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Articolo di ricerca
* These authors contributed equally
Nei pazienti con lesioni del midollo spinale (LMS), la regolazione al rialzo CASC11 è associata alla gravità della lesione. In vitro, la regolazione alla ribasso del CASC11 ha alleviato l'apoptosi e l'infiammazione, suggerendo un'associazione con l'asse miR-130b-5p/SPP1 . Questi risultati suggeriscono il potenziale ruolo di CASC11 come candidato biomarcatore nella patogenesi della SCI.
La lesione del midollo spinale (LMS) è un grave trauma del sistema nervoso centrale. Questo studio monocentrico, osservazionale e in vitro , ha indagato il potenziale diagnostico di CASC11 e il suo possibile meccanismo regolatorio nelle SCI utilizzando campioni clinici di siero e modelli cellulari stimolati da lipopolisaccaridi. I livelli di CASC11, miR-130b-5p e SPP1 sono stati misurati tramite reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR). Le funzioni cellulari e le relazioni di targeting sono state valutate tramite kit di conteggio cellulare 8 (CCK-8), citometria di flusso, western blot, saggio immunoassorbente legato a enzimi (ELISA), doppio rapporto di luciferasi e immunoprecipitazione RNA (RIP). CASC11 era fortemente espressa nelle LM e associata all'infiammazione come potenziale biomarcatore diagnostico. Nelle cellule PC-12 trattate con lipopolisaccaridi (LPS), il silenziamento di CASC11 ha alleviato la soppressione dell'attività cellulare, l'apoptosi e l'infiammazione, che sono state invertite dall'inibitore miR-130b-5p. Questi risultati suggeriscono che CASC11 è associata alla gravità della LMS, mentre i dati in vitro indicano il suo coinvolgimento nelle risposte infiammatorie e apoptotiche attraverso l'asse CASC11/miR-130b-5p/SPP1 . Questo studio è limitato dal suo design a centro singolo e dalla mancanza di validazione in vivo .
La lesione del midollo spinale (LME) indica un disturbo sistemico temporaneo o permanente derivante da danni al midollo spinale causati da forze o malattie esterne, che conseguenti a compromettere le funzioni motorie, sensoriali, riflesse e del sistema nervosoautonomo 1,2. I pazienti spesso incontrano deficit e complicazioni funzionali fisici per tutta la vita, imponendo notevoli sofferenze e oneri a individui e famiglie. L'eziologia della LM è ampiamente classificata in origini traumatiche e nontraumatiche 3. Le lesioni traumatiche, prevalentemente derivanti da fratture spinali dovute a forze esterne come incidenti stradali, cadute dall'altezza e incidenti sportivi, rappresentano una sfida crescente nella gestione clinica della LM4. Nel frattempo, la cascata di lesioni secondarie avviata dopo quella primaria, in particolare la disregolazione della risposta infiammatoria e l'apoptosi neuronale, sono considerate fattori cruciali che contribuiscono al continuo deterioramento della funzione neurologica. Studi recenti hanno evidenziato il ruolo fondamentale della neuroinfiammazione, della rigenerazione e del recupero funzionale nella fisiopatologia e nella riparazione della LM5. Come risposta secondaria centrale, la neuroinfiammazione svolge un doppio ruolo nel processo di lesione e riparazione dei tessuti. Data la limitata capacità rigenerativa del midollo spinale lesionato, è necessario un approccio terapeutico sinergico che combini trattamento antinfiammatorio, trapianto cellulare, riabilitazione e interventimolecolari 6. Sebbene siano state sviluppate diverse strategie diagnostiche e terapeutiche per la LMS, la pratica clinica attuale si basa prevalentemente su esami di imaging7. Tuttavia, queste tecniche sono limitate dalle elevate esigenze di attrezzature avanzate, dai rigorosi prerequisiti per i pazienti e dalle spese finanziariesostanziali. Di conseguenza, esiste un bisogno urgente e insoddisfatto di un biomarcatore di laboratorio conveniente, accurato e non invasivo. L'identificazione di tale marcatore permetterebbe una diagnosi precoce delle LM senza interrompere i protocolli terapeutici convenzionali, facilitando così lo sviluppo di interventi terapeutici più tempestivi ed efficaci.
