Articolo metodologico

Una piattaforma microfluidica per studiare la precipitazione microbica di ossidi metallici in mezzi porosi

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DOI:

10.3791/71047

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12 giugno 2026

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1Department of Civil and Environmental Engineering, University of California, Davis, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, Davis, 3Energy Geosciences Division, Earth and Environmental Sciences Area, Lawrence Berkeley National Laboratory

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo presenta un sistema microfluidico per studiare la precipitazione microbica dei minerali di ossido di manganese. La formazione dei biominerali viene misurata in situ con microscopia ottica e analisi delle immagini. Questo approccio può essere adattato per indagare la precipitazione di altri minerali biogenici di colori distintivi in ambienti porosi.

Abstract

I microrganismi precipitano comunemente nanoparticelle di ossido metallico nei suoli, nei sedimenti e in altri mezzi porosi rilevanti per l'ambiente. Tuttavia, la formazione e la reattività degli ossidi di manganese (Mn) e ferro (Fe) rimangono scarsamente caratterizzate in ambienti fisicamente complessi. Sebbene i sistemi di laboratorio possano incorporare mezzi porosi come substrato, richiedono campionamenti distruttivi e non sono facilmente adatti ad analisi su scala di poro. La natura dinamica ma inaccessibile dei mezzi porosi richiede quindi la capacità di risolvere precipitazioni minerarie mediate da microbi in situ e in tempo reale. Per colmare questa lacuna, viene sviluppata una piattaforma microfluidica per valutare la precipitazione microbica di ossidi metallici in uno spazio poro modello. Questa piattaforma è convalidata con il batterio ossidante di Mn Pseudomonas putida GB-1. Lo sviluppo del biofilm e la precipitazione associata di ossido di Mn sono visualizzati sotto flusso continuo con microscopia a campo chiaro a colori a time-lapse. Un algoritmo di sottrazione dell'immagine viene quindi combinato con le misurazioni di massa finale per stimare il tasso di precipitazione dell'ossido di Mn. Questo approccio fornisce uno strumento per testare sistematicamente come la precipitazione microbica degli ossidi metallici varia in risposta alle condizioni fisiche e chimiche mutevoli.

Introduzione

I minerali metallici ossidi svolgono un ruolo fondamentale nel ciclobiogeochimico 1. Gli ossido di manganese (Mn) e ferro (Fe) sono caricati negativamente a pH circonneutrale e assorbono facilmente i metalli cationici 2,3,4,5,6,7,8, regolando la disponibilità di micronutrienti e la mobilità contaminante nella rizosfera e nella zona iporeica. Questi minerali influenzano la stabilità e la degradazione della materiaorganica 9,10,11,12, determinando l'assorbimento del carbonio da parte di piante e microbi del suolo. In sistemi ingegnerizzati (ad esempio, filtri per il trattamento dell'acqua, zone umide costruite), la precipitazione di ossido metallici viene direttamente sfruttata per la rimozione di Mn o Fe e la bonifica di contaminantico-presenti 13,14,15,16,17. Questi ossidi metallici sono riconoscibili per i loro colori caratteristici, che vanno dall'ocra al marrone scuro fino alnero 18,19.

La precipitazione di ossidi metallici è comunemente facilitata dai microrganismi in un processo noto comebiomineralizzazione 20,21,22. Numerosi batteri e funghi ossidanti Mn sintetizzano multi-rame ossidasi e perossidasi che catalizzano il trasferimento elettronico da Mn(II) a Mn(III) e Mn(IV) in condizioni aerobiche, causando la precipitazione di minerali ossidi di Mn(III, IV) simili allabirnessite 2,23,24. Inoltre, diversi batteri ossidanti di Fe ossidano enzimaticamente Fe(II) a Fe(III) in ambienti circumneutrali o acidi con ossigeno limitato, producendo ossidossi di Fe(II, III), inclusi ferrihydrite emagnetite 25,26,27,28. Questi minerali biogenici precipitano adiacenti alle superfici cellulari e si accumulano su polimeri extracellulari, guaine e altre strutture cellulari, formando assemblaggi microbio-minerali 2,23,25,27,29,30.

Nonostante l'ubiquità della biomineralizzazione di Mn e Fe in ambienti complessi, mancano le informazioni su scala di poro. Gli spazi dei pori sono strutturalmente eterogenei, mostrando un flusso di fluidi preferenziale e un trasporto non uniforme dei reagenti che determinano la distribuzione delle reazionibiogeochimiche 31,32,33,34,35. Inoltre, l'attività microbica può generare gradienti geochimici locali che favoriscono o limitano la biomineralizzazione, mentre le fluttuazioni nella chimica dei fluidi dei pori (ad esempio, pH, ossigeno disciolto, potenziale redox) possono aumentare la precipitazione minerale o facilitare la dissoluzione34,35. Gli studi sulla biomineralizzazione di Mn e Fe si basano tipicamente su condizioni ben miste di batch 30,36,37,38,39,40 oppure sulle colonne 41,42,43,44 per quantificare la cinetica di ossidazione o caratterizzare i precipitati biominerali. Tuttavia, gli esperimenti batch mancano dell'eterogeneità spaziale inseca ai sistemi porosi. Le colonne contenenti mezzi granulari compatti forniscono un'architettura fisica rilevante ma sono limitate nella loro utilità perché richiedono campionamenti distruttivi in momenti temporali statici, il che blocca la progressione dell'esperimento e impedisce osservazioni in scala di pori non perturbate. Pertanto, sono necessari nuovi approcci sperimentali per indagare la precipitazione microbica di ossidi metallici in mezzi porosi.

I sistemi microfluidici sono uno strumento per studiare le reazioni biogeochimiche in situ e in tempo reale. I reattori microfluidici possono essere fabbricati rapidamente e a basso costo con geometrie riproducibili e personalizzabili che simulano mezzi porosi naturali oidealizzati 45. I dispositivi risultanti sono otticamente trasparenti, facilitando la visualizzazione non distruttiva e la quantificazione dei processi su scala di pori, inclusa la formazione di biofilm 46,47,48,49, lo sviluppo di hotspot 50,51, la precipitazione abioticadi metalli 52,53 e la biomineralizzazione dellacalcite 34,54,55,56 . Inoltre, i sistemi microfluidici permettono agli utenti di controllare e variare sistematicamente le condizioni al contorno, inclusa la concentrazione dei metalli, la presenza o assenza di ossigeno disciolto e la portata del fluido. Infine, a seconda del materiale del substrato del reattore, si possono ottenere misurazioni dirette delle interazioni microbio-minerale-fluido utilizzando la spettroscopia a raggi X, Raman oinfrarosso 57. Lo sviluppo di una tale piattaforma basata sulla microfluidica per studiare la precipitazione microbica degli ossidi metallici offre quindi una nuova via per ricerche innovative sulla formazione e la reattività delle fasi minerali Mn o Fe che guidano il ciclo di carbonio, nutrienti e contaminanti in ambienti porosi.

