Un metodo integrato per la modellazione fototrombotica dell'ictus e la registrazione in vivo dell'attività neuronale e astrocita in topi in comportamento

Sommario

Questo protocollo fornisce un metodo integrato che include la somministrazione virale, l'impianto di optrodi, l'induzione fototrombotica, la registrazione simultanea dell'attività degli astrociti e dei neuroni, e la stimolazione optogenetica degli astrociti. Questo metodo integrato mira a fornire un'indagine parallela della relazione astrocito-neurone nelle fasi acute a croniche dell'ictus ischemico.

Abstract

Indagare la dinamica astrocito-neurone dopo un ictus ischemico è essenziale per comprendere i meccanismi di recupero post-ictus. Tuttavia, le metodologie attuali spesso non riescono a catturare le interazioni in tempo reale tra neuroni e astrociti negli animali che svolgono compiti comportamentali specifici, limitando la nostra capacità di indagare la fase acuta della patologia dell'ictus. Questo protocollo presenta un metodo integrato che combina la modellazione fototrombotica dell'ictus con la registrazione simultanea di elettrofisiologia multicanale e la fotometria delle fibre in topi svegli e comportati, utilizzando un optrode personalizzato. Il protocollo include l'induzione di ischemia focale tramite fototrombosi seguita dalla registrazione simultanea di picchi neuronali e transitori di calcio astrocitotici. L'optrodo consente la somministrazione simultanea di fototrombosi, registrazione del segnale di calcio e manipolazione optogenetica senza richiedere procedure chirurgiche separate. I risultati rappresentativi confermano il successo nella registrazione simultanea del segnale astrocitico del calcio e degli spik neuronali. La manipolazione optogenetica degli astrociti produce cambiamenti misurabili nei modelli di scarico neuronali (riduzione della frequenza di sparo dei neuroni piramidali di 1,55 ± 0,45 Hz e dell'interneurone di 3,64 ± 1,37 Hz rispetto alla stimolazione preoptogenetica, n = 2), confermando che il sistema è in grado di indagare le interazioni astrocito-neuroni. Questo approccio integrato affronta lacune critiche nella metodologia di ricerca sull'ictus fornendo registrazioni multimodali in tempo reale dalla fase acuta a quella cronica dell'ictus negli animali che si comportano.

Introduzione

L'ictus ischemico rimane una delle principali sfide sanitarie globali, rappresentando una delle principali cause sia di mortalità che di disabilità acquisita a lungo termine^{a livello mondiale 1,2,3}. L'alto tasso di disabilità associato all'ictus ischemico è associato a una vasta gamma di sintomi clinici, che vanno dalla paralisi motoria e perdita sensoriale al deficit^{cognitivo 4,5,6}. È urgente comprendere meglio i meccanismi patologici e di recupero dell'ictus ischemico durante la fase di riparazione. Oltre al fallimento neuronale, il fallimento catastrofico degli astrociti è stato evidenziato recentemente ^7,8. Gli astrociti, le cellule gliali più abbondanti, sono una componente essenziale del sistema nervoso centrale così come della sinapsi tripartita. In ogni fase della cascata ischemica, gli astrociti svolgono un ruolo indispensabile e influenzano profondamente il recupero neuronale e^{funzionale 9,10,11}. Nel cervello sano, astrociti e neuroni sono funzionalmente accoppiati attraverso la sinapsi tripartita, dove i processi astrocitici coprono i terminali pre- e post-sinaptici e partecipano attivamente alla trasmissione^{sinaptica 7,8}. Gli astrociti regolano le concentrazioni extracellulari di glutammato tramite trasportatori eccitatori di amminoacidi, mantengono l'omeostasi del potassio tramite i canali Kir4.1 e modulano la forza sinaptica tramite il rilascio di gliotrasmettitori tramite esocitosi dipendente dal^{calcio 7,8}. In questo contesto, i transitori intracellulari intracellulari astrocitici rappresentano attività astrocita e sono strettamente legati al discarico^{neuronale 7}. Durante l'ictus ischemico, questa relazione finemente affinata viene rapidamente interrotta. Il collasso dei gradienti ionici dopo un fallimento energetico provoca un massiccio rilascio di glutammato e una depolarizzazione diffusa, portando a lesioni neuronali eccitossiche e proliferazione di astrociti^{reattivi 12}. Gli astrociti nel nucleo dell'infarto e intorno subiscono una cascata di cambiamenti patologici, tra cui sovraccarico di calcio, alterazione della riassorbimento del glutammato, perdita del giunto sinapsi e fallimento del rilascio del^{gliotrasmettitore 13}. Contemporaneamente, l'attività di spiking neuronale è profondamente soppressa poiché i neuroni perdono vitalità e integrità del potenziale della^{membrana 14,15}. Nella zona peri-infarti, i neuroni sopravvissuti e gli astrociti reattivi si impegnano in interazioni dinamiche ritenute fondamentali per determinare l'esito del recupero post-ictus; tuttavia, i correlati elettrofisiologici e calcici in tempo reale di questa interazione negli animali svegli e comportati rimangono scarsamente^{caratterizzati 13,16}. Di conseguenza, comprendere l'attività astrocita fianco a fianco con i segnali neuronali è considerato una pietra angolare per il recupero funzionale neurale dopo una lesione ischemica.

