La riduzione della regolamentazione del miR-483-3p è un indicatore prognostico negativo nel NSCLC. La sovraespressione di miR-483-3p sopprime i fenotipi maligni delle cellule NSCLC, la cui funzione è stata invertita dalla sovraespressione di KIF3B.
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Articolo di ricerca
La riduzione della regolamentazione del miR-483-3p è un indicatore prognostico negativo nel NSCLC. La sovraespressione di miR-483-3p sopprime i fenotipi maligni delle cellule NSCLC, la cui funzione è stata invertita dalla sovraespressione di KIF3B.
I microRNA svolgono un ruolo ampio nel cancro polmonare non a piccole cellule (NSCLC). Per indagare il valore clinico di miR-483-3p nelle NSCLC e nel suo bersaglio molecolare, sono stati reclutati 350 pazienti con NSCLC in questo studio. I risultati della RT-qPCR hanno mostrato che l'espressione istologica tumorale di miR-483-3p è diminuita progressivamente con l'aumentare dello stadio metastasi tumore-linfonodo (TNM). La curva della caratteristica operativa del ricevitore (ROC) ha mostrato che il livello istologico miR-483-3p può distinguere efficacemente i pazienti NSCLC con alto stadio TNM (III) da quelli con stadio basso (I+II) (area sotto la curva ROC = 0,869). La curva di Kaplan-Meier ha mostrato che i pazienti NSCLC con bassa espressione di miR-483-3p hanno mostrato un tasso di sopravvivenza complessiva su 5 anni inferiore. Dopo aver aggiustato per altri fattori di confusione, l'analisi multivariata di Cox ha ulteriormente identificato miR-483-3p come fattore protettivo indipendente per la sopravvivenza degli NSCLC. Meccanicamente, il test di pull-down dell'RNA ha mostrato che la regolazione all'alto di miR-483-3p era co-precipitata con l'mRNA di KIF3B e ne inibiva l'espressione, sopprimendo così i fenotipi maligni delle cellule NSCLC e inducendo l'apoptosi. In conclusione, la riduzione della regolazione del miR-483-3p rappresenta un marcatore prognostico scadente nelle NSCLC, potenzialmente influenzando la progressione del cancro regolando negativamente il KIF3B.
Tra i decessi correlati al cancro, il cancro polmonare a cellule non piccole (NSCLC) è una delle cause principali. Il suo alto tasso di mortalità è attribuito principalmente alla crescita aggressiva dei tumori, alla metastasi precoce e allo sviluppo di resistenzaacquisita 1,2,3. Nonostante i progressi nelle strategie cliniche attuali, la prognosi complessiva per i pazienti con NSCLC rimanescarsa 4,5,6. Oltre alle sfide biologiche, i pazienti con NSCLC spesso sperimentano un pesante carico sintomatario, tra cui dolore, dispnea, affaticamento e disagio psicologico, che compromettono significativamente la loro qualità della vita e complicano la gestione clinica. Un'assistenza infermieristica efficace — come la valutazione dei sintomi, l'educazione del paziente, il supporto psicosociale e il coordinamento delle cure multidisciplinari — svolge un ruolo cruciale nel migliorare gli esiti dei pazienti e l'aderenza al trattamento. Pertanto, un'indagine approfondita sui principali meccanismi molecolari che guidano lo sviluppo e la progressione del NSCLC è di fondamentale importanza per lo sviluppo di nuovi biomarcatori prognostici e strategie terapeutiche efficaci, nonché per informare interventi infermieristici mirati che affrontino sia le malattie che i bisogni centrati sul paziente.