Questo lavoro utilizza la biomineralizzazione del Mn come caso di studio per quantificare la precipitazione microbica di ossidi metallici in un ambiente poroso dinamico. Il seguente protocollo dimostra come fabbricare e inoculare un reattore microfluidico con Pseudomonas putida GB-1, un batterio modello noto per ossidare Mn(II) in Mn(III, IV) nella sua fase stazionaria di crescita58,59. Utilizzando un sistema di controllo del flusso basato sulla pressione, il mezzo di crescita ricco di nutrienti e la soluzione di sale minima vengono iniettati in sequenza per promuovere la formazione di biofilm e indurre rispettivamente la precipitazione di ossido di Mn. Immagini a colori ad alta risoluzione in campo chiaro dello spazio poroso microfluidico vengono raccolte a intervalli temporali regolari, catturando il contrasto cromatico tra i biofilm GB-1 di P. putida e l'accumulo di ossidi di Mn. Al termine di ogni esperimento, tutti gli ossidi di Mn contenuti nel reattore vengono digeriti e la massa totale viene misurata con spettrometria di massa a plasma induttivamente accoppiato (ICP-MS). La velocità di precipitazione dell'ossido di Mn viene stimata in funzione del tempo integrando queste misurazioni di massa finale con un algoritmo di sottrazione dell'immagine. Questo flusso di lavoro può essere facilmente adattato per indagare altri organismi o processi di precipitazione di ossido metallici in diverse condizioni ambientali.

Protocollo

NOTA: Questo protocollo prende diverse ipotesi riguardo alle conoscenze di base degli utenti e agli strumenti disponibili. Innanzitutto, gli utenti dovrebbero avere accesso a una camera bianca e conoscere le procedure di fotolitografia per fabbricare uno stampo microfluidico oppure acquistare uno stampo commerciale. Inoltre, gli utenti dovrebbero conoscere i metodi microbiologici di base, come l'uso della tecnica asettica, la preparazione delle soluzioni stock e lo streaking delle placche. Gli utenti hanno inoltre bisogno di accesso a un autoclave, una microcentrifuga, un incubatore shaker e uno spettrometro di massa. Infine, gli utenti dovrebbero essere competenti nella microscopia ottica e nell'analisi delle immagini.

1. Fabbricazione e assemblaggio di reattori microfluidici

NOTA: I reattori microfluidici utilizzati in questo protocollo sono progettati in AutoCAD con una geometria a grano di sabbia adattata da Wang et al.55. Ogni stampo produce sei canali replicanti con uno spazio poroso di 15 mm × 10 mm, porosità di 0,41 e volume di pori di 2,3 μL. Ad eccezione del trattamento al plasma, i reattori sono fabbricati in un gabinetto di flusso laminare per mantenere un ambiente a basso contenuto di polvere.

  1. Fusionare i canali microfluidici in polidimetilsilossano (PDMS) utilizzando litografia morbida.
    1. In un bicchiere di plastica, pesa la base elastomerica e l'agente polimerico in un rapporto 10:1 (qui, rispettivamente 25 g e 2,5 g).
    2. Usando un coltello di plastica, mescola bene la base elastomerica e l'agente indurificante per 10 minuti.
    3. Degasa il PDMS nella coppa usando un essiccatore a vuoto per 1 ora per rimuovere le bolle d'aria.
    4. Versa il PDMS nello stampo e degas per 30 minuti per rimuovere eventuali residui d'aria.
    5. Metti lo stampo su una piastra calda e indurisci per 3 ore a 95 °C.
    6. Una volta maturato e raffreddato, usa un bisturi per ritagliare il PDMS e staccarlo dallo stampo.
    7. Su un tappetino da taglio, si separano i sei canali microfluidici con una lametta, lasciando 2–3 mm intorno al bordo di ciascun canale. Punzone i fori di entrata e uscita in ogni canale con un perforatore per biopsia.
    8. Copri entrambi i lati di ogni canale microfluidico con una striscia di nastro trasparente per evitare l'accumulo di polvere e conserva in una piastra di Petri da 100 mm.
  2. Un giorno prima dell'esperimento, assemblare il reattore microfluidico finale con plasma d'aria.
    1. Rimuovi il nastro trasparente da un canale microfluidico, poi risciacqua il PDMS e un coprivetro con etanolo al 70% e asciuga con azoto compresso.
      ATTENZIONE: L'etanolo è infiammabile. Maneggiare e conservare secondo la scheda dati di sicurezza.
    2. Posiziona il canale microfluidico e il coprire il slip coperto a faccia in su in un detergente al plasma. Evacua la camera per 1 minuto, poi applica plasma per 1 minuto (18 W e ~0,5 torr).
    3. Rimuovere il canale microfluidico e il copricapo dal detergente al plasma e posizionare il copertino sul PDMS, battendo delicatamente per garantire il legame. Conserva il reattore assemblato in una piastra di Petri da 100 mm durante la notte.

2. Sistema di controllo del flusso microfluidico

NOTA: Un sistema modulare di Elveflow viene utilizzato per facilitare l'iniezione sequenziale di fluidi con le minime interruzioni di pressione e portata. I componenti del sistema includono un compressore d'aria, un regolatore di flusso, una valvola di distribuzione, un sensore di flusso, un rack per serbatoi fluidi (per tubi conici da 15 mL) e il software Elveflow Smart Interface (ESI) (Figura 1). Altri sistemi di controllo del flusso, come le pompe a siringhe, possono essere utilizzati sia in modalità infusione che di prelievo, con siringhe o serbatoi dedicati per ogni soluzione influente e una valvola divisoria a basso volume morto per facilitare l'iniezione sequenziale del fluido attraverso una singola linea di tubo. Tuttavia, bisogna prestare attenzione alle pompe per siringhe per minimizzare le fluttuazioni di pressione che potrebbero spostare i biofilm.