La fototrombosi è un modello ischemico ampiamente utilizzato; Utilizza coloranti fotosensibili e luce localizzata per indurre lesioni ischemiche in aree specifiche^mirate. Gli attuali protocolli di modellazione e registrazione dell'ictus ostacolano l'indagine sull'interazione astrocito-neurone post-ictus a causa di tre principali colli di bottiglia^tecnici 17,18,19. La segregazione tra modellazione e registrazione è uno svantaggio comune della maggior parte dei protocolli attuali, causando un intervallo temporale tra l'istituzione del modello e la registrazione in tempo reale^{del segnale 20,21}. Tuttavia, minuti o ore dopo l'ictus ischemico sono un periodo essenziale durante il quale sia neuroni che astrociti subiscono drastiche^{fluttuazioni 12,22}. Senza un monitoraggio concomitante dell'interazione astrocito-neurone immediatamente dopo l'incidente ischemico, l'indagine di un intervento precoce efficace nell'ictus ischemico sarà profondamente ostacolata. Un'ulteriore limitazione dei protocolli attuali risiede nell'isolamento delle modalità di registrazione; La maggior parte delle metodologie attuali è ottimizzata per un singolo tipo di segnale. Ad esempio, l'elettrofisiologia multicanale offre la rilevazione del discarico neuronale e dei potenziali di campo locale (LFP) ma è cieca agli stati di segnalazione delle cellule^{gliali 15,16}. Al contrario, il monitoraggio delle dinamiche astrocitarie tramite l'imaging in vivo. L'imaging calcio cattura fluttuazioni astrocitarie ma manca di dati di attivazione neuronale. L'ultimo collo di bottiglia dei protocolli attuali sembra essere lo stato di registrazione dell'animale; Nella maggior parte dei protocolli, l'animale è anestetizzato o si muove liberamente. Tuttavia, la disfunzione motoria è considerata una delle sequela più problematiche dell'ictus; Comprendere il legame tra certi comportamenti e gli eventi astrociti-neuroni è essenziale. Pertanto, c'è un'urgente necessità di un metodo integrato in grado di eseguire un modello di ictus fototrombotico catturando contemporaneamente sia segnali di astrocita che neuronali nei topi svegli che evolgono determinati test comportamentali. Le metodologie esistenti affrontano ciascuna solo un sottoinsieme di questi requisiti. L'imaging calcio a due fotoni fornisce una risoluzione spaziale eccezionale della dinamica dei microdomini astrocitici nel cervello intatto, ma richiede che gli animali siano fissati sulla testa o anestetizzati, impedendo una valutazione comportamentale naturalistica, e non può catturare simultaneamente dati di picco neuronale^{multicanale 13}. La fotometria a fibre autonoma consente il monitoraggio astrocitotico del calcio negli animali che si comportano liberamente, ma rimane cieca ai modelli di scarico neuronale, senza fornire una lettura elettrofisiologica della funzione^{del circuito 16}. L'elettrofisiologia extracellulare multicanale risolve l'attività di picco delle unità neuronali e dei potenziali di campo locali con alta risoluzione temporale, ma non fornisce informazioni sullo stato di segnalazione degli astrociti¹⁵. Tuttavia, nessuno di questi approcci può indurre contemporaneamente un ictus fototrombotico localizzato con precisione ed eseguire la registrazione multimodale dallo stesso sito anatomico senza interruzioni.

