Questo studio valuta gli effetti delle fasi del ciclo mestruale sul rilascio di fattori di crescita dalla fibrina piastrinica (PRF).
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Articolo di ricerca
Questo studio valuta gli effetti delle fasi del ciclo mestruale sul rilascio di fattori di crescita dalla fibrina piastrinica (PRF).
La fibrina ricca di piastrine (PRF) è ampiamente utilizzata nella chirurgia dentale per procedure rigenerative; tuttavia, la variabilità del suo contenuto biologico rimane una limitazione chiave per la standardizzazione. Questo studio mirava a implementare un flusso di lavoro sperimentale strettamente controllato per valutare come le fasi del ciclo mestruale influenzino il rilascio dei fattori di crescita dalla PRF. Sono stati prelevati campioni di sangue venoso da 21 volontarie femmine sane in tre fasi mestruali predefinite (mestruale: giorni 1–5; follicolare: giorni 6–14; luteale: giorni 15–28), con tutte le prelieve effettuate entro una finestra temporale fissa (11:00–11:30) per minimizzare la variazione circadiana. Per ogni fase, sono stati assegnati tubi separati per la emocromia completa, l'analisi ormonale (estrogeni, progesterone, ormone follicolo-stimolante [FSH] e ormone luteinizzante [LH]) e la preparazione di PRF. La PRF è stata prodotta tramite centrifugazione immediata in condizioni standardizzate (708 × g per 12 minuti; rotore ad angolo fisso, 40 °; raggio 88 mm; nessun anticoagulante). I coaguli sono stati verificati macroscopicamente (struttura omogenea ed elastica), accuratamente separati dallo strato di globuli rossi e pesati singolarmente. Per standardizzare il rilascio del fattore di crescita, ogni coagulo è stato incubato in mezzo RPMI-1640 utilizzando un rapporto basato sul peso (1 g PRF: 1 mL di mezzo), seguito da un'incubazione controllata a 37 °C con agitazione orbitale (100 rpm). I soprannatanti sono stati raccolti e conservati a -80 °C prima dell'analisi. I fattori di crescita (IGF-1, PDGF, FGF-2, VEGF e TGF-β1) sono stati quantificati tramite il saggio immunosorbente legato a enzimi (ELISA) in condizioni uniformi di analisi. All'interno di questo protocollo standardizzato, i livelli di FGF-2 erano significativamente più alti durante la fase follicolare rispetto alle fasi mestruale e lutea. In questa fase è stata osservata una correlazione positiva moderata tra FGF-2 e livelli di estrogeni, mentre non sono state rilevate differenze statisticamente significative per altri fattori di crescita. Questi risultati indicano che la fase del ciclo mestruale può contribuire alla variabilità nei profili dei fattori di crescita derivati dalla PRF. Il protocollo descritto fornisce un quadro riproducibile per minimizzare la variabilità pre-analitica e analitica negli studi PRF. Le implicazioni cliniche delle differenze correlate alle fasi richiedono ulteriori indagini in studi che incorporano coorti più ampie e risultati terapeutici.
Storicamente, l'uso dei concentrati piastrinari è iniziato con lo sviluppo degli adesivi di fibrina ed è evoluto in varie formulazioni e protocolli di preparazione. La fibrina ricca di piastrine (PRF), introdotta per la prima volta da Choukroun et al. nel 2001, è un concentrato di piastrine di seconda generazione ampiamente utilizzato inodontoiatria 1. Questo biomateriale autologo si ottiene tramite centrifugazione senza anticoagulanti e forma una matrice di fibrina arricchita con piastrine, leucociti e componenti immunitaricircolanti 2. La rete di fibrina funziona come un impalcatura che consente il rilascio graduale di fattori di crescita essenziali per la riparazione e la rigenerazione deitessuti 3.
