La rianalisi dei trascrivomi pubblici rivela firme immunitarie condivise tra disturbo depressivo maggiore e dermatomiosi con contesto unicellulare

Summary

Questo studio mirava a utilizzare una rianalisi bioinformatica integrativa di dataset pubblici GEO, combinata con la contestualizzazione a singola cellula, per identificare geni condivisi candidati tra disturbo depressivo maggiore e dermatomiosi e per caratterizzarne la distribuzione tra sottoinsiemi di cellule immunitarie in un dataset monocellulare correlato alla dermatomiosite.

Abstract

Questo studio mirava a identificare segnali trascritomici condivisi candidati tra disturbo depressivo maggiore e dermatomiosi attraverso una rianalisi bioinformatica integrativa di dataset pubblici GEO con contestualizzazione a singola cellula. Il flusso di lavoro analitico includeva l'Analisi della Rete di Coespressione Genetica Ponderata (WGCNA) per l'identificazione dei moduli chiave, analisi di arricchimento Gene Ontology (GO) e della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) per la caratterizzazione funzionale, analisi di rete basata su GeneMANIA e una piattaforma di visualizzazione di rete per la priorità dei geni candidati, e la valutazione di 113 modelli di apprendimento automatico combinati con SHapley Additive ExPlanations (SHAP) per la selezione delle caratteristiche diagnostiche. Successivamente sono state eseguite analisi di arricchimento del set genico (GSEA), analisi dell'infiltrazione immunitaria e contestualizzazione basata su RNA-seq a cellule singole per caratterizzare ulteriormente il contesto cellulare correlato al sistema immunitario dei segnali identificati. L'integrazione di dataset GEO correlati alla dermatomiosi ha identificato 570 geni espressi differenzialmente, dai quali sono stati ottenuti 33 geni condivisi tramite WGCNA. L'arricchimento funzionale e le analisi di rete hanno evidenziato difesa immunitaria, citotossicità e vie tra cui PPAR, IL-17 e elaborazione antigenica, con ELANE, PPBP e CTSG che sono emersi come nodi altamente connessi. La priorità delle funzionalità basata sul machine learning ha mantenuto 8 geni selezionati dal modello candidato, ovvero KIF4A, OLR1, KIR2DL4, KRT23, KIR3DS1, AZU1, SCG5 e LRRC37E. L'analisi dell'infiltrazione immunitaria ha associato questi geni condivisi con le cellule T regolatorie (Treg), i mastociti a riposo, le cellule dendritiche a riposo e sia macrofagi classicamente attivati (M1) che alternativamente attivati (M2). La contestualizzazione RNA-seq a singola cellula ha inoltre suggerito che i sottoinsiemi di cellule T CD8⁺ con diversi stati di punteggio del gene candidato mostravano distinti schemi di comunicazione intercellulare. Tra questi, l'asse MIF–(CD74+CD44) e i segnali provenienti dalle cellule T di memoria naïve/centrale erano caratteristiche notevoli che richiedevano ulteriori validazioni. Nel complesso, questo studio ha identificato segnali trascritomici condivisi candidati tra disturbo depressivo maggiore e dermatomiosi e ha evidenziato contesti cellulari immunologici che giustificano ulteriori convalide in coorti vere comorbide.

Introduction

La dermatomiosite è una malattia autoimmune sistemica cronica caratterizzata da coinvolgimento infiammatorio della pelle e del muscolo scheletrico, manifestata clinicamente da una debolezza muscolare prossima simmetrica e lesioni cutanee distintive e, nei casi gravi, da disfunzione^{multiorganale 1}. L'accumulo di evidenze cliniche evidenzia che i pazienti con dermatomiosi sperimentano frequentemente comorbidità psichiatriche, in particolare il disturbo depressivo^{maggiore 2,3,4}. La patogenesi del disturbo depressivo maggiore associato alla dermatomiosi è multifattoriale, derivante da un'interazione complessa tra disagio psicosociale, disregolazione neuroendocrina e immunoinfiammazione sistemica. Dolore persistente, affaticamento e debolezza muscolare progressiva possono compromettere notevolmente la funzione fisica e la qualità della vita. Questi oneri possono portare a disgregazioni dei ruoli sociali, stress psicologico cronico e riduzione dell'autonomia⁵. Inoltre, l'esposizione a lungo termine ai glucocorticoidi può perturbare l'asse ipotalamo-ipofisi-surrenale (HPA) e compromettere la plasticità ippocampale, aumentando così la vulnerabilità alle manifestazioni correlate^{alla depressione 6}. Inoltre, l'attivazione immunitaria sostenuta e l'infiammazione sistemica nella dermatomiosi sono sempre più riconosciute come potenziali fattori che contribuiscono ai sintomi legati alla^{depressione 7}. Questi mediatori periferici possono influenzare il sistema nervoso centrale modulando il metabolismo e la neuroplasticità dei neurotrasmettitori, collegando così l'autoimmunità sistemica alle manifestazioni neuropsichiatriche 7,8,9,10.