I microRNA (miRNA) sono stati ampiamente segnalati come una regolazione dell'espressione genica inibendo la traduzione degli mRNA target o promuovendo la loro degradazione al livellopost-trascrizionale 7. Ricerche approfondite indicano che i miRNA svolgono un ruolo regolatore cruciale in vari tumori, incluso il NSCLC. La loro disregolazione è strettamente associata al fenotipo maligno delle cellule tumorali e alla resistenzaalla chemioterapia 7,8,9,10,11. Pertanto, l'identificazione di miRNA che si esprimono in modo anomalo nel NSCLC e che possiedono ruoli funzionali significativi è diventata un argomento caldo nella ricerca tumorale attuale. La nostra analisi bioinformatica preliminare ha rivelato una regolazione costante alla ribasso di miR-483-3p sia nei pazienti con NSCLC sia nelle linee cellulari resistenti ai farmaci, suggerendo la sua potenziale associazione con la progressione avversa della malattia. Pertanto, questo studio si concentra su miR-483-3p per esplorarne la funzione nelle NSCLC. Le evidenze esistenti indicano che il miR-483-3p funziona come gene soppressore del tumore in vari tumoriumani 12,13,14,15, il cui silenziamento si ritiene sia associato alla resistenza al gefitinib nel NSCLC 16. Tuttavia, il suo modello specifico di espressione nelle NSCLC, il valore prognostico clinico e i meccanismi molecolari sottostanti rimangono incompletamente compresi.
L'obiettivo di questo studio era chiarire sistematicamente il significato clinico e le funzioni biologiche di miR-483-3p nelle NSCLC, e chiarire il ruolo del suo membro della famiglia cinesina bersaglio a valle 3B (KIF3B). Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo prima analizzato la sua espressione nei campioni di tessuto clinico e la sua correlazione con le caratteristiche clinico-patologiche dei pazienti e la prognosi. Successivamente, sono stati condotti saggi funzionali in vitro per indagare gli effetti di miR-483-3p sulle funzioni delle cellule NSCLC. Inoltre, abbiamo identificato KIF3B come un gene target chiave a valle di miR-483-3p attraverso esperimenti di bioinformatica e biologia molecolare, e abbiamo validato la relazione regolatoria tramite saghi di salvataggio funzionale. L'elevata espressione di KIF3B è associata a un aumento della proliferazione, una maggiore migrazione e resistenza alla chemioterapia nelle celluletumorali 17,18,19,20,21,22, ma il suo ruolo funzionale nelle NSCLC rimane poco chiaro. Per quanto ne sappiamo, questo studio è il primo a caratterizzare il ruolo e il significato clinico dell'asse miR-483-3p/KIF3B nel NSCLC da tre prospettive: prognosi clinica, identificazione del gene bersaglio e meccanismi funzionali, fornendo così potenzialmente nuove intuizioni per la valutazione della prognosi e della terapia mirata del NSCLC.
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Il Comitato Etico del Secondo Ospedale Affiliato dell'Università Medica di Nanchino ha approvato questo studio. I principi fondamentali della Dichiarazione di Helsinki sono stati applicati in modo coerente durante tutto il processo di ricerca. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i singoli partecipanti allo studio. Informazioni dettagliate su tutti i materiali e reagenti erano fornite nella Tabella dei Materiali.
Analisi bioinformatica:
Il database Gene Expression Omnibus (www.ncbi.nlm.nih.gov) è stato utilizzato per cercare nei dataset relativi al NSCLC. GSE171517 è un'analisi di RNA non codificante basata sui campioni di siero di pazienti con NSCLC e controlli sani. GSE110815 è un'analisi di array di RNA non codificante condotta su cellule NSCLC resistenti e sensibili al gefitinib. I miRNA espressi differenzialmente in questi due dataset sono stati selezionati fissando una soglia di |log 2FC| ≥ 2, p < 0,05. Sebbene questi dataset provengano da compartimenti diversi (siero, linee cellulari), abbiamo utilizzato una strategia complementare: miRNA derivati dal siero per potenziale biomarcatore non invasivo, e miRNA derivati da linee cellulari resistenti ai farmaci per la rilevanza funzionale nella progressione e nella resistenza. L'intersezione ha nominato miR-483-3p per la validazione tissutale, assumendo che la disregolazione trasversale del compartimento indichi una robusta rilevanza biologica per il NSCLC.