Le piastrine svolgono un ruolo centrale nella guarigione delle ferite e nell'emostasi rilasciando citochine e fattori di crescitaall'attivazione 4. Nel PRF, questo processo porta al rilascio prolungato di mediatori chiave, tra cui fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), fattore di crescita fibroblastico-2 (FGF-2), fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF), fattore di crescita insulino-simile (IGF) e fattore di crescita trasformante-beta1 (TGF-β1)5. Nonostante il suo ampio uso clinico, i risultati riguardanti l'efficacia rigenerativa della PRF rimangono incoerenti negli studi 3,6. Una delle principali fonti di variabilità è l'eterogeneità delle preparazioni PRF, influenzata sia da fattori tecnici che biologici.
Da un punto di vista metodologico, differenze nei protocolli di centrifugazione (ad esempio, forza centrifuga relativa, durata, tipo di rotore), materiali a tubo e manipolazione post-raccolta possono modificare significativamente l'architettura PRF e la distribuzionecellulare 7. Inoltre, la variabilità analitica—come la mancanza di standardizzazione nell'elaborazione dei coaguli, strategie di normalizzazione incoerenti e differenze nelle condizioni di incubazione precedenti all'ELISA—può portare a notevoli discrepanze nei livelli di fattori di crescita8 riportati. Queste incongruenze limitano la comparabilità tra gli studi e riducono l'affidabilità traslazionale della ricerca PRF.
La variabilità biologica complica ulteriormente l'interpretazione. Diversi fattori correlati al paziente, tra cui età, sesso, conteggio piastrino, larghezza della distribuzione piastrinica (PDW) e volume medio piastrino (MPV), sono noti per influenzare la composizione delPRF 9. Inoltre, influenze ormonali, genetiche e ambientali possono modulare il comportamento piastrinico e il rilascio dicitochine 10. Esistono prove sia dirette che indirette che gli ormoni sessuali influenzino la biologiapiastrinica 11. L'estrogenio, in particolare, ha dimostrato di aumentare la reattività piastrinica agli agonisti fisiologici e di aumentare l'aggregazione indotta dalla trombona attraverso vie mediate dairecettori 12. Poiché i livelli di estrogeni fluttuano durante il ciclo mestruale, la funzione piastrinica e le relative emissioni biologiche possono variare di conseguenza13. Tuttavia, la letteratura rimane incoerente, con alcuni studi che riportano un aumento dell'attivazione piastrinica e altri che mostrano effetti neutri oinibitori 14.
Data questa combinazione di variabilità tecnica e biologica, è chiara necessità di flussi di lavoro controllati metodologicamente che minimizzino il bias pre-analitico e analitico nella valutazione dei fattori di crescita derivati dalla PRF. A differenza di molti studi precedenti che si basano su campionamento a singolo punto temporale, gestione non standardizzata dei coaguli o quantificazione non normalizzata dei fattori di crescita, il presente studio impiega un protocollo di raccolta del sangue specifico per fase, controllato nel tempo, parametri fissi di centrifugazione e una normalizzazione dei coaguli PRF basata sul peso prima dell'incubazione e dell'analisiELISA 8. Questo approccio è progettato per migliorare la riproducibilità e permettere un confronto più affidabile del rilascio dei fattori di crescita tra stati fisiologici.
Approcci alternativi alla ricerca sulla PRF includono l'uso di formulazioni avanzate come avanzata-PRF7 e iniettabile-PRF15, sistemi di centrifugazione orizzontale7, o l'impianto diretto di membrana senza analisi ex vivo. Sebbene questi metodi possano aumentare la resa cellulare o l'applicabilità clinica, spesso introducono una variabilità aggiuntiva nella quantificazione dei fattori di crescita o limitano la capacità di isolare effetti biologici specifici. Al contrario, l'attuale flusso di lavoro dà priorità alla standardizzazione analitica e al confronto controllato, rendendolo particolarmente adatto per l'indagine di modificatori fisiologici come le fluttuazioni ormonali.
