Disfunzione della barriera intestinale mediata da NEAT1 attraverso il legame con miR-29b-3p in cellule Caco-2 danneggiate da lipopolisaccaride

Sommario

Questo studio ha valutato NEAT1 come marcatore diagnostico e regolatore della disfunzione della barriera intestinale nella sindrome dell'intestino irritabile con diarrea predominante. NEAT1 era aumentato nel siero dei pazienti, si legava a miR-29b-3p e il suo silenziamento ha migliorato i parametri relativi alla barriera, all'apoptosi e all'infiammazione in cellule Caco-2 danneggiate dal lipopolisaccaride.

Abstract

La patogenesi della sindrome dell'intestino irritabile con diarrea (IBS-D) non è chiara e le terapie disponibili rimangono limitate. Questo studio ha valutato il valore diagnostico di NEAT1 nell'IBS-D ed ha esplorato il suo potenziale meccanismo regolatorio. Sono stati inclusi complessivamente 116 pazienti con IBS-D e 116 controlli sani. I livelli sierici di NEAT1 e di miR-29b-3p sono stati rilevati mediante PCR quantitativa in tempo reale con trascrizione inversa (RT-qPCR), e le curve ROC (caratteristica operativa del ricevitore) sono state utilizzate per valutare il valore diagnostico. Per gli studi meccanicistici, è stato stabilito un modello di cellule epiteliali intestinali Caco-2 trattate con lipopolisaccaride (LPS). La vitalità cellulare è stata valutata mediante saggio Cell Counting Kit-8 (CCK-8), l'apoptosi mediante citometria a flusso, l'integrità della barriera mediante resistenza elettrica transepiteliale (TEER) e i livelli di mRNA di ZO-1, occludina e claudina-2 mediante RT-qPCR. Saggi di reporter a doppia luciferasi (DLR) e saggi di immunoprecipitazione dell'RNA (RIP) sono stati utilizzati per verificare la relazione di legame tra NEAT1 e miR-29b-3p. NEAT1 era altamente espresso, mentre miR-29b-3p era scarsamente espresso nei pazienti con IBS-D, e i loro livelli mostravano una forte correlazione negativa. L'abbattimento di NEAT1 ha aumentato i livelli di miR-29b-3p, migliorato la vitalità cellulare e la TEER, ridotto l'apoptosi, aumentato i livelli di mRNA di ZO-1 e di occludina, diminuito i livelli di mRNA di claudina-2 e attenuato i parametri associati al danno della barriera nelle cellule Caco-2 trattate con LPS. Nel complesso, questi risultati indicano che NEAT1 sierico rappresenta un biomarcatore candidato per l'IBS-D e che l'asse NEAT1/miR-29b-3p potrebbe essere coinvolto nella disfunzione della barriera intestinale.

Introduzione

La sindrome dell'intestino irritabile con diarrea (IBS-D) è un comune disturbo funzionale gastrointestinale caratterizzato da dolore addominale, distensione addominale e alterazioni dell'alvo¹. Al momento, il meccanismo fisiopatologico alla base dell'IBS-D non è stato completamente chiarito². I metodi di trattamento si limitano principalmente al sollievo sintomatico, con efficacia ridotta e un'elevata percentuale di recidive³. Si ritiene generalmente che l'IBS-D coinvolga l'interazione di diversi fattori, come la disregolazione dell'asse cervello-intestino, l'ipersensibilità viscerale, un'infiammazione intestinale di basso grado e un malfunzionamento della barriera intestinale^4,5. Sebbene tali criteri abbiano in parte standardizzato la diagnosi, essi sono di natura soggettiva e possono portare a ritardi diagnostici o a errori di classificazione, in particolare quando i sintomi del paziente si sovrappongono a quelli della malattia infiammatoria intestinale o di altre patologie organiche. Nella pratica clinica di routine, al momento non esistono biomarcatori oggettivi validati per l'IBS-D. Pertanto, individuare un nuovo bersaglio molecolare che possa fungere da strumento diagnostico e abbia un potenziale valore terapeutico è diventata un'esigenza urgente nel campo attuale della ricerca sull'IBS-D.

Negli ultimi anni, gli RNA non codificanti lunghi, come molecole chiave nella regolazione epigenetica, hanno dimostrato un notevole potenziale come marcatori diagnostici e bersagli terapeutici in una varietà di malattie^6,7. La causa principale dell'IBS-D è il deterioramento della funzione della barriera intestinale⁸. La distruzione delle proteine delle giunzioni strette porta a una "perdita intestinale", che a sua volta attiva la risposta immunitaria della mucosa^9,10. L'attivazione del sistema immunitario rilascia numerosi fattori pro-infiammatori che possono causare disfunzione intestinale attivando il sistema immuno-nervoso intestinale. Studi hanno indicato che alcuni lncRNA possono regolare la barriera epiteliale intestinale^11,12. Si è riportato che NEAT1 è sovraespresso nel tessuto della mucosa colica di pazienti con colite¹³. L'inibizione dell'lncRNA NEAT1 può alleviare la disfunzione delle cellule epiteliali intestinali (IECs) nella colite ulcerosa¹⁴. Tuttavia, il profilo di espressione di NEAT1 nell'IBS-D e il suo valore diagnostico non sono ancora stati indagati. Inoltre, NEAT1 potrebbe avere un potenziale come biomarcatore diagnostico¹⁵. Se NEAT1 è espresso in modo anomalo nel siero dei pazienti con IBS-D, ciò potrebbe integrare i criteri attuali di Roma IV fornendo uno strumento diagnostico molecolare. Nel frattempo, anche il profilo di espressione dei miRNA è significativamente alterato nei pazienti con IBS. Ad esempio, la downregolazione dell'espressione di miR-29b-3p è stata associata alla patogenesi dell'IBS¹⁶. Tuttavia, i meccanismi regolatori a monte che governano l'espressione di miR-29b-3p nell'IBS-D rimangono completamente inesplorati. In particolare, il ruolo di NEAT1 come RNA endogeno competitivo (ceRNA) per miR-29b-3p nel contesto dell'IBS-D non è mai stato studiato, sebbene questo meccanismo sia ben consolidato in altre malattie^17,18. Inoltre, mentre studi precedenti si sono concentrati principalmente sull'espressione a livello tissutale, il potenziale di NEAT1 circolante come biomarcatore sierico non invasivo per la diagnosi dell'IBS-D rimane completamente sconosciuto.

Ipotesi che l'RNA lungo non codificante NEAT1 possa partecipare alla regolazione della funzione della barriera intestinale nell'IBS-D agendo come ceRNA che assorbe miR-29b-3p. Sulla base del suddetto contesto di ricerca, lo scopo di questo studio è: (1) valutare i livelli di NEAT1 e miR-29b-3p nel siero dei pazienti affetti da IBS-D e il loro valore diagnostico; (2) confermare l'interazione diretta di legame tra NEAT1 e miR-29b-3p; e (3) chiarire il ruolo funzionale dell'asse NEAT1/miR-29b-3p nella regolazione dell'integrità della barriera intestinale e dell'infiammazione, utilizzando un modello cellulare di Caco-2 trattato con LPS.