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Figura 1: Sistema di controllo del flusso e geometria del reattore microfluidico. Il sistema sperimentale consiste in un regolatore di flusso (1) collegato tramite tubi pneumatici, (2) a una cremagliera per il serbatoio del fluido, (3) una valvola di distribuzione per fornire iniezione sequenziale di mezzo di crescita (GMMn) e soluzione salina (SSMn), (4) un sensore di flusso (5) collegato al regolatore di flusso per fornire feedback in tempo reale e regolazione del flusso, (6) tubazione PEEK con un piccolo diametro interno per fornire resistenza fluidica (7) una trappola di bolle (8) a monte del reattore microfluidico (9). Schema di sistema non scalabile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Configura e calibra tutto l'hardware secondo le istruzioni del produttore.
    NOTA: La cremalliera del serbatoio del fluido, la valvola di distribuzione e il sensore di flusso sono installati all'interno di un incubatore di microscopio costruito su misura per mantenere l'esperimento a 30 °C.
  2. Imposta il regolatore di pressione del compressore d'aria a 3 bar e collega l'uscita del compressore d'aria all'ingresso del regolatore di flusso con tubi in poliuretano pneumatico.
  3. Collegare un filtro idrofobo all'uscita del regolatore di flusso per prevenire il riflusso del fluido, poi collegare il regolatore a due porte di ingresso della cremagliera del serbatoio del fluido con tubi pneumatici in polieter poliuretano utilizzando un collettore e adattatori con spine.
  4. Collegare la cremagliera del serbatoio del fluido, la valvola di distribuzione e il sensore di flusso con il tubo come segue, utilizzando raccordi senza flange per tubi esterni di diametro da 1/16 di pollice salvo diversa indicazione.
    1. Collegare due bocche di uscita della cremagliera del serbatoio del fluido alle prime due prese di ingresso della valvola di distribuzione con un tubo interno in politetrafluoroetilene (PTFE) di diametro interno di 1/32 di pollice (ID).
    2. Collega la bocca di uscita della valvola di distribuzione alla porta di ingresso del sensore di flusso con 15 cm di tubo PTFE da 500 μm diametro diametrale e un adattatore adattante.
    3. Collega 60 cm di tubo di polietere etere chetone (PEEK) a 63,5 μm di diametro diametrale alla porta di uscita del sensore di flusso utilizzando un adattatore di attacco.
      NOTA: Per esperimenti che richiedono portate differenti, regolare la lunghezza del tubo PEEK secondo necessità per fornire una resistenza fluidica sufficiente per garantire la stabilità del flusso.
    4. Collega il tubo PEEK a 10 cm di tubo PTFE da 500 μm diametro interno utilizzando un raccordo a unione.
    5. Collegare il tubo PTFE alla porta di ingresso di una sifoglia microfluidica dotato di un filtro a membrana PTFE (dimensione dei pori ~10 μm).
    6. Collega 75 cm di tubo PTFE da 200 μm diametro diametrale alla porta di uscita della trappola per bolle per creare contropressione e una rimozione efficace delle bolle. Questo tubo si attaccherà al foro di ingresso del microfluidico del reattore.
  5. Prima di ogni esperimento, sterilizza il sistema di controllo del flusso con tutti i tubi e l'hardware collegati risciaccando una soluzione di candeggina all'1% per tre volte il volume del sistema (~4 h per linea di tubo a 7,0 μL·min-1), seguita da acqua ultrapura sterile per la stessa durata.
  6. Tra un esperimento e l'altro, pulisci il sistema di controllo del flusso come segue.
    1. Risciacqua la valvola di distribuzione e il sensore di flusso risciacquando al 100% isopropanolo e acqua ultrapura sterile per evitare l'accumulo di residui o precipitati.
      ATTENZIONE: L'isopropanolo è infiammabile. Maneggiare e conservare secondo la scheda dati di sicurezza.
    2. Autoclave della trappola a bolle.
    3. Sostituire il filtro a membrana a trappola di bolle e il tubo PTFE da 200 μm di diametro interno dopo ogni esperimento per prevenire l'ostruzione (filtro a membrana) o la colonizzazione batterica (tubazione).

3. Media sperimentali e soluzioni

  1. Prepara il mezzo liquido Luria Broth (LB, formulazione Miller's) autoclavando polvere al 2,5% LB in acqua ultrapura a 121 °C per 20 minuti. Per le piastre di agar LB, autoclave 2,5% LB in polvere e 1,5% di agar in acqua ultrapura a 121 °C per 20 minuti, poi versare in piastre di Petri da 100 mm (~20 mL per piattaforma) e lasciare raffreddare fino a solidità.
  2. Da soluzioni sterilizzate con filtro preparate con l'American Chemical Society (ACS) o da reagenti di grado batteriologico in acqua ultrapura, si producono 30 mL di ciascuno dei seguenti prodotti. La composizione della soluzione salina e del mezzo di crescita sono adattate da Gehin et al.59.
    1. Preparare la soluzione salina senza Mn(II) (SS0): 0,4 mM CaCl 2,2H 2O, 0,25 mM MgSO4,7H 2O, 0,25 mM Na2HPO4,2H 2O, 0,15 mM KH2PO4, 1:2 Fe(III)-EDTA (20 μM FeCl3,6H 2O e 40 μM EDTA regolati a pH 6,5 con 1M NaOH), 10 mM di tampone HEPES (regolato a pH 7,0 con 1M NaOH), 5 mM (NH4)2SO4, e metalli in tracce (40 nM CuSO4,5H 2O, 273 nM ZnSO4,7H 2O, 84 nM CoCl2,6H 2O, 53,7 nM Na2MoO4,2H 2O) in acqua sterile ultrapura.
    2. Preparare la soluzione salata con Mn(II) (SSMn): Uguale a SS0 con 50 μM MnCl 2,4H2O aggiunto.
    3. Preparare il mezzo di crescita senza Mn(II) (GM0): Uguale a SS0 con 1,5 g· estratto di lievito L-1 e 1,5 g· L-1 acido casamino aggiunto.
    4. Prepara il mezzo di crescita con Mn(II) (GMMn): Uguale al GM0 con 50 μM MnCl 2.4H2O aggiunto.
      ATTENZIONE: Le soluzioni saline e i mezzi di crescita contengono metalli con rischi sia per la salute che per l'ambiente. Maneggiare e conservare secondo le schede dati di sicurezza.
  3. Prepara una soluzione acida contenente 40 mM di acido ossalico diidrato e acido nitrico al 2% in acqua ultrapura per la digestione degli ossidi di Mn all'interno del reattore microfluidico.
    ATTENZIONE: L'acido ossalico diidrato e l'acido nitrico sono corrosivi, mentre l'acido nitrico è un forte ossidante. Maneggiare e conservare secondo le schede dati di sicurezza.
  4. Prepara una soluzione di acido nitrico all'1% in acqua ultrapura per la diluizione del campione ICP-MS.

4. Coltivazione batterica

NOTA: La coltivazione batterica viene eseguita con tecnica asetttica sul piano di lavoro utilizzando un bruciatore Bunsen. I materiali sono sterili salvo diversa indicazione. Le durate di incubazione sono specifiche per P. putida GB-1 e potrebbero dover essere regolate per altri microrganismi.

