Un sistema microfluidico per modellare la disfunzione endoteliale sotto stress fisiologico di taglio pulsatile combinato e iperglicemia oscillatoria

Summary

Qui presentiamo un protocollo per fabbricare e operare un sistema microfluidico che espone le cellule endoteliali a iperglicemia oscillatoria sincronizzata e a stress di taglio pulsatile. Questo approccio fornisce un modello in vitro fisiologicamente rilevante per lo studio della disfunzione endoteliale diabetica. Questo protocollo consente la misurazione quantitativa dello stress ossidativo e delle risposte delle cellule endoteliali.

Abstract

La disfunzione endoteliale nelle complicazioni vascolari diabetiche comporta complesse interazioni tra disturbi metabolici, in particolare glucosio oscillatorio (OG) e stress di taglio pulsatile (PSS). Sebbene questi fattori siano stati studiati isolatamente, i modelli convenzionali rimangono limitati a un flusso statico ad alto livello di glucosio o a flusso laminare semplificato, privo della capacità di imitare l'accoppiamento spaziotemporale integrato presente nella vascolatura diabetica. Utilizzando una piattaforma microfluidica programmabile, questo protocollo offre una preziosa piattaforma per indagare gli effetti integrati dell'iperglicemia oscillatoria sincronizzata e della PSS fisiologica sulle cellule endoteliali. Questo protocollo mira a modellare la disfunzione endoteliale in condizioni metaboliche e meccaniche accoppiate fisiologicamente rilevanti. L'uso di un chip polidimetilsilossano (PDMS) combinato con un sistema di controllo guidato dalla pressione consente la modulazione precisa e indipendente delle forme d'onda del flusso e dei profili di concentrazione di glucosio. La fedeltà emodinamica del sistema viene validata tramite Micro-Particle Image Velocimetria (Micro-PIV), mentre la risposta cellulare è caratterizzata quantitativamente dal monitoraggio dei livelli di specie reattive intracellulari dell'ossigeno (ROS) e della vitalità cellulare. I risultati rappresentativi dimostrano che il PSS fisiologico attenua efficacemente il danno ossidativo indotto dall'OG. Questo effetto è dimostrato dalla riduzione dei livelli intracellulari di ROS e dal miglioramento della vitalità cellulare in condizioni di stimolazione combinata. A seconda della domanda di ricerca, parametri come i modelli di sforzo di taglio, le frequenze di oscillazione del glucosio e le geometrie dei canali possono essere adattati. Questo metodo funge da strumento versatile per studi meccanicistici sulle vie meccanobiologiche e per lo screening farmacologico per interventi terapeutici nelle malattie vascolari diabetiche.

Introduction

La disfunzione endoteliale è un evento critico precoce nello sviluppo delle complicazioni vascolari diabetiche, causata sia da disturbi metabolici sia da forze emodinamiche^{anomale 1,2}. I livelli di OG, piuttosto che solo l'iperglicemia sostenuta da sola, sono sempre più riconosciuti come potenti induttori dello stress ossidativo e della segnalazione infiammatoria nelle cellule endoteliali, portando a lesioni vascolari e omeostasi^{compromessa 3,4,5}. Contemporaneamente, lo stress di taglio emodinamico è un determinante principale del fenotipo endoteliale, con la PSS in condizioni di esercizio fisiologico che promuove la produzione di ossido nitrico, la difesa antiossidante e la protezione^{vascolare 6,7,8}. Pertanto, comprendere gli effetti integrati dell'iperglicemia oscillatoria e della stimolazione emodinamica è essenziale per chiarire i meccanismi della disfunzione endoteliale.