È importante sottolineare che questa logica non implica che nessuna delle due malattie sia biologicamente omogenea. La dermatomiosi comprende sottogruppi clinicamente e sierologicamente distinti, inclusi fenotipi anti-MDA5 e anti-TIF1-γ con profili infiammatori e clinici^{differenti11,12,13}. Il disturbo depressivo maggiore è inoltre sempre più riconosciuto come una condizione eterogenea, e le evidenze attuali supportano l'esistenza di un sottotipo immunitario-infiammatorio piuttosto che di una singola firma infiammatoria^{universale 14,15}. Di conseguenza, il presente studio non è stato progettato per assumere un programma molecolare condiviso uguale per tutti, ma piuttosto per selezionare segnali trascritomici immunoassociati sovrapposti a candidati rilevabili a livello di coorte tra dataset pubblici indipendenti.

Oltre allo stress psicosociale e all'esposizione al trattamento, un legame più biologicamente testabile tra disturbo depressivo maggiore e dermatomiosi è la disregolazione immunitaria condivisa. Il disturbo depressivo maggiore è una condizione eterogenea e non si dovrebbe presumere abbia un unico profilo trascrittomico universale. Tuttavia, evidenze convergenti supportano un sottotipo di disturbo depressivo maggiore correlato all'infiammazione, e studi trascrittomici periferici hanno identificato una disregolazione delle vie innate immunità, neutrofile, interferonte e del complemento in sottogruppi di individui^colpiti 14,16,17. Parallelamente, la segnalazione dello stress correlata alla MACK è stata anche implicata nei fenotipi^{depressivi 18}. La dermatomiosite, al contrario, è una malattia autoimmune ben riconosciuta guidata dall'interferone, e studi trascricomici nel sangue e nei tessuti colpiti hanno dimostrato costantemente l'attivazione dell'interferone di tipo I e di programmi immunitari-infiammatori più ampi; analisi multi-omiche recenti hanno ulteriormente evidenziato l'attività delle vie correlate a ERK e p38 MACK nella^dermatomiosi 19,20,21. Collettivamente, questi risultati forniscono una logica biologicamente plausibile per esaminare se un sottoinsieme di segnali trascricomici associati al sistema immunitario possa sovrapporsi tra disturbo depressivo maggiore e dermatomiosi in dataset pubblici indipendenti.

Nonostante queste osservazioni, la base molecolare alla base della sovrapposizione tra disturbo depressivo maggiore e dermatomiosi rimane insufficientemente compresa. È importante sottolineare che i dataset pubblici attualmente disponibili non forniscono una vera coorte di pazienti diagnosticati contemporaneamente con disturbo depressivo maggiore e dermatomiosite. Pertanto, invece di analizzare direttamente la depressione nei pazienti con dermatomiosite, il presente studio è stato progettato per identificare segnali trascritomici condivisi candidati tra dataset pubblici separati di disturbo depressivo maggiore e dermatomiosi attraverso un quadro integrativo di rianalisi^{bioinformatica 22}. In particolare, dataset trascrittomici pubblicamente disponibili sono stati analizzati utilizzando analisi di espressione differenziale, analisi pesata della rete di co-espressione genica (WGCNA), analisi di arricchimento funzionale, analisi basata su rete e priorità delle caratteristiche basata su apprendimento automatico per identificare geni e vie candidati^{cross-disease 23}. Inoltre, è stato analizzato un dataset unicellulare correlato alla dermatomiosi per contestualizzare questi geni candidati a livello di cellule immunità. Come illustrato nella Figura 1, il flusso di lavoro analitico complessivo è riassunto in un diagramma di flusso a passi. Piuttosto che stabilire un meccanismo definitivo di comorbidità, questo studio mirava a generare un quadro guidato da ipotesi per identificare i segnali molecolari condivisi tra il disturbo depressivo maggiore e la dermatomiosite.