  1. Da una calciatura a -80 °C, stria P. putida GB-1 su una piastra di agar LB. Incubare la piastra per circa 20 ore a 30 °C per permettere la crescita delle colonie batteriche.
  2. La sera prima dell'esperimento, aggiungi 10 mL di LB a un tubo conico da 50 mL e inocula con una sola colonia di placche. Incubare la precoltura LB in un incubatore shaker a 30 °C e 180 giri/min per 16 ore per raggiungere la fase stazionaria.
  3. Dopo 16 ore di incubazione, si somministra 1 mL di precoltura LB in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e centrifuga per 1 minuto a 8.000 x g per pelletare i batteri.
  4. Lavare l'aliquota tre volte per rimuovere il materiale LB esaurito scartando il surnadante, risospendendo il pellet cellulare in 1 mL di SS0 e centrifugando per 1 minuto a 8.000 x g. Risospendere il pellet finale in 1 mL di SS0.
  5. Misurare la densità ottica (OD600) della sospensione cellulare lavata in una cuvetta non sterile con un densimetro cellulare. L'ODprevisto 600 per P. putida GB-1 è 3,6–3,8 in questa fase, quindi è richiesta almeno una diluizione 5 volte in SS0 .
  6. Inoculare 20 mL di GM0 con sospensione a celle lavate a un ODiniziale di 600 di 0,01 in una fiaschetta Erlenmeyer da 50 mL. Incubare a 30 °C e 180 giri/min per 6 ore per raggiungere una fase medio-esponenziale.

5. Esperimento di biomineralizzazione

  1. La mattina dell'esperimento, accendi il sistema di controllo del flusso.
    1. Preriscalda l'incubatore al microscopio a 30 °C.
    2. Versare 10 mL di GMMn e SSMn in due tubi conici da 15 mL e collegare i tubi al rack del serbatoio del fluido. Lavare SSMn per circa tre volte il volume di sistema (~4 h a 7,0 μL·min-1), seguito da GMMn per la stessa durata.
  2. Saturare il reattore microfluidico preparato 5 ore dopo aver inoculato la coltura a media esponenzialità.
    NOTA: La saturazione e l'inoculazione del reattore vengono eseguite con tecnica asettica sul banco di lavoro utilizzando un bruciatore Bunsen. I materiali sono sterili salvo diversa indicazione.
    1. Degassare il reattore in un essiccatore a vuoto per 20 minuti.
    2. Durante il degassaggio, si prelevano 1–2 mL di SS0 in una siringa di plastica da 3 mL, poi si attacca un ago a punta smussata e 20 cm di tubo Tygon da 0,02 pollici diametrali. Premi lo sturalavandini della siringa finché il tubo non è completamente saturo.
    3. Rimuovere il reattore dal disidratatore, poi fissare il tubo al foro di uscita del reattore con pinzette inclinate e saturare manualmente il reattore con la siringa finché non si forma una goccia nel foro di ingresso del reattore.
    4. Collegare 20 cm di tubo Tygon da 0,02 pollici di diametro interno al foro di ingresso del reattore. Continuare a erogare SSMn nel reattore fino a quando tutte le bolle d'aria non saranno rimosse (200–300 μL).
  3. Prepara l'inoculo del reattore e inocula il reattore microfluidico.
    1. Rimuovere la coltura a media esponenziale dall'incubatore shaker 6 ore dopo l'inoculazione e misurare il OD600. L'OD600 atteso è 1,6–1,8 in questa fase, quindi si raccomanda una diluizione 4 volte in SS0 .
    2. Diluire la coltura medioesponenziale in 2 mL di SSMn fino a un ODiniziale di 600 di 0,005 in un tubo microcentrifuga da 2 mL. Inverti il tubo più volte per mescolare.
    3. Posizionare il tubo di ingresso del reattore nel tubo della microcentrifuga, assicurandosi che una goccia di fluido entri in contatto con l'inoculo per impedire l'introduzione d'aria nel tubo. Chiudi parzialmente il tubo della microcentrifuga e fissa il coperchio con del nastro adesivo per evitare contaminazioni.
    4. Prelevare 4–5 mL di SSMn in una siringa vetrosa da 5 mL per bagnare la canna, poi dispensare finché non restano 0,5 mL nella siringa. Carica la siringa in una pompa per siringa.
    5. Rimuovi l'ago dalla siringa di plastica e attaccalo alla siringa di vetro, facendo attenzione a non intrappolare aria nel mozzo dell'ago.
    6. Inoculare il reattore con la pompa di siringa ritirando l'inoculo nel reattore per 20 minuti a una portata di 8,33 μL·min-1 (~70 volumi di poro).
    7. Dopo l'inoculazione, spegni la pompa della siringa e lascia che i batteri si depositino e si attacchino per 1 ora senza flusso.
    8. Dopo 1 ora, rimuovi la siringa dalla pompa ma lasciala collegata al tubo di uscita.
  4. Collega il reattore microfluidico inoculato al sistema di controllo del flusso.
    1. Sposta il reattore e la siringa dal banco al microscopio.
    2. Sul palco del microscopio, rimuovere il tubo di ingresso dal reattore.
    3. Spingi delicatamente lo sturalavandini della siringa per creare una goccia nel foro di ingresso del reattore.
    4. Flettire manualmente il tubo in PTFE dal sistema di controllo del flusso ad angolo retto (~1 cm dalla fine del tubo) in modo che si interfaccia perpendicolarmente alla superficie del PDMS, minimizzando le forze laterali e l'intrusione d'aria nel foro di ingresso del reattore.
    5. Immergi l'estremità del tubo in PTFE in una soluzione di diacrilato di polietilenico glicole (PEG-DA) all'1% per bagnare l'esterno idrofobo del tubo. Assicurarsi una goccia di GMMn all'estremità del tubo in PTFE e fissare il tubo al foro di ingresso del reattore.
    6. Scollega la siringa e inserisci il tubo di uscita in un tubo microcentrifuga non sterile da 5 mL per raccogliere l'effluente del reattore.
    7. Imposta la portata a 1,33 μL·min-1 nel software del sistema di controllo del flusso. Ha impostato un programma per fornireMn GM per 15 ore (~500 volumi di pori) per promuovere la formazione di biofilm, seguito daMn SS per 28,5 ore (~1.000 volumi di poro) per indurre la biomineralizzazione di Mn.
  5. Monta il reattore microfluidico nell'inserimento dello stadio del microscopio.
    NOTA: Un sistema di irradiazione ultravioletta-C (UVC) costruito su misura, collegato all'inserto dello stadio del microscopio, viene utilizzato per mitigare la crescita batterica indesiderata e la precipitazione minerale al di fuori dello spazio dei pori microfluidici (Figura 2). Questo design è adattato da Ramos et al.60 e può essere controllato con un programma automatizzato. Vedi Fadely et al.61 per i dettagli.
    1. Posizionare un telaio campione sotto il reattore per garantire stabilità, poi montare rigidamente il telaio e il reattore nell'inserimento dello stadio, assicurandosi che siano completamente immobilizzati.
    2. Fissare il tubo in PTFE all'inserto del palco con un pezzo di nastro per evitare che il tubo si stacci dal foro di ingresso del reattore.
    3. Allinea i bracci UVC a una distanza di 3 mm dal bordo dello spazio poroso sul lato dell'ingresso e di 2 mm dal lato uscita per minimizzare la diffusione della luce ultravioletta e i danni al biofilm all'interno dello spazio poroso.
      NOTA: Un corretto allineamento UVC comporterà un accumulo di biomassa minimo o nullo nella regione di ingresso del reattore (Figura 3A). L'allineamento dei bracci UVC troppo lontano dal bordo di ingresso dello spazio poroso (Figura 3B) o l'assenza di irradiazione (Figura 3C) provoca precipitazione minerale a monte dello spazio poroso.
    4. Imposta un programma per l'irradiazione dei reattori. Trattare le regioni di ingresso e uscita del reattore per 5 minuti a t = 0 h per inattivare i batteri depositati durante l'inoculazione, poi trattare la regione di uscita solo per 5 minuti a t = 17,5 h per inattivare eventuali biofilm rimanenti.