Protocollo

Inclusione dei pazienti

Tutti i partecipanti hanno fornito un consenso informato scritto dopo aver compreso pienamente il contenuto della ricerca. Il Comitato Etico dell'Ospedale Popolare della Nuova Area di Pudong, Shanghai, ha esaminato e approvato il protocollo di ricerca (n. 2024k007). La dimensione del campione è stata calcolata utilizzando G*Power: il test selezionato è stato un test t, progettato per rilevare differenze tra due campioni indipendenti. Con una dimensione dell'effetto d = 0,5, α = 0,05 e potenza = 0,9, il calcolo ha indicato che ogni gruppo dovrebbe includere almeno 86 soggetti. Per tenere conto di eventuali circostanze impreviste durante lo studio, sono stati arruolati 116 pazienti per ciascun gruppo. In totale, 116 pazienti con SII-D che si sono recati presso l'Ospedale Popolare della Nuova Area di Pudong, Shanghai, tra luglio 2024 e luglio 2025, sono stati inclusi nello studio come gruppo sperimentale. I criteri di inclusione erano: (1) SII-D conforme ai criteri diagnostici di Roma IV; (2) colonscopia che indicasse l'assenza di lesioni organiche della mucosa. Criteri di esclusione: (1) pazienti con malattia infiammatoria intestinale (IBD), cancro del colon-retto, ecc.; (2) pazienti diabetici; (3) pazienti con storia recente di interventi chirurgici addominali; e (4) pazienti con insufficienza grave cardiaca, epatica o renale. Contemporaneamente, sono stati reclutati 116 volontari sani, abbinati ai pazienti per caratteristiche demografiche come età e sesso, come gruppo di controllo. Ai controlli sani è stato confermato l'assenza di storia di malattie gastrointestinali croniche o di sintomi clinici corrispondenti. Da tutti i soggetti è stato prelevato 5 mL di sangue venoso periferico. Il soprannatante è stato quindi trasferito in un congelatore a temperatura ultra-bassa a -80 °C per la criopreservazione, in previsione dell'estrazione successiva di RNA.

A ogni partecipante è stato somministrato un questionario della durata di 10 giorni per registrare le seguenti manifestazioni cliniche: (a) valutazione della gravità del dolore addominale mediante una scala analogica visiva da 0 a 10; (b) frequenza del dolore addominale durante il periodo di osservazione (numero di giorni con dolore); (c) frequenza delle evacuazioni intestinali (numero massimo di evacuazioni al giorno); (d) Scala delle Caratteristiche Fecali di Bristol per la valutazione delle caratteristiche delle feci. Lo stato emotivo dei soggetti è stato valutato mediante la Scala dell'Ansia e della Depressione in Ambiente Ospedaliero (HADS).

Coltura cellulare e modellizzazione

Le cellule Caco-2 sono state coltivate regolarmente in mezzo Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina, in un incubatore a 37 °C e 5% CO₂. La linea cellulare Caco-2 si differenzia spontaneamente in un monostrato polarizzato di cellule con giunzioni strette e microvilli, mostrando caratteristiche morfologiche e funzionali simili a quelle delle cellule epiteliali intestinali mature. L'LPS induce una risposta infiammatoria e altera le giunzioni strette nell'epitelio intestinale, aumentando la permeabilità intestinale—un processo molto simile alle caratteristiche patologiche dell'IBS-D. Inoltre, poiché le cellule Caco-2 trattate con LPS sono state ampiamente utilizzate in studi precedenti^19,20,21 per modellare la disfunzione della barriera e l'infiammazione associate all'IBS, il trattamento con lipopolisaccaride (LPS) delle cellule Caco-2 è stato scelto in questo studio per stabilire un modello in vitro di IBS-D. Una volta che le cellule avevano raggiunto una confluenza di circa l'80%, il mezzo di coltura è stato sostituito con mezzo completo contenente 5 µg/ml di LPS²², e le cellule sono state stimolate per 24 ore. Le cellule coltivate convenzionalmente senza LPS sono state utilizzate come gruppo di controllo.

Trasfezione cellulare

Per studiare i ruoli di NEAT1 e miR-29b-3p nelle cellule Caco-2, le cellule Caco-2 sono state trasfettate. Le cellule sono state suddivise in sei gruppi come segue: 1. gruppo di controllo (nessun trattamento); 2. gruppo LPS; 3. gruppo LPS + si-NC; 4. gruppo LPS + si-NEAT1; 5. gruppo LPS + si-NEAT1 + inibitore NC; e 6. gruppo LPS + si-NEAT1 + inibitore di miR-29b-3p. Sono stati progettati e sintetizzati due RNA interferenti piccoli (si-NEAT1) mirati a NEAT1: si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) e si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′). È stato utilizzato un siRNA con sequenza casuale non mirata (si-NC) come controllo negativo. Nel frattempo, sono stati sintetizzati anche l'inibitore di miR-29b-3p e il suo controllo negativo. Inibitore di miR-29b-3p: 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’. Controllo negativo: 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’.

Le cellule Caco-2 sono state seminate in piastre a 24 pozzetti e trasfettate una volta raggiunta una confluenza del 60–70%, seguendo il protocollo del produttore. In breve, 1,25 µL di siRNA sono stati diluiti in 25 µL di mezzo con siero ridotto per ottenere una concentrazione finale di siRNA di 50 nM. Per l'inibizione del miRNA, 2 µL dell'inibitore di miR-29b-3p o del suo controllo negativo sono stati diluiti in 25 µL di mezzo con siero ridotto fino a una concentrazione finale di 100 nM. Separatamente, 1,5 µL del reagente di trasfezione sono stati mescolati con 25 µL di mezzo con siero ridotto. L'siRNA diluito (o l'inibitore/il controllo negativo) è stato quindi mescolato con il reagente di trasfezione diluito per formare il complesso di trasfezione, che è stato aggiunto alle cellule goccia a goccia. Sei ore dopo la trasfezione, la miscela di trasfezione è stata sostituita con mezzo completo fresco e le cellule sono state mantenute per ulteriori 48 h prima dei saggi funzionali successivi. L'efficienza dell'abbattimento o dell'inibizione è stata confermata mediante RT-qPCR prima di ulteriori esperimenti.

PCR quantitativa in tempo reale con trascrizione inversa (RT-qPCR)

L'RNA totale è stato isolato da campioni di siero e da cellule Caco-2 sottoposte ai trattamenti indicati. In breve, ogni campione è stato lisato con 1 mL di reagente per l'estrazione dell'RNA e combinato con 200 µL di cloroformio. Dopo centrifugazione a 12.000 × g per 15 min a 4 °C, la fase acquosa superiore è stata trasferita in una provetta nuova, mescolata con 500 µL di isopropanolo e mantenuta a −20 °C per 30 min. I campioni sono stati quindi centrifugati a 12.000 × g per 10 min a 4 °C. Il pellet di RNA ottenuto è stato lavato due volte con etanolo al 75%, essiccato all'aria e risospeso in 20 µL di acqua priva di RNasi. Il rendimento e la purezza dell'RNA sono stati misurati mediante microspettrofotometro, e sono stati considerati solo campioni con A₂₆₀/A₂₈₀ valori compresi tra 1,8 e 2,0 sono stati utilizzati. L'RNA è stato trascritto a ritroso in cDNA seguendo il protocollo del produttore. Per il rilevamento di NEAT1, ZO-1, occludina, claudina-2, e GAPDH, 1 µg di RNA totale è stato utilizzato per ogni reazione di trascrizione inversa in un volume di 20 µL contenente 1× tampone RT, 0,5 mM dNTPs, 0,5 µM primer oligo(dT), 200 U di trascrittasi inversa e acqua priva di RNasi. La reazione è stata eseguita a 37 °C per 15 min, seguita dall'inattivazione dell'enzima a 85 °C per 5 s.