I potenziali obiettivi di miR-483-3p sono stati previsti simultaneamente nei database miRDB (https://mirdb.org/custom.html) e starbase (https://rnasysu.com/encori/index.php). La soglia di screening in questi due database era rispettivamente Target Score ≥ 60 e TDMDScore ≥ 1. Successivamente, è stata utilizzata una Piattaforma di Analisi Bioinformatica (www.bioinformatics.com.cn) per l'analisi GO utilizzando l'intersezione di questi bersagli.
Inclusione del campione clinico:
Questo studio è uno studio osservazionale retrospettivo di coorte basato su campioni NSCLC resezionati chirurgicamente. Questo studio ha incluso 350 pazienti con NSCLC che hanno subito trattamenti chirurgici in ospedale, tra cui 96 pazienti con metastasi dei linfonodi tumorali (TNM) stadio I, 96 pazienti con malattia di stadio II e 158 pazienti con malattia di stadio III. Le loro caratteristiche cliniche dettagliate sono state presentate nella Tabella 1. Tutti questi pazienti sono stati diagnosticati con NSCLC tramite esame istologico. I criteri di esclusione includono funzionalità cardiaca, epatica o renale compromessibile, infezioni attive o malattie autoimmuni, disturbi psichiatrici gravi o compromissione cognitiva, cartelle cliniche mancanti o incomplete e mancato ottenimento del consenso informato dai pazienti. L'analisi clinica è stata condotta raccogliendo campioni di tessuto tumorale e lo stato di sopravvivenza entro cinque anni dalla diagnosi. La metodologia del follow-up è la seguente: tutti i pazienti sono stati seguiti dalla data dell'intervento fino alla loro morte, alla perdita del follow-up o alla fine dello studio. Durante il primo anno, il follow-up avveniva ogni 3 mesi. Successivamente, è stato effettuato ogni 6 mesi tramite visite ambulatoriali e colloqui telefonici. Ad ogni follow-up, venivano registrate informazioni sullo stato di sopravvivenza, la causa di morte, la recidiva della malattia e il trattamento successivo. Il periodo complessivo di sopravvivenza è stato definito come il periodo dalla data dell'intervento chirurgico alla data della morte per qualsiasi causa.
Elaborazione cellulare:
BEAS-2B, una linea cellulare epiteliale polmonare umana normale, è stata coltura in DMEM contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina (P/S). Tutte le linee cellulari NSCLC (HCC827, H1299, H520, A549) sono state coltivate nel mezzo di crescita dedicato fornito dallo stesso fornitore. La formulazione base dei mezzi specializzati per HCC827, H1299 e H520 è RPMI-1640 + 10% FBS + 1% P/S, e per A549 è F-12K di Ham + 10% FBS + 1% P/S. Le celle congelate vengono rapidamente scongelate in un bagno d'acqua a 37 °C, centrifugate per rimuovere il mezzo crioconservativo e risospese in un mezzo di coltura fresco. Quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza, vengono digerite con lo 0,25% di tripsina-EDTA e passate con un rapporto 1:3. Tutte le linee cellulari sono state verificate tramite analisi STR (Supplementare File 1) e sono prive di contaminazione da micoplasmi. Tutti gli esperimenti in vitro hanno utilizzato cellule dalla quarta alla decima generazione.
L'agonista miR-483-3p e il suo controllo negativo (agonista-NC), il piccolo RNA interferente di KIF3B (si-KIF3B) e il suo controllo negativo (si-NC), così come il vettore di sovraespressione KIF3B (oe-KIF3B) e il suo controllo a vuoto (oe-NC) sono stati trasfectati utilizzando un reagente di trasfezione. La concentrazione operativa dell'agonista miR-483-3p o agonista-NC era di 100 nM, e la quantità del plasmide oe-KIF3B era di 2,5 μg (piastra a 6 pozzi). Le cellule sono state prelevate 48 ore dopo la trasfezione per esperimenti successivi.
