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Articolo di ricerca
* These authors contributed equally
Questo studio ha valutato NEAT1 come marcatore diagnostico e regolatore della disfunzione della barriera intestinale nella sindrome dell'intestino irritabile con diarrea predominante. NEAT1 era aumentato nel siero dei pazienti, si legava a miR-29b-3p e il suo silenziamento ha migliorato i parametri relativi alla barriera, all'apoptosi e all'infiammazione in cellule Caco-2 danneggiate dal lipopolisaccaride.
La patogenesi della sindrome dell'intestino irritabile con diarrea (IBS-D) non è chiara e le terapie disponibili rimangono limitate. Questo studio ha valutato il valore diagnostico di NEAT1 nell'IBS-D ed ha esplorato il suo potenziale meccanismo regolatorio. Sono stati inclusi complessivamente 116 pazienti con IBS-D e 116 controlli sani. I livelli sierici di NEAT1 e di miR-29b-3p sono stati rilevati mediante PCR quantitativa in tempo reale con trascrizione inversa (RT-qPCR), e le curve ROC (caratteristica operativa del ricevitore) sono state utilizzate per valutare il valore diagnostico. Per gli studi meccanicistici, è stato stabilito un modello di cellule epiteliali intestinali Caco-2 trattate con lipopolisaccaride (LPS). La vitalità cellulare è stata valutata mediante saggio Cell Counting Kit-8 (CCK-8), l'apoptosi mediante citometria a flusso, l'integrità della barriera mediante resistenza elettrica transepiteliale (TEER) e i livelli di mRNA di ZO-1, occludina e claudina-2 mediante RT-qPCR. Saggi di reporter a doppia luciferasi (DLR) e saggi di immunoprecipitazione dell'RNA (RIP) sono stati utilizzati per verificare la relazione di legame tra NEAT1 e miR-29b-3p. NEAT1 era altamente espresso, mentre miR-29b-3p era scarsamente espresso nei pazienti con IBS-D, e i loro livelli mostravano una forte correlazione negativa. L'abbattimento di NEAT1 ha aumentato i livelli di miR-29b-3p, migliorato la vitalità cellulare e la TEER, ridotto l'apoptosi, aumentato i livelli di mRNA di ZO-1 e di occludina, diminuito i livelli di mRNA di claudina-2 e attenuato i parametri associati al danno della barriera nelle cellule Caco-2 trattate con LPS. Nel complesso, questi risultati indicano che NEAT1 sierico rappresenta un biomarcatore candidato per l'IBS-D e che l'asse NEAT1/miR-29b-3p potrebbe essere coinvolto nella disfunzione della barriera intestinale.
La sindrome dell'intestino irritabile con diarrea (IBS-D) è un comune disturbo funzionale gastrointestinale caratterizzato da dolore addominale, distensione addominale e alterazioni dell'alvo1. Al momento, il meccanismo fisiopatologico alla base dell'IBS-D non è stato completamente chiarito2. I metodi di trattamento si limitano principalmente al sollievo sintomatico, con efficacia ridotta e un'elevata percentuale di recidive3. Si ritiene generalmente che l'IBS-D coinvolga l'interazione di diversi fattori, come la disregolazione dell'asse cervello-intestino, l'ipersensibilità viscerale, un'infiammazione intestinale di basso grado e un malfunzionamento della barriera intestinale4,5. Sebbene tali criteri abbiano in parte standardizzato la diagnosi, essi sono di natura soggettiva e possono portare a ritardi diagnostici o a errori di classificazione, in particolare quando i sintomi del paziente si sovrappongono a quelli della malattia infiammatoria intestinale o di altre patologie organiche. Nella pratica clinica di routine, al momento non esistono biomarcatori oggettivi validati per l'IBS-D. Pertanto, individuare un nuovo bersaglio molecolare che possa fungere da strumento diagnostico e abbia un potenziale valore terapeutico è diventata un'esigenza urgente nel campo attuale della ricerca sull'IBS-D.