Di conseguenza, questo studio ha adottato un quadro di prioritizzazione graduale. I moduli di co-espressione associati alla malattia sono stati identificati per la prima volta separatamente nei dataset di disturbi depressivi maggiori e dermatomiosite, e la loro sovrapposizione è stata utilizzata per definire segnali condivisi tra le malattie candidate. Questi candidati sono stati poi contestualizzati funzionalmente tramite arricchimento e analisi di rete basata su GeneMANIA, prioritizzati all'interno di un quadro di classificazione incentrato sulla dermatomiosite utilizzando metodi di apprendimento automatico, e infine esaminati in un dataset monocellulare correlato alla dermatomiosi per fornire contestualizzazione cellulare.

Figura 1: Diagramma di flusso del processo di raccolta e analisi dei dati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Sono stati utilizzati diversi approcci alternativi per indagare la sovrapposizione molecolare tra malattie. L'intersezione semplice di liste geniche differenzialmente espresse (DEG) è computazionalmente semplice ma manca delle informazioni contestuali a livello di modulo fornite dall'analisi delle co-espressioni ed è sensibile a soglie arbitrarie di pieghe e valori P. La meta-analisi tradizionale concentra le dimensioni degli effetti tra gli studi della stessa malattia, ma non è progettata per identificare segnali condivisi tra due condizioni distinte. L'attuale flusso di lavoro integra molteplici livelli analitici complementari—sovrapposizione di moduli di co-espressione, arricchimento funzionale, analisi di rete, priorità delle caratteristiche basata su machine learning, deconvoluzione immunitaria e contestualizzazione di singola cellula—ognuno con uno scopo distinto all'interno di un quadro di priorità sequenziale. Questo design multilivello aiuta a ridurre il numero di geni candidati a passo in passo e fornisce una contestualizzazione biologica convalidata incrociata a più livelli. Il protocollo è applicabile a qualsiasi coppia di malattie per le quali esistono dataset di transscritti in massa e, opzionalmente, a singola cellula, disponibili pubblicamente, soprattutto quando non sono disponibili vere coorti comorbide. Tuttavia, il flusso di lavoro è osservazionale e non incorpora quadri formali di inferenza causale; Tutti i risultati devono essere interpretati come generatori di ipotesi e richiedono una validazione sperimentale indipendente.

Nel complesso, il flusso di lavoro analitico è stato progettato come una strategia di prioritizzazione sequenziale piuttosto che come un quadro di inferenza causale diretta. Ogni fase aveva uno scopo distinto: sovrapposizione di moduli basati su WGCNA per l'identificazione del segnale condiviso candidato, analisi di arricchimento/rete per la contestualizzazione biologica, machine learning per la priorità delle caratteristiche nella classificazione correlata alla dermatomiosite e analisi di singola cellula per la contestualizzazione a livello di tipo cellulare.

Protocol

Questo studio ha utilizzato solo dataset pubblici e deidentificati dal database Gene Expression Omnibus (GEO). Poiché il lavoro prevedeva un'analisi secondaria di dati pubblici esistenti e non includeva il contatto diretto dei partecipanti, l'intervento o l'accesso a informazioni personali identificabili, non era richiesta un'approvazione aggiuntiva del comitato etico e un consenso informato.

Sorgenti dati e preelaborazione

Tutti i dati sull'espressione genica e il dataset a singola cellula sono stati ottenuti dal database^{GEO 24}. Per il disturbo depressivo maggiore, è stato utilizzato il dataset GSE98793, che comprende campioni di sangue periferico da 128 pazienti e 64 controlli sani. Per la dermatomiosite, i dataset sono stati selezionati in base a criteri predefiniti, tra cui il profiling dell'espressione di Homo sapiens, gruppi di malattia e controllo chiaramente identificabili, annotazioni disponibili per la mappatura sonda-gene e idoneità per l'analisi di scoperta o validazione. Quando una serie GEO conteneva più sottotipi di miopatia infiammatoria, per il presente studio sono stati prelevati solo la dermatomiosi e i campioni di controllo normali. GSE1551, GSE46239 e GSE128470 sono stati utilizzati come dataset di scoperta/addestramento, mentre GSE5370, GSE39454 e GSE11971 sono stati utilizzati come dataset di validazione indipendenti. I dataset analizzati sulla dermatomiosi in questo studio sono stati derivati principalmente da muscoli o tessuti cutanei colpiti piuttosto che dal sangue periferico. I dati a singola cellula per la dermatomiosi sono stati raccolti dal dataset GSE190510.

