Un modello murino di lesione cerebrale cerebrale chiusa a rotazione singola e ripetitiva

Sommario

Viene descritto un modello murino riproducibile di lesioni cerebrali da concussione rotazionale, che fornisce un metodo versatile per indagare le sottili basi funzionali e biologiche - inclusi cambiamenti neurovascolari, infiammatori e comportamentali - a seguito di un impatto singolo o ripetitivo in assenza di danni strutturali cerebrali evidenti.

Abstract

La lesione cerebrale commozionale (CBI), il substrato fisiopatologico alla base della commozione cerebrale clinica, è una condizione frequente ma poco compresa con potenziale compromissione neurologica a lungo termine in un sottoinsieme di pazienti. In particolare la CBI ripetitiva, cioè negli sport di contatto, è stata associata a deficit cognitivi duraturi e a neurodegenerazione progressiva (ad esempio, encefalopatia traumatica cronica, CTE). Per colmare questa lacuna di conoscenza, è stato stabilito un modello murino riproducibile di lesioni cerebrali rotazionali a testa chiusa che riproduce caratteristiche biomeccaniche e patologiche chiave della CBI. Un impattatore elettromagnetico guidato stereotaticamente veniva utilizzato per infliggere un colpo standardizzato al cranio intatto. Per ridurre la pressione focale sul cranio e sul tessuto cerebrale adiacente, la punta dell'impattatore è stata dotata di un cappuccio in silicone su misura. Questa configurazione induceva in modo affidabile la rotazione della testa con bassa variabilità interanimale, prevenendo al contempo fratture craniche o lesioni microscopiche ai tessuti. Per preservare l'attività fisiologica neuronale e vascolare e per evitare potenziali effetti neuromodulatori dell'anestesia profonda, una lesione cerebrale è stata indotta in topi coscienti sotto sedazione leggera utilizzando l'agonista α2 medetomidina. Gli impatti indotti causavano un movimento rotazionale riproducibile della testa con solo una variabilità minore attribuibile al posizionamento della testa. L'integrità strutturale del cervello è stata valutata utilizzando immagini di risonanza magnetica ponderate in T2 in vivo e confermate da analisi istologiche ex vivo , che non hanno rivelato alcuna evidenza di disturbo tissutale, contusione o microemorragie, ma hanno mostrato una lieve e diffusa interruzione dell'interfaccia microvascolare. Questo nuovo modello di lesione cerebrale chiusa rotazionale fornisce una solida piattaforma sperimentale per indagini longitudinali su sottili alterazioni neurovascolari, infiammatorie e della barriera emato-encefalica che avvengono in assenza di patologie strutturali palesi. La sua applicazione consente intuizioni meccanicistiche sulla fisiopatologia della commozione cerebrale e sulle potenziali conseguenze neurodegenerative di lesioni ripetitive, facilitando così lo sviluppo di biomarcatori clinici di cui sono urgenti necessità.

Introduzione

La lesione cerebrale traumatica (TBI) rimane una causa significativa di disabilità a lungo termine in tutte le fasce d'età, con adolescenti e giovani adulti colpiti ^{in modo sproporzionato 1,2,3}. La stragrande maggioranza dei TBI è classificata come lieve (mTBI), comunemente chiamata commozione cerebrale a livello clinico. Sebbene la commozione cerebrale non sia per definizione associata a danni cerebrali strutturali evidenti rilevabili tramite neuroimaging convenzionale, sempre più evidenze suggeriscono che il meccanismo di lesione sottostante — qui chiamato lesione cerebrale concussiva (CBI) — rappresenta un'entità fisiopatologica distinta e clinicamente rilevante.

In particolare, la CBI ripetitiva, soprattutto quando si verifica in successione temporale ravvicinata, come spesso accade negli sport di contatto e in contesti militari, è stata collegata a un declino cognitivo persistente, sintomi neuropsichiatrici e allo sviluppo di encefalopatia traumatica cronica (CTE^)1,2,3. Questa apparente discrepanza tra la natura lieve della lesione iniziale e il potenziale di sequele neurologiche a lungo termine rappresenta una sfida importante sia per la diagnosi clinica che per la ricerca meccanicistica.