Per affrontare le limitazioni tecniche esistenti, proponiamo questo sistema integrato. Questo sistema affronta tutte e tre le limitazioni all'interno di un unico dispositivo cronico impiantato, consentendo l'induzione concomitante della fototrombosi, la registrazione astrocita del calcio tramite fotometria delle fibre e l'elettrofisiologia neuronale multicanale nei topi svegli e liberamente comportati—dal momento dell'insorgenza dell'ictus fino alle fasi croniche dell'ictus. La fattibilità di questo metodo viene validata tramite l'impianto cronico di un optrodo personalizzato nel cervello di topi che esprime un indicatore di calcio specifico per astrocita e un vettore virale optogenetico. Utilizzando questo metodo, i transitori astrocitici del calcio e le attività di scarico neuronale vengono registrati e analizzati simultaneamente durante i compiti comportamentali e sotto modulazioni optogenetiche.

Protocollo

Questo protocollo ha ricevuto l'approvazione del Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Medicina Cinese di Guangzhou (00379474) ed è stato condotto seguendo le linee guida e i regolamenti elaborati dalla Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio degli Istituti Nazionali di Salute. Sono state adottate tutte le possibili misure per minimizzare il numero di animali utilizzati in questo studio.

1. Somministrazione del vettore virale

NOTA: Questa sezione descrive l'iniezione stereotassica di vettori AAV specifici per astrociti nella corteccia motoria (M1FL). Lo scopo è ottenere un'espressione stabile e specifica per astrociti sia dell'indicatore di calcio GCaMP6s sia del costrutto optogenetico opto-vTRAP prima dell'impianto dell'optrodo. Attrezzature principali richieste: telaio stereotassico, sistema di vernier digitale, micropipetta di vetro e micro-pompa d'infusione.

1. Inserire il topo nella camera di induzione; Inizia l'induzione anestesica con isoflurano al 3%–4% e la concentrazione di isoflurano può essere aumentata fino al massimo del 5% nel primo minuto finché il topo non risponde.
   ATTENZIONE: L'isoflurano è un agente anestetico volatile. Esegui tutte le procedure sotto ventilazione attiva. Evita un'esposizione personale prolungata.
2. Trasferire il topo nella struttura stereotassica dotata di una maschera anestesica e utilizzare isoflurano all'1–2% per mantenere un piano anestetico profondo.
3. Controlla la profondità dell'anestesia ogni 10 minuti tramite ritmo respiratorio, riflesso palpebrale e pizzicamento all'allucco. Mantieni la temperatura corporea del mouse tra 36 e 37,5 °C con un tappetino riscaldante controllato da feedback.
4. Applicare una pomata oftalmica sugli occhi per prevenire danni alla cornea durante l'intervento.
5. Fissa il mouse a una struttura stereotassica con cuffie per le orecchie e una barra per la bocca. Regola le barre auricolari per assicurarti che la testa del mouse sia fissata simmetricamente. Assicurati che la testa sia immobilizzata con una lieve sondazione.
6. Rimuovere accuratamente i peli con una crema depilatoria e eseguire un'incisione mediana con forbici chirurgiche per esporre il cranio. Pulisci il periosteo usando soluzione salina e cotton fioc per esporre Bregma e Lambda.
7. Abbassare la micropipetta di vetro fino a toccare Bregma e Lambda successivamente; nota la coordinata Z sul vernier digitale. Regola la barra bocca per assicurarti che la differenza sia di <0,04 mm.
8. Abbassa la micropipetta di vetro a Bregma e resetta il vernier digitale a zero. Sposta la micropipetta di 2,3 mm a sinistra e a destra del Bregma successivamente; nota la coordinata Z sul vernier digitale. Regolare le barre auricolari per assicurarsi che le differenze bilaterali siano di <0,04 mm.
9. Resetta il vernier digitale a zero a Bregma e segna la corteccia motoria (M1FL; AP: +1,5 mm, ML: +0,74 mm). Usa un microtrapano con punte da 0,5 mm (punta rotonda) per forare un piccolo foro di circa 0,5 mm di diametro nella posizione indicata. Esercitare con attenzione per evitare sanguinamenti e danni al tessuto cerebrale; lascia cadere soluzione salina gelida per compensare il calore generato durante il processo di perforazione.
10. Abbassare la micropipetta di vetro collegata a una micropompa d'infusione verso il sito bersaglio (DV: -0,94 mm dalla superficie cerebrale). Prima del caricamento, miscelare AAV9-GfaABC1D-GCaMP6 e AAV9-GfaABC1D-opto-vTRAP in volumi uguali per preparare un mix virale. Infondi 400 nL della miscela (200 nL di ogni vettore) a una velocità di 50 nL/min.
    NOTA: Il cocktail virale contiene: 200 nL dell'indicatore calcio specifico per astrociti (AAV-GfaABC1D-GCaMP6s, 1,0 × 10¹³ vg/mL) e 200 nL del vettore virale optogenetico specifico per astrocita (AAV-GfaABC1D-opto-vTrap, 1 × 10¹³vg/mL). La trasduzione specifica degli astrociti è stata verificata in un sottoinsieme di animali tramite colorazione immunofluorescenza per GFAP, confermando la co-localizzazione del reporter fluorescente con cellule GFAP-positive e l'assenza di espressione nelle cellule GFAP-negative.
    ATTENZIONE: I vettori AAV sono agenti biologici ricombinanti; gestire tutti i vettori virali e i rifiuti secondo le linee guida di biosicurezza dell'istituzione.
11. Lascia la pipetta in posizione per 10 minuti dopo il completamento dell'infusione per consentire una migliore diffusione virale e prevenire il riflusso di riflusso. Ritira lentamente la pipetta, sutura il cuoio capelluto (4-0, 20 mm, 3/8 cerchio) e posiziona il topo su una borsa riscaldante finché non si ritrova completamente.
    NOTA: È necessario un periodo di 3–4 settimane per un'espressione virale ottimale. La cronologia dettagliata del protocollo è illustrata nella Figura 1A.