La PCR quantitativa è stata eseguita utilizzando il cDNA come stampo mediante un sistema di PCR in tempo reale basato sul colorante SYBR Green. NEAT1, miR-29b-3p, ZO-1, occludina, e I livelli di espressione della claudina-2 sono stati misurati con primers specifici per il gene. U6 è stato utilizzato come gene di riferimento per miR-29b-3p, mentre GAPDH è stato impiegato per la normalizzazione NEAT1 e geni correlati alle giunzioni strette. L'espressione relativa è stata calcolata utilizzando il metodo 2−ΔΔCt. Le sequenze dei primer sono elencate in Tabella 1.

Saggio di vitalità cellulare

Le cellule Caco-2 in fase logaritmica sono state seminate in piastre a 96 pozzetti a una densità di 1 × 10⁴ cellule per pozzetto. Sono stati allestiti un gruppo di controllo bianco (contenente solo il mezzo di coltura), un gruppo di controllo (cellule non trattate) e un gruppo sperimentale (cellule Caco-2 sottoposte a diverse condizioni di trattamento), con 5–6 pozzetti replicati per ogni gruppo. Le cellule sono state assegnate a quattro diversi tempi: 0, 24, 48 e 72 h. Per ogni punto temporale è stata preparata una piastra di coltura separata, al fine di evitare aperture ripetute dell'incubatore durante le misurazioni. Al termine del periodo di coltura, sono stati aggiunti 10 µL di soluzione CCK-8 in ogni pozzetto, evitando la formazione di bolle. Successivamente, la piastra è stata rimessa in un incubatore a 37 °C e 5% di CO₂ e incubata al buio per 2 h. L'assorbanza di ogni pozzetto è stata misurata immediatamente a 450 nm mediante un lettore di micropiastre. Infine, la vitalità cellulare è stata espressa in percentuale.

Saggio di apoptosi cellulare

L'apoptosi è stata quantificata mediante citometria a flusso dopo colorazione con Annexina V-FITC/PI. Le cellule Caco-2 di ciascun gruppo di trattamento sono state raccolte e lavate due volte con PBS freddo. La centrifugazione è stata eseguita a 300 × g per 5 min a 4 °C. Il pellet cellulare è stato quindi risospeso in 100 µL di buffer di legame 1×, seguito dall'aggiunta sequenziale di 5 µL di Annexina V-FITC e 5 µL di PI. Dopo un'accurata miscelazione, i campioni sono stati incubati per 15 min a temperatura ambiente al buio. Successivamente, sono stati aggiunti 300 µL di buffer di legame 1×, e la sospensione è stata mescolata delicatamente prima di essere trasferita in un tubo da citometria a flusso da 5 mL. I campioni sono stati analizzati mediante citometria a flusso entro 1 h.

Resistenza elettrica transepiteliale (TEER)

La permeabilità è stata valutata misurando i valori di resistenza transepiteliale (TEER) delle cellule Caco-2²³. Le cellule Caco-2 sono state inoculate in camere Transwell e coltivate per 21 giorni per formare un monolayer denso. Sono state effettuate sei repliche biologiche indipendenti per ciascuna condizione sperimentale e, inoltre, cinque repliche tecniche per ogni condizione. Prima e dopo il trattamento sperimentale, i valori di TEER di ciascun gruppo sono stati misurati mediante un misuratore di resistenza transepiteliale, utilizzando elettrodi sterilizzati con etanolo ed equilibrati con PBS. In breve, la sonda lunga dell'elettrodo è stata immersa nel mezzo di coltura basolaterale e quella corta nel mezzo di coltura apicale, evitando il contatto con la membrana filtrante. Dopo il raggiungimento della stabilità, è stato registrato il valore di resistenza (Ω) e la misurazione è stata ripetuta fino a ottenere tre letture concordanti. La resistenza dei filtri Transwell vuoti (senza cellule) è stata misurata nelle stesse condizioni e tale valore è stato sottratto da tutte le letture sperimentali. TEER (Ω·cm²) = (resistenza del campione – resistenza del bianco) × area effettiva della membrana. I dati sono espressi come: (gruppo sperimentale/gruppo di controllo) × 100%.

Saggio immunoenzimatico (ELISA)

I soprannatanti delle cellule Caco-2 provenienti da diversi gruppi di trattamento sono stati raccolti dopo 24 ore di coltura. I livelli di citochine pro-infiammatorie, tra cui il fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α), l'interleuchina-6 (IL-6), l'interleuchina-8 (IL-8) e l'interleuchina-1β (IL-1β), sono stati misurati utilizzando reagenti ELISA commerciali seguendo le istruzioni del produttore. Il saggio è stato eseguito rigorosamente secondo le istruzioni fornite. I campioni e gli standard sono stati aggiunti alle pozzette pre-ricoperte con anticorpi, quindi incubati e lavati. Successivamente, è stato aggiunto l'anticorpo di rilevamento biotinilato. Dopo un'ulteriore incubazione e lavaggio, è stata aggiunta la streptavidina marcata con perossidasi di rafano. Infine, è stato aggiunto il substrato TMB per lo sviluppo del colore e la reazione è stata arrestata con la soluzione di arresto. L'assorbanza di ogni pozzetta è stata misurata immediatamente a 450 nm utilizzando un lettore per micropiastre.

Western blot

Le proteine sono state isolate da cellule Caco-2 dopo i trattamenti indicati utilizzando un tampone RIPA contenente inibitori delle proteasi. I livelli proteici sono stati misurati mediante un saggio con acido bicinconinico (BCA). Per ogni campione, sono stati caricati 30 µg di proteina per pozzetto, risolti su gel di elettroforesi SDS-PAGE al 10% e trasferiti su membrane in PVDF. Le membrane sono state bloccate in latte scremato al 5% per 1 h a temperatura ambiente e successivamente incubate tutta la notte a 4 °C con anticorpi diretti contro ZO-1 (1:1.000), occludina (1:500), claudina-2 (1:1.000) e GAPDH (1:5.000). Dopo i lavaggi, le membrane sono state incubate con anticorpi secondari marcati con HRP per 1 h a temperatura ambiente. Le bande sono state rivelate mediante chemiluminescenza migliorata (ECL) e l'intensità delle bande è stata analizzata utilizzando ImageJ. GAPDH è stato utilizzato come controllo di caricamento.

Saggio del reporter dual-luciferasi (DLR)

I potenziali siti di legame di miR-29b-3p con la sequenza di NEAT1 sono stati predetti mediante il database ENCORI (https://rnasysu.com/encori/). Successivamente, frammenti di NEAT1 contenenti siti di legame di tipo selvaggio (WT) o mutati (MUT) sono stati clonati nel vettore reporter pmirGLO. Il plasmide ricombinante costruito è stato co-trasfettato nelle cellule insieme a mimici di miR-29b-3p (Sense: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’; Antisense: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’) o inibitori e rispettivi controlli negativi (mimic NC, Sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’; Antisense: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’). Quarantotto ore dopo la trasfezione, le cellule sono state raccolte e le attività della luciferasi di fotino e della luciferasi renilla sono state determinate utilizzando un reagente di rilevamento a doppia luciferasi. L'attività della luciferasi renilla è stata utilizzata come riferimento interno per la standardizzazione.