Evidenze emergenti indicano che alterazioni sottili ma sostenute all'interfaccia neurovascolare e neurogliale rappresentano un meccanismo patologico^{rilevante 4}. Questi cambiamenti comprendono l'integrità della barriera emato-encefalica (BBB), la struttura microvascolare, l'attivazione gliale, l'eccitabilità neuronale e i processi di riparazione endogeni, collegando potenzialmente la fisiopatologia a livello cellulare ai deficit funzionali e comportamentali a lungo termine osservati dopo, in particolare i ripetitivi ^CBI 5,6,7,8 . Collettivamente, tali alterazioni sono sempre più riconosciute come potenziali fattori che contribuiscono ai deficit funzionali e comportamentali ritardati dopo la CBI. Tuttavia, la natura diffusa e multifaccettata complica una comprensione meccanicistica e finora ha ostacolato lo sviluppo di interventi terapeutici mirati.

I modelli preclinici che riproducono aspetti chiave della cascata fisiopatologica sono strumenti cruciali per analizzare questi meccanismi e individuare nuove vie terapeutiche. Sebbene esista un'ampia gamma di modelli sperimentali di TBI, la maggior parte è stata progettata per imitare lesioni da moderate a gravi o per basarsi su danni strutturali^{focali 9,10,11}. Al contrario, vi è una sorprendente carenza di modelli animali per il meccanismo caratteristico di lesione della^{CBI 5}. Per lo più, un trauma cerebrale etichettato come "lieve" viene indotto da un impatto focale sulla testa rigidamente fissata, o persino da un impatto corticale diretto dopo una craniotomia, che contraddice fondamentalmente il meccanismo diffuso di lesione guidato da accelerazione-decelerazione che definisce la commozione cerebrale negli esseri^{umani 6,7}. Sebbene tali approcci permettano un controllo preciso sui parametri dell'infortunio, la loro capacità limitata di replicare la dinamica delle commozioni cerebrali nel mondo reale ne riduce la rilevanza traslazionale.

Per superare queste limitazioni, esistono diversi metodi per indurre una lesione cerebrale chiusa replicabile e^diffusa 12,13,14. Partendo da questi concetti e con l'obiettivo di minimizzare la complessità tecnica, è stato sviluppato un modello controllato di lesioni rotazionali nei topi utilizzando un impattatore elettromagnetico disponibile in commercio spesso impiegato in altri modelli sperimentali di trauma (ad esempio, impatto corticale controllato, CCI). Fornendo un impatto riproducibile alla testa in movimento libero, questo approccio preserva l'integrità strutturale consentendo al contempo l'indagine longitudinale delle alterazioni neurovascolari, neurogliali e funzionali a seguito di CBI singoli e ripetitivi in condizioni che si avvicinano molto alle caratteristiche biomeccaniche della commozione cerebrale umana.

Combinato con la valutazione comportamentale longitudinale, l'imaging in vivo e l'istologia ex vivo , questo modello offre una piattaforma versatile e accessibile per esplorare alterazioni neurovascolari, gliali e comportamentali a seguito di impatti singoli o ripetitivi. In quanto tale, è particolarmente adatta per studiare i meccanismi sottili della malattia secondaria della CBI, identificare i parametri dei surrogati traslazionali e valutare potenziali interventi terapeutici in un contesto sperimentale clinicamente rilevante.

Protocollo

Tutte le procedure animali rispettavano la Legge tedesca sul benessere animale e furono approvate dalle autorità istituzionali e governative (LANUV Nordrhein-Westfalen; AZ 81-02.04.2020.A058). Gli esperimenti sono stati condotti seguendo le linee guida ARRIVE. Un flusso di lavoro schematico è descritto nella Figura 1. Questo protocollo induce in modo affidabile lesioni cerebrali commozionali, come dimostrato da un panel definito di esiti strutturali, comportamentali e neurovascolari di validazione (Figura 2). Tutti i materiali utilizzati in questo studio sono dettagliati nella Tabella dei Materiali.

1. Considerazioni generali

NOTA: I topi venivano ospitati socialmente in condizioni standardizzate (ciclo luce/oscurità di 12 ore) con accesso ad libitum a cibo e acqua. I topi sono stati acclimatati alla struttura sperimentale per almeno 7 giorni prima dell'intervento. In questo studio pilota sono stati utilizzati in totale 40 topi, con 10 animali assegnati a ciascun gruppo sperimentale (sham come gruppo di controllo, gruppo CBI singolo, CBI ripetitivo in gruppo ad alta frequenza e CBI ripetitivo in gruppo a bassa frequenza). Installare un sistema di telecamere ad alta velocità all'altezza degli occhi con la testa del mouse in una posizione fissa davanti al mouse (ad esempio, 10 cm). Per garantire la coerenza tra le prove, mantenere costanti la posizione e l'orientamento della telecamera. In questo studio è stata utilizzata una GoPro Hero6 a 240 fotogrammi al secondo (fps) con una risoluzione di 1080px. Il software open-source di analisi del movimento Kinovea (versione 2025.2.0) viene utilizzato per le analisi cinematiche descritte.

