Qui presentiamo un protocollo per l'imaging intravitale di Mycobacterium tuberculosis approvato BSL-2 attenuato. Ceppo nel polmone murino utilizzando una finestra polmonare permanente. Questo approccio consente un'analisi longitudinale a risoluzione monocellulare delle prime interazioni ospite-patogeno, inclusa localizzazione bacillare, dinamica vascolare e assorbimento di macrofagi nello stesso microambiente polmonare.
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Articolo metodologico
Imaging intravitale dell'attenuazione dell'Auxotrophic Mycobacterium tuberculosis nel polmone murino durante l'infezione intravascolare precoce
In questo articolo
Sommario
Abstract
La microscopia intravitale consente la visualizzazione diretta dei processi cellulari dinamici all'interno dei tessuti intatti. Tuttavia, la sua applicazione a Mycobacterium tuberculosis (Mtb) è stata limitata dai requisiti di contenimento di Biosafety Level 3 (BSL-3) e dalle sfide tecniche di stabilizzazione del polmone per l'imaging ad alta risoluzione. Qui presentiamo un protocollo che combina la finestra toracica per l'imaging ad alta risoluzione del polmone murino (WHRIL) con mc27902, un ceppo di MTB triplo auxotrofo geneticamente definito e approvato per l'uso in condizioni BSL-2. Descriviamo inoltre la generazione dimc28471, un derivato di mc 2 7902 che esprime tdtomato, la sua preparazione per infezioni endovenose e l'applicazione per l'imaging intravitale nei topi reporter. Questo sistema consente la visualizzazione in tempo reale delle dinamiche precoci dell'infezione, inclusa la rapida introduzione bacillare nella vascolatura polmonare, aggregazione, diffusione nel parenchima polmonare e assorbimento di macrofagi nello stesso microambiente polmonare nei primi 3 giorni dopo l'infezione. Consentendo l'imaging longitudinale di bacilli e interazioni ospite–patogeno a risoluzione singola cellulare, questo approccio supera le principali limitazioni associate ai modelli convenzionali di imaging e ad alto contenimento. Questo protocollo fornisce una piattaforma pratica compatibile con BSL-2 per l'imaging intravitale in tempo reale dei micobatteri attenuati nei polmoni e stabilisce una base per studi meccanicistici sulla fisiologia batterica, il riconoscimento dell'ospite e la clearance mediata dal sistema immunitario.
Introduzione
La microscopia intravitale ad alta risoluzione ha trasformato lo studio del comportamento cellulare dinamico nei tessuti intatti permettendo la visualizzazione diretta della migrazione cellulare, delle interazioni vascolari e della sorveglianza immunitaria a risoluzioneunicellulare 1,2,3,4. Sebbene questi approcci siano ampiamente utilizzati nella ricerca sulcancro 3,5, la loro applicazione alle infezioni polmonari è stata limitata da problemi di movimento respiratorio, fragilità tissutale e biosicurezza. I recenti progressi nelle piattaforme di imaging toracico, inclusi i finestrini ottici stabilizzati dal vuoto e impiantati permanentemente, hanno affrontato molte di queste sfide tecniche fornendo immagini stabili e senza movimento del microambiente polmonare per periodiprolungati 6,7,8,9,10 . Le finestre impiantabili permanentemente, in particolare, sono strumenti potenti poiché permettono la visualizzazione ripetuta del flusso vascolare, della dinamica delle cellule immunitarie e del comportamento delle singole cellule per ore o settimane, e sono state fondamentali nella definizione dei meccanismi della metastasi tumorale, della permeabilità vascolare e della sorveglianzaimmunitaria 11,12.
Nonostante questi progressi, l'imaging intravitale non è mai stato precedentemente applicato all'infezione da Mycobacterium tuberculosis (Mtb) nel polmone mammifero in vivo a risoluzione unicellulare. I precedenti più vicini provengono dall'imaging intravitale delle infezioni micobatteriche in altri contesti. L'imaging in tempo reale dell'infezione da Mycobacterium marinum negli embrioni di pesce zebra13 ha rivelato interazioni precoce con i macrofagi e l'inizio del granuloma, mentre l'imaging a due fotoni dei granulomi indotti da BCG nelfegato del topo 14,15 ha rivelato dinamiche di macrofagi e cellule T durante lo sviluppo del granuloma e ha dimostrato una presentazione antigenica limitata e una funzione degli effettori delle cellule T all'interno delle lesioni granulomatose. Questi studi hanno stabilito intuizioni fondamentali sulle interazioni micobatteriche ospite-patogeno ma non hanno raggiunto il polmone intatto deimammiferi 8,16.