L'RNA non codificante lungo (lncRNA) rappresenta una categoria importante di molecole funzionali di RNA che, pur privo di potenziale codificante proteico, sono parte integrante di una vasta gamma di funzioni biologiche, tra cui la regolazione dell'infiammazione e l'apoptosi9. Gli LncRNA agiscono come spugne molecolari per i microRNA (miRNA), impedendo così di fatto a questi miRNA di legarsi e silenziare i loro mRNAbersaglio 10. Ad esempio, l'RNA MAGI2-AS3 media miR-223-3p per accelerare la guarigione dellafrattura 11. Il targeting della rete lncRNA OIP5-AS1/miR-128-3p/Nrf2 rappresenta un approccio terapeutico promettente per migliorare il recupero nella SCI12. CASC11, caratterizzata da un trascrizione a 872 bp situata sul cromosoma 8q24.21, è riconosciuta come una molecola con espressione disregolata in vari tumoriumani 13. CASC11 mostra espressione positiva nei pazienti con osteoporosi postmenopausale e ha la capacità di differenziare gli individui affetti dai controllisani 14. Inoltre, CASC11 mostra un pattern di regolazione all'alza e un potenziale terapeutico simili nei pazienti confratture 15. Sulla base di questi rapporti, CASC11 potrebbe regolare le risposte infiammatorie e l'attività cellulare. Nonostante queste informazioni, il modello di espressione e il ruolo biologico di CASC11 nelle SCI rimangono completamente sconosciuti. Dato che iperinfiammazione e apoptosi sono i principali fattori che conducono la LME secondaria, abbiamo ipotizzato che CASC11 possa essere un biomarcatore e fattore regolatore candidato nella LME. Questo studio ha indagato l'associazione clinica e il potenziale biomarcatore di CASC11 nelle LM analizzando le coorti di pazienti e i modelli cellulari in vitro (Figura 1). Inoltre, abbiamo esplorato un possibile meccanismo molecolare di CASC11, incluso il suo potenziale ruolo nel modulare la risposta infiammatoria successiva alla LM.
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Iscrizione delle materie
I pazienti con trauma spinale acuto (n = 300) trattati in ospedale da gennaio 2023 a maggio 2025 sono stati selezionati e classificati nel gruppo per lesioni completas del midollo spinale (CSCI) (grado A, n = 98), nel gruppo lesioni incomplete del midollo spinale (ISCI) (gradi B, C e D; n = 95) e nel gruppo con funzione neurologica normale (NNF) (grado E, n = 107) secondo la scala di impairment dell'American Spinal Injury Association (classificazione AIS). Per i pazienti del gruppo NNF, le evidenze radiologiche di LM, come edema, contusione o compressione, sono state confermate tramite risonanza magnetica (MRI), ma non sono stati evidenziati deficit sensoriali o motori. Altri 90 partecipanti sani reclutati nello stesso periodo sono stati selezionati come gruppo di controllo. I criteri di inclusione erano: (1) diagnosi di LMS confermata tramite imaging (MRI o TC), in conformità con le linee guida cliniche di gestionestabilite 16; (2) trauma subito entro 24 ore prima del ricovero; e (3) partecipanti adulti con dati clinici completi. I criteri di esclusione erano: (1) storia di interventi chirurgici precedenti legati a fratture o LME; (2) grave malattia coronarica o cardiopolmonare significativa; (3) lesioni craniocerebrali acute gravi; e (4) tumori maligni, malattie cardiovascolari/cerebrovascolari o malattie immunitari. L'approvazione per questo studio fu ottenuta dal Comitato Etico del Quarto Ospedale Popolare di Shenzhen e fu ottenuto il consenso informato dai soggetti. Le procedure utilizzate in questo studio aderivano ai principi della Dichiarazione di Helsinki.