Saggio di immunoprecipitazione dell'RNA (RIP)

Per il saggio RIP, le cellule Caco-2 sono state raccolte, lavate con PBS e incubate sul ghiaccio per 15 min in 200 µL di buffer di lisi RIP supplementato con inibitori di proteasi e RNasi. I lisati cellulari sono stati centrifugati a 16.000 × g per 10 min a 4 °C e 10 µL di ciascun sopranatante sono stati conservati come controllo di input. Per l'immunoprecipitazione, 40 µL di perle magnetiche Protein A/G sono stati posti in rotazione con 5 µg di anticorpo anti-Ago2 o IgG normale in 200 µL di buffer di lavaggio RIP per 30 min a temperatura ambiente. Dopo tre lavaggi con 500 µL di buffer di lavaggio RIP, 100 µL della sospensione di perle sono stati combinati con 100 µL di lisato, portati a un volume finale di 1 mL con buffer di lavaggio RIP ed incubati tutta la notte a 4 °C con rotazione. Le perle sono state quindi lavate cinque volte con 500 µL di buffer di lavaggio RIP e risospese in 150 µL dello stesso buffer. La digestione proteica è stata eseguita aggiungendo 15 µL di proteinasi K (20 mg/mL) e 15 µL di SDS al 10%, seguita da incubazione a 55 °C per 30 min con agitazione. Il sopranatante è stato raccolto e l'RNA è stato isolato con il reagente di estrazione e precipitato tutta la notte. L'arricchimento di NEAT1 e miR-29b-3p è stato quindi valutato mediante RT-qPCR.

Analisi della localizzazione subcellulare

Le cellule Caco-2 sono state separate in frazioni nucleare e citoplasmatica utilizzando il reagente commerciale disponibile in commercio per la separazione nucleo-citoplasmatica, seguendo le istruzioni del produttore. L'RNA totale è stato estratto da questi due componenti e la distribuzione di NEAT1 nel nucleo e nel citoplasma è stata rilevata mediante RT-qPCR. La calibrazione è stata eseguita utilizzando U6 (prevalentemente nucleare) e l'mRNA di GAPDH (prevalentemente citoplasmatico) come indicatori dell'efficienza di separazione.

Analisi statistica

Per campioni clinici di siero, un'analisi della potenza statistica (t-test, d = 0,5, α = 0,05, potenza = 0,9) ha indicato che era richiesto un minimo di 86 soggetti per gruppo. Per tenere conto di eventuali circostanze impreviste durante lo studio, sono stati arruolati 116 pazienti per ciascun gruppo al fine di rilevare differenze clinicamente significative. La normalità dei dati per le variabili continue è stata valutata mediante il test di Shapiro-Wilk. Poiché tutti i dati continui erano distribuiti normalmente (P > 0,05), sono state applicate analisi parametriche. Le variabili categoriche sono state analizzate utilizzando il test del chi-quadro. Gli esperimenti su cellule hanno incluso sei repliche biologiche indipendenti, con cinque repliche tecniche per ciascuna replica biologica. I dati sono espressi come media ± DS. I confronti tra due gruppi di variabili continue sono stati effettuati mediante il test t di Student, mentre i confronti tra più gruppi sono stati analizzati mediante ANOVA ad un fattore seguita dal test post hoc di Tukey. L'importanza statistica è stata definita come P < 0,05.

Risultati

Espressione di NEAT1 e valore diagnostico

Rispetto al gruppo di controllo sano (HC), NEAT1 i livelli di espressione nei pazienti con SII-D erano notevolmente più elevati (P < 0.0001; Figura 1A). L'area sotto la curva (AUC) di NEAT1, come mostrato dalla curva ROC (caratteristica operativa del ricevitore), era di 0,867 (IC 95%: 0,821–0,913). La sua specificità era del 75,9%, mentre la sensibilità era dell'84,5% (Figura 1B). Ciò suggerisce che anomalie NEAT1 l'espressione nel siero dei pazienti con SII-D potrebbe rappresentare un nuovo biomarcatore diagnostico per la condizione.

Inoltre, sono stati confrontati i dati clinici dei pazienti nei gruppi sani e con IBS-D. I risultati hanno mostrato nessuna differenza significativa tra i due gruppi per età, sesso o altre caratteristiche (P > 0,05). Tuttavia, sono state osservate differenze significative nei punteggi HADS, nella frequenza delle evacuazioni intestinali e nella forma delle feci (P < 0,0001, Tabella 2). Per quanto riguarda la frequenza del dolore addominale, 69 pazienti hanno riportato sintomi per ≥ 5 giorni, pari al 59,48% dei casi. Per quanto riguarda la gravità del dolore addominale, 72 pazienti hanno ottenuto un punteggio ≥ 5, pari al 62,07% (Tabella 2). Ciò indica che i pazienti con IBS-D sono chiaramente distinguibili dal gruppo di controllo in base ai loro sintomi. Data l'associazione clinica tra l'aumento di NEAT1 e i sintomi dell'IBS-D, abbiamo successivamente analizzato l'impatto funzionale di NEAT1 sull'integrità della barriera intestinale utilizzando un modello cellulare di Caco-2 trattato con LPS.

Effetti di bassi livelli di NEAT1 sul danno alla barriera intestinale e sulle risposte infiammatorie in cellule Caco-2 trattate con LPS

Per modellare la disfunzione della barriera intestinale e l'infiammazione di basso grado osservata nella SII-D, abbiamo trattato le cellule Caco-2 con LPS. Quando l'LPS è stato aggiunto alle cellule, i livelli di NEAT1 sono risultati upregolati rispetto al gruppo di controllo. Dopo la trasfezione con si-NEAT1, il livello di NEAT1 è risultato marcatamente ridotto rispetto al gruppo LPS + si-NC (P < 0,0001, Figura 2A). Il trattamento con LPS ha ridotto la vitalità cellulare e aumentato l'apoptosi rispetto al gruppo di controllo. Dopo l'abbattimento di NEAT1, la vitalità cellulare è aumentata e il tasso di apoptosi è diminuito rispetto al gruppo LPS + si-NC (P < 0,001; Figura 2B,C). Dopo l'abbattimento di NEAT1, il valore di TEER ridotto dall'LPS è stato significativamente ripristinato (P < 0,0001, Figura 2D). L'LPS ha ridotto l'espressione mRNA di ZO-1 e occludina e aumentato l'espressione di claudina-2 rispetto ai controlli, mentre l'abbattimento di NEAT1 ha invertito questi effetti (P < 0,001, Figura 2E-G). Il trattamento con LPS può innescare una risposta infiammatoria nelle cellule. I livelli dei fattori pro-infiammatori TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-1β nelle cellule erano più elevati rispetto al gruppo di controllo. Dopo l'abbattimento di NEAT1, i livelli di questi fattori pro-infiammatori sono risultati significativamente ridotti rispetto al gruppo si-NC (P < 0,0001, Figura 3A-D). Questo suggerisce che livelli ridotti di NEAT1 attenuano la disfunzione della barriera intestinale e le risposte infiammatorie indotte dall'LPS e che NEAT1 possa contribuire alla progressione della SII-D.

Legame diretto di NEAT1 ed effetti su miR-29b-3p in cellule Caco-2

Nelle cellule Caco-2, NEAT1 è presente principalmente nel citoplasma (Figura 4A). I siti di legame di NEAT1 e miR-29b-3p sono stati predetti tramite il database ENCORI. Sulla base di questi dati, abbiamo progettato le sequenze WT-NEAT1 e MUT-NEAT1 (Figura 4B). I risultati sperimentali del saggio DLR hanno mostrato che i mimici di miR-29b-3p riducevano l'attività enzimatica di WT-NEAT1 rispetto al controllo negativo (mimic NC), mentre gli inibitori aumentavano tale attività rispetto al controllo inibitore (inhibitor NC). Al contrario, nessuno dei due trattamenti ha avuto effetto su MUT-NEAT1 (P < 0.0001, Figura 4C). Il saggio RIP ha rivelato che NEAT1 e miR-29b-3p erano notevolmente abbondanti nella frazione anti-Ago2 rispetto al gruppo anti-IgG, indicando un'interazione specifica tra i due (P < 0.0001, Figura 4D). Questi risultati indicano che NEAT1 si lega specificamente a miR-29b-3p. Nel frattempo, il livello di miR-29b-3p era significativamente ridotto nei pazienti con IBS-D rispetto al gruppo HC (P < 0.0001, Figura 4E). L'AUC della curva ROC era pari a 0,856 (IC 95%: 0,808–0,905), con una sensibilità del 89,7% e una specificità del 71,6% (Figura 4F). L'analisi della correlazione di Pearson ha evidenziato una correlazione inversa tra i livelli di NEAT1 e l'espressione di miR-29b-3p (r = -0,744, P < 0,0001, Figura 4G).