Approcci di imaging intravitale sono stati applicati anche al polmone in altri contesti infettivi e biologici, inclusi l'imaging polmonare generale8, studi che rivelano che la pattuglia dei macrofagi alveolari può nascondere i batteri dal sistemaimmunitario 17 e caratterizzano la risposta mieloide immediata all'infezione da SARS-CoV-2 nel polmoneumano 16. L'imaging intravitale è stato applicato analogamente ai polmoni infetti dall'influenza, consentendo una visualizzazione diretta del comportamento dinamico delle cellule immunitarie all'interno del tessuto polmonareinfetto 18,19.
Approcci di imaging ottico a corpo intero utilizzando la tecnologia di eccitazione microendoscopicaa fibre ottiche 20 e la fluorescenza enzimicareporter 21,22 hanno permesso la rilevazione sensibile della Mtb nei polmoni del topo, ma non possono rilevare singoli o piccoli gruppi di bacilli, monitorare la dinamica dell'aggregazione batterica o visualizzare interazioni dirette tra micobatteri e cellule ospiti all'interno del tessuto polmonare intatto. Approcci di imaging intravitale ad alto contenimento sono stati implementati per polmoni infetti in contesti BSL-3, inclusi i piattaformi di imaging multifotonico da SARS-CoV-223 eMtb-focalizzati su 24. Questi studi dimostrano la fattibilità di richiamare polmoni infetti sotto contenimento, ma tali sistemi restano tecnicamente impegnativi e non sono ampiamente accessibili. Il lavoro con Mtb virulento richiede il contenimento BSL-3, ponendo significative sfide ingegneristiche e di biosicurezza per l'imagingintravitale 23,24. Di conseguenza, la maggior parte degli studi sulle infezioni precoci da Mtb si basa su saghi statici di endpoint che non riescono a catturare la dinamica spaziale e temporale del comportamento batterico all'interno del polmone.
Lo sviluppo di ceppi di Mtb triple-auxotrofi, geneticamente definiti e approvati dalla BSL-2, offre un'opportunità unica per superare queste limitazioni. Il ceppo mc2 7902, un derivato auxotrofo Mtb di H37Rv in pantotenato-leucina-arginina, è completamente attenuato, non si replica nei topi immunocompromessi, mantiene la classica colorazione acido-fast, presenta una suscettibilità normale ai fagi e può essere maneggiato in sicurezza al di fuori delle struttureBSL-325. Queste proprietà rendono ilmc27902 un surrogato ideale per stabilire approcci di imaging intravitale e sondare le prime interazioni ospite-patogeno sotto un contenimento ridotto della biosicurezza.
Qui applichiamo la Finestra per l'Imaging ad Alta Risoluzione del Polmone (WHRIL) con mc28471, un derivato fluorescente che esprime tdTomato, del ceppo triplo auxotrofico di Mtb mc27902, per visualizzare l'infezione precoce da Mtb nel polmone murino intatto. Sono stati condotti esperimenti su topi immunodepressi Rag2-/- incrociati con topiMacBlue 27, in cui il promotore Csf1r guida l'espressione della proteina fluorescente ciano aumentata (ECFP) in monociti, microglie e sottoinsiemi di cellule dendritiche e macrofagi. Il transgene MacBlue consente una visualizzazione chiara delle popolazioni di fagociti mononucleari durante l'infezione precoce da Mtb. Abbiamo scelto di utilizzare topi carenti di Rag2 per concentrare il sistema sulle prime interazioni innate ospite-patogeno ed evitare la complessità aggiuntiva delle risposte immunitarie adattative durante la breve finestra di imaging esaminata qui. È importante notare che questa tecnica non è limitata ai topi carenti di Rag2 e può essere eseguita anche su animali immunocompetenti.