Il protocollo proposto è più adatto per studi sperimentali o traslazionali controllati che mirano a quantificare il rilascio di fattori di crescita in condizioni standardizzate. Potrebbe essere meno applicabile in contesti focalizzati esclusivamente sugli esiti clinici, nella preparazione semplificata a scuola di conduzione o in studi in cui è richiesta un'applicazione immediata di PRF senza elaborazione. I ricercatori dovrebbero considerare l'adozione di questo flusso di lavoro quando l'obiettivo principale è ridurre la variabilità e migliorare la riproducibilità delle misurazioni relative al PRF.
Pertanto, l'obiettivo del presente studio era valutare la correlazione tra i livelli ormonali nelle diverse fasi del ciclo mestruale e il rilascio dei fattori di crescita dalla PRF utilizzando un quadro metodologico standardizzato e riproducibile.
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Questo studio è stato condotto presso il Dipartimento di Parodontologia, Facoltà di Odontoiatria, Università di Çukurova, Adana, Turchia, con la partecipazione di 21 volontarie donne. Tutti i partecipanti sono stati informati in dettaglio sullo scopo, la progettazione e le procedure dello studio, e prima dell'inclusione è stato ottenuto un consenso informato scritto. Il protocollo dello studio è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico della Facoltà di Medicina dell'Università di Cukurova (Approvazione n. 125/56, datata 16.09.2022). Tutte le procedure sono state condotte in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki per la ricerca che coinvolge soggetti umani.
Tutte le procedure che coinvolgono il sangue umano, comprese le precauzioni di biosicurezza e la gestione e lo smaltimento di rifiuti biopericolosi e chimici, sono state condotte in conformità con le linee guida di biosicurezza stabilite come delineato dai Centers for Disease Control and Prevention e dai National Institutesof Health 16. Il personale utilizzava dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati, cioè guanti, camice da laboratorio, occhiali protettivi. Tutta la manipolazione dei campioni è stata effettuata in aree di laboratorio designate per prevenire contaminazioni ed esposizioni. I rifiuti biologici (residui di sangue, residui di PRF, consumabili) venivano smaltiti in conformità con il Protocollo di Gestione dei Rifiuti Medici dell'Università di Cukurova e le normative nazionali sui rifiuti biomedici. Gli oggetti appuntiti venivano collocati in contenitori antifora; I rifiuti liquidi venivano disinfettati chimicamente prima dello smaltimento e i rifiuti solidi biologici venivano autoclavati prima dello smaltimento autorizzato.
Selezione dei partecipanti
Nello studio sono stati inclusi individui che soddisfacevano i seguenti criteri: assenza di qualsiasi malattia sistemica, ciclo mestruale regolare di 27–30 giorni ed età compresa tra 18 e 25 anni
Le persone che soddisfacevano i seguenti criteri sono state escluse dallo studio: Presenza di malattia sistemica, ciclo mestruale irregolare, uso di qualsiasi farmaco o preparazione ormonale, presenza di disturbi endocrini o sanguinari e storia di sanguinamento eccessivo durante il ciclo mestruale
Raccolta del sangue e assegnazione dei gruppi
I primi giorni del ciclo mestruale di ogni partecipante sono stati utilizzati per costruire un protocollo di programmazione. Secondo classificazioni fisiologiche ampiamente accettate, il ciclo era suddiviso in tre fasi: giorni 1–5 come fase mestruale (associata alla perdita dell'endometrio), giorni 6–14 come fase follicolare (caratterizzata da aumento dei livelli di estrogeni e sviluppo follicolare), e giorni 15–28 come fase luteale (caratterizzata da un aumento della secrezione di progesterone dopo l'ovulazione)12,13. Sono stati prelevati campioni di sangue da ciascun partecipante durante le fasi corrispondenti. In un singolo ciclo sono stati prelevati in totale nove tubi per soggetto: tre per l'emocromo completo (uno per fase), tre per l'analisi dell'ormone sessuale (estrogeni, progesterone, ormone luteinizzante (LH), ormone follicolo-stimolante (FSH) e tre per la preparazione del PRF e l'analisi dei fattori di crescita basati su ELISA. Tutti i campioni di sangue sono stati raccolti tra le 11:00 e le 11:30 alla stessa ora ogni giorno per minimizzare la variabilità biologica. Sono stati prelevati campioni di sangue venoso dalla vena antecubitale utilizzando un sistema sterile di raccolta di sangue a vuoto e aghi a farfalla da 21G per garantire un campionamento non traumatico. Il sangue veniva raccolto direttamente in tubi di vetro sterili da 10 mL senza anticoagulanti (tubi PRF), secondo i protocolli standard di preparazione PRF. Per minimizzare la variabilità pre-analitica, tutti i campioni sono stati raccolti dalla stessa infermiera formata in condizioni standardizzate.