Negli ultimi anni, gli RNA non codificanti lunghi, come molecole chiave nella regolazione epigenetica, hanno dimostrato un notevole potenziale come marcatori diagnostici e bersagli terapeutici in una varietà di malattie6,7. La causa principale dell'IBS-D è il deterioramento della funzione della barriera intestinale8. La distruzione delle proteine delle giunzioni strette porta a una "perdita intestinale", che a sua volta attiva la risposta immunitaria della mucosa9,10. L'attivazione del sistema immunitario rilascia numerosi fattori pro-infiammatori che possono causare disfunzione intestinale attivando il sistema immuno-nervoso intestinale. Studi hanno indicato che alcuni lncRNA possono regolare la barriera epiteliale intestinale11,12. Si è riportato che NEAT1 è sovraespresso nel tessuto della mucosa colica di pazienti con colite13. L'inibizione dell'lncRNA NEAT1 può alleviare la disfunzione delle cellule epiteliali intestinali (IECs) nella colite ulcerosa14. Tuttavia, il profilo di espressione di NEAT1 nell'IBS-D e il suo valore diagnostico non sono ancora stati indagati. Inoltre, NEAT1 potrebbe avere un potenziale come biomarcatore diagnostico15. Se NEAT1 è espresso in modo anomalo nel siero dei pazienti con IBS-D, ciò potrebbe integrare i criteri attuali di Roma IV fornendo uno strumento diagnostico molecolare. Nel frattempo, anche il profilo di espressione dei miRNA è significativamente alterato nei pazienti con IBS. Ad esempio, la downregolazione dell'espressione di miR-29b-3p è stata associata alla patogenesi dell'IBS16. Tuttavia, i meccanismi regolatori a monte che governano l'espressione di miR-29b-3p nell'IBS-D rimangono completamente inesplorati. In particolare, il ruolo di NEAT1 come RNA endogeno competitivo (ceRNA) per miR-29b-3p nel contesto dell'IBS-D non è mai stato studiato, sebbene questo meccanismo sia ben consolidato in altre malattie17,18. Inoltre, mentre studi precedenti si sono concentrati principalmente sull'espressione a livello tissutale, il potenziale di NEAT1 circolante come biomarcatore sierico non invasivo per la diagnosi dell'IBS-D rimane completamente sconosciuto.
Ipotesi che l'RNA lungo non codificante NEAT1 possa partecipare alla regolazione della funzione della barriera intestinale nell'IBS-D agendo come ceRNA che assorbe miR-29b-3p. Sulla base del suddetto contesto di ricerca, lo scopo di questo studio è: (1) valutare i livelli di NEAT1 e miR-29b-3p nel siero dei pazienti affetti da IBS-D e il loro valore diagnostico; (2) confermare l'interazione diretta di legame tra NEAT1 e miR-29b-3p; e (3) chiarire il ruolo funzionale dell'asse NEAT1/miR-29b-3p nella regolazione dell'integrità della barriera intestinale e dell'infiammazione, utilizzando un modello cellulare di Caco-2 trattato con LPS.
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Inclusione dei pazienti
Tutti i partecipanti hanno fornito un consenso informato scritto dopo aver compreso pienamente il contenuto della ricerca. Il Comitato Etico dell'Ospedale Popolare della Nuova Area di Pudong, Shanghai, ha esaminato e approvato il protocollo di ricerca (n. 2024k007). La dimensione del campione è stata calcolata utilizzando G*Power: il test selezionato è stato un test t, progettato per rilevare differenze tra due campioni indipendenti. Con una dimensione dell'effetto d = 0,5, α = 0,05 e potenza = 0,9, il calcolo ha indicato che ogni gruppo dovrebbe includere almeno 86 soggetti. Per tenere conto di eventuali circostanze impreviste durante lo studio, sono stati arruolati 116 pazienti per ciascun gruppo. In totale, 116 pazienti con SII-D che si sono recati presso l'Ospedale Popolare della Nuova Area di Pudong, Shanghai, tra luglio 2024 e luglio 2025, sono stati inclusi nello studio come gruppo sperimentale. I criteri di inclusione erano: (1) SII-D conforme ai criteri diagnostici di Roma IV; (2) colonscopia che indicasse l'assenza di lesioni organiche della mucosa. Criteri di esclusione: (1) pazienti con malattia infiammatoria intestinale (IBD), cancro del colon-retto, ecc.; (2) pazienti diabetici; (3) pazienti con storia recente di interventi chirurgici addominali; e (4) pazienti con insufficienza grave cardiaca, epatica o renale. Contemporaneamente, sono stati reclutati 116 volontari sani, abbinati ai pazienti per caratteristiche demografiche come età e sesso, come gruppo di controllo. Ai controlli sani è stato confermato l'assenza di storia di malattie gastrointestinali croniche o di sintomi clinici corrispondenti. Da tutti i soggetti è stato prelevato 5 mL di sangue venoso periferico. Il soprannatante è stato quindi trasferito in un congelatore a temperatura ultra-bassa a -80 °C per la criopreservazione, in previsione dell'estrazione successiva di RNA.