Combinando una finestra polmonare permanente con un ceppo di MTB fluorescente attenuato compatibile con BSL-2, questa piattaforma consente immagini intravitali seriali delle interazioni bacillo-cellula ospite nello stesso microambiente polmonare a risoluzione di singola cellula per più giorni. Sebbene dimostrata qui per infezioni precoci, la piattaforma stessa non è intrinsecamente limitata a punti temporali iniziali e potrebbe, in linea di principio, essere applicata a fasi successive a seconda del modello sperimentale e del disegno dello studio. Poiché l'applicazione efficace di questa piattaforma di imaging dipende dall'uso della specifica preparazione bacillare fluorescente descritta qui, abbiamo incluso i passaggi essenziali necessari per generare e preparare quel reagente come parte del protocollo completo. Questa piattaforma fornisce immagini dirette e in tempo reale del comportamento delle Mtb in vivo e stabilisce le basi per futuri studi meccanicistici sulla fisiologia batterica, il riconoscimento dell'ospite e la clearance mediata dal sistema immunitario.
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Protocollo
Tutte le procedure sono state condotte in conformità con le linee guida istituzionali per la biosicurezza e la cura degli animali e sono state approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) dell'Albert Einstein College of Medicine. La ceppa mc28471 è un trasformante pYUB1169 di mc27902, una ceppa Mtb tripla auxotrofa approvata per l'uso BSL-2. Tutti i lavori che coinvolgevano batteri vivi venivano eseguiti con le precauzioni standard per la gestione dei micobatteri.
1. Costruzione del ceppo MTB a espressione tdTomato approvato dalla BSL-2 mc28471
- Generazione di MSL-2-2 sicuro per espressione di tdTomato, mc28471 tramite trasformazione plasmidiale
- Trasformare il ceppo triplo-auxotrofico approvato dalla BSL-2 mc27902 con il plasmide micobatterico episomale pYUB1169, che contiene il gene tdTomato espresso dal promotore G13, per generare il derivato fluorescente mc28471.
- Inoculare 100 μL di mc2 7902(densità ottica a 600 nm (OD600 nm) di 0,7-1,0) in 10 mL di Middlebrook 7H9 sterile integrato con arricchimento OADC (10% (v/v)), glicerolo (0,2% (v/v)), D-pantotenato (24 mg/L), L-leucina (50 mg/L), L-arginina (200 mg/L), propionato di sodio (0,1 mM) e tyloxapol (0,05% (v/v)) in una bottiglia da 30 mL per calamaio da 30 mL.
- Incubare la coltura, scuotendo lentamente (100 giri/min) a 37 °C fino a raggiungere un OD600 nm di 0,7-1,0.
- Trasferire le celle in un tubo centrifugo conico da 15 mL e centrifugare per 10 minuti a 3.000 x g a temperatura ambiente. Scartare il soprandanante e risospendere le cellule in 10 mL di glicerolo sterile al 10% contenente 0,05% (v/v) di tiloxapol (lavaggio #1). Ripeti centrifugazione e lavaggi due volte. Risospendere il pellet cellulare in 0,175 mL di glicerolo al 10% contenente 0,05% (v/v) di tiloxapol e aggiungere 2 μL di DNA pYUB1169 (100-200 ng di DNA).
- Trasferire mc27902 e pYUB1169 in una cuvetta elettroporazione da 0,2 cm. Aspetta 10 minuti. Tocca la cuvetta 2-3 volte per rimuovere le bolle d'aria ed elettropora a 2.500 mV, 1.000 Ω, 25 μF, costante temporale 20 ms, a temperatura ambiente.
- Aggiungere 1 mL di Middlebrook 7H9 sterile integrato con arricchimento OADC (10% (v/v)), glicerolo (0,2% (v/v)), D-pantotenato (24 mg/L), L-leucina (50 mg/L), L-arginina (200 mg/L), propionato di sodio (0,1 mM) e tiloxapol (0,05% (v/v)) alla cuvetta e trasferire il contenuto della cuvetta in un tubo centrifuga conico da 15 mL. Incubare il tubo mentre si scuote a 37 °C durante la notte.
- Placca 0,1 mL della miscela di trasformazione su una piastra agar Middlebrook 7H10 integrata con arricchimento OADC (10% (v/v)), glicerolo (0,2% (v/v)), D-pantotenato (24 mg/L), L-leucina (50 mg/L), L-arginina (200 mg/L), propionato di sodio (0,1 mM) e kanamicina (20 mg/L). Centrifugare la miscela di trasformazione residua, scartare 0,9 mL del sovrantantante e risospendere la pellet cellulare nel sovrantaente residuo. Placca le cellule risospese su una seconda piastra agar Middlebrook 7H10 contenente gli stessi integratori e antibiotici. Incubare le piastre a 37 °C per 3–4 settimane. Le colonie rosa indicano trasformanti di successo.
