati raccolti dal database GeneCards (https://www.genecards.org/; consultato nel gennaio 2026) utilizzando "insufficienza cardiaca" come termine di ricerca, e sono stati selezionati geni con punteggio di rilevanza ≥ 10 per ulteriori analisi. I bersagli correlati all'HF sono stati successivamente intersecati con obiettivi associati al composto identificati dal TCMSP utilizzando la piattaforma Weishengxin (https://www.bioinformatics.com.cn; consultato nel gennaio 2026). I geni sovrapposti sono stati definiti come bersagli di intersezione e sono stati utilizzati per la successiva costruzione di reti di interazione proteina-proteina (PPI) e analisi di arricchimento funzionale.
Costruzione della rete e analisi dell'arricchimento funzionale
L'analisi PPI dei bersagli identificati è stata effettuata utilizzando il database STRING (http://cn.string-db.org/; consultato nel gennaio 2026)23 con la specie impostata su Homo sapiens e una soglia di punteggio di confidenza di ≥0,7. I dati di interazione sono stati importati nello strumento di visualizzazione Cytoscape per la visualizzazione della rete. L'analisi topologica è stata effettuata utilizzando il plugin NetworkAnalyzer nello strumento di visualizzazione, e i geni hub sono stati identificati utilizzando il pluginCytoHubba 24,25. L'analisi di arricchimento dell'Ontologia Genica (GO) è stata effettuata sui target di intersezione, inclusi i processi biologici (BP), componenti cellulari (CC) e funzioni molecolari (MF). I termini GO con valore P < 0,05 sono stati considerati significativi e i primi 10 termini arricchiti di ciascuna categoria sono stati selezionati perla visualizzazione 26. I target di intersezione sono stati ulteriormente sottoposti all'analisi di arricchimento dei percorsi della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) utilizzando il pacchetto clusterProfiler nel software statistico. I percorsi con un valore P < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi e i primi 20 percorsi arricchiti sono stati selezionati per la visualizzazione. Questi percorsi sono stati successivamente utilizzati per costruire una rete di interazione bersaglio–percorso 27.
Analisi statistica
I dati sono presentati come media ± SD. La normalità della distribuzione dei dati è stata valutata utilizzando il test di Shapiro–Wilk, e l'omogeneità della varianza è stata analizzata utilizzando il test di Levene o il test di Brown-Forsythe prima dell'analisi. I confronti statistici tra i gruppi sono stati effettuati utilizzando un'analisi unidirezionale della varianza seguita dal test post hoc di Tukey con GraphPad Prism. P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
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Ecocardiografia transtoracica
L'analisi ecocardiografica ha rivelato un marcato rimodellamento cardiaco e disfunzione nei ratti TAC (Figura 1). Rispetto ai controlli Sham, la TAC ha aumentato significativamente LVIDd e LVPWd, mentre LVEF è stata notevolmente ridotta. In particolare, la somministrazione di SXQY ha parzialmente invertito questi cambiamenti patologici, come dimostrato da una significativa riduzione d...
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SXQY è stato ampiamente utilizzato nella pratica clinica per oltre due decenni, dimostrando efficacia nel trattamento di varie condizioni cardiovascolari. Recentemente, il suo utilizzo è stato esteso a pazienti con insufficienza cardiaca con frazione di eiezione ridotta e frazione di eiezione leggermente ridotta16. Nel presente studio, un modello su ratti è stato stabilito tramite chirurgia TAC per imitare i cambiamenti patologici dell'IC, e nel frattempo alcuni r...
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Gli autori riportano che non ci sono conflitti di interesse in quest'opera.