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Figura 2: Sistema di irradiazione ultravioletto-C (UVC) costruito su misura per reattori microfluidici. (A). Vista dall'alto del sistema montato sull'inserto del palco del microscopio che mostra braccia posabili (blu) con array di diodi UVC a emissione luminosa (LED) (rettangoli gialli) e un reattore microfluidico montato su un telaio campione (piccolo rettangolo grigio). (B). Vista inferiore del sistema che mostra LED UVC (quadrati color beige) incorporati nelle braccia posabili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Effetto dell'irradiazione UVC sulla regione di ingresso del reattore microfluidico. (A). Regione di ingresso del reattore con trattamento UVC di 5 minuti a t = 0 h che mostra il corretto allineamento per la completa rimozione dei biofilm indesiderati. (B). Regione di ingresso del reattore con un array UVC allineato in modo errato, che lasciava biofilm residui nel foro di ingresso e all'esterno dello spazio poroso, permettendo agli ossidi di Mn di precipitare a monte. (C). Area di ingresso del reattore senza trattamento UVC, portando a una crescita estesa di biofilm e precipitazioni minerali. Ombreggiature grigie delimitano lo spazio dei pori. La barra in scala è di 2 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Microscopia ottica a time-lapse

NOTA: Per l'imaging a colori in campo chiaro è utilizzato un microscopio a epifluorescenza invertita Nikon Ti2 Eclipse dotato di fotocamera digitale (2304 x 2304 pixel per campo visivo), motore a luce bianca, obiettivo 4x (1,62 μm·pixel-1) e software NIS Elements. Altri microscopi ottici capaci di imaging a colori sono anch'essi adatti. L'uso dell'imaging a colori migliora la sensibilità a bassa massa di ossido di Mn. Se l'automazione time-lapse non è un'opzione, gli utenti possono raccogliere manualmente le immagini e post-elaborarle come serie temporali.

  1. Per immagini di alta qualità, esegui i seguenti passaggi di allineamento e correzione:
    1. Per garantire un'illuminazione uniforme, regolare manualmente l'allineamento di Köhler seguendo le istruzioni del produttore.
    2. Ottimizza l'illuminazione del campo luminoso per evitare sottosaturazione o sovrasaturazione dell'immagine (Fusion Pad > Colore > Auto Luminosità e Fusion Pad > Colore > Auto Bianco).
      NOTA: È meglio ottimizzare l'illuminazione del campo chiaro solo una volta su un reattore che contiene già biofilm e ossidi di Mn, quindi applicare lo stesso tempo di esposizione e bilanciamento colore a tutti gli esperimenti successivi per un'illuminazione coerente. Qui si utilizza un'illuminazione di 5 ms con rosso al 97,58%, verde al 44,76% e blu al 100%.
    3. Per evitare artefatti di quilting durante l'acquisizione di immagini cucite dello spazio poroso microfluidico, applica una correzione di ombreggiatura (Acquisire > Pannello di Correzione di Ombreggiatura).
  2. Imposta la coordinata centrale dell'immagine cucita (acquisizione ND > XY).
  3. Imposta l'area di scansione dell'immagine cucita (qui, 5 x 4 campi visivi) e applica una sovrapposizione dell'1% (acquisizione ND > immagine grande).
  4. Imposta l'acquisizione di immagini a colori in campo chiaro con l'obiettivo 4x (acquisizione ND > λ).
  5. Impostare la frequenza di imaging con intervalli di 1 ora per 15 ore (fase di crescita) e 0,5 h per 28,5 h (fase di mineralizzazione) (acquisizione ND > tempo), quindi eseguire il programma time-lapse.
    NOTA: La durata delle fasi di crescita e mineralizzazione è specifica per P. putida GB-1 e può essere regolata secondo necessità per altri microrganismi.
  6. Quando l'esperimento è completato, esporta le immagini come Tagged Image File Format (TIFF) (Macro Panel > Esporta le immagini in TIFF).

7. Digestione acida e misurazione della massa di Mn

NOTA: Un ICP-MS viene utilizzato per misurare la massa di Mn trattenuta nel reattore microfluidico, ma anche altri strumenti, come gli spettrometri di emissione ottica (ICP-OES), sono accettabili. Se non sono disponibili strumenti analitici, i campioni digeriti dall'acido possono essere inviati a un laboratorio commerciale.

  1. Al termine dell'esperimento, rimuovere il reattore dall'inserimento dello stadio del microscopio e scollegare i tubi di ingresso e uscita.
  2. Preleva 1,5 mL di soluzione acida in una siringa di vetro ermetica da 5 mL (separata dalla siringa da inoculazione). Attacca un ago a punta smussa e 20 cm di tubo PTFE diametro interno da 1/32 di pollice alla siringa e dispensa manualmente l'acido finché non si forma una goccia all'estremità del tubo.
  3. Sul piano di lavoro, carichi la siringa in una pompa per siringa e collegate il tubo al foro di ingresso del reattore, facendo attenzione a non intrappolare bolle d'aria, che potrebbero impedire alla soluzione acida di penetrare in tutti i pori. Collega 30 cm di tubo PTFE diametro diametrale da 1/32 di pollice al foro di uscita del reattore e inserisci l'estremità del tubo di uscita in un tubo da microcentrifuga da 2 mL.
  4. Iniettare una soluzione acida nel reattore per 10 minuti a una portata di 100 μL·min-1.
  5. Dopo l'iniezione di soluzione acida, scollega l'ago a punta smussa dalla siringa di vetro. Riempi una siringa di plastica da 10 mL con aria e collega al ferro a punta smussata, poi dispensa manualmente tutta l'aria della siringa per drenare l'acido residuo dal reattore e dal tubo nel tubo da 2 mL della microcentrifuga.
    NOTA: Sebbene un piccolo volume di soluzione acida possa rimanere intrappolato nello spazio poroso dopo l'iniezione d'aria, è trascurabile rispetto al volume totale iniettato. Gli utenti che lavorano con geometrie a bassa porosità possono considerare di lavare ulteriori volumi d'aria per rimuovere film di fluido e residui di acido da pori mal collegati.
  6. Diluire il campione digerito nell'acido nitrico all'1% secondo il range di calibrazione ICP-MS. Qui, prepara una diluizione 100x (volume totale di 5 mL) in un tubo conico da 15 mL.
  7. Misurare la concentrazione di Mn nel campione diluito con ICP-MS. Correggere la concentrazione misurata con il fattore di diluizione e il volume totale del campione per determinare la massa di Mn trattenuta nel reattore.