2. Ispezione Optrode e verifica funzionale

NOTA: Prima dell'impianto, l'optrode prodotto su misura deve essere ispezionato fisicamente e testato otticamente per confermare che sia in grado di fornire luce in tutte e tre le modalità funzionali (fototrombosi, stimolazione optogenetica e fotometria delle fibre). Principali apparecchiature richieste: microscopio, misuratore di potenza ottica e sorgenti laser a 532 nm, 488 nm, 470 nm e 405 nm.

1. Ispezione fisica dell'optrode:
   1. Posizionare l'optrode fabbricato sotto un microscopio per ispezionare la disposizione dei siti di registrazione.
   2. Assicurati che i 16 fili di tungsteno siano uniformmente raggruppati e circondino la fibra ottica centrale. Controlla eventuali fili piegati o incrociati che potrebbero causare cortocircuiti elettrici.
   3. Conferma che la punta della fibra ottica sia più corta dei fili di tungsteno (Figura 1B).
      NOTA: La punta della fibra ottica deve essere incassata di 100-200 μm dalle punte^{dell'elettrodo 23}. Questo offset, adottato da Lee et ^al.22, garantisce che il cono luminoso copra sufficientemente l'area di registrazione prevenendo un eccessivo rumore fotoelettrico. Si incoraggia i ricercatori a verificare empiricamente lo spostamento appropriato sotto il proprio optrode.
2. Collega la fibra ottica alla sorgente di modellazione laser e alla sorgente di registrazione. Utilizzare un misuratore di potenza ottica per misurare l'uscita alla punta della fibra per le seguenti tre modalità funzionali (Figura 1B):
   1. Modalità di modellazione fototrombotica: verificare che il sistema possa fornire luce ad onde continue (CW) ad alta intensità (532 nm).
      NOTA: In questo esperimento viene utilizzata fibra con NA 0,22. Il diametro stimato del punto illuminato a 100–200 μm sotto la punta della fibra è di circa 200–400 μm. Assicurarsi che la potenza all'estremità raggiunga >20 mW per garantire una buona attivazione e formazione del trombo del Rose Bengal.
   2. Modalità di manipolazione optogenetica: Testare l'uscita laser pulsata (ad esempio, 488 nm per opto-vTrap).
      NOTA: Calibrare la potenza a 10 mW all'estremità; questo è ottimizzato per l'attivazione opto-vTRAP a una profondità di registrazione di 0,94 mm nella corteccia motoria. Per altre regioni cerebrali è raccomandata la verifica comportamentale o elettrofisiologica.
   3. Fotometria della fibra (registrazione calcio): Testare la luce di eccitazione a bassa potenza (ad esempio, 470 nm e 405 nm).
      NOTA: Assicurarsi che l'output sia stabile e mantenuto a un livello molto basso (<50 μW) per minimizzare la fototossicità e lo sbiancamento fotosbiancante dell'indicatore del calcio (ad esempio, GCaMP6) durante la registrazione a lungo termine.