- Scegli una colonia rosa isolata e coltivala a 37 °C, scuotendo lentamente, in 5 mL di Middlebrook 7H9 sterile integrato con arricchimento OADC (10% (v/v)), glicerolo (0,2% (v/v)), D-pantotenato (24 mg/L), L-leucina (50 mg/L), L-arginina (200 mg/L), propionato di sodio (0,1 mM), tyloxapol (0,05% (v/v)) e 20 mg/L kanamicina in una bottiglia da 30 mL da calamaio da 30 mL.
- Preparazione del MC28471 per infezione endovenosa
- Coltivare 10 mL dimc28471 a 37 °C, agitando lentamente, in Middlebrook 7H9 sterile integrato con arricchimento OADC (10% (v/v)), glicerolo (0,2% (v/v)), D-pantotenato (24 mg/L), L-leucina (50 mg/L), L-arginina (200 mg/L), propionato di sodio (0,1 mM), tiloxapol (0,05% (v/v)) e 20 mg/L di kanamicina in una bottiglia da 30 mL da calamaio fino alla fase mid-log (OD600 nm dovrebbe essere tra 0,7 e 1,0).
- Trasferire le celle in un tubo centrifugo conico da 15 mL e centrifugare per 10 minuti a 3.000 x g a temperatura ambiente. Scartare il soprandanante e risospendere le cellule in 10 mL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato contenente 0,05% (v/v) di tyloxapol (PBS-T, lavaggio #1). Ripeti centrifugazione e lavaggi due volte. Risospendere la pellet cellulare in 4 mL di PBS-T e sonicare le celle a una potenza di 100 W, 2x 1.000 J.
- Misurare la densità ottica della coltura e diluirla in PBS-T per una concentrazione finale di 5 x 106 CFU per iniezione, usando la conversione approssimativa che un OD600 nm di 1 corrisponde a 1 x 108 CFU/mL. Poiché questa relazione può variare con le condizioni di deformazione e crescita, OD600 nm dovrebbe essere calibrato empiricamente rispetto ai valori di CFU placcati per garantire accuratezza e riproducibilità.
2. Impianto permanente di finestra polmonare nei topi per imaging intravitale
- Prepara un mouse Rag2KO MacBlue per l'imaging intravitale. In questo studio è stato utilizzato un maschio di 10 settimane di 30 g. Tuttavia, topi di entrambi i sessi, tra le 8 e le 12 settimane di età, e nell'intervallo di peso previsto per quell'età, sono adatti a questa procedura. Questo ceppo esprime proteina ciano fluorescente (ECFP) potenziata nei macrofagi su uno sfondo knockout Rag2 ed è stato generato incrociando topi B6.129S6-Rag2tm1FwaN12 (Rag2, Modello RAGN12) con topi Tg (Csf1r-GAL4/VP16, UAS-ECFP)1Hume/J (Stock n. 026051).
- Impiantare la finestra per l'imaging ad alta risoluzione del polmone (WHRIL) 24 ore prima dell'infezione batterica per garantire un accesso ottico stabile al polmone e consentire il recupero prima dell'imaging artificiale.
- Indurre anestesia con isoflurano al 5% in una camera di induzione. Confermare la profondità adeguata dell'anestesia prima di iniziare qualsiasi procedura e monitorare l'animale durante l'intervento chirurgico e l'imaging per prevenire dolore, disagio o compromissione respiratoria.
- Somministrare analgesia preoperatoria: iniettare 10 μL (0,1 mg/kg) di buprenorfina diluita in 90 μL di PBS sterile sottocutanea.
- Applicare una pomata oftalmica su entrambi gli occhi per evitare la secchezza corneale durante l'anestesia.
- Lega una sutura di seta 2-0 alla base di un catetere da 22G, lasciando code di ~2 pollici per fissare il catetere.
- Intuba il topo con il catetere legato con sutura. Visualizza l'apertura tracheale tramite transilluminazione e conferma la posizione usando una lampadina di gonfiaggio (rialzo bilaterale del torace).