Collezione di esemplari
Campioni di sangue venoso (5 mL) sono stati prelevati dai partecipanti al momento del ricovero utilizzando tubi separatori sierici entro 24 ore dopo l'infortunio. Il sangue è stato lasciato coagulare a temperatura ambiente per 30 minuti e poi centrifugato a 3.000 × g per 10 minuti a 4 °C. Il siero soprantantante veniva accuratamente separato, allicitato in microtubi privi di RNasi e conservato a -80 °C fino a ulteriori analisi.
Coltura cellulare e induzione LPS
Cellule feocromocitomate di ratto (PC-12) e cellule microgliali murine (BV-2) sono state coltivate nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco, integrato con siero bovino fetale al 10% a 37 °C. Per stabilire modelli in vitro di lesioni infiammatorie, le cellule PC-12 e BV-2 sono state esposte a lipopolisaccaridi (LPS) a concentrazioni di 0, 1, 5 e 10 μg/mL per 12 oree 17. Ogni concentrazione è stata testata in tre repliche biologiche indipendenti.
RT-qPCR
L'RNA totale è stato isolato dai campioni utilizzando un protocollo di estrazione fenolico-cloroformico, seguito dalla precipitazione con isopropanolo. La purezza dell'RNA è stata valutata tramite spettrofotometria e campioni con un rapporto A260/280 nm nell'intervallo 1,8–2,1 sono stati utilizzati per l'analisi a valle. L'RNA veniva trascritto inversamente in cDNA secondo il protocollo del kit di trascrizione inversa, e il cDNA risultante veniva utilizzato come modello per le reazioni RT-qPCR con un premix SYBR Green su uno strumento PCR. La gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) è stata utilizzata come gene di riferimento per l'mRNA CASC11 e SPP1 , mentre un piccolo RNA nucleare (U6) è stato utilizzato come gene di riferimento per miR-130b-5p. Per i campioni di siero, il cel-miR-39 sintetico è stato inserito nel siero prima dell'estrazione dell'RNA per controllare eventuali variazioni nel recupero dell'RNA. Gli innesco erano i seguenti: CASC11 avanti 5'-ACCCTATGGAGAACCAGAC-3' e retromarcia 5'-GAGGACCAACTCAGTAGGAAAT-3'; miR-130b-5p avanti 5'-ATCCATGGTTGAGCTTCCCG-3' e retromarcia 5'-TAGTGCAACCTCGTCAGAGC-3'; e SPP1 mRNA avanti 5'-GTTAAACAGGCTGATTCTGG-3' e indietro 5'-CATGGTCATCATCATTCA-3'. L'espressione è stata calcolata utilizzando il metodo 2-ΔΔCt . Ogni reazione RT-qPCR è stata eseguita in repliche tecniche triplice con tre repliche biologiche.
Trasfezione
Il silenziamento CASC11 (si-CASC11), mimetico/inibitore miR-130b-5p, plasmide di sovraespressione SPP1 (ov-SPP1) e i rispettivi controlli negativi (NC) sono stati sintetizzati e trasfettati nelle cellule PC-12 e BV-2 utilizzando un reagente di trasfezione. L'efficienza della trasfezione è stata valutata 48 ore dopo la trasfezione in repliche biologiche triplice.