3. Impianto cronico di optrodo

NOTA: Questa sezione tratta la procedura chirurgica per l'impianto cronico dell'optrode nel sito di iniezione virale. La posizione precisa delle coordinate di iniezione è fondamentale per garantire che gli elettrodi di registrazione e la fibra ottica campionino la regione dell'espressione dei GCaMP6 e dell'opto-vTRAP. Principali attrezzature richieste: struttura stereotassica, microtrapano, pinzep, viti per cranioplastica, gel di agarosio e cemento dentale.

1. Per anestesia, fissazione stereotassica, preparazione cranica e bilanciamento, si segue la stessa procedura descritta nella sezione 1, tranne che durante l'incisione sul cuoio capelluto, rimuovere 1,5 cm × 1,5 cm del cuoio capelluto assicurandosi che rimanga abbastanza pelle intorno agli occhi.
2. Pulisci il cranio con perossido di idrogeno e soluzione salina allo 0,9%. Identifica il Bregma e resetta il vernier digitale a zero.
3. Usa il trapano (0,8 mm, punta rotonda) per rendere leggermente ruvida la superficie del cranio e consentire una migliore adesione del cemento dentale.
4. Segna la corteccia motoria con un marcatore (M1FL; AP: 1,5 mm, ML: 0,74 mm), poi usarlo come punto centrale per disegnare un quadrato da 5 mm × 5 mm (Figura 1C).
   1. Usa un microtrapano a una velocità appropriata (circa 10000 giri/min) e traccia il quadrato. Getta costantemente soluzione salina gelida sul percorso del trapano per compensare il calore prodotto dall'alta velocità e prevenire danni ai tessuti cerebrali. Fermarsi immediatamente se il lembo osseo si allenta (Figura 1C).
5. Forare tre piccoli fori (0,5 mm di diametro) sopra l'emisfero controlaterale e il cervelletto, e impiantare delle viti per cranioplastica nei fori. Assicurati che ogni vite raggiunga la dura madre, ma evita ulteriori penetrazioni e danni aggiuntivi al tessuto cerebrale (Figura 1C).
6. Usa le pinze per rimuovere il lembo osseo che era stato allentato prima. Evitare qualsiasi ulteriore forza verso il basso durante la rimozione per evitare danni al tessuto cerebrale e mantenere intatta la dura madre.
   NOTA: Se si verifica un sanguinamento, si può usare una spugna emostatica per fermare rapidamente il sanguinamento.
7. Usa una pinza con punta ultra-fine (<0,03 mm × 0,01 mm) per rimuovere la dura mater alla finestra cranica. Impedire che la punta della pinza si schiacci direttamente su qualsiasi tessuto cerebrale durante questo processo.
   NOTA: Dopo la rimozione dell'osso, è molto importante mantenere il tessuto cerebrale umido. Si consiglia di utilizzare palline di cotone sterili imbevute di soluzione salina per coprire la finestra quando non viene effettuata alcuna procedura, per evitare gonfiore e danni neuronali dovuti alla secchezza.
8. Fissa l'optrode al braccio micromanipolatore del telaio stereotassico e spostalo sopra la finestra cranica. Intreccia saldamente i fili di massa argentato e di riferimento dell'optrode alle tre viti per la cranioplastica (Figura 1C).
9. Pulisci la superficie cranica con soluzione salina sterile per assicurarti che non ci siano sanguinamenti o coaguli che potrebbero ostacolare l'inserimento degli elettrodi. Abbassare lentamente l'optrode fino alla profondità desiderata (DV: -0,94 mm) a una velocità di 1 μm/s.
   NOTA: Il tessuto corticale esposto deve essere umido con soluzione salina sterile durante l'impianto.
10. Applicare uno strato di agarosio sopra la finestra cranica dopo l'impianto per proteggere il tessuto corticale dal cemento dentale.
11. Applicare 3–4 strati di cemento dentale per coprire il cranio esposto, assicurandosi che l'intero optrode sia ancorato. Rimuovere il topo dal telaio stereotassico una volta che il cemento dentale diventa rigido (Figura 1C).
12. Somministrare analgesia per 3–5 giorni e lasciare che il topo si riprenda per 1–2 settimane prima di registrare e modellare.