RT-qPCR:
L'RNA totale nei campioni di tessuto tumorale e nelle cellule è stato estratto utilizzando il reagente TRIzol. Il cDNA trascritto inversamente è stato preparato utilizzando un kit di reagenti RT, e successivamente è stato eseguito il qPCR su un sistema RT-PCR 7500 Fast RT-PCR utilizzando il premix SYBR Green Pro Taq HS. L'espressione relativa di miR-483-3p e KIF3B è stata normalizzata con il mantenimento di U6 e GAPDH tramite il metodo 2-ΔΔCT . Le sequenze di innesco corrispondenti sono le seguenti:
miR-483-3p (F), 5'-ACACTCCAGCTGGGTCACTCCTCTCCTCC-3'
miR-483-3p (R), 5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAAGACGG-3'
KIF3B (F), 5'-ATCCTGGAGCAGAAACGACAGG-3'
KIF3B (R), 5'-GTTCCAAGGTCTCCTCATCG-3'
U6 (F), 5'-ATGTTCCAGTATGACTCTA-3'
U6 (R), 5'-ATGTTCCAGTATGACTCTA-3'
GAPDH (F), 5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3'
GAPDH (R), 5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3'
La RT-qPCR è stata eseguita con tre repliche biologiche indipendenti.
Vitalità cellulare:
Le cellule HCC827 (3000 cellule/pozzo) e A549 (2000 cellule/pozzo), con o senza trasfezione, sono state seminate in una piastra da 96 pozzi per periodi di coltura variabili. Dopo che le cellule aderirono alla superficie, la vitalità cellulare veniva valutata in momenti temporali specifici nei pozzi designati. In particolare, sono stati aggiunti ai pozzi 10 μL di Kit di Conteggio Cellulare-8 (CCK-8) e 90 μL di mezzo per un'incubazione di 2 ore a 37 °C. L'assorbenza di ciascun pozzo veniva poi misurata a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre. La vitalità cellulare è stata effettuata con tre repliche biologiche indipendenti.
Analisi di Transwell:
Il dispositivo di camera Transwell rivestito o non rivestito con matrice basale (8 μm) è stato utilizzato per il test di invasione/migrazione. Dopo che la camera superiore è stata seminata con le cellule NSCLC trasfettate (8 × 104, 500 μL), la camera inferiore è stata riempita con 700 μL di DMEM (10% FBS). È stata eseguita un'incubazione di 24 ore a 37 °C. Dopo che le cellule dello strato superiore della membrana della camera sono state delicatamente rimosse con un cotton fioc, le cellule sulla superficie inferiore della membrana sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente, poi colorate con soluzione di viola cristallina allo 0,1% per 10 minuti a temperatura ambiente, seguite da un breve lavaggio con acqua del rubinetto corrente per rimuovere la macchia in eccesso. Le cellule migrate venivano contate manualmente tramite un microscopio ottico. Per ogni camera Transwell, sono stati selezionati casualmente tre campi visivi non sovrapposti e il numero di celle colorate in ciascun campo è stato contato. Successivamente, veniva calcolato il conteggio medio delle cellule. Questo conteggio è stato effettuato da due ricercatori indipendenti che non erano a conoscenza delle condizioni sperimentali, e i valori medi risultanti sono stati utilizzati per l'analisi statistica. Il test transwell è stato eseguito con tre repliche biologiche indipendenti.