Saggio sulla proliferazione e sull'apoptosi
Per il saggio di vitalità cellulare, le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzi a 5 × 103 cellule per pozzo e coltivate per 24 ore per permettere l'attacco. Dopo questa incubazione, sono stati erogati 10 μL di reagente CCK-8 in ogni pozzo, seguiti da un'incubazione per 2 ore a 37 °C. La densità ottica veniva quindi registrata a 450 nm con un lettore di microplacche. Per la rilevazione dell'apoptosi, le cellule sono state staccate con tripsina, risciacquate due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e sospese in tampone di legame fino a una concentrazione finale di 1 × 106 cellule per pozzo. Successivamente, 100 μL della sospensione sono stati inseriti in un tubo di citometria a flusso da 5 mL, seguiti dall'aggiunta di 5 μL di Annexin V-FITC e 5 μL di soluzione di colorazione di propidio iodio (PI). I campioni sono stati miscelati delicatamente e conservati per 15 minuti a temperatura ambiente, protetti dalla luce. Il tampone di legame è stato poi aggiunto a un volume aggiuntivo finale di 400 μL per tubo, e le cellule apoptotiche sono state quantificate tramite citometria a flusso. Tutte le condizioni sono state analizzate utilizzando tre repliche tecniche in tre esperimenti biologici indipendenti.
Saggio sull'attività dual-luciferasi
I target a valle di CASC11 e miR-130b-5p sono stati previsti tramite siti web di bioinformatica (lncRNASNP2 e TargetScan). Frammenti contenenti sequenze complementari di tipo selvatico (wt) o mutanti (mut) venivano sintetizzati e clonati in un vettore reporter dual-luciferasi per costruire plasmidi reporter wt e mut. Le cellule PC-12 sono state seminate e co-trasfettate con miMique/inibitore miR-130b-5p e plasmidi wt/mut costruiti utilizzando un reagente di trasfezione a base di lipidi. Dopo 48 ore, l'attività della luciferasi è stata quantificata per valutare l'interazione. Ogni gruppo era composto da tre repliche tecniche e tre repliche biologiche.
Saggio di immunoprecipitazione a RNA (RIP)
Il RIP è stato eseguito utilizzando un kit di immunoprecipitazione di proteine legati all'RNA. Le cellule sono state lisate con il tampone di lisi e incubate con anticorpi anti-Ago2 o anticorpo IgG normale. I complessi RNA-proteina sono stati arricchiti tramite sfere magnetiche. Dopo il lavaggio, le proteine legate venivano rimosse e l'RNA immunoprecipitato veniva isolato. I livelli di arricchimento di CASC11 e miR-130b-5p sono stati quantificati tramite RT-qPCR. Ogni gruppo era composto da tre repliche tecniche e tre repliche biologiche.
Tachia occidentale
I lisati proteici sono stati preparati da cellule PC-12 e BV-2 utilizzando un tampone di lisi cellulare, e il contenuto proteico totale è stato misurato con un saggio BCA. Per ogni campione, 30 μg di proteina venivano caricati su gel SDS-PAGE al 12% e trasferiti alle membrane PVDF dopo la separazione elettroforetica. Le membrane sono state bloccate per 2 ore a temperatura ambiente nel latte scremato al 5% diluito in TBST e poi incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro Bcl-2, Bax, caspasi-3 scindito e GAPDH a una diluizione di 1:1.000. Dopo il lavaggio, le membrane sono state incubate con anticorpi secondari coniugati con HRP per 1 ora a temperatura ambiente. I segnali proteici sono stati analizzati utilizzando software di analisi delle immagini e le densità di bande sono state utilizzate per valutare l'espressione di proteine correlate all'apoptosi. Gli esperimenti western blot includevano tre repliche biologiche, con tre repliche tecniche per ciascun gruppo.
ELISA
Le concentrazioni di citochine infiammatorie TNF-α, IL-1β e IL-6 nei sieri del paziente e nei supernatanti cellulari PC-12 e BV-2 sono state quantificate utilizzando kit ELISA secondo le istruzioni del produttore. I campioni sono stati incubati in pozzi pre-rivestiti e sono stati aggiunti anticorpi di rilevamento per un'ulteriore incubazione. Venivano aggiunti e incubati i coniugati enzimatici. Dopo il lavaggio, venivano aggiunti substrati per lo sviluppo del colore e le reazioni venivano interrotte. L'assorbanza è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre e convertita in concentrazioni di fattori infiammatori basate sulla curva standard fornita. Ogni saggio ELISA è stato eseguito in repliche tecniche triplice su tre repliche biologiche indipendenti.