2. Induzione di analgesia e anestesia

1. Prepara l'allestimento, incluso il telaio stereotassico e l'attacco per l'impattatore elettromagnetico.
2. Somministrare Tramadolo (1 mg/mL) con acqua bevuta due giorni prima dell'induzione del trauma e proseguire per tre giorni dopo l'ultimo intervento.
3. Indurre l'anestesia utilizzando isoflurano in una miscela di protossido di azoto/ossigeno (O₂ 30%,_{N 2}O 70%), con 4–4,5% di isoflurano in una camera di induzione.
4. Valuta la tolleranza chirurgica utilizzando il riflesso del pizzicotto delle dita. Procedi una volta che manca una risposta di ritiro.
5. Rimuovi il mouse dalla camera a induzione e posizionalo su una borsa riscaldante all'interno del telaio stereotattico. Mantieni la temperatura del nucleo a 37 ± 1,0 °C utilizzando una sonda rettale in fibra ottica. Proteggi gli occhi dalla disidratazione applicando unguenti oftalmici.
6. Mantieni l'anestesia somministrando isoflurano al 2,0–2,5% tramite un cono nasale collegato all'impianto stereotattico.

3. Preparazione del cranio

1. Fissa il mouse all'interno del frame stereotattico usando specifiche barre per le orecchie.
2. Rasi il cuoio capelluto e disinfetta accuratamente l'area chirurgica con un antisettico a base di alcol.
3. Applicare anestesia locale tramite iniezione sottocutanea di bupivacaina (0,1 mg/kg).
4. Rivalutare il riflesso del pizzichio delle dita prima dell'incisione cutanea. Procedere solo in assenza di una risposta di astinenza per garantire una profondità costante dell'anestesia.
5. Eseguire un'incisione cutanea mediana di circa 7 mm per esporre il cranio.
6. Espone con attenzione il cranio sull'osso parietale destro tra Bregma e Lambda.
7. Assicurarsi che il sistema stereotattico sia orientato perpendicolarmente al cranio, con l'asse verticale posizionato a un angolo di 90° rispetto alla superficie della testa.
8. Monta un perno marcatore nel portaoggetti stereotassico e centralo direttamente su Bregma.
9. Zerare tutte le coordinate stereotassici e spostare il pin del marcatore alle coordinate predefinite anteroposteriori (AP) e mediolaterali (ML) (nel nostro modello, AP 0,5, ML -2,5). Segna il punto bersaglio con una penna impermeabile a punta d'acqua.

4. Aggiustamento dell'analgesia

1. Libera il mouse dalle barre auricolari.
2. Iniettare medetomidina sottocutaneamente (0,5 mg/kg) e ridurre gradualmente l'isoflurano fino al <0,5%.
3. Mantieni l'anestesia a < 0,5% di isoflurano mentre monitora continuamente la respirazione e la temperatura corporea.
4. Consentire l'equilibrio in queste condizioni per 10 minuti per raggiungere uno stato stabile di anestesia preservando l'attività della rete neuronale. Frequenza respiratoria, assenza di risposte riflesse e temperatura corporea stabile (37 ± 1,0 °C) sono stati utilizzati come indicatori standardizzati per garantire una profondità anestesica comparabile tra gli animali.

5. Induzione d'impatto

NOTA: Prima dell'esperimento, fabbricare un supporto per la testa del modello animale utilizzando un isolante per tubi in schiuma di polietilene (PE) disponibile in commercio, una schiuma polimerica a celle chiuse e non reticolata, che limita l'accelerazione verso il basso consentendo il movimento rotazionale. Inoltre, si realizza una punta sferica su misura da 5 mm in silpuran (rapporto 1:1; rigidità 830 kPa).