Ringraziamo il Centro Sperimentale Animale dell'Ospedale dell'Amicizia Cina–Giappone per l'assistenza nella cura degli animali e nelle procedure chirurgiche.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2-cloro-L-fenilalanina | Aladdin | C105993-1g | Standard interno; ≥ 98% |
| Acetonitrile (grado LC-MS) | Aladdin | A120771-1L | Solvente per estrazione |
| Acido acetico | Solarbio | G1340 | macchie di massone; pre-raffreddato a 4 °Grad; C |
| Fiale autocampionatore | Agilent | 5190-9590 | Per il caricamento di campioni LC-MS/MS |
| Buprenorfina | Cerilliant | B-044S | Analgesico |
| Colonna C18 (1.8 e mu; m, 2,1 mm e multipli; 100 mm) | Acque | 176001125 | Colonna ACQUITY Premier HSS T3 |
| Tubi capillari, sterili | Fisherbrand | 22-362-566 | Raccolta di sangue retro-orbitale |
| Centrifuga (refrigerata) | KUBOTA | N61196-F000 | Per la lavorazione del siero e dei campioni |
| Pacchetto clusterProfiler | Bioconduttore | — | pacchetto R per l'analisi dell'arricchimento KEGG; v4.0.2 |
| Pinza curva, sterile | HL-SQX | HL-JP | Manipolazione dell'arco aortico |
| Software Cytoscape | NHGRI | NIH NHGRI U24 HG012107 | Versione 6.4.1 |
| Piattaforma dedicata all'imaging | Fujifilm VisualSonics | Sistema di imaging a ultrasuoni VisualSonics Vevo 1100 | Posizionamento degli animali durante l'ecocardiografia |
| Acqua distillata | N/A | N/A | Preparazione della decoction e controllo del veicolo |
| Mantello elettrico per riscaldamento | Midea | WK2102 | Bollitura a decocto |
| Tubo endotracheale | CWE Inc., USA | SAR-1000 | Intubazione endotracheale; Il tubo endotracheale utilizzato in questo studio era integrato nella configurazione del ventilatore e non era un dispositivo separato o autonomo |
| Etanolo (assoluto) | Beijing Yili Fine Chemicals Co., Ltd. | 64-17-5 | Disidratazione e sterilizzazione |
| Acido formico | Aladdin | O930702 | Additivo di fase mobile |
| Garza | Solarbio | YA0720 | Filtrazione a decocto; 200– 300 & mu; m dimensione dei pori |
| Database GeneCards | GeneCards | — | Recupero di bersagli correlati a malattie; consultato gennaio 2026 |
| Database GNPS | Università della California San Diego | — | Database spettrale; versione 1.3.16, dati archiviati a dicembre 2025 |
| Software GraphPad Prism | GraphPad Software | — | Versione 10.1.2; SCR_002798 |
| Cuscina riscaldante (termostatica) | Fisitempa | HP-4M | Mantenuto a 37 & deg; C |
| Ematossilina ed eosina (H&; E) Kit per la Tintura | Solarbio | G1120 | Colorazione istologica |
| Trasduttore ad alta frequenza | VisualSonics | Vevo F2 | 18– 40 MHz |
| Spettrometro di massa ad alta risoluzione | Thermo Fisher Scientific | Q Esattivo | Q Esattivo HF-X |
| Sistema a ultrasuoni ad alta risoluzione per piccoli animali | Fujifilm VisualSonics | Sistema di imaging a ultrasuoni VisualSonics Vevo 1100 | Vevo 2100 |
| Database HMDB | Wishart Research Group / Centro per l'Innovazione Metabolomica, Università dell'Alberta | — | Database spettrale; HMDB versione attuale 5.0; release 5.0; Gennaio 2022 |
| Biblioteca di riferimento standard interna | METWARE | — | Composizione della biblioteca standard di riferimento interna: La libreria contiene un totale di 5.000 composti e include sia informazioni MS1 (precursori) sia dati spettrali MS2 (frammentazione). Dichiarazione di disponibilità: Il formato dei dati della biblioteca è .txt. Condizione di archiviazione: Il database è archiviato sul server interno dell'azienda. Permessi di accesso: questa libreria standard autocostruita è una libreria spettrale proprietaria interna dell'azienda. Viene utilizzato esclusivamente per l'identificazione dei metaboliti, la verifica dei risultati e la tracciabilità della qualità all'interno dei flussi di lavoro analitici controllati dall'azienda. La biblioteca non è disponibile pubblicamente per il download. I client possono ottenere i risultati delle annotazioni, le informazioni sui risultati e le descrizioni necessarie dei campi generate in base a questa libreria. |