4. Modellazione fototrombotica e registrazione concorrente

NOTA: Questa sezione descrive l'abitudine comportamentale, la registrazione basale, l'induzione dell'ictus tramite fototrombosi e le procedure di registrazione longitudinale post-ictus. La fototrombosi viene somministrata tramite l'optrode impiantato mentre si mantiene la registrazione simultanea di elettrofisiologia e fotometria delle fibre. Principali apparecchiature richieste: apparecchiature rotative, misuratore della forza di presa, sistema di fotometria a fibra, sistema di registrazione neurale multicanale, colorante Rose Bengal e sorgente laser a 530 nm.

1. Fai subire un addestramento comportamentale al topo prima di modellare.
   NOTA: Tutti gli animali sono stati ospitati e testati in condizioni di laboratorio standardizzate. Condizioni abitative: temperatura ambiente 20–25 °C, umidità relativa 50%–60%, su un ciclo di 12 ore luce/scuro (luci accese alle 07:00). Gli animali hanno avuto libero accesso a cibo e acqua durante tutto lo studio. Tutti gli esami e le procedure chirurgiche sono stati eseguiti durante la fase luminosa. Durante la fase luminosa, sono state condotte sessioni di registrazione comportamentale a un orario costante ogni giorno per minimizzare la variazione circadiana dell'attività neuronale e della dinamica astrocitaria del calcio. L'involucro di registrazione veniva inoltre mantenuto a una temperatura ambiente di 20–25 °C.
   1. Per il test rotatorio, fai correre il topo continuamente sull'asta rotante per 5 minuti in 3 prove consecutive, con il rotatorio che accelera da 4 a 40 RPM in 5 minuti.
   2. Per il test di forza di presa, fai imparare al topo a tirare la barra di prova con le zampe anteriori e completa tre prove consecutive con risultati che oscillano sotto il 10%.
2. Imposta i parametri di acquisizione dati per la fotometria delle fibre.
   1. Utilizzare un sistema di fotometria a fibra a doppia o tripla lunghezza d'onda per eccitare l'indicatore di calcio (ad esempio, GCaMP6s). Per i GCaMP6, imposta il canale del segnale a 470 nm e il canale di controllo a 405 nm per correggere artefatti di movimento e autofluorescenza.
      NOTA: È molto importante testare nuovamente la potenza del laser di registrazione per assicurarsi che l'uscita all'estremità della fibra sia tra 20 e 40 μW per evitare fotosbiancamento e fototossicità.
   2. Imposta la frequenza di campionamento per l'acquisizione dati a 60–100 Hz, sufficiente per catturare i transitori astrociti del calcio.
3. Imposta i parametri di acquisizione dati per l'elettrofisiologia multicanale.
   1. Assicurati che tutti i componenti del sistema di registrazione (incluso il dispositivo per il test di resistenza di presa e la gabbia) siano correttamente collegati a massa per ridurre il rumore. Utilizzare un riferimento mediano comune (CMR) durante la registrazione per eliminare artefatti globali.
      NOTA: È molto importante controllare la visuale dello spettro del segnale nel sistema di registrazione per assicurarsi che non esistano interferenze sulla linea elettrica e che il rumore causato dagli artefatti di movimento sia minimizzato. Artefatti di movimento di grandi dimensioni possono indicare il fallimento delle viti e la fissazione del filo di terra durante l'intervento di impianto.
   2. Assicurati che i segnali a banda larga e LFP siano selezionati nel software di registrazione e monitora eventuali rumori durante la sessione di registrazione.
4. Esegui la registrazione di base.
   1. Anestesia brevemente con isoflurano (entro 60 s); collega l'Optrode alla linea di registrazione tramite un adattatore.
   2. Metti il topo in un ambiente simile a una gabbia per la registrazione e lascia 10 minuti di acclimatazione dopo il risveglio.
   3. Eseguite la registrazione contemporaneamente al test di forza di presa, il mouse deve tirare la barra di prova una volta ogni minuto per 5 minuti.
   4. Assicurarsi che i test comportamentali siano con precisione timestampati sia nei sistemi di fotometria multicanale che in fibra per consentire l'allineamento dei dati (Figura 1D).
5. Stabilire un modello fototrombotico.
   1. Somministrare una soluzione di colorante di Rose Bengal all'1,5% intraperitonealmente (i.p.) a una dose di 10–20 mg/kg, attendere 5 minuti affinché il colorante circoli attraverso la vascolatura corticale.
      ATTENZIONE: Rose Bengal è un colorante fotosensibilizzante. Proteggi il reagente dalla luce ambientale intensa. Indossa guanti e protezione per gli occhi durante la maneggiazione.
   2. Anestesiare il topo con isoflurano seguendo gli stessi parametri di induzione e mantenimento descritti in precedenza.
   3. Quando il topo si trova in un piano anestetico profondo e mantenuto con una maschera anestesia, collega la sonda ottica dell'ottrodo alla sorgente laser.
   4. Indurre l'ischemia focale erogando un fascio laser a 530 nm a 15 mW attraverso l'optrodo impiantato per 5–8 minuti.
      ATTENZIONE: Il laser da 530 nm a 15 mW è pericoloso. Tutti i ricercatori devono indossare una protezione oculare per la sicurezza laser. Non guardare mai direttamente nella punta della fibra durante la fototrombosi.
6. Esegui la registrazione post-ictus.
   1. Metti il mouse su un tappetino riscaldato per il recupero. Una volta che il topo è completamente sveglio (normalmente entro 10 minuti), avvia la prima registrazione acuta post-ictus.
   2. Ripeti la registrazione ogni giorno per un attento monitoraggio dell'evoluzione della malattia.
7. Esegui manipolazioni optogenetiche.
   1. Oltre alla registrazione dei segnali di calcio e all'emissione del fascio laser per l'induzione ischemica, l'optrode è anche in grado di fornire stimolazione optogenetica, come mostrato nei risultati rappresentativi (Figura 4).
   2. Collega l'optrode a uno stimolatore laser optogenetico con la giusta lunghezza d'onda e potenza laser (in questo caso, è 488 nm, 10 mW, 5 min per opto-vTrap), e accendi lo stimolatore per eseguire la manipolazione optogenetica.