8. Analisi delle immagini

NOTA: MATLAB è raccomandato per le sue funzioni integrate per l'analisi delle immagini, incluse nel testo. Tuttavia, altri strumenti come ImageJ o le librerie di analisi immagini di Python possono essere utilizzati per eseguire analisi comparabili. I passaggi chiave dell'analisi delle immagini sono mostrati nella Figura 4. Tutti gli script di analisi delle immagini sono forniti come File Supplementari (File Supplementare 1, File Supplementare 2 e File Supplementare 3).

figure-protocol-4
Figura 4: Flusso di lavoro per sottrazione dell'immagine per isolare i precipitati di ossido di Mn. Dalle immagini a colori in campo chiaro in time-lapse, è stata identificata un'immagine di riferimento (tref) (1) per rimuovere l'intensità dei biofilm della fase stazionaria sottostante da tutte le immagini successive a punti temporali (tn) (2) maschere binarie di tutti i tn sono state generate (3) e moltiplicate sia per tref (4) che per il corrispondente tn (5) per catturare l'estensione biofilm-biominerale. Infine, i tn mascherati furono sottratti dal tréf mascherato (6). Le matrici risultanti corrette in intensità quantificano la diminuzione dell'intensità (u.a.) dovuta all'accumulo di ossido di Mn su ogni pixel. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Carica un TIFF ad alta risoluzione della geometria dello spazio poroso microfluidico (esportato da AutoCAD) nello spazio di lavoro da usare come maschera di grano (imread).
  2. Raddrizzare e registrare le immagini a colori a campo chiaro per applicare efficacemente la maschera di grana.
    1. Genera un binario di registrazione della prima immagine del punto temporale (t = 0 h).
      1. Carica il TIFF a campo luminoso colore nello spazio di lavoro (imread).
      2. Ritaglia l'immagine leggermente più grande della dimensione dello spazio poroso (ritaglia).
      3. Affina l'immagine per migliorare la risoluzione dei confini di grana (imnitidezza).
      4. Binarizzare l'immagine usando una soglia adattiva che dia priorità alle caratteristiche scure (rgb2gray, adaptthresh con polarità in primo piano = "scuro" e sensibilità regolata secondo necessità, imbinarizzazione, imcomplement).
      5. Riempire i granelli del binario di registrazione risultante per creare caratteristiche solide (imfill con "fori" specificati). Si noti che non tutti i cereali possono essere riempiti.
      6. Erodere il binario di registrazione secondo necessità per rimuovere il rumore di fondo, poi dilatare per sostituire i pixel persi ai bordi del grano (imerode, imdilate).
    2. Utilizzare un algoritmo di registrazione scale-invariant feature transform (SIFT) per calcolare la matrice di trasformazione necessaria ad allineare il binario di registrazione alla maschera del grano (detectSIFTFeatures, extractFeatures, matchFeatures, estgeotform2d con tipo di trasformazione = "affine").
    3. Applicare questa matrice di trasformazione al binario di registrazione e alla prima immagine del punto temporale, poi sovrapporle con la maschera del grano per valutare l'adattamento (imwarp, imshowpair).
    4. Se l'allineamento scorribile persiste dopo la registrazione SIFT, applicare la registrazione locale quando necessario (cpselect, fitgeotform2d con tipo di trasformazione = "lwm", imwarp).
    5. Ritaglia l'immagine registrata e la maschera di grana secondo necessità per rimuovere artefatti di registrazione ai bordi della matrice, poi ridimensiona alle dimensioni dello spazio poroso (15 mm x 10 mm) (ricrociamento, ridimensionamento).
    6. Scorre tutte le immagini a colori del campo chiaro per applicare la stessa registrazione (imwarp).
  3. Identifica visivamente un'immagine di riferimento (riferimento t, Pannello 1 nella Figura 4) quando i biofilm entrano per la prima volta nella fase stazionaria, determinata come mancanza di movimento o crescita continua (qui, t = 18,5 h).
  4. Binarizzare ogni immagine a punto temporale (tn, Pannello 2 nella Figura 4) (rgb2gray, adattare il thresh con polarità in primo piano = "scuro" e la sensibilità regolata secondo necessità, imbinarizzare, imcomplementare) in modo che gli assemblaggi biofilm-biominerale = 1 e grani e pori vuoti = 0. Moltiplicare ogni maschera a punto temporale per la maschera a grano invertita (imcomplemento) per rimuovere i confini residui del grano.
  5. Moltiplica tn per la corrispondente maschera a punto temporale (Pannello 3 nella Figura 4) per isolare la regione biofilm-biominerale di interesse (Pannello 5 nella Figura 4), poi moltiplica tref per ogni maschera a punto temporale per isolare la stessa regione (Pannello 4 nella Figura 4).
  6. Sottrai tutto il tn mascherato dallareferenza t mascherata per quantificare la diminuzione dell'intensità dei pixel associata all'accumulo di ossido di Mn in ogni momento (sottrare), poi convertire in matrici composite corrette per intensità (rgb2gray, Pannello 6 in Figura 4).
  7. Per valutare la distribuzione spaziale dei minerali attraverso lo spazio dei pori (u.a.), si somma lungo le colonne (somma con dimensione = 1) di ciascuna matrice corretta per intensità.
  8. Per stimare il tasso di precipitazione dell'ossido di Mn nel tempo (μg·h-1):
    1. Sommare ogni matrice corretta in intensità (somma con dimensione = "tutte") per quantificare l'intensità totale corretta in ogni momento temporale.
    2. Dividere l'intensità totale corretta in ogni momento temporale per l'intensità totale corretta nel momento finale in modo che il momento finale = 1 e tutti i valori precedenti siano frazionari. Riscalare a μg moltiplicando per la massa di Mn misurata con ICP-MS.
    3. Si prenda la derivata rispetto al tempo dividendo l'aumento di massa (μg) tra i punti temporali sequenziali (diff) per l'intervallo di tempo tra immagini (0,5 h).

Risultati

Questo protocollo fornisce una piattaforma sperimentale per l'imaging risolto spaziotemporalmente della formazione di biofilm e della biomineralizzazione del Mn. Le immagini a colori in campo chiaro hanno dimostrato che i biofilm GB-1 di P. putida erano distribuiti uniformemente nello spazio poroso microfluidico a t = 18,5 h prima dell'inizio della precipitazione di ossido di Mn (Figura 5A). Successivamente, gli ossidi di Mn si sono accumulati preferentemente sul lato di ingresso dello spazio poroso più vicino alla sorgente influente di Mn(II) (Figura 5B). La differenza tra l'immagine di riferimento e i momenti temporali dell'immagine successiva ha rivelato il contributo isolato dei precipitati di ossido di Mn all'intensità complessiva dell'immagine (Figura 5C) e ha permesso la quantificazione del gradiente osservato su scala reattore nell'accumulo di minerali (Figura 5D). A scala biofilm, questo approccio di sottrazione d'immagine ha catturato la graduale precipitazione di ossidi di Mn sulle superfici dei biofilm e l'accumulo di minerali ai margini dei biofilm in contatto con il fluido dei pori (Figura 6).