Rilevamento dell'apoptosi cellulare
Un kit di colorazione Annexin V-FITC/PI è stato utilizzato per la rilevazione dell'apoptosi nelle cellule NSCLC. In breve, una sospensione contenente 6 × 104 celle è stata preparata per la prima volta utilizzando 195 μL di buffer di legame Annexin V-FITC. Successivamente sono stati aggiunti sequenzialmente Annexin V-FITC (5 μL) e soluzione di colorazione PI (10 μL) per un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo il completamento dell'incubazione, il citometro a flusso veniva immediatamente utilizzato per rilevare le cellule da testare. Per ogni campione sono stati raccolti 10.000 eventi. La strategia di gating era la seguente: le celle venivano inizialmente bloccate su FSC-A vs. SSC-A per escludere i detriti, seguite da una gating singlet su FSC-A vs. FSC-H. Le cellule apoptotiche sono state quindi identificate nei grafici puntino Annexin V-FITC rispetto a PI. I quadranti venivano impostati utilizzando comandi non colorati e a tinta singola. La percentuale di apoptosi è stata calcolata come la somma delle cellule apoptotiche precoce (Annexin V⁺/PI⁻) e delle cellule apoptotiche tarde (Annexin V⁺/PI⁺). La rilevazione dell'apoptosi cellulare è stata eseguita con tre repliche biologiche indipendenti.
Pull-down dell'RNA
Il segmento dell'mRNA KIF3B (KIF3B/NM004798.4/NP004789.1: 32334713–32334791, 5'-AGAAATCTGTGTCACCTTCTGCCTGCTTGTTTCCTGAATGAATGCTTGTGTTTTATGAATGCTTGGGGTTTATGAAAGGAGTGATCCT-3', 78 nt) è stato sintetizzato in vitro e marcato con biotina utilizzando un kit di destiobiotinilazione a RNA 3' End. Dopo che gli estratti cellulari sono stati incubati con mRNA KIF3B marcato con biotina per 1,5 ore a 4 °C, sono state aggiunte sfere magnetiche di streptavidina per un'incubazione di 2 ore a temperatura ambiente. Infine, il livello di miR-483-3p in ciascuna reazione è stato rilevato tramite RT-qPCR, con tre repliche biologiche indipendenti.
Analisi statistica
Le variabili continue in questo studio sono state espresse come media ± deviazione standard (media ± SD), mentre i dati categorici sono stati presentati come conteggi. Per l'analisi statistica veniva utilizzato un software di analisi statistica appropriato. Per l'analisi sperimentale dei dati è stato utilizzato ANOVA unidirezionale/bidirezionale, seguito dal test post hoc di Tukey. P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
È stata eseguita un'analisi della curva della caratteristica operativa del ricevitore (ROC) per determinare la capacità dell'espressione di miR-483-3p di distinguere i pazienti con NSCLC con alto stadio (III) da quelli con classificazione TNM in basso stadio (I + II). L'indice di Youden (sensibilità + specificità – 1) è stato utilizzato per identificare il valore di soglia che massimizza l'equilibrio tra sensibilità e specificità. L'area sotto la curva (AUC) è stata calcolata per valutare la capacità discriminatoria complessiva dell'espressione di miR-483-3p. Un AUC > 0,7 era considerato accettabile. Tutte le analisi ROC sono state effettuate utilizzando GraphPad Prism.
Per l'analisi della sopravvivenza, è stato utilizzato il metodo Kaplan-Meier per stimare le curve complessive di sopravvivenza. Il test log-rank è stato applicato per confrontare le distribuzioni di sopravvivenza tra i gruppi (gruppi ad alta espressione miR-483-3p). Le curve di Kaplan-Meier sono state tracciate con intervallo di confidenza (IC) del 95%. Per il modello di regressione dei rischi proporzionali multivariato di Cox, è stata applicata la seguente strategia di selezione delle variabili: è stata eseguita inizialmente l'analisi univariata per ogni variabile candidata. Le variabili con un valore p < 0,10 nell'analisi univariata sono state considerate come potenziali predittori e successivamente inserite nel modello di regressione multivariata di Cox. L'analisi multivariata è stata condotta utilizzando il metodo di selezione anticipata a passi (condizionale) basato sul test del rapporto di verosimiglianza, con criteri di ingresso e rimozione stabiliti rispettivamente a p < 0,05 e p > 0,10. L'assunzione dei rischi proporzionali è stata verificata per ciascuna variabile utilizzando i residui di Schoenfeld (p > 0,05 non indicava alcuna violazione). I risultati sono stati riportati come rapporti di rischio (HR) con IC al 95%. Tutti i test erano a doppio senso e un valore p < 0,05 era considerato statisticamente significativo salvo diversa specificazione.