Effetti della bassa espressione di NEAT1 sul danno alla barriera intestinale in cellule Caco-2 trattate con LPS e sui livelli di miR-29b-3p

In cellule Caco-2 trattate con LPS, l'espressione di miR-29b-3p è risultata notevolmente ridotta rispetto al gruppo di controllo. La trasfezione con si-NEAT1 ha aumentato i livelli di miR-29b-3p, mentre la trasfezione con l'inibitore di miR-29b-3p ha nuovamente ridotto i livelli di miR-29b-3p (P < 0,0001, Figura 5A). L'abbassamento di NEAT1 ha aumentato la vitalità cellulare e ridotto l'apoptosi, e questi effetti sono stati annullati dall'inibitore di miR-29b-3p (P < 0,01, Figura 5B,C). La riduzione indotta da LPS del valore TEER è stata ripristinata dall'abbassamento di NEAT1, e tale ripristino è stato nuovamente impedito dall'inibitore di miR-29b-3p (P < 0,0001, Figura 5D). Il trattamento con LPS ha determinato una riduzione dell'espressione di mRNA di ZO-1 e occludina e un aumento dell'espressione di mRNA di claudina-2 rispetto al gruppo di controllo. Dopo l'abbassamento di NEAT1, i livelli di miR-29b-3p sono aumentati, i livelli di mRNA di ZO-1 e occludina sono aumentati e i livelli di mRNA di claudina-2 sono diminuiti rispetto al gruppo LPS + si-NC. Dopo l'inibizione di miR-29b-3p, i livelli di mRNA di ZO-1 e occludina sono diminuiti, mentre i livelli di mRNA di claudina-2 sono aumentati rispetto al gruppo LPS + si-NEAT1 + inibitore NC (P < 0,001, Figura 5E-G). NEAT1 (principalmente il sottotipo citoplasmatico NEAT1_1) agisce da spugna per miR-29b-3p. L'abbassamento di NEAT1 libera miR-29b-3p, regolando così indirettamente per aumento ZO-1 e occludina e per riduzione la claudina-2, attenuando la rottura della barriera indotta da LPS. Questi risultati suggeriscono che, in questo modello, miR-29b-3p regola positivamente l'espressione di ZO-1 e occludina e negativamente la claudina-2, e che gli effetti dell'abbassamento di NEAT1 sono mediati, almeno in parte, da miR-29b-3p.

Abbiamo inoltre esaminato i livelli di espressione delle proteine delle giunzioni strette mediante analisi di western blot. Come mostrato nella Figura 5H, l'abbattimento di NEAT1 ha aumentato l'espressione di ZO-1 e occludina ridotta dal LPS e ha soppresso l'espressione di claudina-2 rispetto al gruppo LPS + si-NC. Tuttavia, la co-trasfezione con un inibitore di miR-29b-3p ha indebolito l'effetto protettivo dell'abbattimento di NEAT1 rispetto al gruppo LPS + si-NEAT1 + inibitore NC. Questi risultati supportano la conclusione che l'abbattimento di NEAT1 ripristina l'espressione delle proteine delle giunzioni strette, almeno in parte attraverso la regolazione positiva di miR-29b-3p, migliorando così la funzione della barriera intestinale.

Effetti di livelli bassi di NEAT1 sull'infiammazione intestinale in cellule Caco-2 trattate con LPS e sull'espressione di miR-29b-3p

In cellule Caco-2 trattate con LPS, l'LPS ha innescato una risposta infiammatoria. I livelli dei fattori pro-infiammatori TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-1β erano significativamente più elevati rispetto al gruppo di controllo. Dopo l'abbattimento di NEAT1, i livelli di miR-29b-3p sono aumentati, mentre i livelli dei fattori pro-infiammatori sono diminuiti significativamente rispetto al gruppo si-NC. Dopo l'inibizione di miR-29b-3p, i livelli dei fattori infiammatori sono nuovamente aumentati (P < 0,0001, Figura 6A-D). Pertanto, l'abbattimento di NEAT1 sopprime il rilascio di citochine infiammatorie, almeno in parte, attraverso la regolazione positiva di miR-29b-3p.

Questi risultati indicano che i livelli di NEAT1 sono anormalmente elevati nel siero dei pazienti con IBS-D e che NEAT1 presenta un'area sotto la curva (AUC) elevata per distinguere i pazienti con IBS-D dai controlli sani. Dal punto di vista meccanicistico, NEAT1 si lega direttamente a miR-29b-3p nel citoplasma, trattenendolo. Nei modelli cellulari e negli esperimenti di recupero funzionale, l'abbattimento di NEAT1 ha aumentato l'espressione di miR-29b-3p, migliorato la sopravvivenza cellulare e la resistenza transepiteliale (TEER), ridotto l'apoptosi e attenuato il rilascio di citochine pro-infiammatorie. Questi dati supportano l'ipotesi che NEAT1 regoli negativamente l'integrità della barriera intestinale inibendo miR-29b-3p e suggeriscono che il targeting di NEAT1 potrebbe rappresentare una strategia diagnostica e terapeutica potenziale per l'IBS-D.

Disponibilità dei dati:

I dati grezzi sottostanti alle figure e alle tabelle sono forniti come File Supplementare 1 (foglio di calcolo dei dati grezzi) e File Supplementare 2 (immagini non modificate dei western blot).