A ogni partecipante è stato somministrato un questionario della durata di 10 giorni per registrare le seguenti manifestazioni cliniche: (a) valutazione della gravità del dolore addominale mediante una scala analogica visiva da 0 a 10; (b) frequenza del dolore addominale durante il periodo di osservazione (numero di giorni con dolore); (c) frequenza delle evacuazioni intestinali (numero massimo di evacuazioni al giorno); (d) Scala delle Caratteristiche Fecali di Bristol per la valutazione delle caratteristiche delle feci. Lo stato emotivo dei soggetti è stato valutato mediante la Scala dell'Ansia e della Depressione in Ambiente Ospedaliero (HADS).
Coltura cellulare e modellizzazione
Le cellule Caco-2 sono state coltivate regolarmente in mezzo Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina, in un incubatore a 37 °C e 5% CO₂. La linea cellulare Caco-2 si differenzia spontaneamente in un monostrato polarizzato di cellule con giunzioni strette e microvilli, mostrando caratteristiche morfologiche e funzionali simili a quelle delle cellule epiteliali intestinali mature. L'LPS induce una risposta infiammatoria e altera le giunzioni strette nell'epitelio intestinale, aumentando la permeabilità intestinale—un processo molto simile alle caratteristiche patologiche dell'IBS-D. Inoltre, poiché le cellule Caco-2 trattate con LPS sono state ampiamente utilizzate in studi precedenti19,20,21 per modellare la disfunzione della barriera e l'infiammazione associate all'IBS, il trattamento con lipopolisaccaride (LPS) delle cellule Caco-2 è stato scelto in questo studio per stabilire un modello in vitro di IBS-D. Una volta che le cellule avevano raggiunto una confluenza di circa l'80%, il mezzo di coltura è stato sostituito con mezzo completo contenente 5 µg/ml di LPS22, e le cellule sono state stimolate per 24 ore. Le cellule coltivate convenzionalmente senza LPS sono state utilizzate come gruppo di controllo.
Trasfezione cellulare
Per studiare i ruoli di NEAT1 e miR-29b-3p nelle cellule Caco-2, le cellule Caco-2 sono state trasfettate. Le cellule sono state suddivise in sei gruppi come segue: 1. gruppo di controllo (nessun trattamento); 2. gruppo LPS; 3. gruppo LPS + si-NC; 4. gruppo LPS + si-NEAT1; 5. gruppo LPS + si-NEAT1 + inibitore NC; e 6. gruppo LPS + si-NEAT1 + inibitore di miR-29b-3p. Sono stati progettati e sintetizzati due RNA interferenti piccoli (si-NEAT1) mirati a NEAT1: si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) e si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′). È stato utilizzato un siRNA con sequenza casuale non mirata (si-NC) come controllo negativo. Nel frattempo, sono stati sintetizzati anche l'inibitore di miR-29b-3p e il suo controllo negativo. Inibitore di miR-29b-3p: 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’. Controllo negativo: 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’.