I modelli convenzionali in vitro, che spesso si basano su condizioni statiche ad alto livello di glucosio o su un flusso laminare semplificato, non riescono a replicare la complessa e dinamica interazione tra segnali metabolici e meccanici presente in^{vivo 9,10,11}. Sebbene i modelli animali catturiscano aspetti sistemici del diabete, mancano della risoluzione a livello cellulare necessaria per dissezionare la segnalazione in condizioni microambientali^{controllate 12}. La tecnologia microfluidica offre un'alternativa efficace, fornendo un controllo spaziotemporale preciso degli stimoli biochimici e biomeccanici in geometrie fisiologicamente rilevanti¹³, e ha guidato importanti progressi recenti in varie applicazioni biomediche innovative^14,15. Ad esempio, Chen et ^al.16 progettarono un dispositivo microfluidico con stress di taglio della parete spaziale e temporale e segnalazione ATP per lo studio della dinamica intracellulare del Ca²+ nelle cellule endoteliali. Yu et ^al.11 hanno sviluppato un sistema a chip microfluidico emodinamico per rilevare le risposte cellulari sotto diverse combinazioni di PSS fisiologico e concentrazioni elevate di glucosio. Sebbene questi sistemi siano stati utilizzati per studiare le risposte endoteliali allo stress di taglio o alle perturbazioni metaboliche a singolo fattore, pochi sono riusciti a integrare con successo sia le oscillazioni del glucosio che il PSS all'interno di un unico sistema. Pertanto, manca un protocollo standardizzato e riproducibile che sincronizzi entrambi i fattori in un contesto microfluidico controllato.

Questo metodo colma questa lacuna stabilendo un sistema microfluidico riproducibile in grado di fornire OG e PSS accoppiati. L'obiettivo principale di questo approccio è modellare lo stress ossidativo, la vitalità cellulare compromessa e le risposte meccanobiologiche alla base della disfunzione endoteliale in modo fisiologicamente rilevante. A differenza della coltura statica o delle camere di perfusione convenzionali, questo approccio migliora i modelli esistenti consentendo una modulazione simultanea e controllata sia di stimoli metabolici che meccanici, avvicinandosi più da vicino al microambiente vascolare diabetico. Inoltre, il sistema è compatibile con imaging a cellule vive, monitoraggio in tempo reale e analisi molecolare, rendendolo adatto a un'ampia gamma di applicazioni tra cui studi meccanicistici, modellazione delle malattie e screening farmacologico per la funzione e lesioni endoteliali.

Protocol

Dichiarazione etica:

NOTA: Tutti i reagenti, dispositivi e software utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Fabbricazione di chip microfluidici

1. Utilizzare software di progettazione assistita da computer (CAD) per progettare la struttura del chip microfluidico (L x L x H = 2 mm x 30 mm x 0,1 mm, Figura 1A) e realizzare lo stampo master SU-8 tramite una società commerciale.
2. Mescola agente polimerico PDMS e prepolimero in un rapporto 10:1 in peso in una tazza pulita e mescola vigorosamente manualmente per 5 minuti.
3. Posizionare il contenitore in una camera a vuoto sotto -0,08 MPa per almeno 15 minuti per rimuovere le bolle d'aria intrappolate durante il processo di miscelazione.
   NOTA: Per accelerare la rimozione delle bolle e prevenire il traboccamento, sfiati temporaneamente la camera a pressione atmosferica per far scoppiare le bolle grandi, e poi riapplica immediatamente il vuoto. Ripeti questo ciclo di ventilazione 2–3 volte finché la miscela di massa non diventa completamente trasparente e priva di bolle macroscopiche.
4. Versa il PDMS sulla wafer posta in una piastra di vetro di Petri.
5. Degas il PDMS versato sul wafer in un essiccatore per altri 15 minuti per rimuovere eventuali bolle che potrebbero essersi formate durante la colata.
   NOTA: Se rimane qualche micro-bolla ostinata intrappolata vicino o all'interno delle strutture dello stampo master SU-8, soffiale delicatamente fino al bordo o falle scoppiare con un soffiatore manuale in gomma. La rimozione completa delle bolle d'aria è fondamentale per prevenire difetti strutturali nei microcanali.
6. Metti la piastra di Petri contenente muffa e polimero in un forno caldo impostato a 80 °C per 2 ore.
   ATTENZIONE: Usa guanti resistenti al calore quando manipolhi materiali caldi
7. Speggi con cura la lastra polimerica solidificata dallo stampo master usando un bisturi.
8. Usa uno strumento per perforare nuclei (ad esempio, diametro 1,2 mm) per creare porte di ingresso e uscita alle estremità designate dei canali sulla lastra di polimero.
9. Pulisci il vetrato di vetro e la faccia decorata della lastra di polimero con del nastro adesivo.
   PUNTO DI PAUSA: Le lastre PDMS polimerizzate e perforate possono essere conservate in un contenitore pulito (ad esempio, una piastra di Petri sigillata) a temperatura ambiente per diverse settimane prima del trattamento al plasma e del legame.
10. Tratta sia la lastra di polimero che il vetravetro con un detergente al plasma a 65W di potenza sotto aria ambiente per 60 secondi.
11. Allinea immediatamente la faccia del canale in polimero con il lato trattato del vetrato di copertura.
12. Premi delicatamente per creare un canale microfluidico permanente e chiuso.