Le matrici di espressione grezze venivano scaricate dal database GEO insieme ai relativi file di annotazione della piattaforma. Gli ID delle sonde sono stati mappati ai simboli genici ufficiali secondo l'annotazione GPL fornita dal produttore. Le sonde che non potevano essere mappate in modo inequivocabile a un singolo simbolo genetico ufficiale venivano rimosse. Quando più sonde sono state mappate allo stesso gene, venivano collassate a livello genico usando il valore medio di espressione implementato dalla funzione 'avereps' nel pacchetto limma, generando così una matrice di espressione gene per campione.

Per ridurre il bias dipendente dall'intensità e stabilizzare la varianza, è stata applicata la trasformazione log2 quando appropriato secondo la distribuzione dei valori di espressione. La normalizzazione tra array veniva quindi eseguita utilizzando la funzione 'normalizeBetweenArrays' nel pacchetto limma. I valori mancanti, quando presenti, venivano imputati tramite l'imputazione del vicino più prossimo. Per i dataset integrati di addestramento della dermatomiosite, la correzione batch è stata eseguita utilizzando la funzione 'ComBat' nel pacchetto sva, con l'origine del dataset/piattaforma trattata come variabile batch e gruppo campione (dermatomiosite contro controllo sano) inclusi nella matrice di progettazione per preservare la variazione biologica di interesse durante l'aggiustamento del lotto.

Tutte le analisi sono state effettuate in R utilizzando un ambiente di sviluppo integrato per R su un sistema operativo desktop. Il pacchetto limma veniva utilizzato per la sintesi e la normalizzazione delle sonde. Il pacchetto sva veniva utilizzato per la correzione batch di ComBat. I valori mancanti sono stati imputati usando l'imputazione di K-vicino più prossimo con k = 10.

Analisi della rete di coespressione genica pesata

L'Analisi della Rete di Coespressione Genetica Ponderata (WGCNA) è stata eseguita separatamente per i dataset di disturbi depressivi maggiori e dermatomiosi utilizzando il pacchetto WGCNA R^25,26. I campioni sono stati raggruppati gerarchicamente usando flashClust per identificare outlier; Sono stati esclusi campioni che superano un'altezza dendrografica di 100 e geni nel 25% più basso della varianza. Per ogni rete, una potenza di soglia morbida (β) veniva selezionata usando pickSoftThreshold per ottenere una topologia approssimativa senza scala (R² > 0,8). La matrice di adiacenza è stata trasformata in una Matrice di Sovrapposizione Topologica (TOM), e i moduli sono stati identificati tramite taglio dinamico dell'albero con una dimensione minima di 60 moduli e un'altezza di taglio di fusione di 0,25²⁷. Il pacchetto WGCNA R veniva utilizzato insieme a flashClust per il clustering gerarchico. Il seme casuale è stato impostato a 12345 per la riproducibilità. Gli autogeni del modulo sono stati correlati allo stato della malattia tramite correlazione di Pearson, con i valori P aggiustati dal metodo Benjamini–Hochberg. Per ogni malattia, il modulo che mostrava l'associazione più forte e significativa con lo stato di malattia è stato mantenuto come modulo chiave associato alla malattia. La sovrapposizione tra i geni chiave del modulo del dataset del disturbo depressivo maggiore e quelli del dataset sulla dermatomiosi è stata definita come il set genetico condiviso candidato per analisi a valle. L'analisi dell'espressione differenziale della coorte integrata di dermatomiosi è stata eseguita separatamente per caratterizzare i cambiamenti trascrizionali correlati alla dermatomiosite.