Le cellule Caco-2 sono state seminate in piastre a 24 pozzetti e trasfettate una volta raggiunta una confluenza del 60–70%, seguendo il protocollo del produttore. In breve, 1,25 µL di siRNA sono stati diluiti in 25 µL di mezzo con siero ridotto per ottenere una concentrazione finale di siRNA di 50 nM. Per l'inibizione del miRNA, 2 µL dell'inibitore di miR-29b-3p o del suo controllo negativo sono stati diluiti in 25 µL di mezzo con siero ridotto fino a una concentrazione finale di 100 nM. Separatamente, 1,5 µL del reagente di trasfezione sono stati mescolati con 25 µL di mezzo con siero ridotto. L'siRNA diluito (o l'inibitore/il controllo negativo) è stato quindi mescolato con il reagente di trasfezione diluito per formare il complesso di trasfezione, che è stato aggiunto alle cellule goccia a goccia. Sei ore dopo la trasfezione, la miscela di trasfezione è stata sostituita con mezzo completo fresco e le cellule sono state mantenute per ulteriori 48 h prima dei saggi funzionali successivi. L'efficienza dell'abbattimento o dell'inibizione è stata confermata mediante RT-qPCR prima di ulteriori esperimenti.
PCR quantitativa in tempo reale con trascrizione inversa (RT-qPCR)
L'RNA totale è stato isolato da campioni di siero e da cellule Caco-2 sottoposte ai trattamenti indicati. In breve, ogni campione è stato lisato con 1 mL di reagente per l'estrazione dell'RNA e combinato con 200 µL di cloroformio. Dopo centrifugazione a 12.000 × g per 15 min a 4 °C, la fase acquosa superiore è stata trasferita in una provetta nuova, mescolata con 500 µL di isopropanolo e mantenuta a −20 °C per 30 min. I campioni sono stati quindi centrifugati a 12.000 × g per 10 min a 4 °C. Il pellet di RNA ottenuto è stato lavato due volte con etanolo al 75%, essiccato all'aria e risospeso in 20 µL di acqua priva di RNasi. Il rendimento e la purezza dell'RNA sono stati misurati mediante microspettrofotometro, e sono stati considerati solo campioni con A260/A280 valori compresi tra 1,8 e 2,0 sono stati utilizzati. L'RNA è stato trascritto a ritroso in cDNA seguendo il protocollo del produttore. Per il rilevamento di NEAT1, ZO-1, occludina, claudina-2, e GAPDH, 1 µg di RNA totale è stato utilizzato per ogni reazione di trascrizione inversa in un volume di 20 µL contenente 1× tampone RT, 0,5 mM dNTPs, 0,5 µM primer oligo(dT), 200 U di trascrittasi inversa e acqua priva di RNasi. La reazione è stata eseguita a 37 °C per 15 min, seguita dall'inattivazione dell'enzima a 85 °C per 5 s.
La PCR quantitativa è stata eseguita utilizzando il cDNA come stampo mediante un sistema di PCR in tempo reale basato sul colorante SYBR Green. NEAT1, miR-29b-3p, ZO-1, occludina, e I livelli di espressione della claudina-2 sono stati misurati con primers specifici per il gene. U6 è stato utilizzato come gene di riferimento per miR-29b-3p, mentre GAPDH è stato impiegato per la normalizzazione NEAT1 e geni correlati alle giunzioni strette. L'espressione relativa è stata calcolata utilizzando il metodo 2−ΔΔCt. Le sequenze dei primer sono elencate in Tabella 1.
Saggio di vitalità cellulare
Le cellule Caco-2 in fase logaritmica sono state seminate in piastre a 96 pozzetti a una densità di 1 × 104 cellule per pozzetto. Sono stati allestiti un gruppo di controllo bianco (contenente solo il mezzo di coltura), un gruppo di controllo (cellule non trattate) e un gruppo sperimentale (cellule Caco-2 sottoposte a diverse condizioni di trattamento), con 5–6 pozzetti replicati per ogni gruppo. Le cellule sono state assegnate a quattro diversi tempi: 0, 24, 48 e 72 h. Per ogni punto temporale è stata preparata una piastra di coltura separata, al fine di evitare aperture ripetute dell'incubatore durante le misurazioni. Al termine del periodo di coltura, sono stati aggiunti 10 µL di soluzione CCK-8 in ogni pozzetto, evitando la formazione di bolle. Successivamente, la piastra è stata rimessa in un incubatore a 37 °C e 5% di CO₂ e incubata al buio per 2 h. L'assorbanza di ogni pozzetto è stata misurata immediatamente a 450 nm mediante un lettore di micropiastre. Infine, la vitalità cellulare è stata espressa in percentuale.