Immediatamente dopo la prelieva, i tubi venivano maneggiati con delicatezza senza agitazione e trasferiti nella centrifuga entro 60–90 secondi per prevenire una coagulazione prematura e garantire una polimerizzazione costante della fibrina. I tubi erano posizionati simmetricamente all'interno del rotore per mantenere l'equilibrio ed evitare variabilità correlata alle vibrazioni durante la centrifugazione. Non sono stati utilizzati additivi o anticoagulanti in nessuna fase della procedura.
Di conseguenza, sono stati creati tre gruppi di studio: Gruppo 1: Campioni della fase mestruale, Gruppo 2: Campioni della fase follicolare, e Gruppo 3: Campioni della fase luteale
Passaggi di preparazione PRF:
I campioni di sangue venivano immediatamente centrifugati senza anticoagulanti utilizzando una centrifuga da banco dotata di un rotore ad angolo fisso (40 °; raggio: 88 mm). La centrifugazione è stata eseguita in condizioni standardizzate a 708 × g per 12 minuti a temperatura ambiente (22°C–24 °C). I valori della forza centrifuga relativa (RCF) sono stati calcolati utilizzando la formula standard (RCF = 1,118 × 10⁻5 × r × g2), tenendo conto del raggio del rotore (88 mm), in conformità con i protocolli PRF stabiliti descritti da Choukroun et al.17 e i successivi studi distandardizzazione 1,3,18. Dopo la centrifugazione, sono stati identificati tre strati distinti: uno strato inferiore di globuli rossi, uno strato superiore povero di plasma piastrinico e un coagulo intermedio di PRF. Il coagulo PRF è stato rimosso delicatamente con una pinzetta sterile, evitando la distruzione dell'interfaccia degli eritrociti. I componenti residui dei globuli rossi furono accuratamente tagliati con forbici sterili.
I coaguli di PRF sono stati valutati macroscopicamente per una superficie liscia e omogenea, una struttura cilindrica elastica e una consistenza densa e compatta secondo criteripredefiniti 19,20. I coaguli che non soddisfacevano questi criteri venivano scartati e venivano prelevati nuovi campioni di sangue quando necessario. Tutti i campioni sono stati processati in condizioni standardizzate e congelati a -80 °C entro 30 minuti dalla raccolta per minimizzare la degradazione proteolitica. I campioni sono stati conservati per una durata controllata e uniforme (fino a 4 settimane) prima dell'analisi batch per ridurre la variabilità tra i test e garantire la comparabilità delle misurazioni dei fattori di crescita.
Passaggi di analisi ELISA dei fattori di crescita:
I coaguli di PRF sono stati accuratamente separati dalla frazione dei globuli rossi in condizioni asettiche utilizzando forbici chirurgiche sterili e pesati individualmente con una bilancia analitica calibrata. Il mezzo di coltura RPMI-1640 è stato aggiunto a ciascun campione con un rapporto fisso basato sul peso del coagulo (1 g PRF: 1 mL medio) per standardizzare l'estrazione del fattore di crescita e minimizzare la variabilità associata alle differenze di massa del coagulo. I campioni sono stati incubati a 37 °C su uno shaker orbitale a 100 × g per facilitare la diffusione omogenea dei fattori di crescita solubili dalla matrice PRF nel mezzo di coltura. Dopo l'incubazione, i soprantativi venivano raccolti e conservati a -80 °C fino all'analisi.