5. Pipeline di analisi dati multimodale

NOTA: Questa sezione illustra il flusso di lavoro di analisi per l'elaborazione dei dati elettrofisiologici multicanale (spike sorting), i segnali astrocitici di calcio (calcolo ΔF/F) e l'allineamento cross-modale dei due flussi di dati. Software richiesto: Plexon Offline Sorter (software offline per l'ordinamento degli spike), NeuroExplorer (software di analisi dei dati neurali) e software di analisi RWD OFRs (fotometria in fibra).

1. Ordinamento degli spike neuronali (Sistema Plexon):
   1. Importa i file grezzi .pl2 nel software offline per l'ordinamento degli spike. Applicare un filtro digitale passa-banda alta (<300 Hz) per isolare l'attività di picchi ad alta frequenza.
   2. Imposta una soglia di tensione (tipicamente -5 deviazioni standard del rumore) per rilevare picchi di potenziale.
   3. Dopo lo screening manuale e l'invalidazione delle forme d'onda del rumore, si utilizza la funzione di scansione nel software offline di spike sorting per eseguire l'analisi delle componenti principali (PCA) per raggruppare le forme d'onda e scansionare diversi cluster di^{neuroni 24}.
   4. Ispezionare gli istogrammi a intervalli inter-picchi (ISI). Assicurarsi che ogni "Unità Singola" abbia un tasso di violazione ISI del <1% (riflettendo il periodo refrattario). Il tasso di violazione ISI è mostrato nell'angolo in alto a sinistra di ciascuna unità nel software offline di spike sorting.
   5. Esporta i timestamp ordinati nel software di analisi dei dati neurali. Utilizza l'istogramma di velocità e gli istogrammi peri-eventi versus funzione temporale nel software di analisi dei dati neurali per generare istogrammi di velocità e istogrammi a tempo di peri-stimolo (PSTH).
   6. Riproduce la lunghezza media della forma d'onda e la velocità media di sparo di ogni unità dalla sezione statistica nel software di analisi dei dati neurali per ulteriori analisi.
2. Elaborazione del segnale di calcio astrocitario (software per l'analisi della fotometria delle fibre)
   1. Apri i dati grezzi di fluorescenza (canale 470 nm per il segnale e canale 410 nm per il controllo del movimento) nel software di analisi.
   2. Nella sezione pre-elaborazione del sistema di fotometria a fibra, esegui 410 nm come controllo per la correzione del movimento, imposta il coefficiente di livellatura a 8 e scegli PLS Fit come correzione di base.
   3. Calcola la variazione della fluorescenza (ΔF/F) usando la formula²⁵:
      