Analisi dell'arricchimento funzionale

L'analisi di arricchimento dell'ontologia genica (GO) è stata eseguita utilizzando R. I simboli genici sono stati convertiti in ID Entrez tramite org. Hs.eg.db e termini GO significativamente arricchiti (p < 0,05) sono stati identificati utilizzando enrichGO in clusterProfiler. Per la visualizzazione multidimensionale dei risultati, sono stati generati grafici a barre e diagrammi a bolle utilizzando il pacchetto enrichplot, mentre un grafico circolare è stato costruito con il pacchetto circlize per mostrare le categorie GO, il conteggio genico e i fattori di arricchimento. Le leggende sono state aggiunte con il pacchetto ComplexHeatmap. L'analisi di arricchimento delle vie di geni differenzialmente espressi dalla Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) è stata condotta anche su R. I simboli genici sono stati convertiti in ID Entrez basati sull'org. Hs.eg.db database e percorsi significativamente arricchiti (FDR < 0,05) sono stati identificati utilizzando la funzione enrichKEGG dal pacchetto^{clusterProfiler} 28,29,30,31. I risultati dell'arricchimento sono stati visualizzati utilizzando grafici a barre e bolle.

Analisi della rete di associazione funzionale basata su GeneMANIA

Sulla base dei geni condivisi precedentemente identificati, è stata costruita una rete di associazione funzionale basata su GeneMANIA per esplorare il contesto di interazione tra questi geni e i loro partner correlati. La lista genica è stata inviata a GeneMANIA utilizzando Homo sapiens come specie di riferimento. GeneMANIA integra molteplici tipi di evidenze, tra cui co-espressione, interazioni fisiche, percorsi, co-localizzazione, interazioni genetiche e domini proteici condivisi. La rete risultante veniva esportata e importata in una piattaforma di visualizzazione di rete per visualizzazione e analisi. L'analisi topologica della rete è stata poi eseguita su una piattaforma di visualizzazione della rete per la visualizzazione e l'analisi per identificare i nodi candidati altamente^connessi 32,33,34.

Costruzione di modelli diagnostici basati su machine learning

Per la classificazione diagnostica sono stati utilizzati molteplici algoritmi di apprendimento automatico, tra cui Random Forest (RF), Support Vector Machine (SVM), Linear Discriminant Analysis (LDA), Naive Bayes, Gradient Boosting Machine (GBM), XGBoost, glmBoost, Elastic Net (Enet), Ridge, Least Absolute Shrinkage and Selection Operator (LASSO), Stepglm Generalized Linear Model (Stepglm) e Partial Least Square Regression Generalized Linear Model (plsRglm⁾³⁵. È stato applicato un framework di modellazione a due stadi per generare 113 combinazioni di modelli candidati. Nella prima fase, l'algoritmo iniziale veniva utilizzato per lo screening variabile nella coorte di addestramento; Nella seconda fase, le variabili trattenute sono state utilizzate per adattarsi a un modello di classificazione diagnostica. I modelli con ≤5 variabili selezionate sono stati esclusi da ulteriori confronti. I dataset combinati sulla dermatomiosite hanno servito come coorte di allenamento, con etichette definite come dermatomiosite contro controlli sani, mentre la coorte indipendente di validazione è stata utilizzata per la valutazione esterna delle prestazioni. Il ricampionamento interno e la regolazione erano specifici per algoritmo: i modelli basati su glmnet (LASSO, Ridge ed Elastic Net) utilizzavano una validazione incrociata a 10 volte per selezionare lambda.min; GBM utilizzava una validazione interna incrociata a 10 volte per determinare il numero ottimale di alberi; XGBoost utilizzava il ricampionamento a 5 volte per selezionare il round finale di boost secondo la perdita logaritmica minima del test; glmBoost utilizzava la validazione interna incrociata basata su cvrisk per determinare l'iterazione di arresto; e LDA era integrato nel framework di validazione incrociata di Caret. Per gli algoritmi senza passaggi espliciti di tuning nell'attuale implementazione, sono state utilizzate impostazioni fisse o predefinite per il pacchetto. Per ridurre la perdita di informazioni, la selezione delle caratteristiche, l'adattamento del modello e la messa a punto interno sono stati eseguiti utilizzando solo la coorte di addestramento, mentre la coorte di validazione è stata utilizzata esclusivamente per la previsione indipendente e la valutazione delle prestazioni basata su AUC. Il pacchetto caret veniva utilizzato per la gestione dei flussi di lavoro di apprendimento automatico, con glmnet, randomForest, e1071, gbm, xgboost, mboost, plsRglm e MASS per singoli algoritmi. L'analisi SHAP veniva eseguita utilizzando il pacchetto shapviz. Il seed casuale veniva impostato a 12345 prima di ogni prova del modello. I modelli con meno di 5 caratteristiche selezionate sono stati esclusi. L'interpretabilità del modello e il contributo a livello genico sono stati ulteriormente valutati utilizzando SHapley Additive ExPlanations (SHAP), e i geni più informativi sono stati prioritizzati come caratteristiche candidate selezionate dal modello per l'interpretazione biologica a valle.