Saggio di apoptosi cellulare
L'apoptosi è stata quantificata mediante citometria a flusso dopo colorazione con Annexina V-FITC/PI. Le cellule Caco-2 di ciascun gruppo di trattamento sono state raccolte e lavate due volte con PBS freddo. La centrifugazione è stata eseguita a 300 × g per 5 min a 4 °C. Il pellet cellulare è stato quindi risospeso in 100 µL di buffer di legame 1×, seguito dall'aggiunta sequenziale di 5 µL di Annexina V-FITC e 5 µL di PI. Dopo un'accurata miscelazione, i campioni sono stati incubati per 15 min a temperatura ambiente al buio. Successivamente, sono stati aggiunti 300 µL di buffer di legame 1×, e la sospensione è stata mescolata delicatamente prima di essere trasferita in un tubo da citometria a flusso da 5 mL. I campioni sono stati analizzati mediante citometria a flusso entro 1 h.
Resistenza elettrica transepiteliale (TEER)
La permeabilità è stata valutata misurando i valori di resistenza transepiteliale (TEER) delle cellule Caco-223. Le cellule Caco-2 sono state inoculate in camere Transwell e coltivate per 21 giorni per formare un monolayer denso. Sono state effettuate sei repliche biologiche indipendenti per ciascuna condizione sperimentale e, inoltre, cinque repliche tecniche per ogni condizione. Prima e dopo il trattamento sperimentale, i valori di TEER di ciascun gruppo sono stati misurati mediante un misuratore di resistenza transepiteliale, utilizzando elettrodi sterilizzati con etanolo ed equilibrati con PBS. In breve, la sonda lunga dell'elettrodo è stata immersa nel mezzo di coltura basolaterale e quella corta nel mezzo di coltura apicale, evitando il contatto con la membrana filtrante. Dopo il raggiungimento della stabilità, è stato registrato il valore di resistenza (Ω) e la misurazione è stata ripetuta fino a ottenere tre letture concordanti. La resistenza dei filtri Transwell vuoti (senza cellule) è stata misurata nelle stesse condizioni e tale valore è stato sottratto da tutte le letture sperimentali. TEER (Ω·cm2) = (resistenza del campione – resistenza del bianco) × area effettiva della membrana. I dati sono espressi come: (gruppo sperimentale/gruppo di controllo) × 100%.
Saggio immunoenzimatico (ELISA)
I soprannatanti delle cellule Caco-2 provenienti da diversi gruppi di trattamento sono stati raccolti dopo 24 ore di coltura. I livelli di citochine pro-infiammatorie, tra cui il fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α), l'interleuchina-6 (IL-6), l'interleuchina-8 (IL-8) e l'interleuchina-1β (IL-1β), sono stati misurati utilizzando reagenti ELISA commerciali seguendo le istruzioni del produttore. Il saggio è stato eseguito rigorosamente secondo le istruzioni fornite. I campioni e gli standard sono stati aggiunti alle pozzette pre-ricoperte con anticorpi, quindi incubati e lavati. Successivamente, è stato aggiunto l'anticorpo di rilevamento biotinilato. Dopo un'ulteriore incubazione e lavaggio, è stata aggiunta la streptavidina marcata con perossidasi di rafano. Infine, è stato aggiunto il substrato TMB per lo sviluppo del colore e la reazione è stata arrestata con la soluzione di arresto. L'assorbanza di ogni pozzetta è stata misurata immediatamente a 450 nm utilizzando un lettore per micropiastre.