Figura 1. Espressione e valore diagnostico di NEAT1 in pazienti con IBS-D. (A) Livelli di espressione di NEAT1 nel siero di controlli sani (HC, n = 116) e di pazienti con IBS-D (n = 116) rilevati mediante RT-qPCR; (B) Analisi della curva ROC di NEAT1 per discriminare i pazienti con IBS-D dai controlli sani. I dati sono espressi come media ± DS (n = 116 per gruppo). **** P < 0,0001. Abbreviazioni: IBS-D = sindrome dell'intestino irritabile con diarrea; ROC = caratteristica operativa del ricevitore. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2. Effetto di NEAT1 sul danno alla barriera intestinale indotto da LPS in cellule Caco-2. (A) La trasfezione con si-NEAT1 riduce i livelli di NEAT1 indotti da LPS; (B) Viabilità cellulare misurata mediante saggio CCK-8 a 0, 24, 48 e 72 h. L'abbattimento di NEAT1 migliora la viabilità cellulare; (C) Tasso di apoptosi determinato mediante citometria a flusso con colorazione Annexin V-FITC/PI. L'abbattimento di NEAT1 riduce il tasso di apoptosi; (D) Resistenza elettrica transepiteliale (TEER) misurata in monociti di Caco-2. L'inibizione di NEAT1 aumenta il TEER cellulare; (E-G) Livelli di espressione di mRNA di (E) ZO-1, (F) occludina e (G) claudina-2 misurati mediante RT-qPCR. L'abbattimento di NEAT1 aumenta l'espressione di mRNA di ZO-1 e occludina, riduce i livelli di mRNA di claudina-2. I dati sono espressi come media ± DS di sei esperimenti indipendenti (n = 6 per gruppo). *** P < 0,001; **** P < 0,0001, LPS rispetto al controllo, LPS + si-NEAT1 rispetto a LPS + si-NC. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3. Effetto del silenziamento di NEAT1 sul rilascio di citochine pro-infiammatorie indotto da LPS in cellule Caco-2. (A-D) Concentrazioni di (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-8 e (D) IL-1β nei soprannatanti di colture cellulari misurate mediante saggio ELISA. Il silenziamento di NEAT1 riduce i livelli di TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-1β indotti da LPS. I dati sono espressi come media ± DS di sei esperimenti indipendenti (n = 6 per gruppo). **** P < 0,0001, LPS rispetto al controllo, LPS + si-NEAT1 rispetto a LPS + si-NC. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4. Legame diretto di NEAT1 e associazione con miR-29b-3p. (A) Localizzazione subcellulare di NEAT1 in cellule Caco-2 determinata mediante frazionamento nucleo-citoplasmatico (U6: controllo nucleare, GAPDH: controllo citoplasmatico). NEAT1 si trova principalmente nel citoplasma; (B) Sequenze di legame previste di tipo selvaggio (WT) e mutante (MUT) di NEAT1 per miR-29b-3p ottenute dal database ENCORI; (C) Il saggio DLR ha confermato la relazione di legame tra NEAT1 e miR-29b-3p; (D) L'analisi RIP ha verificato la relazione di legame tra NEAT1 e miR-29b-3p. I dati in A, C e D rappresentano la media ± DS di sei esperimenti indipendenti (n = 6 per gruppo). (E) Livelli di espressione sierici di miR-29b-3p in controlli sani (HC, n = 116) e pazienti con IBS-D (n = 116); (F) Curva ROC di miR-29b-3p per discriminare i pazienti con IBS-D dai controlli sani; (G) Analisi di correlazione di Pearson tra i livelli di NEAT1 e miR-29b-3p nei pazienti con IBS-D. NEAT1 era negativamente correlato con l'espressione di miR-29b-3p (r = -0,744, P < 0,0001). I dati in E sono espressi come media ± DS (n = 116 per gruppo). **** P < 0,0001. Abbreviazioni: WT = tipo selvaggio; MUT = mutante; DLR = saggio con reporter bivalente della luciferasi; RIP = immunoprecipitazione dell'RNA. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5. Effetti dell'abbattimento di NEAT1 sulla funzione della barriera intestinale in cellule Caco-2 trattate con LPS e su miR-29b-3p. (A) L'abbattimento di NEAT1 aumenta i livelli di miR-29b-3p, mentre la trasfezione con inibitori di miR-29b-3p riduce l'espressione di miR-29b-3p. (B) Viabilità cellulare misurata mediante saggio CCK-8. Bassi livelli di NEAT1 migliorano la viabilità cellulare aumentando miR-29b-3p; (C) Tasso di apoptosi determinato mediante citometria a flusso. Bassi livelli di NEAT1 riducono il tasso di apoptosi aumentando miR-29b-3p; (D) Bassi livelli di NEAT1 aumentano la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) delle cellule innalzando il livello di miR-29b-3p; (E-G) Espressione mRNA di (E) ZO-1, (F) occludina e (G) claudina-2. Bassi livelli di NEAT1 aumentano l'espressione di ZO-1 e di occludina e riducono l'espressione di mRNA di claudina-2 potenziando miR-29b-3p. (H) Rappresentative immagini di immunoblotting Western che mostrano l'espressione proteica di ZO-1, occludina, claudina-2 e GAPDH nelle condizioni di trattamento indicate. I dati sono espressi come media ± DS di sei esperimenti indipendenti (n = 6 per gruppo). ** P < 0,01; *** P < 0,001; **** P < 0,0001, LPS rispetto al controllo, LPS + si-NEAT1 rispetto a LPS + si-NC, LPS + si-NEAT1 + miR-inibitore rispetto a LPS + si-NEAT1 + inibitore NC. Abbreviazione: miR-inibitore = inibitore di miR-29b-3p; TEER = resistenza elettrica transepiteliale. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6. Effetti dell'abbattimento di NEAT1 sull'infiammazione in cellule Caco-2 trattate con LPS e miR-29b-3p. (A-D) Concentrazioni di (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-8 e (D) IL-1β nei supernatanti cellulari misurate mediante ELISA. Bassi livelli di NEAT1 riducono il contenuto di TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-1β nel supernatante cellulare aumentando miR-29b-3p. I dati sono espressi come media ± DS di sei esperimenti indipendenti (n = 6 per gruppo). **** P < 0,0001, LPS rispetto al controllo, LPS + si-NEAT1 rispetto a LPS + si-NC, LPS + si-NEAT1 + miR-inibitore rispetto a LPS + si-NEAT1 + inibitore NC. Abbreviazione: miR-inibitore = inibitore di miR-29b-3p. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gene	Sequenza dei primer
NEAT1 forward	5’-GTGGCTGTTGGAGTCGGTAT-3’
NEAT1 reverse	5’-TAACAAACCACGGTCCATGA-3’
ZO-1 forward	5’-GCCGCTAAGAGCACAGCAA-3′
ZO-1 reverse	5’-TCCCCACTCTGAAAATGAGGA-3’
Occludin forward	5’-ATGGCAAAGTGAATGACAAGCGG-3’
Occludin reverse	5’-CTGTAACGAGGCTGCCTGAAGT-3’
Claudin-2 forward	5’-GTGACAGCAGTTGGCTTCTCCA-3’
Claudin-2 reverse	5’-GGAGATTGCACTGGATGTCACC-3’
miR-29b-3p forward	5’-GCTCTAGATCAGTTACAGAAAGACCACGA-3’
miR-29b-3p reverse	5’-GCTCTAGATAGTGTCCATGCACGGACC-3’
GAPDH forward	5’-CCAGGTGGTCTCCTCTGA-3’
GAPDH reverse	5’-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3’
U6 forward	5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’
U6 reverse	5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’

Tabella 1: Sequenze dei primer.

Indicatore	Gruppo di controllo (N=116)	Gruppo IBS-D (N=116)	P
Età, anni
< 40	63	54	0.293
≥ 40	53	62
Sesso
Maschio	64	66	0.895
Femmina	52	50
Fumo
NO	58	53	0.599
SI	58	63
Consumo di alcol
NO	63	58	0.599
SI	53	58
HADS, punteggio
< 8	96	26	< 0.0001
≥ 8	20	90
Numero di evacuazioni intestinali, numero/giorno
< 4	103	51	< 0.0001
≥ 4	13	65
Forma delle feci, punteggio di Bristol
< 5	87	25	< 0.0001
≥ 5	29	91
Frequenza del dolore addominale, numero di giorni
< 5	/	47	/
≥ 5	/	69
Gravità del dolore addominale, punteggio
< 5	/	44	/
≥ 5	/	72

Tabella 2: Confronto delle caratteristiche demografiche e cliniche tra controlli sani e pazienti con SII-D. I valori sono riportati come numero di partecipanti per ciascun gruppo (n = 116/gruppo). Le differenze tra i gruppi sono state valutate mediante il test del chi-quadrato. Abbreviazione: HADS = Scala di Ansia e Depressione Ospedaliera; IBS-D = sindrome dell'intestino irritabile con diarrea.