| Isoflurano | Sigma-Aldrich | 792632 | Anestetico inalatorio |
| Sistema di cromatografia liquida (UPLC) | SCIEX | ExionLC d.C. | ExionLC d.C. |
| Database MassBank | consorzio MassBank; Società di Spettrometria di Massa del Giappone / MassBank Europe | — | Database spettrale; versione 2024.06; dati archiviati a dicembre 2025 |
| Masson' s Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | Colorazione istologica |
| Filtro a membrana (0,22 & mu; m) | Beyotime | FF362 | Polietersolone (PES) |
| Database METLIN | L'Istituto di Ricerca Scripps / Laboratorio Siuzdak | RRID: SCR_010500 | Database spettrale; questo database non fornisce un numero di versione annuale fisso; Dati scaricati nel 2023 |
| Metanolo (grado LC-MS) | Beijing Yili Fine Chemicals Co., Ltd. | 67-56-1 | Solvente per estrazione |
| Tubi microcentrifughe (1,5 mL) | Corning Life Sciences (Wujiang) Co., Ltd. | MCT-150-C | Elaborazione del campione |
| Microtomo | Leica | DSC1 | Sezionamento tissutale |
| Resina neutra | Solarbio | G8590 | Montaggio a carrello |
| Evaporatore di azoto/fonte di gas | Organomazione | N-EVAP | Essiccazione del campione |
| Pomata oftalmica | Aladdin | 08-03-8009 | Protezione oculare durante l'anestesia |
| Paraffina | Solarbio | YA0010 | Incassamento dei tessuti |
| Paraformaldeide (4%) | Solarbio | P1110 | Fissazione dei tessuti |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | TI SALUTO | DYP1021 | Lavaggio dei tessuti |
| Acido fosfomolibdico | Solarbio | G1340 | Colorazione di massone |
| Povidone– Iodio | Solarbio | IP3800 | Disinfezione chirurgica |
| Software ProteoWizard | Fondazione ProteoWizard | — | Versione 3.0.19254 |
| Software R | Fondazione R | — | Versione 4.2.2 |
| Evaporatore rotativo | QINGDAO JINGCHENG INSTRUMENT CO., LTD | JC-2LZF | Concentrazione di decocto a pressione ridotta |
| Sutura di seta (2-0) | FULAN | NL30RH26A-76 | Costrizione aortica |
| Ventilatore per piccoli animali | CWE Inc., USA | SAR-1000 | Ventilazione meccanica |
| Sprague– Ratti Dawley (maschio, 8 settimane) | SPF Bio Co., Ltd. | — | RGD_70508; Patente n. SCXK(jing)2024-0001 |
| Database STRING | Consorzio STRING | — | Analisi delle interazioni proteiche; consultato gennaio 2026 |
| Supporta pacchetto/script di normalizzazione per regressione vettoriale | MetNormalizer | — | Correzione della deriva del segnale; v1.3.02 |
| Database TCMSP | TCMSP | — | Recupero di compound e bersagli; consultato gennaio 2026 |
| Database UniProt | Consorzio UniProt | — | Standardizzazione dei simboli genici |
| Gel per ultrasuoni | MAGNAFLUX | 25-912 | Ecocardiografia |
| Acqua ultrapura | Preparati in laboratorio | — | Solvente in fase mobile |
| Miscelatore a vortice | Yalin | VM-ST | Miscelazione di campioni |
| Bagno d'acqua | Julabo | PURA22 | Sezione galleggiante a 45 ° C |
| Piattaforma Weishengxin | Weishengxin | — | Analisi dell'intersezione bersaglio; consultato gennaio 2026 |
| Software XCMS | Fondazione R | — | Versione 3.16.1 |
| Xylene | Aladdin | X775162 | Deparaffinizzazione |