Western blot
Le proteine sono state isolate da cellule Caco-2 dopo i trattamenti indicati utilizzando un tampone RIPA contenente inibitori delle proteasi. I livelli proteici sono stati misurati mediante un saggio con acido bicinconinico (BCA). Per ogni campione, sono stati caricati 30 µg di proteina per pozzetto, risolti su gel di elettroforesi SDS-PAGE al 10% e trasferiti su membrane in PVDF. Le membrane sono state bloccate in latte scremato al 5% per 1 h a temperatura ambiente e successivamente incubate tutta la notte a 4 °C con anticorpi diretti contro ZO-1 (1:1.000), occludina (1:500), claudina-2 (1:1.000) e GAPDH (1:5.000). Dopo i lavaggi, le membrane sono state incubate con anticorpi secondari marcati con HRP per 1 h a temperatura ambiente. Le bande sono state rivelate mediante chemiluminescenza migliorata (ECL) e l'intensità delle bande è stata analizzata utilizzando ImageJ. GAPDH è stato utilizzato come controllo di caricamento.
Saggio del reporter dual-luciferasi (DLR)
I potenziali siti di legame di miR-29b-3p con la sequenza di NEAT1 sono stati predetti mediante il database ENCORI (https://rnasysu.com/encori/). Successivamente, frammenti di NEAT1 contenenti siti di legame di tipo selvaggio (WT) o mutati (MUT) sono stati clonati nel vettore reporter pmirGLO. Il plasmide ricombinante costruito è stato co-trasfettato nelle cellule insieme a mimici di miR-29b-3p (Sense: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’; Antisense: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’) o inibitori e rispettivi controlli negativi (mimic NC, Sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’; Antisense: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’). Quarantotto ore dopo la trasfezione, le cellule sono state raccolte e le attività della luciferasi di fotino e della luciferasi renilla sono state determinate utilizzando un reagente di rilevamento a doppia luciferasi. L'attività della luciferasi renilla è stata utilizzata come riferimento interno per la standardizzazione.
Saggio di immunoprecipitazione dell'RNA (RIP)
Per il saggio RIP, le cellule Caco-2 sono state raccolte, lavate con PBS e incubate sul ghiaccio per 15 min in 200 µL di buffer di lisi RIP supplementato con inibitori di proteasi e RNasi. I lisati cellulari sono stati centrifugati a 16.000 × g per 10 min a 4 °C e 10 µL di ciascun sopranatante sono stati conservati come controllo di input. Per l'immunoprecipitazione, 40 µL di perle magnetiche Protein A/G sono stati posti in rotazione con 5 µg di anticorpo anti-Ago2 o IgG normale in 200 µL di buffer di lavaggio RIP per 30 min a temperatura ambiente. Dopo tre lavaggi con 500 µL di buffer di lavaggio RIP, 100 µL della sospensione di perle sono stati combinati con 100 µL di lisato, portati a un volume finale di 1 mL con buffer di lavaggio RIP ed incubati tutta la notte a 4 °C con rotazione. Le perle sono state quindi lavate cinque volte con 500 µL di buffer di lavaggio RIP e risospese in 150 µL dello stesso buffer. La digestione proteica è stata eseguita aggiungendo 15 µL di proteinasi K (20 mg/mL) e 15 µL di SDS al 10%, seguita da incubazione a 55 °C per 30 min con agitazione. Il sopranatante è stato raccolto e l'RNA è stato isolato con il reagente di estrazione e precipitato tutta la notte. L'arricchimento di NEAT1 e miR-29b-3p è stato quindi valutato mediante RT-qPCR.
Analisi della localizzazione subcellulare
Le cellule Caco-2 sono state separate in frazioni nucleare e citoplasmatica utilizzando il reagente commerciale disponibile in commercio per la separazione nucleo-citoplasmatica, seguendo le istruzioni del produttore. L'RNA totale è stato estratto da questi due componenti e la distribuzione di NEAT1 nel nucleo e nel citoplasma è stata rilevata mediante RT-qPCR. La calibrazione è stata eseguita utilizzando U6 (prevalentemente nucleare) e l'mRNA di GAPDH (prevalentemente citoplasmatico) come indicatori dell'efficienza di separazione.