File Supplementare 1: Dati grezzi alla base delle figure e delle tabelle. Questo file contiene i dati numerici grezzi utilizzati per generare i risultati quantitativi mostrati in Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, e Figura 6, e i dati demografici/clinici riassunti in Tabella 2.Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Immagini non modificate dei blot occidentali. Questo file contiene le immagini non modificate dei blot occidentali per ZO-1, occludina, claudina-2 e GAPDH corrispondenti al pannello rappresentativo del blot occidentale mostrato in Figura 5H.Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

L'IBS-D è un comune disturbo funzionale del tratto gastrointestinale. Il suo meccanismo patologico non è ancora stato completamente chiarito. Negli ultimi anni, gli lncRNA, come molecole chiave nella regolazione epigenetica, hanno mostrato un notevole potenziale nel campo della diagnosi e del trattamento delle malattie. L'lncRNA NEAT1 è stato studiato in diverse patologie, come il cancro del colon-retto²⁴, il glioma²⁵ e l'infarto miocardico²⁶. Diversi studi hanno dimostrato che NEAT1 è coinvolto nella regolazione delle risposte infiammatorie¹³, della proliferazione cellulare²⁷ e dell'integrità della barriera intestinale²⁸. Tuttavia, l'espressione specifica di NEAT1 nell'IBS-D, il suo valore clinico e i meccanismi regolatori alla base dell'IBS-D non sono ancora stati approfonditi in modo esaustivo.

NEAT1 è upregolato in diverse condizioni infiammatorie, come polmonite²⁹, osteoartrite³⁰, rinite³¹ e sepsi³². I nostri risultati sono in linea con quelli riportati in questi studi: l'espressione di NEAT1 è significativamente upregolata nei pazienti con SII-D. Ciò suggerisce che potrebbe essere associata all'insorgenza del SII-D. Attualmente, la diagnosi del SII-D si basa principalmente sui criteri sintomatologici di Roma IV, e non sono disponibili biomarcatori di laboratorio oggettivi. Sebbene questi criteri si siano dimostrati efficaci nella ricerca e in molti contesti clinici, presentano comunque limitazioni, tra cui soggettività, sovrapposizione dei sintomi con altre malattie e ritardi diagnostici. Un'ulteriore analisi della curva ROC indica che NEAT1 possiede un valore diagnostico relativamente buono nei pazienti con SII-D. I livelli sierici di espressione di NEAT1 distinguono efficacemente i pazienti con SII-D dai controlli sani, con un AUC di 0,867 e alta sensibilità e specificità. Ciò suggerisce che NEAT1 potrebbe rappresentare uno strumento utile per integrare i criteri di Roma IV nella diagnosi o come nuovo marcatore diagnostico per il SII-D. Ad esempio, nei pazienti che presentano dolore addominale cronico e alterazioni dell'alvo, livelli elevati di NEAT1 potrebbero consentire una valutazione più affidabile quando i risultati del biomarcatore vengono considerati insieme ai criteri di Roma IV. Questo approccio facilita l'avvio precoce di trattamenti mirati ai sintomi ed evita esami invasivi non necessari. Al contrario, nei pazienti con risultati normali del biomarcatore ma che soddisfano i criteri di Roma IV, è consigliabile un monitoraggio più accurato per escludere altre malattie organiche. Pertanto, l'integrazione di questi biomarcatori nella pratica clinica potrebbe migliorare l'accuratezza e l'efficienza diagnostica, sebbene sia ancora necessaria una validazione prospettica in contesti clinici.

I sintomi clinici riscontrati nei pazienti con SII-D potrebbero essere correlati a un'alterata funzione della barriera intestinale³³. Tale funzione è mediata principalmente dalla struttura delle giunzioni strette (TJ) tra le cellule epiteliali intestinali, con le proteine ZO-1 e occludina che svolgono ruoli importanti^34,35. ZO-1 è coinvolta nel mantenimento della barriera meccanica e della permeabilità dell'epitelio mucoso³⁶. L'occludina è principalmente responsabile della formazione delle giunzioni strette tra le cellule, fondamentali per il mantenimento della loro funzione di barriera³⁷. La proteina delle giunzioni strette claudina-2 svolge un ruolo importante nella formazione dei canali di bypass cellulare, tra le altre funzioni³⁸. Nei pazienti con SII-D, ZO-1 e occludina sono generalmente ridotte, la claudina-2 è aumentata, la barriera intestinale è danneggiata e la permeabilità è aumentata. Questo studio ha evidenziato che il silenziamento di NEAT1 aumenta il valore di TEER nel modello cellulare in vitro, supportando un effetto dannoso di NEAT1 sulla barriera intestinale in questo modello. A livello molecolare, l'inibizione dell'espressione di NEAT1 ha determinato un significativo recupero dei livelli di espressione mRNA delle principali proteine delle giunzioni strette ZO-1 e occludina, mentre l'espressione della claudina-2 è diminuita. Ciò suggerisce che NEAT1 possa regolare negativamente l'espressione delle proteine delle giunzioni strette, alterando la barriera fisica dell'epitelio intestinale e aumentandone la permeabilità. In definitiva, questo può portare al fenomeno del "intestino permeabile". Inoltre, l'infiammazione a basso grado, ampiamente diffusa nel SII-D, rappresenta un fattore importante che aggrava il danno alla barriera³⁹. Numerosi studi hanno confermato che gli RNA lunghi non codificanti (lncRNA) possono agire come nodi regolatori chiave nelle vie di segnalazione infiammatoria⁴⁰. La nostra ricerca è coerente con queste evidenze. Il silenziamento di NEAT1 riduce in modo significativo il rilascio delle citochine pro-infiammatorie TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-1β indotto da LPS. Questo effetto è molto simile al ruolo svolto da NEAT1 come lncRNA pro-infiammatorio in altri modelli infiammatori, indicando che nel SII-D potrebbe esistere un circolo vizioso infiammazione-danno alla barriera-infiammazione, in cui NEAT1 svolge un ruolo importante.

I microRNA (miRNA) sono un'altra importante classe di fattori coinvolti nella regolazione delle malattie. È stato osservato che miR-29b-3p è poco espresso in varie risposte infiammatorie cellulari indotte da LPS^41,42. In accordo con la maggior parte degli studi, abbiamo riscontrato che i livelli di miR-29b-3p erano notevolmente ridotti nel siero dei pazienti con SII-D e mostravano una forte correlazione negativa con l'upregolazione di NEAT1. Abbiamo inoltre dimostrato che NEAT1 si lega direttamente a miR-29b-3p e lo assorbe nel citoplasma in questo modello. L'esperimento di recupero funzionale ha ulteriormente mostrato che NEAT1 influisce sulla vitalità e sull'apoptosi delle cellule Caco-2, nonché sui livelli di mRNA di ZO-1, occludina e claudina-2, almeno in parte attraverso miR-29b-3p, influenzando infine l'integrità della barriera intestinale. In particolare, i nostri dati indicano che, nel contesto del danno alla barriera intestinale associato al SII, i livelli di miR-29b-3p sono positivamente correlati ai livelli di ZO-1 e occludina. Questa regolazione positiva potrebbe essere indiretta; ad esempio, miR-29b-3p potrebbe sopprimere la trascrizione di proteine delle giunzioni strette mirando i loro repressori trascrizionali, alleviando così la repressione e promuovendo l'espressione di ZO-1 e occludina. Questa ipotesi è supportata anche da studi precedenti, che hanno riportato che miR-29b-3p svolge un ruolo protettivo nelle condizioni infiammatorie mirando regolatori negativi della funzione della barriera⁴².