1. Rimuovere la sonda di temperatura rettale e interrompere la somministrazione di isoflurano, poi posizionare il topo in posizione prona sul supporto della testa.
2. Fissa il tappo in silicone su misura alla punta del percussore disponibile in commercio.
3. Montare l'impattatore elettromagnetico nel supporto stereotassico e assicurarsi che il dispositivo sia orientato a un angolo di 10° rispetto alla superficie del cranio.
4. Allinea la punta dell'impattatore sopra la regione predefinita del bersaglio sul cranio.
5. Abbassare la punta dell'impattatore in posizione prolungata finché non tocca leggermente la superficie del cranio.
6. Ritrae la punta dell'impattatore e avanzala fino alla profondità di incavazione desiderata (cioè 3 mm in questi esperimenti) verso la superficie del cranio. Per gli animali di controllo, ometti la diminuzione e alza la punta della stessa quantità.
7. Inizia la registrazione video. Eseguire un singolo impatto concussivo rotazionale attivando il fulmine elettromagnetico tramite l'interruttore di controllo con una velocità di 5 mm/s e una durata dell'impulso di 0,1 ms.
8. Ritrae l'impattatore immediatamente dopo il completamento dell'impatto.
9. Antagonizzare l'anestesia con medetomidina utilizzando l'antagonista atipamazolo (0,5 mg/kg, s.c.).

6. Valutazione post-impatto e chiusura della ferita

1. Gira il mouse in posizione supina.
2. Valuta il riflesso di raddrizzamento registrando il tempo necessario affinché l'animale torni in posizione prona.
3. Riinduce l'anestesia con isoflurano in una miscela di protossido di azoto/ossigeno (O₂ 30%,_{N 2}O 70%) al 4% di isoflurano.
4. Rimuovi il mouse dalla camera a induzione e posizionalo sulla borsa riscaldante vicino alla struttura stereotattica. Mantieni la temperatura del nucleo a 37 ± 1,0 °C utilizzando una sonda rettale in fibra ottica.
5. Fissa il mouse nel frame stereotastico usando delle barre per le orecchie.
6. Chiudere l'incisione cutanea usando suture interrotte con filamenti autoassorbenti (ad esempio, Polyglactin 910, 6-0).
7. Trasferire il topo in una scatola riscaldante e monitorare fino al completo recupero della coscienza.
8. Riporta l'animale nella sua gabbia di casa.

7. Paradigma dell'impatto ripetuto

1. Assegnare i topi a gruppi simulati, singoli o ripetuti CBI secondo il disegno sperimentale.
2. Per i gruppi con lesioni ripetute, programmare sessioni CBI successive a intervalli definiti (ad esempio, ogni 48 ore).
3. Prima di ogni successivo CBI, somministrare analgesia preoperatoria tramite tramadolo nell'acqua potabile come descritto nella sezione 3.1.
4. Anestesia ripetuta, marcatura stereotassica e impatto seguendo la stessa procedura descritta nelle sezioni 3–6, inclusa anestesia locale con bupivacaina (0,1 mg/kg, s.c.), somministrazione di medetomidina (0,5 mg/kg, s.c.) con mantenimento dell'isoflurano a < 0,5%, targeting stereotassico a AP 0,5 e ML −2,5 rispetto al Bregma, e somministrazione di un impatto rotazionale con impattatore elettromagnetico (profondità di indentazione 3 mm, velocità 5 mm/s, durata dell'impulso 0,1 ms, angolo di 10° rispetto alla superficie del cranio).
5. Garantire una posizione costante (posizionamento prono su un portatestine in schiuma di polietilene che consente il movimento rotazionale), parametri d'impatto identici (angolo, profondità, velocità e durata) e condizioni standardizzate peri- e post-procedurali, inclusa antagonizzazione con medetomidina con atipamazolo (0,5 mg/kg, s.c.), riinduzione dell'anestesia (4% isoflurano in O₂ 30%/N₂O 70%) e controllo della temperatura a 37 ± 1,0 °C, durante sessioni ripetute per mantenere la riproducibilità tra animali e momenti temporali.
6. Garantire un posizionamento coerente, parametri di impatto e condizioni di recupero durante sessioni ripetute per mantenere la riproducibilità tra animali e momenti temporali.
7. Monitorare continuamente gli animali per eventuali deficit comportamentali cumulativi a seguito di ripetuti impatti.