Le concentrazioni di fattori di crescita, inclusi fattore di crescita simile all'insulina-1 (IGF-1), fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF), fattore di crescita fibroblastico-2 (FGF-2), fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e fattore di crescita trasformante-β1 (TGF-β1), sono state quantificate utilizzando kit di immunosorbente enzimatico collegato commercialmente disponibili (ELISA) secondo le istruzioni del produttore. Sono stati utilizzati i seguenti kit: Kit ELISA IGF-1 Umano, Kit ELISA PDGF Umano, Kit ELISA FGF-2 Umano, Kit VEGF ELISA Umano e Kit ELISA TGF-β1 Umano. Tutti i campioni e gli standard sono stati analizzati in duplicato e l'assorbanza è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di microplacche. Le curve di calibrazione sono state generate utilizzando la regressione logistica a quattro parametri (4-PL) per determinare le concentrazioni dianaliti 5.
Passi ELISA
La diluizione del campione è stata determinata secondo l'intervallo di concentrazione atteso e le istruzioni del produttore per ogni kit ELISA. I campioni previsti rientrare nell'intervallo standard della curva sono stati analizzati senza diluizione. Quando le letture preliminari o le concentrazioni attese dell'analite superavano il limite superiore della curva standard, i campioni venivano diluiti utilizzando il diluente fornito nel kit e rianalizzati. Le concentrazioni finali sono state calcolate moltiplicando i valori misurati per il corrispondente fattore di diluizione.
A ciascun pozzetto di una micropiastra pre-rivestita a 96 pozzetti sono stati aggiunti standard (100 μL), preparati per diluizione seriale secondo le istruzioni del kit FineTest, e campioni non diluiti o adeguatamente diluiti. La piastra è stata incubata a 37 °C per 90 minuti per permettere il legame degli antigeni. Tutti i campioni e gli standard sono stati analizzati in duplicazione. Dopo l'incubazione, il liquido veniva rimosso senza lavaggio e in ciascun pozzo venivano aggiunti 100 μL di soluzione di lavoro per anticorpi di deteczione marcata con biotina. La piastra è stata incubata a 37 °C per 60 minuti. Dopo l'incubazione, i pozzi venivano aspirati e lavati tre volte utilizzando 350 μL di tampone di lavaggio 1× per pozzo. Il tampone di lavaggio veniva lasciato nei pozzi per circa 1 minuto durante ogni ciclo di lavaggio per garantire una rimozione adeguata dei componenti non legati. Successivamente, sono stati aggiunti 100 μL di soluzione lavorativa coniugata di persossidasi di rafano (HRP)–streptavidina a ciascun pozzo, e la piastra è stata incubata a 37 °C per 30 minuti. I pozzi sono stati lavati cinque volte utilizzando 350 μL di tampone di lavaggio per pozzo per minimizzare il segnale di fondo. Successivamente, sono stati aggiunti 90 μL di soluzione substratale di tetrametilbenzidina (TMB) in ciascun pozzo e la piastra è stata incubata a 37 °C per 10–20 minuti al buio per permettere lo sviluppo del colore, mentre la reazione veniva monitorata visivamente. La reazione enzimatica è stata interrotta aggiungendo 50 μL della soluzione di stop fornita con il kit a ciascun pozzo, causando un cambio di colore dal blu al giallo.
L'assorbanza è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre entro 5 minuti dall'aggiunta della soluzione di stop. Una curva standard è stata generata utilizzando le concentrazioni note fornite nel kit, e la curva è stata adattata utilizzando un modello di regressione logistica a quattro parametri (4-PL). Le concentrazioni del campione sono state calcolate di conseguenza e corrette per eventuali fattori di diluizione.