NOTA: Un'intubazione impropria può causare traumi alle vie aeree o ventilazione inadeguata. Procedere solo dopo che la corretta posizione è confermata dall'espansione bilaterale del torace. - Fissa il catetere di intubazione legando la sutura di seta 2-0 intorno al muso dopo l'intubazione riuscita. Collega il catetere al ventilatore.
- Posizionare il topo nel decubito laterale destro su una piattaforma chirurgica riscaldata per esporre il torace sinistro, poi fissare gli arti anteriori, gli arti posteriori e la schiena con del nastro adesivo per mantenere una posizione stabile durante tutta la procedura.
- Riduci l'isoflurano al 3% per il resto dell'intervento. Rimuovere i peli dal torace superiore sinistro usando una crema depilatoria.
- Prepara il campo chirurgico con una soluzione antisettica. Sollevare la pelle e eseguire un'incisione circolare di 5-10 mm con un punzone biopsico (33-35-SH) circa 7 mm a sinistra dello sterno e 7 mm sopra il margine sottocostale, centrata sopra il 6° e il 7° spazio intercostale.
- Ispezionare il campo esposto per contenere vasi superficiali. Se è necessaria la divisione di un vaso visibile, cauterizzare entrambe le estremità per mantenere l'emostasi. Rimuovere i tessuti molli sovrastanti per esporre chiaramente le costole prima di entrare nella cavità toracica.
- Afferra e solleva la sesta o settima costola con la pinza e perfora delicatamente il muscolo intercostale tra di esse usando forbici micro-dissezionanti smussate (lato arrotondato rivolto verso il polmone) per entrare nella cavità toracica.
NOTA: Entra nella cavità toracica con delicatezza e sotto visualizzazione diretta per evitare di lacerare il polmone, i vasi intercostali o i tessuti circostanti. - Applica brevi e delicati scarichi d'aria compressa all'apertura intercostale per sgonfiare temporaneamente la superficie polmonare adiacente e separarla dalla parete toracica prima di creare l'apertura della finestra.
- Posiziona il punzone per la biopsia sullo strumento da taglio e guida lo strumento attraverso l'apertura intercostale, mantenendolo parallelo alla parete toracica. Inserisci un difetto circolare di 5 mm nella gabbia toracica.
- Posizionare una sutura a borsa in seta 5-0 a ~1 mm dal bordo del difetto circolare, passando tra le costole adiacenti per circondare l'apertura.
- Posiziona il telaio della finestra in modo che i bordi del difetto della parete toracica si adattino alla scanalatura del telaio, poi stringi e fissa la sutura a cordino per bloccare il telaio in posizione.
- Carica l'adesivo gel di cianoacrilato in una siringa da 1 mL. Solleva delicatamente il telaio per separarlo dal polmone, poi applica uno strato sottile di adesivo cianoacrilato sulla superficie inferiore del telaio.
- Asciuga la superficie del polmone usando un flusso continuo e delicato di aria compressa finché la superficie non appare opaca.
NOTA: Usa solo un flusso d'aria delicato ed evita l'asciugatura prolungata, poiché una forza eccessiva o l'eccessiva seccazione possono danneggiare la superficie polmonare e compromettere l'adesione della finestra. - Utilizzando pressione espertiva positiva (PEEP), gonfia il polmone e poi attacca la finestra al telaio. Rilascia il PEEP e mantieni la pressione sul telaio della finestra per 20-30 secondi.
NOTA: Una pressione eccessiva durante il gonfiaggio o il posizionamento del telaio può danneggiare il polmone o compromettere la tenuta. Applica solo la pressione minima necessaria per ottenere un'apposizione delicata. - Posizionare una seconda sutura a borsa in seta 5-0 a <1 mm dal bordo dell'incisione cutanea. Infila la pelle sotto la cornice, assicurati che eventuali eccessi di pelle vengano catturate sotto il telaio o rifilate, poi stringi bene la sutura a borsa e lega saldamente.
- Utilizzando un pickup a vuoto, applica uno strato molto sottile di adesivo sotto il copricapo da 5 mm, raschiando via l'eccesso sul bordo di un vetro rettangolare. Ancora una volta, asciuga la superficie polmonare con un flusso continuo e delicato di aria compressa.
- Posizionare il voglio circolare all'interno della cavità del telaio della finestra con un angolo ridotto (~15°) sopra la superficie polmonare. Aumentare brevemente la pressione delle vie aeree per gonfiare il polmone, poi ruotare il coperchio in una posizione parallela in modo che la superficie polmonare si opponga alla parte inferiore del vetro. Mantieni una pressione delicata per circa 25 secondi mentre l'adesivo si fissiona, poi stacca il pickup a vuoto dal copertore.