Valutazione delle prestazioni diagnostiche

Le curve caratteristiche operative del ricevitore (ROC) sono state generate utilizzando il pacchetto "pROC" R per valutare le prestazioni diagnostiche dei biomarcatori candidati. I livelli di espressione e l'accuratezza predittiva dei marcatori candidati sono stati validati in dataset indipendenti (GSE5370, GSE11971 e GSE39454). Le prestazioni del modello sono state ulteriormente valutate utilizzando matrici di confusione. L'espressione differenziale dei geni dei moduli chiave è stata visualizzata utilizzando grafici vulcanici e a scatole, e sono state costruite curve ROC per valutare il valore diagnostico dei singoli geni.

Analisi dell'arricchimento degli insiemi genici

Per esplorare i cambiamenti funzionali coordinati associati ai segnali trasscrittomici condivisi candidati, è stata eseguita l'Analisi di Arricchimento del Set Genico (GSEA) utilizzando clusterProfiler^36,37. I dati sull'espressione genica da campioni di dermatomiosi e controllo sono stati classificati in base all'espressione differenziale. Sono stati utilizzati insiemi genici predefiniti corrispondenti alle vie KEGG (c2.cp.kegg.Hs.symbols.gmt) per valutare se i geni all'interno di ciascuna via mostrassero una tendenza coordinata di regolazione al rialzo o al ribasso. La significatività statistica è stata definita come P < 0,05.

Analisi dell'infiltrazione delle cellule immunitarie

La matrice della dermatomiosi normalizzata, trasformata log2 e corretta in batch è stata utilizzata per la deconvoluzione immunitaria. L'algoritmo CIBERSORT è stato applicato per stimare l'abbondanza relativa dei sottotipi di cellule immunitarie utilizzando la matrice di riferimento^{LM22 38}. I campioni con deconvoluzione P < 0,05 sono stati mantenuti per l'analisi a valle. Le differenze nelle proporzioni di cellule immunitarie inferite tra i gruppi sono state visualizzate utilizzando diagrammi a scatola e l'analisi di correlazione di Spearman è stata condotta per valutare le associazioni tra sottoinsiemi di cellule immunitarie e geni condivisi candidati.

Analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula per la contestualizzazione cellulare

Analisi RNA-seq a singola cellula sono state effettuate in R utilizzando Seurat. Harmony è stato utilizzato per la correzione in batch, DoubletFinder per il rilevamento di doppietti, celda/decontX per la stima dell'RNA ambientale, Monocle per l'analisi della traiettoria pseudotemporale, CellChat per l'analisi della comunicazione cellula-cellula, AUCell per il punteggio dell'attività del set genetico e GSVA per il punteggio ssGSEA. Le matrici di conteggio grezzo venivano importate negli oggetti Seurat con i parametri min.celle = 5 e min.features = 300. Sono state calcolate metriche di controllo qualità, incluse le proporzioni dei geni mitocondriali, ribosomici e dell'emoglobina, per ciascuna cellula. Le celle venivano mantenute solo se soddisfavano tutti i seguenti criteri: nFeature_RNA > 500, nCount_RNA < 5.000, percent_mito < 25, percent_ribo > 3 e percent_hb < 1. I geni rilevati in meno di 3 cellule sono stati esclusi. Inoltre, MALAT1 e i geni mitocondriali sono stati rimossi prima dell'analisi a valle. Dopo il filtraggio iniziale, i doppietti sono stati identificati in ogni campione usando DoubletFinder, con PC = 1:30 e pN = 0,25; i tassi attesi di doppio sono stati fissati in base al numero di cellule specifiche per campione (<4.000 cellule: 2,5%; 4.000–8.000 cellule: 5%; >8.000 cellule: 6,5%). Furono mantenuti solo i canottieri. La contaminazione da RNA ambiente è stata ulteriormente stimata utilizzando decontX, e sono state mantenute cellule con punteggi di contaminazione < 0,2.