Analisi statistica
Per campioni clinici di siero, un'analisi della potenza statistica (t-test, d = 0,5, α = 0,05, potenza = 0,9) ha indicato che era richiesto un minimo di 86 soggetti per gruppo. Per tenere conto di eventuali circostanze impreviste durante lo studio, sono stati arruolati 116 pazienti per ciascun gruppo al fine di rilevare differenze clinicamente significative. La normalità dei dati per le variabili continue è stata valutata mediante il test di Shapiro-Wilk. Poiché tutti i dati continui erano distribuiti normalmente (P > 0,05), sono state applicate analisi parametriche. Le variabili categoriche sono state analizzate utilizzando il test del chi-quadro. Gli esperimenti su cellule hanno incluso sei repliche biologiche indipendenti, con cinque repliche tecniche per ciascuna replica biologica. I dati sono espressi come media ± DS. I confronti tra due gruppi di variabili continue sono stati effettuati mediante il test t di Student, mentre i confronti tra più gruppi sono stati analizzati mediante ANOVA ad un fattore seguita dal test post hoc di Tukey. L'importanza statistica è stata definita come P < 0,05.
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Espressione di NEAT1 e valore diagnostico
Rispetto al gruppo di controllo sano (HC), NEAT1 i livelli di espressione nei pazienti con IBS-D erano notevolmente più elevati (P < 0.0001; Figura 1A). L'area sotto la curva (AUC) di NEAT1, come mostrato dalla curva caratteristica operativa del ricevitore (ROC), era 0,867 (IC 95%: 0,821–0,913). La sua specificità era del 75,9%, mentre la sensibilità era dell'84,5% (<...
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L'IBS-D è un comune disturbo funzionale del tratto gastrointestinale. Il suo meccanismo patologico non è ancora stato completamente chiarito. Negli ultimi anni, gli lncRNA, come molecole chiave nella regolazione epigenetica, hanno mostrato un notevole potenziale nel campo della diagnosi e del trattamento delle malattie. L'lncRNA NEAT1 è stato studiato in diverse patologie, come il cancro del colon-retto24, il glioma25 e l'infarto miocardico26
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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre a 24 pozzetti | Corning | CLS3524 | Per la semina delle cellule |
| Piastre a 96 pozzetti | Corning | CLS3599 | Per la semina delle cellule nei saggi CCK-8 |
| Kit per apoptosi Annexina V-FITC/PI | Invitrogen | V13242 | Per rilevare i tassi di apoptosi |
| Anticorpo monoclonale anti-AGO2 | Proteintech | 67934-1-Ig | Per l'immunoprecipitazione di complessi RNA legati ad Ago2 |
| Anticorpo anti-Claudina-2 | Invitrogen | 32-5600 | Anticorpo primario, diluizione 1:1000 |
| Anticorpo anti-GAPDH | Cell Signaling Technology | 5174 | Anticorpo primario, diluizione 1:5000; controllo di caricamento |
| Anticorpo anti-IgG umana | Proteintech | 10284-1-AP | Utilizzato come controllo negativo per il saggio RIP |
| Anticorpo anti-Occludina | Abcam | ab31721 | Anticorpo primario, diluizione 1:500 |
| Anticorpo anti-ZO-1 | Proteintech | 21773-1-AP | Anticorpo primario, diluizione 1:1000 |
| Cellule Caco-2 | SUNNCELL | SNL-068 | Per la costruzione di modelli di barriera epiteliale intestinale |
| Kit CCK-8 | Solarbio | CA1210 | Kit per saggio di proliferazione cellulare |
| Cloroformio | Sigma-Aldrich | C2432 | Per la separazione delle fasi nell'estrazione dell'RNA |
| Mezzo DMEM | Gibco | 11965092 | Per la coltivazione delle cellule |