   4. Eseguire l'analisi del segnale di calcio degli astrociti basata su timestamp degli eventi, estrarre dati peri-eventi per la visualizzazione (ad esempio, heatmap e tracce medie) e calcolare l'area sotto la curva (AUC).
3. Correlazione sincronizzata astrocito-neurone
   1. Allinea i picchi neuronali e i segnali di calcio degli astrociti usando il timestamp dell'evento comportamentale condiviso come tempo zero.
   2. Dopo aver estratto i dati peri-evento, allinea i due flussi di dati a questo tempo condiviso a zero e visualizza la correlazione astrocito-neurone (Figura 3).

Risultati

Linea temporale sperimentale

La Figura 1 riassume la cronologia sperimentale e i principali punti di riferimento chirurgici. Un intervallo di tre settimane tra l'iniezione virale e l'impianto dell'optrodo è fondamentale per ottenere un'adeguata espressione di GCaMP6s, e segnali robusti di calcio astrocitici dovrebbero essere confermati esaminando le tracce di fotometria delle fibre durante il periodo di registrazi...

Discussione

Il protocollo integrato descritto qui rappresenta un significativo progresso nello studio delle interazioni astrocito-neuroni durante la progressione dell'ictus ischemico. Combinando l'induzione fototrombotica con il monitoraggio opto-elettrofisiologico in tempo reale e la manipolazione optogenetica, questa metodologia colma efficacemente il divario tra l'insorgenza dell'ictus e l'osservazione della riorganizzazione a livello di circuito di neuroni e astrociti. Lavori recenti di Boyce et...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2% TTC Staining Solution	Solarbio	G3005
Agorose	Biosharp	BS081
Body Temperature Maintenance System / Homeothermic Monitor	RWD life Science	69002
Cranial Screws	Zhongke Huida	23092007
Data Acquisition and Analysis Software(Fiber photometry)	RWD life Science	ORFs
Data Acquisition and Analysis Software(Multi-channel electrophysiology)	Plexon	PlexControl, Offline Sorter, Neuroexplorer
Digital laboratory stereotactic frame	RWD life Science	68804
Forcep	FST	11252-00	Forcep diametro 0,005 mm ´ 0,025 mm
Laser power meter	Sanwa	LP10
Laser Speckle Blood Flow Imaging System	Pericam AB	Pericam PSI NR
Mice	Risemice	C57BL/6J
Miniature handheld cranial drill	RWD life Science	78001
Mouse Viral Micro-injector	RWD life Science	68025
Optrode	Customized	Kedou	Personalizzato con 16 elettrodi in tungsteno che circondano 1 fibra ottica
Prism	GraphPad	5.01 version
R studio	Posit	version 4.4.1
rAAV-GfaABC1D-GCaMP6s	BrainVTA	PT-2560	Indicatore di calcio specifico per astrociti
rAAV-GfaABC1D-opto-vTrap	BrainCase	BC-2446	Vettore virale optogenetico specifico per astrociti
Rose Bengal Dye	Sigma-Aldrich	198250	Colorante fotosensibile per l'induzione del trombo/Sigma-Aldrich
Trolley-mounted anesthesia workstation	RWD life Science	R520	Macchina per l'anestesia per inalazione controllabile per topi