Analisi statistica
Le variabili numeriche sono state riassunte come media ± deviazione standard per i dati normalmente distribuiti, e come mediana con valori minimi–massimi quando le assunzioni di normalità non sono state soddisfatte. Le variabili categoriche sono state espresse come frequenze e percentuali. La normalità dei dati numerici è stata valutata utilizzando il test di Shapiro–Wilk. Per confronti di misurazioni numeriche ripetute ottenute dagli stessi individui in momenti temporali diversi, è stata applicata l'analisi delle misure ripetute della varianza (ANOVA) quando le assunzioni parametriche erano soddisfatte; altrimenti, veniva utilizzato il test di Friedman. Le correlazioni tra variabili numeriche non normalmente distribuite sono state valutate utilizzando il coefficiente di correlazione di rango di Spearman. Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando software statistico (IBM SPSS Statistics versione 26.0), e un valore p bilaterale < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
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Non sono stati osservati dati mancanti, poiché tutte le partecipanti hanno completato il campionamento in tutte e tre le fasi mestruali. I parametri completi del contento ematico rientravano nei range di riferimento fisiologico per tutti i campioni, supportando la coerenza della qualità del campione e l'affidabilità della preparazione con PRF.
Valutazione dei parametri ematici nelle fasi mestruali
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Il ciclo mestruale è un complesso processo fisiologico orchestrato da fluttuazioni ormonali che guidano cambiamenti in vari sistemi all'interno del corpo femminile. In questo studio, abbiamo indagato il contenuto di PRF ottenuto da campioni di sangue raccolti durante diverse fasi del ciclo mestruale e analizzato i livelli di fattori di crescita all'interno di questa PRF.
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Gli autori non hanno nulla da rivelare. Il programma AI ChatGPT veniva utilizzato per la modifica linguistica.
Gli autori desiderano ringraziare il Dipartimento di Biochimica della Facoltà di Medicina dell'Università di Cukurova per il loro supporto nell'esecuzione dell'analisi ELISA.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Bilanciamento analitico | Bilanciamento di precisione (leggibilità 0,001 g) | Sartorius | Entris |
| Tubi di raccolta del sangue | Tubi di vetro, senza anticoagulante (10 mL) | BD | Sistema a vacuainer |
| Centrifuga | Centrifuga da banco | Hettich | Universal 320R |
| Kit ELISA e ndash; FGF | Kit FGF ELISA umano | FineTest | EH0541 |
| Kit ELISA e ndash; IGF-1 | Kit umano IGF-1 ELISA | FineTest | ER0030 |
| Kit ELISA e ndash; PDGF | Kit ELISA PDGF umano | FineTest | ER1240 |
| Kit ELISA e ndash; TGF-& beta; 1 | Umano TGF-β 1 kit ELISA | FineTest | EH0287 |
| Kit ELISA e ndash; VEGF | Kit VEGF ELISA umano | FineTest | EH0327 |
| HRP– Coniugato di streptavidina | Reagente ELISA (incluso nel kit) | FineTest | Inclusi nell'equipaggiamento |
| Incubatore | Incubatore a temperatura controllata (37 & deg; C) | Memmert | — |
| Tubi microcentrifughe | Tubi sterili (1.5 e linea; 2 mL) | Eppendorf | — |
| Lettore di microplacche | Lettore di assorbimento a 450 nm | BioTek | ELx800 |
| Ago | Ago sterile usa e getta da 21G. | BD | — |
| Oscillatore orbitale | Shaker regolabile (100 giri/min) | IKA | KS 3000 i controllo |
| Equipaggiamento di protezione individuale | Guanti, camice da laboratorio, occhiali protettivi | Vari | — |
| RPMI-1640 media | Mezzo di coltura cellulare | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 11875-093 |
| Software di analisi statistica | Software per l'analisi dei dati (Versione 26.0) | IBM | Statistiche SPSS |
| Soluzione di stop | Reagente di stop ELISA | FineTest | Inclusi nell'equipaggiamento |
| Substrato TMB | Substrato cromogenico per ELISA | FineTest | Inclusi nell'equipaggiamento |
| Buffer di lavaggio | Buffer di lavaggio ELISA (1 e volte;) | FineTest | Inclusi nell'equipaggiamento |