Un sistema microfluidico per modellare la disfunzione endoteliale sotto stress fisiologico di taglio pulsatile combinato e iperglicemia oscillatoria

Summary

Qui presentiamo un protocollo per fabbricare e operare un sistema microfluidico che espone le cellule endoteliali a iperglicemia oscillatoria sincronizzata e a stress di taglio pulsatile. Questo approccio fornisce un modello in vitro fisiologicamente rilevante per lo studio della disfunzione endoteliale diabetica. Questo protocollo consente la misurazione quantitativa dello stress ossidativo e delle risposte delle cellule endoteliali.

Abstract

La disfunzione endoteliale nelle complicazioni vascolari diabetiche comporta complesse interazioni tra disturbi metabolici, in particolare glucosio oscillatorio (OG) e stress di taglio pulsatile (PSS). Sebbene questi fattori siano stati studiati isolatamente, i modelli convenzionali rimangono limitati a un flusso statico ad alto livello di glucosio o a flusso laminare semplificato, privo della capacità di imitare l'accoppiamento spaziotemporale integrato presente nella vascolatura diabetica. Utilizzando una piattaforma microfluidica programmabile, questo protocollo offre una preziosa piattaforma per indagare gli effetti integrati dell'iperglicemia oscillatoria sincronizzata e della PSS fisiologica sulle cellule endoteliali. Questo protocollo mira a modellare la disfunzione endoteliale in condizioni metaboliche e meccaniche accoppiate fisiologicamente rilevanti. L'uso di un chip polidimetilsilossano (PDMS) combinato con un sistema di controllo guidato dalla pressione consente la modulazione precisa e indipendente delle forme d'onda del flusso e dei profili di concentrazione di glucosio. La fedeltà emodinamica del sistema viene validata tramite Micro-Particle Image Velocimetria (Micro-PIV), mentre la risposta cellulare è caratterizzata quantitativamente dal monitoraggio dei livelli di specie reattive intracellulari dell'ossigeno (ROS) e della vitalità cellulare. I risultati rappresentativi dimostrano che il PSS fisiologico attenua efficacemente il danno ossidativo indotto dall'OG. Questo effetto è dimostrato dalla riduzione dei livelli intracellulari di ROS e dal miglioramento della vitalità cellulare in condizioni di stimolazione combinata. A seconda della domanda di ricerca, parametri come i modelli di sforzo di taglio, le frequenze di oscillazione del glucosio e le geometrie dei canali possono essere adattati. Questo metodo funge da strumento versatile per studi meccanicistici sulle vie meccanobiologiche e per lo screening farmacologico per interventi terapeutici nelle malattie vascolari diabetiche.

Introduction

La disfunzione endoteliale è un evento critico precoce nello sviluppo delle complicazioni vascolari diabetiche, causata sia da disturbi metabolici sia da forze emodinamiche^{anomale 1,2}. I livelli di OG, piuttosto che solo l'iperglicemia sostenuta da sola, sono sempre più riconosciuti come potenti induttori dello stress ossidativo e della segnalazione infiammatoria nelle cellule endoteliali, portando a lesioni vascolari e omeostasi^{compromessa 3,4,5}. Contemporaneamente, lo stress di tagl....

Protocol

Dichiarazione etica:

NOTA: Tutti i reagenti, dispositivi e software utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Fabbricazione di chip microfluidici

1. Utilizzare software di progettazione assistita da computer (CAD) per progettare la struttura del chip microfluidico (L x L x H = 2 mm x 30 mm x 0,1 mm, Figura 1A) e realizzare lo stampo master SU-8 tramite una società commerciale.
2. Mescola agente polimerico PDMS e prepolimero in un rapporto 10:1 in peso in una tazza p....

Results

Validazione micro-PIV del campo di flusso all'interno del canale microfluidico
La Figura 1D offre una panoramica della piattaforma microfluidica utilizzata per indagare le risposte endoteliali alla stimolazione metabolica e meccanica accoppiata. Il sistema integra un microfluidico PDMS a canale diretto con un modulo di controllo del flusso guidato dalla pressione, consentendo l'applicazione della condizione OG insieme al PSS fisiologico........

Discussion

Il sistema microfluidico descritto qui fornisce una piattaforma robusta e fisiologicamente rilevante per indagare gli effetti integrati di OG e PSS sulla funzione delle cellule endoteliali. Il principale vantaggio di questo metodo risiede nella sua capacità di controllare e disaccoppiare con precisione stimoli meccanici e biochimici all'interno di un microambiente definito. A differenza delle colture statiche convenzionali che non dispongono di forze emodinamiche o dei modelli animali ch.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% Tripsina-EDTA	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211052	Dissociazione cellulare
1 mL di siringa	Shanghai Zhengbang Medical Science Co., Ltd.	1mL	Iniettare liquido
Piatto di coltura da 60 mm	NEST Biotechnology Co., Ltd.	705001	Coltura cellulare
90° Connettore in acciaio inox inclinato	Luoyang Mayer Trading Co., Ltd.	1,3 mm	Dispositivo di sigillatura per adattatore
Software AutoCAD	Autodesk	RRID:SCR_014981	Software di progettazione assistita da computer
Bottiglia di vetro boronizzata	Hunan Aidete Scientific Instruments Co., Ltd.	Doppio passaggio 100mL	Bacino
Calcein-AM/PI Kit	Beyotime	BYT-C2015	Colorazione
Incubatore cellulare	ESCO	Esco CelMate	Coltura cellulare
CellROX Deep Red	Invitrogen	C10422	Colorazione
D-glucosio	Sigma Aldrich	47249	Glucosio
D-mannitolo	Macklin	M813423	Bilanciare la pressione osmotica
DynamicStudio	Dantec Dynamics	V8.6	Software per l'analisi PIV
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco	14190-094	Medium
Fibronectina	Sigma Aldrich	F-2006	Adesione cellulare
Microparticelle fluorescenti	Thermo Scientific	G0100	Micro-PIV
Copertura in vetro	Citotest Scientific Co., Ltd.	#1	Chip microfluidico
DMEM ad alto livello di glucosio	Solarbio	12100	Medium
Telecamera ad alta velocità	Dantec Dynamics	FlowSense EO	Micro-PIV
ImageJ	NIH	RRID:SCR_003070	Software di elaborazione immagini
Microscopio a fluorescenza invertita	Olympus	IX73	Vitalità cellulare
Microscopio a fluorescenza invertita	Olympus	IX83	Osservazione e acquisizione
DMEM a basso livello di glucosio	Solarbio	31600	Medium
Origine	OriginLab	RRID:SCR_014212	Software per l'analisi dei dati e la graficazione
PDMS	Dow Inc.	184	Chip microfluidico
Penicillina/streptomicina (P/S)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211092	Medium
Soluzione salina tampone fosfato (PBS)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211031	Coltura cellulare
Detergente al plasma	Jiarun Wanfeng Technology Co., Ltd.	PC-6D	Chip microfluidico
Sistema di controllo della pressione programmabile	Elvesys	OB1 MK4	Controllo del flusso
Tubo in silicone	Nanchino Runze Fluid Control Equipment Co., Ltd.	96410	1mm*3mm
Stampo master SU-8	Boao Biology Group Co. Ltd.	N/A	Chip microfluidico
Regolatore valvole	Elvesys	MUX Wire V3	Controllo del flusso