Tuttavia, i geni bersaglio attraverso i quali miR-29b-3p regola l'espressione dell'mRNA di ZO-1 e della occludina richiedono ulteriori indagini per completare la rete ceRNA, il che rappresenta una limitazione del nostro studio attuale. Inoltre, il nostro studio presenta altre limitazioni: innanzitutto, si è trattato di uno studio monocentrico con un numero relativamente ridotto di campioni (sono stati inclusi soltanto 116 pazienti con SII-D). Il valore diagnostico clinico di NEAT1 necessita ancora di ulteriore validazione attraverso studi prospettici su larga scala e multicentrici. In secondo luogo, questo studio si basa principalmente sull'analisi di associazione clinica e su modelli cellulari in vitro. In futuro, saranno necessari modelli animali per verificare il ruolo di questo asse in vivo. In terzo luogo, la rete genica bersaglio a valle di miR-29b-3p coinvolta nella patogenesi del SII-D non è ancora stata completamente chiarita. Studi futuri dovrebbero concentrarsi su: (1) la validazione del valore diagnostico di NEAT1 e di miR-29b-3p nei pazienti con SII-C e SII-M; (2) la valutazione dell'efficacia terapeutica di interventi mirati a NEAT1 in modelli animali; e (3) l'elucidazione del meccanismo molecolare preciso con cui miR-29b-3p regola le proteine delle giunzioni strette. Tali sforzi favoriranno la traduzione clinica dei nostri risultati.

In conclusione, NEAT1 è altamente espresso nei pazienti con IBS-D e presenta un buon valore diagnostico in questo gruppo. Bassi livelli di NEAT1 possono promuovere la vitalità cellulare, ridurre l'apoptosi, attenuare i danni alla barriera intestinale e sopprimere le risposte infiammatorie aumentando i livelli di miR-29b-3p in cellule Caco-2 trattate con LPS. L'asse NEAT1/miR-29b-3p fornisce una nuova prospettiva sui complessi meccanismi fisiopatologici dell'IBS-D. NEAT1 potrebbe fungere da biomarcatore diagnostico potenziale per l'IBS-D, e l'asse NEAT1/miR-29b-3p potrebbe rappresentare un possibile bersaglio terapeutico per questa condizione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre a 24 pozzetti	Corning	CLS3524	Per la semina delle cellule
Piastre a 96 pozzetti	Corning	CLS3599	Per la semina delle cellule nei saggi CCK-8
Kit per apoptosi Annexina V-FITC/PI	Invitrogen	V13242	Per rilevare i tassi di apoptosi
Anticorpo monoclonale anti-AGO2	Proteintech	67934-1-Ig	Per l'immunoprecipitazione di complessi RNA legati ad Ago2
Anticorpo anti-Claudina-2	Invitrogen	32-5600	Anticorpo primario, diluizione 1:1000
Anticorpo anti-GAPDH	Cell Signaling Technology	5174	Anticorpo primario, diluizione 1:5000; controllo di caricamento
Anticorpo anti-IgG umana	Proteintech	10284-1-AP	Utilizzato come controllo negativo per il saggio RIP
Anticorpo anti-Occludina	Abcam	ab31721	Anticorpo primario, diluizione 1:500
Anticorpo anti-ZO-1	Proteintech	21773-1-AP	Anticorpo primario, diluizione 1:1000
Cellule Caco-2	SUNNCELL	SNL-068	Per la costruzione di modelli di barriera epiteliale intestinale
Kit CCK-8	Solarbio	CA1210	Kit per saggio di proliferazione cellulare
Cloroformio	Sigma-Aldrich	C2432	Per la separazione delle fasi nell'estrazione dell'RNA
Mezzo DMEM	Gibco	11965092	Per la coltivazione delle cellule
Kit per saggio Dual-Luciferase Reporter	ThermoFisher	16186	Per rilevare l'attività della luciferasi
Kit ELISA (per IL-1β)	R&D Systems	DY201	Per rilevare proteine bersaglio nei supernatanti di colture cellulari
Kit ELISA (per IL-6)	R&D Systems	D6050B	Per rilevare proteine bersaglio nei supernatanti di colture cellulari
Kit ELISA (per IL-8)	R&D Systems	NBP3-28022	Per rilevare proteine bersaglio nei supernatanti di colture cellulari
Kit ELISA (per TNF-α)	R&D Systems	DTA00D	Per rilevare proteine bersaglio nei supernatanti di colture cellulari
Substrato chemiluminescente potenziato (ECL)	Thermo Fisher	32106	Per visualizzare le bande proteiche
Etilene (75%)	Sigma-Aldrich	459844	Per il lavaggio del pellet di RNA
FBS (Siero fetale bovino)	Gibco	10099141	Per la coltivazione delle cellule
Citometro a flusso	Beckman Coulter	B53002	Per rilevare i tassi di apoptosi
Anticorpi secondari coniugati con HRP	Cell Signaling Technology	7074	Catalizzano la generazione di un segnale chemiluminescente dai substrati ECL
Isopropanolo	Sigma-Aldrich	1133502500	Per la precipitazione dell'RNA
Lipofectamina 3000	ThermoFisher	L3000015	Reagente per trasfezione
Lipopolisaccaride (LPS)	Sigma-Aldrich	L2880	Per indurre la costruzione del modello cellulare
Lettore per micropiastre	BioTek	Epoch 2	Per rilevare l'assorbanza dei campioni in piastre a 96 pozzetti
Microsspettrofotometro Nanodrop	Thermo Scientific	ND-2000C	Per determinare concentrazione e purezza dell'RNA
Latte in polvere scremato	Coolaber	CN7861	Per il bloccaggio delle membrane (soluzione al 5%)
Kit PARIS	Thermo Fisher	AM1921	Per la frazionamento nucleo-citoplasmatico
Penicillina–Streptomicina	Gibco	15140122	Per la resistenza alla contaminazione durante la crescita cellulare
Kit per saggio proteico Pierce BCA	Thermo Fisher	23225	Per determinare le concentrazioni proteiche
Vettore pmirGLO Dual-Luciferase	Promega	E1330	Vettore per gene reporter a doppia luciferasi
Kit PrimeScript RT Reagent	Takara	RR047A	Per la trascrizione inversa dell'RNA in cDNA
Membrana PVDF	Millipore	IPVH00010	Per il trasferimento proteico dopo elettroforesi SDS-PAGE
Strumento per PCR quantitativa in tempo reale con fluorescenza	Applied Biosystems	4365464	Per rilevare geni bersaglio
Tampone di lisi RIPA (con inibitori di proteasi)	Thermo Fisher	89901	Per l'estrazione totale delle proteine dalle cellule
Kit per immunoprecipitazione di proteine leganti l'RNA	Sigma-Aldrich	17-701	Saggio di immunoprecipitazione di proteine leganti l'RNA (RIP) mediante microsferette magnetiche Protein A/G
Reagenti SDS-PAGE (gel al 10%)	TargetMol	C0189	Per separare le proteine in base al peso molecolare
Mix master SYBR Green	Thermo Fisher	4309155	Da utilizzare nei test PCR
Misuratore di resistenza transepiteliale (Volt-Ohm Metro)	Millipore	MERS00002	Misuratore di resistenza transmembrana, per la valutazione dell'integrità del monocstrato
Camere Transwell	Corning Costar	CLS3413	Per la coltivazione di monocstrati cellulari e la misurazione della TEER
Reagente TRIzol	Invitrogen	15596026CN	Per l'estrazione totale dell'RNA