| Kit per saggio Dual-Luciferase Reporter | ThermoFisher | 16186 | Per rilevare l'attività della luciferasi |
| Kit ELISA (per IL-1β) | R&D Systems | DY201 | Per rilevare proteine bersaglio nei supernatanti di colture cellulari |
| Kit ELISA (per IL-6) | R&D Systems | D6050B | Per rilevare proteine bersaglio nei supernatanti di colture cellulari |
| Kit ELISA (per IL-8) | R&D Systems | NBP3-28022 | Per rilevare proteine bersaglio nei supernatanti di colture cellulari |
| Kit ELISA (per TNF-α) | R&D Systems | DTA00D | Per rilevare proteine bersaglio nei supernatanti di colture cellulari |
| Substrato chemiluminescente potenziato (ECL) | Thermo Fisher | 32106 | Per visualizzare le bande proteiche |
| Etilene (75%) | Sigma-Aldrich | 459844 | Per il lavaggio del pellet di RNA |
| FBS (Siero fetale bovino) | Gibco | 10099141 | Per la coltivazione delle cellule |
| Citometro a flusso | Beckman Coulter | B53002 | Per rilevare i tassi di apoptosi |
| Anticorpi secondari coniugati con HRP | Cell Signaling Technology | 7074 | Catalizzano la generazione di un segnale chemiluminescente dai substrati ECL |
| Isopropanolo | Sigma-Aldrich | 1133502500 | Per la precipitazione dell'RNA |
| Lipofectamina 3000 | ThermoFisher | L3000015 | Reagente per trasfezione |
| Lipopolisaccaride (LPS) | Sigma-Aldrich | L2880 | Per indurre la costruzione del modello cellulare |
| Lettore per micropiastre | BioTek | Epoch 2 | Per rilevare l'assorbanza dei campioni in piastre a 96 pozzetti |
| Microsspettrofotometro Nanodrop | Thermo Scientific | ND-2000C | Per determinare concentrazione e purezza dell'RNA |
| Latte in polvere scremato | Coolaber | CN7861 | Per il bloccaggio delle membrane (soluzione al 5%) |
| Kit PARIS | Thermo Fisher | AM1921 | Per la frazionamento nucleo-citoplasmatico |
| Penicillina–Streptomicina | Gibco | 15140122 | Per la resistenza alla contaminazione durante la crescita cellulare |
| Kit per saggio proteico Pierce BCA | Thermo Fisher | 23225 | Per determinare le concentrazioni proteiche |
| Vettore pmirGLO Dual-Luciferase | Promega | E1330 | Vettore per gene reporter a doppia luciferasi |
| Kit PrimeScript RT Reagent | Takara | RR047A | Per la trascrizione inversa dell'RNA in cDNA |
| Membrana PVDF | Millipore | IPVH00010 | Per il trasferimento proteico dopo elettroforesi SDS-PAGE |
| Strumento per PCR quantitativa in tempo reale con fluorescenza | Applied Biosystems | 4365464 | Per rilevare geni bersaglio |
| Tampone di lisi RIPA (con inibitori di proteasi) | Thermo Fisher | 89901 | Per l'estrazione totale delle proteine dalle cellule |
| Kit per immunoprecipitazione di proteine leganti l'RNA | Sigma-Aldrich | 17-701 | Saggio di immunoprecipitazione di proteine leganti l'RNA (RIP) mediante microsferette magnetiche Protein A/G |
| Reagenti SDS-PAGE (gel al 10%) | TargetMol | C0189 | Per separare le proteine in base al peso molecolare |
| Mix master SYBR Green | Thermo Fisher | 4309155 | Da utilizzare nei test PCR |
| Misuratore di resistenza transepiteliale (Volt-Ohm Metro) | Millipore | MERS00002 | Misuratore di resistenza transmembrana, per la valutazione dell'integrità del monocstrato |
| Camere Transwell | Corning Costar | CLS3413 | Per la coltivazione di monocstrati cellulari e la misurazione della TEER |
| Reagente TRIzol | Invitrogen | 15596026CN | Per l'estrazione totale dell'RNA |
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