2. Preparazione e semina delle cellule endoteliali

1. Posiziona il chip microfluidico legato in una bottiglia di vetro boronizzata riempita di acqua deionizzata e sterilizza tramite autoclaving a 121 °C e 15 psi per 20 minuti.
   NOTA: Immergere il chip nell'acqua durante l'autoclaving per equalizzare la pressione e prevenire la deformazione dei microcanali PDMS. Questo aiuta anche a rimuovere le bolle d'aria intrappolate e prepara i canali per la successiva introduzione del fluido.
   PUNTO DI PAUSA: I CHIP MICROFLUIDICI STERILIZZATI POSSONO ESSERE CONSERVATI IN SICUREZZA NELLA BOTTIGLIA DI VETRO SIGILLATA A TEMPERATURA AMBIENTE PER FINO A DIVERSE SETTIMANE, FINO A QUANDO NON SARANNO NECESSARI PER LA SEMINA DELLE CELLULE.
2. Posizionare il chip sterilizzato in una teglia di coltura da 60 mm riempita con una miscela 1:1 di fosfato tampone salino (PBS) e il Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) a basso livello di glucosio.
3. Introdurre 100 μg·^mL-1 di fibronectina nel canale usando una siringa da 1 mL e incubare a 37 °C per 4 ore.
   NOTA: Assicurati che il chip microfluidico sia posizionato sotto il livello del liquido. Collega il tubo adattatore all'ago della siringa, riempi il tubo con liquido e inseriscilo sotto il livello del liquido, collega l'ingresso e poi inietta per assicurarti che non entrino bolle.
4. Aggiungere 24,5 mM di D-mannitolo al DMEM a basso glucosio (5,5 mM di glucosio) per aumentare la pressione osmotica. Aggiungi 5 mM di D-glucosio al DMEM ad alto contenuto di glucosio (25 mM di glucosio) a un ultimo 30 mM di glucosio. Integrare rispettivamente il medium di coltura normale per il glucosio (NG) e il medio per coltura ad alto contenuto di glucosio (HG) con siero bovino fetale (FBS) al 20%, 1% di penicillina/estreptomicina (P/S).
5. Riscaldare 1× PBS, tripsina, NG e substrati di coltura HG in un bagno d'acqua a 37 °C. Preleva le Cellule Endoteliali della Vena Ombelicale Umana (HUVEC) dal piatto di coltura con confluenza al 90%. Distogliere le cellule utilizzando una soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% e incubare a 37 °C per 30 secondi. Contare le cellule prelevate e regolare la concentrazione a 1 x 10⁶ cellule/mL rispettivamente nel mezzo NG e nel mezzo HG.
6. Iniettare 100 μL della sospensione della cella nella porta di ingresso di un chip microfluidico utilizzando una siringa da 1 mL, utilizzando un mezzo NG per il gruppo di controllo e un mezzo HG per il gruppo sperimentale. Posizionare i chip microfluidici in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO₂ per 48 ore.
   NOTA: Lasciare che le cellule si attacchino per almeno 4 ore prima di ulteriori lavorazioni. Alternare manualmente i due mezzi di coltura ogni 2 ore per stimolare l'iperglicemia oscillatoria durante la fase di coltura statica. Mantieni le cellule a 5,5 mM di glucosio durante la notte per imitare la situazione in vivo (Figura 1B).