I dati filtrati sono stati normalizzati utilizzando il metodo LogNormalize con un fattore di scala di 10.000, seguiti dall'identificazione dei geni variabili, dalla scalabilità dei dati e dall'analisi dei componenti principali. Gli effetti batch tra i campioni sono stati corretti usando Harmony con orig.ident come variabile batch. Le prime 15 dimensioni di Harmony furono utilizzate per la visualizzazione UMAP e la costruzione dei grafi vicini. Il clustering è stato eseguito utilizzando FindNeighbors e FindClusters, e il risultato finale del clustering è stato definito con una risoluzione di 0,05. I tipi cellulari sono stati annotati manualmente secondo i geni marker canonici insieme ai risultati^{FindAllMarkers 39}.

Per la contestualizzazione funzionale a valle, l'attività dei geni candidati è stata valutata a livello di singola cellula, e il sottoinsieme rilevante delle cellule immunitarie è stato sottoposto ad analisi della traiettoria e della comunicazione intercellulare. L'analisi del pseudotempo è stata effettuata utilizzando Monocle con riduzione della dimensionalità basata su DDRTree seguita da ordinazione delle cellule. L'analisi della comunicazione cellula-cellula è stata condotta utilizzando CellChat con il database umano ligando–recettore, limitata alla categoria Segnalazione Secreta, e le comunicazioni che coinvolgevano meno di 10 cellule sono state filtrate.

Per ogni cellula, l'attività dei geni candidati è stata quantificata utilizzando tre approcci complementari: AUCell, ssGSEA e AddModuleScore. I punteggi AUCell sono stati calcolati sulla base di matrici di classificazione genetica, e i punteggi ssGSEA sono stati generati utilizzando il framework GSVA. AddModuleScore è stato calcolato utilizzando la funzione integrata di Serat. I valori risultanti di AUCell, ssGSEA e AddModuleScore sono stati poi combinati in un'unica matrice di punteggio. Ogni tipo di punteggio è stato inizialmente standardizzato tramite trasformazione Z-score e successivamente riscalato in un intervallo 0–1 usando la normalizzazione min–max. Il punteggio composito finale ("Scoring") per ogni cella è stato definito come la somma dei tre punteggi normalizzati:

Punteggio = AUCell normalizzato + ssGSEA normalizzato + AddModuleScore normalizzato.

Per le analisi dei sottogruppi a valle, è stato estratto il sottoinsieme delle cellule T CD8⁺ e le cellule sono state dicotomiche secondo il valore mediano di Scoring all'interno di questo sottoinsieme. Le celle con valori di punteggio superiori alla mediana sono state assegnate al gruppo High_Hub_genes, mentre le restanti sono state assegnate al gruppo Low_Hub_genes.

Results

Identificazione dei geni condivisi tra disturbo depressivo maggiore e dermatomiosi

Dopo la fusione dei dati, la normalizzazione e la correzione batch di dataset GEO correlati alla dermatomiosi (Figura 2A,B), sono stati identificati in totale 570 geni espressi differenzialmente (Figura 2C,D), comprendenti 517 geni regolati all'alto e 53 sotto-regolati....