Il protocollo fornisce inoltre un flusso di lavoro per stimare la cinetica della precipitazione dell'ossido di Mn dalle sottrazioni di immagini e dalle misurazioni ICP-MS. I reattori microfluidici triplicati contenevano 4,29 ± 0,22 μg Mn nel momento sperimentale finale. La digestione acida del contenuto del reattore era stata precedentemente validata utilizzando misurazioni basate su sincrotrone della massa di ossido di Mn e risultava che aveva un errore61 inferiore al 18%. Pertanto, le matrici corrette in intensità furono riscalate a questa massa finale. Il tasso stimato risultante di precipitazione di ossido di Mn è stato non monotono, aumentando bruscamente tra t = 19,5 h e t = 21 h, prima di raggiungere il picco a 0,29 ± 0,04 μg·h-1 e decelerare gradualmente fino a t = 43,5 h (Figura 7). Va notato che questo calcolo di velocità non tiene conto di alcun nanoparticolato di ossidi di Mn inferiore alla risoluzione del microscopio ottico né di alcuna massa ossida persa a causa del trasporto durante la durata dell'esperimento, che si prevede sia minima. Questo approccio sfrutta quindi tecniche di microscopia accessibili per valutare semi-quantitativamente le tendenze temporali nella cinetica della biomineralizzazione.

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Figura 5: Distribuzione su scala reattore di biofilm e ossidi di Mn. (A). Immagine a colori in campo chiaro dei biofilm GB-1 di P. putida nello spazio poroso microfluidico all'inizio della fase stazionaria (t = 18,5 h,t ref). (B). Immagine a colori in campo chiaro dell'ossido di Mn precipita su e intorno ai biofilm GB-1 di P. putida nel momento sperimentale finale (t = 43,5 h). (C). Matrice di accumulo minerale corretta in intensità al punto temporale sperimentale finale (t = 43,5 h), con i grani mostrati in grigio e i pori in bianco. La barra della scala è di 1 mm (D). Distribuzione spaziale unidimensionale dell'intensità totale corretta dall'ingresso (a sinistra) al lato di uscita (destra) dello spazio dei pori (t = 43,5 h). La linea solida rappresenta una media mobile di 1 mm lungo lo spazio porico dall'ingresso all'uscita, media su esperimenti triplicati e l'ombreggiatura rappresenta la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Accumulo di ossido di Mn su scala biofilm. (A). Selezionare immagini a colori in campo chiaro dei biofilm rappresentativi P. putida GB-1. Gli ossido di manganese sono stati rilevati prima come un cambiamento di colore dal grigio al marrone sulle superfici del biofilm (mostrato a t = 20 h e t = 21 h) e successivamente come accumulo di precipitati marrone scuro ai bordi del biofilm (mostrato a t = 33 h e t = 43 h). (B). Matrice di accumulo minerale corretta in intensità con granuli grigio scuro, pori bianchi e biofilm sottostanti grigio chiaro. La barra della scala è di 150 μm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Stima del tasso di precipitazione dell'ossido di Mn nel tempo. La velocità (μg·h-1) è stata quantificata riscalando l'intensità totale corretta in ogni punto temporale alla massa Mn finale misurata con ICP-MS, quindi prendendo la derivata rispetto al tempo. I marcatori rappresentano la media degli esperimenti triplicati e l'ombratura rappresenta la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Step1_ImageRegistrationClicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Step2_ImageSubtraction.m.Clicca qui per scaricare questo file.

Fascicolo supplementare 3: Step3_Figures.m.Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Questa piattaforma sperimentale offre opportunità uniche per indagare la dinamica spaziotemporale dei processi biogeochimici in ambienti porosi privi di artefatti che impediscono l'acquisizione di dati ad alta fedeltà. Questo approccio è particolarmente adatto per la biomineralizzazione Mn e Fe, che produce precipitati minerali con caratteristiche tonalità di ocra, marrone e nero che possono essere facilmente segmentate tramite microscopia ottica e analisi d'immagini. Utilizzando la biomineralizzazione Mn come caso di studio, è possibile valutare modelli e tassi di precipitazione minerale in situ con alta risoluzione spaziale e temporale.

Diversi aspetti di questo protocollo hanno permesso la raccolta di misurazioni riproducibili di trasformazioni biogeochimiche. Innanzitutto, l'uso di una valvola di iniezione sequenziale con basso volume morto ha facilitato esperimenti con più fluidi senza disturbare i biofilm nello spazio dei pori microfluidici. Questa configurazione ha preservato la distribuzione spaziale iniziale del biofilm prevenendo picchi di pressione che possono portare allo sloghing o allo spostamento dei biofilm durante il cambio di fluidi iniettati, cosa che può avvenire con altri strumenti come le pompe a siringhe. Questo componente offre inoltre all'utente la flessibilità di personalizzare le condizioni geochimiche imposte ai microrganismi residenti. Infine, poiché preserva la distribuzione iniziale del biofilm, questa configurazione permette all'utente di testare sistematicamente come diverse morfologie di biofilm o quantità di biomassa influenzino la distribuzione e il tasso di precipitazione di ossido di Mn.

In secondo luogo, mitigare la formazione e l'intrusione di bolle nello spazio poroso microfluidico ha permesso esperimenti di più giorni che hanno catturato le scale temporali rilevanti per l'ambiente della biomineralizzazione del Mn. Le bolle, un problema comune e spesso inevitabile in esperimenti lunghi sopra la temperaturaambiente di 62,63, possono frammentare e bloccare i singoli pori, deviare il flusso dei fluidi e interrompere il progresso della reazione. Per evitare l'intrappolamento delle bolle nello spazio poroso, il reattore era completamente saturo prima dell'inoculazione. Per minimizzare l'introduzione di bolle attraverso il sistema di controllo del flusso, l'incubatore del microscopio è stato impostato a 30 °C ben prima dell'esperimento e più volumi di soluzione influente sono stati lavati prima di collegare il reattore inoculato. Questo passaggio rimuoveva l'aria intrappolata dai tubi e dai raccordi e minimizzava il rischio di fuoriuscimento di fluidi durante l'esperimento. Un trappola per bolle era inoltre integrato nel sistema di controllo del flusso per catturare eventuali bolle residue, con un tubo PTFE da 200 μm diametro diametrale collegato all'uscita del sifone per aumentare la resistenza e migliorare l'efficienza della rimozione delle bolle. Infine, per evitare che l'aria intrappolasse o perdesse all'interfaccia tra il tubo influente e il foro di ingresso del reattore, tutte le connessioni sono state effettuate con gocce di fluido a entrambe le estremità del tubo e sul foro perforato, il tubo idrofobo in PTFE è stato rivestito con PEG-DA all'1% e l'estremità del tubo inserito è stata mantenuta perpendicolare alla superficie del PDMS per tutto l'esperimento.