3. Impostazione della stimolazione dinamica

1. Riempire due serbatoi da 100 mL rispettivamente con mezzi di coltura NG e HG, e collegarli ai canali corrispondenti del sistema di controllo della pressione programmabile.
2. Collega i serbatoi, la valvola magnetica a due posizioni a tre vie e il microfluidico tramite tubi in silicone.
3. Utilizzare connettori in acciaio inox, con un diametro di 1,3 mm e inclinato a 90°, per collegare le porte di ingresso e uscita del chip PDMS al tubo.
   NOTA: Sterilizza in anticipo i serbatoi da 100 mL, i tubi in silicone e i connettori in acciaio inox in un'autoclave ad alta pressione e alta temperatura.
4. Calcola la portata (Q) necessaria per raggiungere il PSS target (τ). Usare la formula τ = (6μQ)/(wh²), dove μ la viscosità, w è la larghezza del canale e h è l'altezza del canale.
5. Imposta un PSS fisiologico target (τ = 10 ± 2 dyn·^cm-2, 1 Hz), che corrisponde a una portata calcolata di 200 ± 40 μL·^min-1.
6. Programma la pompa d'aria programmabile per generare una funzione a onda sinusoidale per mantenere il PSS. Programmare il controller della valvola per cambiare canale ogni 5 minuti per generare un'oscillazione di glucosio a onda quadrata durante la stimolazione dinamica.
7. Avvia il sistema di pompa programmabile per fornire la combinazione OG e PSS per un totale di 30 minuti.

4. Micro-PIV per la verifica del campo di flusso

1. Preparare i mezzi NG e HG contenenti una concentrazione volumetrica dello 0,05% di microparticelle fluorescenti (1 μm). Assicurati che le particelle siano distribuite uniformemente e prive di aggregazione.
2. Posizionare un chip microfluidico pulito e privo di cellule (identico a quello usato negli esperimenti cellulari) sul palco del microscopio a fluorescenza invertita.
3. Collega tutti i componenti del sistema (Figura 1C).
   1. Collega la sorgente di pressione al controllore di pressione.
   2. Collega il controllore di pressione al regolatore valvole, che è collegato al computer per il controllo automatico delle forme d'onda di pressione.
   3. Collega le uscite del controllore di pressione ai serbatoi HG e NG tramite tubi separati.
   4. Collega entrambi i serbatoi alla valvola a pressione 3/2, che commuta tra media HG e NG secondo il protocollo oscillatorio programmato per il glucosio.
   5. Collega l'uscita della valvola di pressione 3/2 all'ingresso del chip microfluidico tramite un tubo.
   6. Collega l'uscita del microfluidico al serbatoio di scarto.
   7. Posizionare il chip microfluidico sul palco del microscopio per l'imaging delle cellule vive durante tutto l'esperimento.
      NOTA: Assicurati che tutte le connessioni dei tubi siano sicure e prive di perdite prima di iniziare il flusso.
4. Attiva la telecamera ad alta velocità (che opera a 15 Hz in modalità doppio fotogramma) dopo che il flusso è stabile per catturare coppie di immagini sequenziali delle microparticelle in movimento. Imposta il ritardo preciso (Δt) tra i due frame di ciascuna coppia a 80 μs.
5. Cattura immagini per la Regione di Interesse (ROI) all'interno del canale. Seleziona il ROI al centro della sezione del canale rettilineo (Figura 2A), equidistante sia dall'ingresso che dall'uscita, per evitare effetti finali e garantire misurazioni rappresentative del flusso.
6. Elabora le coppie di immagini acquisite utilizzando software di analisi PIV. Utilizzare un algoritmo adattivo di correlazione incrociata multi-passaggio, partendo da un'area di interrogazione iniziale di 64 × 64 pixel e affinando fino a un'area finale di 16 × 16 pixel con una dimensione di passo della griglia di 8 × 8 pixel, per determinare il vettore di spostamento (Δx) delle particelle tra i due fotogrammi.
7. Calcola il vettore velocità (v) per ogni area di interrogatorio usando la formula v = Δx / Δt.

5. Acquisizione dati

NOTA: Quantificare la vitalità e la funzione cellulare utilizzando il kit Calcein-AM/propidium ioduro (PI) e la sonda fluorescente di stress ossidativo a cellule vive per verificare i danni causati dalle fluttuazioni del glucosio e valutare l'effetto della co-stimolazione.