NOTA: Evitare di intrappolare bolle o applicare eccesso di adesivo durante il posizionamento del copertore, poiché ciò può ridurre la qualità dell'immagine, disturbare la tenuta o danneggiare la superficie polmonare. - Applica una piccola quantità di cianoacrilato liquido all'interfaccia tra il copertino e la struttura metallica per rafforzare la tenuta ermetica.
- Attacca un ago sterile a una siringa di insulina da 1 mL. Inserire l'ago appena sotto il processo xifoide e avanzare verso la spalla sinistra attraverso il diaframma nella cavità toracica. Aspirare delicatamente per rimuovere l'aria residua intratoracica.
NOTA: Avanza con attenzione l'ago per evitare di perforare polmone, cuore o vasi principali. Aspira delicatamente e solo finché l'aria residua non viene rimossa. - Spegni l'isoflurano e continua la ventilazione con ossigeno al 100% finché una frequenza respiratoria quasi normale da sveglio non è quasi ripresa. Non lasciare l'animale incustodito durante il recupero. Se la respirazione spontanea normale non riprende tempestivamente, fornire cure di supporto adeguate o sopportare l'eutanasia secondo le linee guida istituzionali.
- Rimuovi il punto di sutura di sicurezza, estuba il topo e mettilo in una gabbia pulita e riscaldata per il recupero. Monitorare l'animale fino a quando non è completamente deambulato; I topi che non riescono a recuperare la respirazione normale dovrebbero essere soppressi secondo le linee guida istituzionali.
- Somministrare analgesia post-operatoria: iniettare 10 μL (0,1 mg/kg) di buprenorfina diluita in 90 μL di PBS sterile sottocutanea.
3. Imaging intravitale
- Permettere ai topi di recuperare dopo l'impianto della finestra prima dell'imaging (imaging). Eseguire esami di imaging da 1 a 5 giorni dopo l'intervento.
- Indurre anestesia con isoflurano al 3%, poi mantenere l'1,5% per tutta la durata dell'imaging.
- Inserire l'adattatore personalizzato per piastra da palco-telaio tra la pelle e il bordo esterno del telaio polmonare e fissare una piastra standard per il microscopio con nastro adesivo.
- Posiziona il mouse con l'adattatore personalizzato per la piastra e la finestra del palco collegato al palco di traslazione del microscopio. Mantieni la temperatura corporea a ~37 °C usando una camera riscaldata ad aria forzata con circuito di feedback del sensore di temperatura.
- Con il topo sulla piastra dello stadio, tira delicatamente indietro la pelle intorno all'occhio sul lato iniezione per esporre il canto mediale e inietta FITC-destroano (150 kDa; 20 mg/mL, 100 μL) retro-orbitalmente per etichettare la vascolatura.
- Acquisire immagini istantanee, z-stack o time-lapse della vascolatura polmonare prima dell'iniezione batterica utilizzando i seguenti parametri.
- Per le impostazioni della microscopia confocale: Profondità bit: 12 bit, Frame rate: 2 fps, Dimensione immagine: 512 × 512 pixel, Dimensione dei pixel: 0,497 μm/pixel, 0,994 μm/pixel, Dimensione Z-step: 2 μm, Profondità Z totale: 50–70 μm, Media frame: 3, Velocità di scansione: 2 μs/pixel (977 linee/s), Lunghezze d'onda di eccitazione laser: 405 nm, 488 nm, 559 nm, Potenza laser al campione: 230 μW (405 nm), 75 μW (488 nm), 40 μW (559 nm), Filtri di rilevamento: 430-470 nm (Blu), 505-540 nm (Verde), 575-675 nm (Rosso), Guadagni del rivelatore: 800 V per il Blu, 650 V per il Verde, 700 V per il Rosso, Diametro del foro stenopeico: 60 μm o 1 unità Airy per 559 nm
- Per la microscopia multifotonica, si utilizzano gli stessi parametri di imaging usati per la microscopia confocale, tranne che è stato utilizzato un laser di eccitazione da 920 nm con potenza laser di 25 mW al campione.
- Iniettare retro-orbitalmente 5 x 106 CFU tdPomato-expressing mc28471.