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Il miR-483-3p ridimensionato rappresenta una prognosi negativa per NSCLC
Il diagramma di Venn (Figura Supplementare 1) indica che il miR-483-3p appare sotto-regolato sia nei campioni sierici di pazienti con NSCLC sia nelle linee cellulari NSCLC resistenti alla chemioterapia. Un'analisi ANOVA unidirezionale ha mostrato che l'espressione di miR-483-3p nel tumore diminuiva progressivamente con l'aumento dello sta...
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Questo studio ha indagato sistematicamente il ruolo del miR-483-3p nella soppressione dei tumori NSCLC e il suo meccanismo sottostante attraverso l'analisi clinica dei campioni e l'esplorazione dei meccanismi molecolari. L'obiettivo di questo studio era duplice: (1) determinare se miR-483-3p funga da marcatore prognostico indipendente nel NSCLC, e (2) chiarire il meccanismo molecolare con cui miR-483-3p può sopprimere fenotipi maligni mirando a KIF3B. I nostri risultati suggeriscono il v...
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,1% viola cristallo | Solarbio/Cina | G1064 | |
| 0,25% tripsina-EDTA | Gibco/USA | 25200056 | |
| 4% di paraformaldeide | Beyotime/Cina | P0099 | |
| Sistema RT-PCR veloce 7500 | Biosistemi applicati/USA | 4351106 | |
| A549 | Procell/Cina | CL-0016 | |
| Mezzo specifico per A549 | Procell/Cina | CM-0016 | |
| Kit di colorazione Annexin V-FITC/PI | Beyotime/Cina | C1062S | |
| BEAS-2B | STEM RECELL/Cina | STM-CL-5102 | |
| Kit di conteggio delle celle-8 (CCK-8) | Solarbio/Cina | CA1210 | |
| Mezzo DMEM | MeilunBio/Cina | PWL003 | |
| Siero bovino fetale | Gibco/USA | A5256701 | |
| Software GraphPad Prism & nbsp; | GraphPad | Versione 7.0 | |
| H1299 | Procell/Cina | CL-0165 | |
| Mezzo specifico H1299 | Procell/Cina | CM-0165 | |
| H520 | Procell/Cina | CL-0402 | |
| Mezzo specifico per H520 | Procell/Cina | CM-0402 | |
| HCC827 | Procell/Cina | CL-0094 | |
| Mezzo specifico per HCC827 | Procell/Cina | CM-0094 | |
| MRNA KIF3B | Genscript Biotech/Cina | personalizzato | |
| Reagente Lipo6000 | Beyotime/Cina | C0526 | |
| miR-483-3p agonista/agonista-NC | MedChemExpress/USA | HY-R01451A | |
| oe-KIF3B/oe-NC | RiboBio/Cina | personalizzato | |
| Penicillina/streptomicina | Solarbio/Cina | P1400 | |
| Pierce RNA 3' Kit di destiobiotinilazione finale | Thermo Fisher Scientific/USA | 20163 | |
| PrimeScript RT Reagent Kit (Tempo Reale Perfetto) | TaKaRa/Giappone | RR037A | |
| si-KIF3B/si-NC | RiboBio/Cina | personalizzato | |
| SPSS | IBM | Versione 23.0 | |
| Perle magnetiche di streptavidina | New England Biolabs/USA | S1420S | |
| SYBR Green Pro Taq HS Premix | Biologia accurata/Cina | AG11701 | |
| Camera Transwell | Corning/USA | 3428 | |
| Reagente Trizol | Invitrogen/USA | 15596026CN |
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