1. Vitalità cellulare
   1. Preparare la soluzione di lavoro Calcein-AM/PI secondo le istruzioni del produttore all'endpoint sperimentale.
      ATTENZIONE: Il PI è un mutageno noto e un sospetto cancerogeno che si intercala nel DNA. Maneggiare con estrema attenzione. Indossa i guanti e la maniglia all'interno di uno spazio di lavoro sicuro designato.
   2. Sciacquare il canale una volta con PBS e introdurre la soluzione di lavoro Calcein-AM/PI nel canale. Incubare il dispositivo a 37 °C con il 5% di_CO2 per 30 minuti al buio.
   3. Cattura immediatamente immagini fluorescenti delle cellule colorate utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita dotato di una lente obiettivo al 10×. Usa il filtro FITC (Verde) per Calcein-AM e il filtro TRITC o Rhodamine (Rosso) per PI.
2. Misurare ROS intracellulari
   1. Preparare la soluzione di lavoro fluorescente a tensione ossidativa a cellule vive (vedi Tabella dei Materiali) alla concentrazione specificata dal produttore (5 μM) in PBS.
      ATTENZIONE: Le sonde fluorescenti e i loro soldati solventi comuni (come il DMSO) possono essere tossici e facilitare l'assorbimento di sostanze pericolose attraverso la pelle. Indossa i guanti e la maniglia all'interno di uno spazio di lavoro sicuro designato.
   2. Risciacquare il canale tre volte con PBS e introdurre la soluzione fluorescente a pressione ossidativa a cellule vive nel canale. Incubare il chip a 37 °C con il 5% di CO2 per 30 minuti al buio.
   3. Risciacqua il canale tre volte con PBS per rimuovere la sonda non legata. Cattura immediatamente immagini fluorescenti utilizzando il set di filtri Far-Red (eccitazione 640 nm, emissione 665 nm) attraverso una lente obiettivo 20×, mantenendo esattamente gli stessi parametri di esposizione per tutti i gruppi.
      NOTA: L'aumento dell'intensità della fluorescenza indica livelli più elevati di ROS.

6. Analisi dei dati

PUNTO DI PAUSA: Una volta acquisite e salvate in modo sicuro su hard disk tutte le immagini fluorescenti grezze e quelle delle fotocamere ad alta velocità, l'elaborazione delle immagini, l'analisi quantitativa e i confronti statistici possono essere messi in pausa e eseguiti in qualsiasi momento.

1. Quantificare la vitalità cellulare
   1. Apri le immagini acquisite Calcein-AM (verde) e PI (rosso) in ImageJ (vedi Tabella dei Materiali). Regola manualmente la soglia per ogni canale per distinguere i segnali fluorescenti da quelli di fondo. Usa la funzione del contatore delle cellule per contare le cellule fluorescenti, regolando la dimensione minima della cellula in base alla dimensione della cellula osservata, e contando il numero di cellule vive (N_Live) e morte (N_Dead) in più campi visivi.
      NOTA: N_Live si riferisce al numero di cellule Calcein-AM-positive (verdi), N_Dead si riferisce al numero di cellule PI-positive (rosse).
   2. Calcola la percentuale di cellule vive (N_vive / (N_vive + N_morte) x 100%) per ogni condizione sperimentale utilizzando un software di calcolo. Calcola la media e la deviazione standard in più campi visivi utilizzando software di analisi statistica per il confronto tra gruppi.
2. Quantificare le ROS intracellulari
   1. Trascina l'immagine preferita in ImageJ. Imposta la scala calibrando la dimensione del pixel usando i metadati del microscopio (o una griglia di riferimento nota): Analizza | Stabilisci la scala.
   2. Rimuovere un segnale di fondo uniforme non specifico dall'intera immagine usando la funzione di sottrazione dello sfondo: Process | Sottrai il background.
   3. Regolare manualmente il cursore della soglia in segmento e definire il segnale ROS intracellulare: Immagine | Modifica | Soglia. Una volta impostata la soglia, usa Analizza | Imposta le misure per scegliere l'area e il valore medio grigio. Imposta la dimensione minima della cella in base alla dimensione della cella osservata e misura l'intensità media del segnale segmentato all'interno del ROI del monolayer della cella: Analizza | Analizza le particelle.
   4. Riporta il livello ROS per ogni condizione sperimentale come media dei valori misurati (ad esempio, intensità media) derivati da almeno tre campi di vista selezionati casualmente per chip.
3. Esecuzione di confronti statistici
   1. Inserire i risultati quantitativi (percentuale di vitalità e intensità media ROS) nel software di analisi dei dati e graficazione (vedi Tabella dei Materiali).
   2. Determinare la significatività statistica confrontando i gruppi sperimentali con il gruppo di controllo utilizzando l'Analisi bidirezionale della Varianza (ANOVA) seguita dal test post-hoc di Tukey, con un livello di significatività p = 0,05. Utilizzare il software per eseguire l'analisi e generare grafici con barre di errore che rappresentano la deviazione standard (SD).