NOTA: Eseguire le iniezioni retro-orbitali solo con adeguata formazione e contenzione, poiché una tecnica impropria può causare lesioni oculari, sanguinamento o mancata somministrazione dell'inocolo. - Acquisire immagini istantanee, z-stack e time-lapse di tubercolosi e cellule e vascolarità marcate fluorescentmente utilizzando i parametri di imaging in 3.6.1 e 3.6.2. Regolare il guadagno di tutti i rivelatori per massimizzare il segnale evitando la saturazione del rilevatore.
- Dopo l'imaging, disattiva l'isoflurano e rimuovi il topo dal microscopio. Tieni il topo al caldo e monitora fino alla guarigione completa.
- Ripeti l'imaging nei seguenti momenti dopo l'iniezione di MC28471: 0-60 min, 6 ore e 3 giorni. Per ogni sessione di imaging, reiniettare FITC-destrono (100 μL, retro-orbitalmente) per visualizzare la vascolatura, quindi acquisire immagini come descritto nei passaggi 3.8-3.9.
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Risultati
Dopo l'elettroporazione e la selezione della kanamicina, le colonie isolate di mc28471 hanno mostrato una fluorescenza rosso brillante, confermando un'espressione stabile di tdTomatoes. I bacilli MC28471 sono stati espansi, preparati come sospensione a cellula singola e somministrati per via endovenosa a topi portatori di WHRIL impiantata chirurgicamente. Sono state effettuate immagini intravitali per visualizzare le dinamiche precoci delle infezioni da Mtb nel micr...
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Discussione
Questa piattaforma colma una vera lacuna nella ricerca sulla tubercolosi consentendo la visualizzazione diretta delle interazioni bacilli e cellula ospite all'interno del polmone intatto del mammifero in condizioni BSL-2. Le precedenti strategie di imaging in vivo, inclusa la rilevazione ottica a tutto il corpo tramite eccitazione microendoscopicaa fibra ottica 20, imaging a fluorescenza enzimatica con enzimireporter 21 e Mtb
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non esserci interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro fu sostenuto dalle seguenti sovvenzioni: AI26170; La Fondazione della Famiglia Evelyn-Lipper e il Centro Biofotonico Gruss Liper. Riconosciamo il sostegno della Analytical Imaging Facility, supportata dal NCI Cancer Center Grant P30 CA013330.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 15 ml conical tube | Corning | 430790 | |
| 2-0 silk tie | Ethicon, Inc | LA55G | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| 5-0 silk purse-string suture | Ethicon, Inc | 640G | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Iniezione di 10 μL di buprenorfina (soluzione stock 0,3 mg/mL) diluito in 90 μL di PBS sterile (dose finale = 0,1 mg/kg) |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 234790 | |
| D-calcium pantothenate | Acros | 243305000 | |
| ECM 630 Electroporation System Complete, with Safety stand | BTX Harvard Apparatus | 45-0051 | |
| Electroporation cuvette | Fisher Scientific | FB102 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S-1G | 150 kDa |
| Glycerol | Fisher Chemicals | G33-1 | |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | Per afferrare ed elevare la costola durante la procedura di impianto della finestra polmonare |
| Isoflurane | Pivetal | 78949580 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Kanamycin | Goldbio.com | K-120-25 | |
| L-arginine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | A5131-100G | |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| MacBlue mice | Jackson Labs | Strain #: 026051 | |
| Middlebrook 7H10 Agar | Difco | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 broth | Difco | 271310 | |
| Middlebrook OADC Enrichment | Becton Dickinson | 212351 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| PETG media inkwell bottle | Thermo Scientific | 342020 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-5623 | Per monitorare il volume tidale del topo tramite intubazione durante l'intervento chirurgico |
| Plasmid pYUB1169 | Plasmid personalizzato | ||
| Rag2 KO mice | Jackson Labs | Strain #: 008449 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Sodium propionate | Thermo Scientific | A17440.36 | |
| Sonicator | Fisher Scientific | FB705 | |
| Sorval Centrifuge X pro series | Thermo Scientific | 75009020 | |
| Spectrophotometer Genesys 10 UV | Thermo Spectronic | 335903 | |
| SurgiSuite | Kent Scientific | SURGI-M02 | Piattaforma chirurgica multifunzionale per topi, con riscaldamento |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22G |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T0307-50G | |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
Riferimenti
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