8. Analisi cinematica

1. Esportare i video in formato standard (ad esempio MP4) per l'analisi e caricarli nel software Kinovea.
2. Naviga fino alla finestra temporale pertinente contenente i fotogrammi pre e post-impatto (ad esempio, -0,025 a 0,3 s dall'impatto). Assicurati di impostare un frame rate adeguato (ad esempio, 240 fps) nelle impostazioni del software. Definisci un riferimento di scala (ad esempio, distanza tra gli occhi).
3. Usa lo strumento di tracciamento di Kinovaea per stabilire un sistema di tracciamento a tre punti (ad esempio, occhio destro, occhio sinistro, naso; Figura 3A). Inizia a tracciare ogni punto e correggi manualmente gli errori di tracciamento, soprattutto durante movimenti rapidi o occlusione.
4. Esporta le coordinate tracciate come file CSV o Excel.
   NOTA: Ulteriori analisi cinematiche sono state eseguite utilizzando uno script MATLAB personalizzato. I dati di tracciamento a risoluzione temporale esportati da Kinovea venivano importati e preprocessati per rimuovere voci non valide e garantire una scala temporale coerente. La traslazione della testa è stata definita come il baricentroide dei tre punti di riferimento tracciati (occhio destro, occhio sinistro e naso), da cui sono derivati spostamenti lineari, velocità e accelerazione tramite differenziazione numerica. La rotazione della testa è stata stimata dall'orientamento dell'asse occhio–naso, con lo spostamento angolare calcolato rispetto a una linea di base pre-impatto e la velocità angolare ottenuta come prima derivata. Per ridurre l'amplificazione del rumore, tutti i segnali di posizione e angolari venivano smussati utilizzando un filtro Savitzky–Golay prima della differenziazione. Il parametro principale di esito era lo spostamento angolare massimo, mentre i profili di velocità e accelerazione sono stati analizzati come misure relative della dinamica del movimento della testa tra gli studi.

Risultati

Considerazioni generali:

L'applicazione di questo protocollo induce riproducibilmente lesioni cerebrali concussive, come dimostrato da un insieme definito di letture di validazione strutturale, comportamentali e neurovascolari (vedi Figura 2). L'integrità strutturale è stata preservata dopo l'infortunio. Non è stata rilevata alcuna alterazione macroscopica o emorragia esplicita, indicando che il protocollo induce...

Discussione

È caratterizzato un modello murino nuovo di CBI a testa chiusa basato su lesioni da accelerazione-decelerazione, caratterizzato da un lieve ma diffuso deficit della BBB e un fenotipo neuropsichiatrico distinto che ricorda una commozione cerebrale clinica. Riproduendo i principali tratti distintivi della CBI in modo controllato e coerente, preservando l'integrità strutturale, il modello fornisce un quadro sperimentale utile e ben caratterizzato per studiare i meccanismi alla base della CB...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Medicazione
Antipamezolo	Vetoquinol	VM 06043/4004	Antagonista Medetomidina (antagonista α2-adrenorecettore), sottocutaneo (0,5 mg/kg)
Bepanthen Pomata Oftalmica	Bayer	11809917	Protezione degli occhi durante l'anestesia, topico
Bupivacaina	Sigma-Aldrich	B1160000	Anestesia locale, sottocutanea (0,1 mg/kg)
Isoflurano	CP pharma	1214CN	Anestesia, inalazione (induzione e mantenimento)
Medetomidina	Vetoquinol	VM 06043/4003	Sedativo/anestetico aggiuntivo (agonista α2-adrenorecettore), per via sottocutanea (0,5 mg/kg)
Tramadol cloridrato (100 mg/mL)	Grünenthal	6867645	Analgesico somministrato tramite acqua potabile, 1 mg/mL concentrazione finale per i topi, da 2 giorni prima a 3 giorni dopo l'intervento
Attrezzatura
Cuscino collo in polietilene	Personalizzato		Supporto per il posizionamento a pancia in giù durante l'impatto
Copertura per Impattatore Stereotassico Silupran	Personalizzato		Distribuisce il carico meccanico, previene danni focali al cranio, attaccato alla punta dell'impattatore, 830 kPa
Impattatore Stereotassico	Leica Biosystems	39463923/IM10131	Dispositivo ad impatto elettromagnetico per l'erogazione controllata dell'impatto
Strumenti
GoPro Hero6	GoPro Inc., San Mateo, CA, USA
Kinovea		(versione 2025.2.0)
MATLAB	MathWorks, Natick, MA, USA	NA