Results

Validazione micro-PIV del campo di flusso all'interno del canale microfluidico
La Figura 1D offre una panoramica della piattaforma microfluidica utilizzata per indagare le risposte endoteliali alla stimolazione metabolica e meccanica accoppiata. Il sistema integra un microfluidico PDMS a canale diretto con un modulo di controllo del flusso guidato dalla pressione, consentendo l'applicazione della condizione OG insieme al PSS fisiologico....

Discussion

Il sistema microfluidico descritto qui fornisce una piattaforma robusta e fisiologicamente rilevante per indagare gli effetti integrati di OG e PSS sulla funzione delle cellule endoteliali. Il principale vantaggio di questo metodo risiede nella sua capacità di controllare e disaccoppiare con precisione stimoli meccanici e biochimici all'interno di un microambiente definito. A differenza delle colture statiche convenzionali che non dispongono di forze emodinamiche o dei modelli animali ch...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211052	Dissociazione cellulare
1 mL siringa	Shanghai Zhengbang Medical Science Co., Ltd.	1mL	Iniettare fluido
Piastrella di cultura da 60 mm	NEST Biotechnology Co., Ltd.	705001	Coltura cellulare
Connettore angolato a 90° in acciaio inossidabile	Luoyang Mayer Trading Co.,Ltd.	1,3 mm	Dispositivo di tenuta dell'adattatore
Software AutoCAD	Autodesk	RRID:SCR_014981	Software di progettazione assistita da computer
Bottiglia di vetro borata	Hunan Aidete Scientific Instruments Co., Ltd.	Double-pass 100mL	Serbatoio
Kit Calcein-AM/PI	Beyotime	byt-c2015	Colorazione
Incubatore cellulare	ESCO	Esco CelMate	Coltura cellulare
CellROX Deep Red	Invitrogen	C10422	Colorazione
D-glucosio	Sigma Aldrich	47249	Glucosio
D-mannitolo	Macklin	M813423	Bilanciare la pressione osmotica
DynamicStudio	Dantec Dynamics	V8.6	Software di analisi PIV
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco	14190-094	Medium
Fibronectin	Sigma Aldrich	F-2006	Adesione cellulare
Microparticelle fluorescenti	Thermo Scientific	G0100	Micro-PIV
Vetrino di copertura in vetro	Citotest Scientific Co.,Ltd.	#1	Chip microfluidico
DMEM ad alta concentrazione di glucosio	Solarbio	12100	Medium
Fotocamera ad alta velocità	Dantec Dynamics	FlowSense EO	Micro-PIV
ImageJ	NIH	RRID:SCR_003070	Software di elaborazione delle immagini
Microscopio a fluorescenza invertito	Olympus	IX73	Vitalità cellulare
Microscopio a fluorescenza invertito	Olympus	IX83	Osservazione e acquisizione
DMEM a bassa concentrazione di glucosio	Solarbio	31600	Medium
Origin	OriginLab	RRID:SCR_014212	Software per l'analisi dei dati e la creazione di grafici
PDMS	Dow lnc.	184	Chip microfluidico
Penicillina/streptomicina (P/S)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211092	Medium
Soluzione salina fosfatato (PBS)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211031	Coltura cellulare
Pulitore al plasma	Jiarun Wanfeng Technology Co., Ltd.	PC-6D	Chip microfluidico
Sistema di controllo programmabile della pressione	Elvesys	OB1 MK4	Controllo del flusso
Tubo di silicone	Nanjing Runze Fluid Control Equipment Co., Ltd.	96410	1mm*3mm
Stampo master SU-8	Boao Biology Group Co. Ltd.	N/A	Chip microfluidico
Controller della valvola	Elvesys	MUX Wire V3	Controllo del flusso