Analisi statistica
Le variabili continue sono state riportate come media ± deviazione standard (SD), e le variabili categoriche sono state presentate come numeri e percentuali (n, %). I confronti tra i due gruppi sono stati effettuati utilizzando il test t di Student. Per confronti che coinvolgono più di due gruppi, è stata applicata l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA), seguita dal test post-hoc di Tukey. La capacità di CASC11 di discriminare tra gruppi clinici è stata valutata utilizzando l'analisi della curva delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC). Le associazioni tra due variabili sono state esaminate tramite analisi di correlazione di Pearson. Per gli esperimenti cellulari, ogni gruppo conteneva tre repliche biologiche indipendenti, e ogni misurazione veniva ripetuta in tre repliche tecniche. La significatività statistica è stata definita come P < 0,05.
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Dati di base dei soggetti
Le caratteristiche di base dei pazienti nei gruppi Controllo, NNF, ISCI e CSCI sono presentate nella Tabella 1. L'analisi statistica non ha rilevato differenze significative tra i gruppi di variabili, come sesso, età, indice di massa corporea (BMI), eziologia dell'infortunio e tempo dell'infortunio (P > 0,05). Differenze significative tra i quattro gruppi sono state osservate per la durata de...
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La LMS è una condizione devastante del sistema nervoso centrale che spesso provoca deficit significativi di sensibilità, controllo motorio e funzione autonoma, riducendo così in modo significativo la qualità della vita del paziente e la prognosia lungo termine 18. I pazienti possono presentare un deficit funzionale e una perdita sensoriale dopo traumi spinali, e possono essere utilizzati esami di imaging (come la risonanza magnetica) per valutare la presenza della...
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Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Non applicabile.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BCA protein assay kit | Yeasen, China | P0010 | |
| CCK-8 solution | Sigma-Aldrich, USA | 96992 | |
| Dual-luciferase reporter vector | Promega, USA | E133A | vettore pmirGLO |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | ATCC, Manassas, VA, USA | 30-2002 | |
| ELISA kit per IL-1β | R&D Systems, USA | DY401 | |
| ELISA kit per IL-6 | R&D Systems, USA | HS600B | |
| ELISA kit per TNF-α | R&D Systems, USA | DTA00C | |
| Siero fetale bovino | Gibco, Grand Island, NY, USA | 10099141 | |
| Citometro a flusso | BD FACSCalibur, USA | FACS101 | |
| Software di analisi delle immagini | NIH, Bethesda, MD, USA | versione 1.44p | Software ImageJ |
| Isopropanolo | Beijing Chemical Factory, Cina | 32064 | |
| Reagente di trasfezione a base lipidica | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | L3000008 | Lipofectamine 3000 |
| Lipopolisaccaride | Sigma-Aldrich, USA | L2880 | |
| Buffer di lisi | Beyotime, Cina | P0013D | Buffer di lisi RIPA |
| Lettore di micropiastre | Reagen, Cina | RNE90002 | |
| Cellule PC-12 e BV-2 | ATCC, Manassas, USA | ||
| Reagente fenolo-cloroformio | Thermo, USA | 15596026 | Reagente Trizol |
| Kit di trascrizione inversa | Takara, Giappone | RR047A | PrimeScript RT Kit |
| Kit per immunoprecipitazione di proteine che si legano all'RNA | Millipore, USA | 17-700 | Magna RIP Kit |
| Microtube privi di RNase | Axygen, Corning, NY, USA | MCT-150-C-S | |
| Tubi separatori per siero | Terumo, Tokyo, Giappone | VP-AS109K60 | |
| Software di analisi statistica | San Diego, USA | versione 9.0 | GraphPad Prism |
| Premix SYBR Green | Takara, Giappone | RR420A | SYBR Premix Ex Taq |