Discussion

La dermatomiosite è una malattia autoimmune sistemica cronica con un coinvolgimento prominente della pelle e dei muscoli, e le osservazioni cliniche accumulate suggeriscono che i pazienti con dermatomiosi possano anche sperimentare un notevole carico psichiatrico, inclusi sintomi compatibili con il disturbo depressivo maggiore. In questo contesto, il presente studio ha applicato un quadro integrativo di rianalisi bioinformatica per identificare segnali trascrittomici condivisi candidati ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AddModuleScore	Funzione Seurat	versione 4.4.0	Calcolo del punteggio del modulo all'interno di Seurat RRID: NA
AUCell	Bioconductor	versione 1.32.0	Punteggio dell'attività dei geni singolo-cellula RRID: SCR_021327
caret	CRAN	versione 7.0.1	Supporto del flusso di lavoro del machine learning RRID: SCR_022524
celda / decontX	Bioconductor	versione 1.24.0	Stima della contaminazione dell'RNA ambientale RRID: NA
CellChat	GitHub / CellChat	versione 2.2.0	Analisi della comunicazione cellula-cellula RRID: SCR_021946
CIBERSORT / LM22 signature matrix	CIBERSORT	LM22	Stima dell'infiltrazione delle cellule immunitarie RRID: NA
clusterProfiler	Bioconductor	versione 4.12.6	Analisi di arricchimento funzionale RRID: SCR_016884
Cytoscape	Cytoscape Consortium	versione 3.10	una piattaforma di visualizzazione di rete per la visualizzazione e l'analisi RRID: SCR_003032
DoubletFinder	GitHub / McGinnis Lab	versione 2.0.4	Rilevamento di doppietti nei dataset singolo-cellula RRID: NA
e1071	CRAN	versione 1.7.16	Supporto per la macchina dei vettori di supporto e il modello di Bayes naif RRID: NA
gbm	CRAN	versione 2.2.2	Modellazione con Gradient Boosting Machine RRID: NA
Gene Expression Omnibus (GEO) database	National Center for Biotechnology Information (NCBI)	GSE98793	Dataset del bulk transcriptome del disturbo depressivo maggiore RRID: NA
Gene Expression Omnibus (GEO) database	NCBI	GSE1551	Dataset di addestramento per la dermatomiosite; campioni di biopsia muscolare scheletrica RRID: NA
Gene Expression Omnibus (GEO) database	NCBI	GSE46239	Dataset di addestramento per la dermatomiosite; campioni di biopsia cutanea RRID: NA
Gene Expression Omnibus (GEO) database	NCBI	GSE128470	Dataset di addestramento per la dermatomiosite; campioni di dermatomiosite estratti dal coorte di miopatie infiammatorie RRID: NA
Gene Expression Omnibus (GEO) database	NCBI	GSE5370	Dataset di validazione indipendente per la dermatomiosite; campioni di muscolo adulto non trattati RRID: NA
Gene Expression Omnibus (GEO) database	NCBI	GSE11971	Dataset di validazione indipendente per la dermatomiosite RRID: NA
Gene Expression Omnibus (GEO) database	NCBI	GSE39454	Dataset di validazione indipendente per la dermatomiosite; campioni di dermatomiosite estratti dal coorte di miopatie infiammatorie RRID: NA
Gene Expression Omnibus (GEO) database	NCBI	GSE190510	Dataset di RNA-seq singolo-cellula correlato alla dermatomiosite RRID: NA
GeneMANIA	University of Toronto / GeneMANIA	versione del server web utilizzata in questo studio	Costruzione di una rete di associazione funzionale RRID: RRID:SCR_005709
glmnet	CRAN	versione 4.1.8	Modellazione LASSO, Ridge e Elastic Net RRID: NA
GSVA	Bioconductor	versione 2.0.7	Punteggio ssGSEA RRID: NA
Harmony	CRAN	versione 1.2.4	Correzione batch per l'integrazione dei dati singolo-cellula RRID: NA
limma	Bioconductor	versione 3.60.6	Analisi dell'espressione differenziale, sommatoria delle sonde e utilità di normalizzazione RRID: SCR_010943
MASS	CRAN	versione 7.3.61	Analisi discriminante lineare RRID: NA
mboost	CRAN	versione 2.9.11	Modellazione glmBoost RRID: NA
Monocle	Bioconductor	versione 2.38.0	Analisi del tragitto pseudotemporale RRID: SCR_016339
org.Hs.eg.db	Bioconductor	versione 3.19.1	Database di annotazione dei geni umani RRID: NA
plsRglm	CRAN	versione 1.5.1	Modellazione parziale delle minime quadrati generalizzata lineare RRID: NA
pROC	CRAN	versione 1.18.5	Analisi della curva ROC RRID: SCR_024286
R statistical software	R Foundation for Statistical Computing	versione 4.4.2	Ambiente di calcolo statistico principale RRID: SCR_001905
randomForest	CRAN	versione 4.7.1.2	Modellazione Random Forest RRID: SCR_015718
RStudio	Posit Software, PBC	versione 2024.4.1.748	Ambiente di sviluppo integrato per R RRID: SCR_000432
Seurat	CRAN / Satija Lab	versione 4.4.0	Preprocessing, clustering e visualizzazione dell'RNA-seq singolo-cellula RRID: SCR_016341
shapviz	CRAN	versione 0.10.2	Analisi di interpretabilità del modello basata su SHAP RRID: NA
sva