In terzo luogo, l'incorporazione di un sistema di irradiazione UVC costruito su misura nella piattaforma sperimentale manteneva una condizione geochimica al contorno definita e una biomineralizzazione Mn riproducibilmente vincolata nello spazio dei pori microfluidici. Esperimenti pilota hanno dimostrato che biofilm estranei nella regione dell'ingresso del reattore precipitavano ossidi di Mn a monte dello spazio poroso, limitando la disponibilità a valle di Mn(II). Irradiare brevemente le regioni di ingresso e uscita del reattore con un corretto allineamento dopo il periodo di assestamento senza flusso ha impedito lo sviluppo di biofilm da parte di batteri depositati inizialmente. Il flusso continuo unidirezionale del fluido ha impedito la recolonizzazione della regione di ingresso del reattore dopo questo trattamento UVC iniziale. Irradiare la regione di uscita del reattore a t = 17,5 h prima dell'inizio della fase stazionaria e della precipitazione visibile di ossido di Mn minimizzava la quantità di accumulo minerale a valle dello spazio poroso. Questo ha facilitato il confronto diretto dei dati di immagine a colori in campo chiaro con la massa di Mn digerita e misurata con ICP-MS.

La combinazione di sottrazione immagine e misurazioni di massa finale ha fornito un metodo semi-quantitativo per valutare la cinetica della precipitazione di ossido di Mn in situ. Tuttavia, è importante notare che l'intensità dei pixel cessa di essere direttamente proporzionale alla massa di ossido di Mn a densità minerale molto elevata a causa della sensibilità limitata della fotocamera ai coloriscuri 61. La valutazione di questo comportamento non lineare potrebbe essere migliorata digerendo campioni acidi in punti temporali definiti e confrontando la massa digerita con la massa originale scalata dal punto temporale sperimentale finale. Se è richiesta una quantificazione esatta della massa minerale, gli utenti possono sviluppare una curva di calibrazione utilizzando campioni minerali di intensità e massa noti, come dimostrato in precedenza in Fadely et al.61, oppure effettuare misurazioni dirette con fluorescenza a raggi X basata su sincrotrone.

La piattaforma microfluidica presentata qui può essere applicata per indagare i processi di biomineralizzazione in una vasta gamma di condizioni ambientali. Sebbene esperimenti rappresentativi siano stati ottimizzati per P. putida GB-1, questa configurazione può essere utilizzata per testare sistematicamente una gamma di chimiche di soluzioni influenti (ad esempio, concentrazione di Mn o Fe, fonte di carbonio, presenza di metalli coesistenti), portate, temperature o la presenza di un consorzio microbico. Condizioni specifiche acidiche o suboxiche, come quelle favorevoli ai batteri ossidanti del Fe, possono essere simulate diminuendo il pH influente o rivestindo il PDMS con un polimero impermeabile all'ossigeno. Informazioni sui controlli microbici della biomineralizzazione possono essere ottenute implementando ceppi di fusione genica reporter e tracciando la fluorescenza otticarisultante 59,64. I reattori microfluidici possono essere riprogettati per simulare una gamma di ambienti porosi modificando la distribuzione delle dimensioni delle particelle, la forma o la porosità, oppure funzionalizzando il PDMS per imitare la carica superficiale delle particelle di argilla o materia organica naturale. Con modifiche aggiuntive (ad esempio, sostituire il substrato del reattore di vetro con plastica), i reattori possono supportare misurazioni spettroscopiche dirette dello stato di ossidazione dei metalli, mineralogia, associazioni organo-minerali o l'assorbimento o co-precipitazione di metalli secondari. Infine, questa piattaforma sperimentale può essere ampliata per studiare la precipitazione di altri biominerali metallici (ad esempio fosfati, carbonati, solfuri), a condizione che le loro proprietà ottiche siano sufficientemente distinte da permettere la segmentazione dell'immagine. Questo protocollo offre quindi un quadro per indagare in modo completo la biomineralizzazione e le interazioni microbio-minerale-fluido in ambienti porosi rilevanti.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non esserci conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo progetto è stato finanziato dal Centro della National Science Foundation degli Stati Uniti per la Geotecnica Bio-mediata e Bio-ispirata (ERC-1449501), dalla Fondazione Nazionale Svizzera per la Scienza (200021_188546) e dalla Fondazione Nazionale per la Scienza degli Stati Uniti (MCA-2322428, EAR-1847689, DMR-2003849). Parte di questo studio è stata condotta presso il Centro per la Nano e Micro Produzione (CNM2) dell'UC Davis. Ringraziamo Steven Lucero e la UC Davis Tech Foundry per la progettazione e la fabbricazione dell'incubatore per microscopio e del sistema di irradiazione UVC. Ringraziamo inoltre il Dr. Yuze Wang e il Dr. Jason DeJong per aver fornito la geometria del mezzo poroso utilizzata per la fabbricazione di reattori microfluidici, e il Dr. Arunima Bhattacharjee, il Dr. Noah Goshi, il Dr. Gregory Girardi e il Dr. Hyehyun Kim per le discussioni utili e/o per la formazione sulla fotolitografia e la litografia morbida. Infine, ringraziamo il dottor Gaitan Gehin, la dottoressa Tonya Kuhl, il dott. Filippo Miele e il dott. Charles Graddy per le preziose discussioni sul design sperimentale e sull'analisi delle immagini.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Adapter fitting (Elveflow, 6-40 to 1/4-28)Darwin MicrofluidicsLVF-KFI-08Usato per l'interfaccia tra sensore di flusso e raccordi senza flangia.
Agar (Fisher BioReagents)Fisher ScientificBP9744Usato per versare piastre per sverniciatura di scorte congelate.
Compressore d'aria (Jun-Air)ElveflowKCP-110Usato per pressurizzare il controller di flusso.
Solfato di ammonio ((NH4)2SO4, CAS: 7783-20-2)Sigma-AldrichA4915Usato per media e soluzioni sperimentali.
Pinzette angolateTDI International7-SAUsato per collegare la tubazione al reattore microfluidico.
Software AutoCADAutodesk --Usato per progettare la geometria del reattore microfluidico.
AutoclaveSteris--Usato per sterilizzare materiali e liquidi. 
BilanciaMettler ToledoME2002TUsato per pesare la base di elastomero PDMS e l'agente di indurimento.
Adattatore barboso (1/4-28 girevole a 3/32-in barbosa)ElveflowKFI-06Usato per collegare la tubazione in polietere poliuretano al manifold e al rack del serbatoio di fluido.
Pugno bioptico (Rapid-Core, diametro 1,2 mm)Darwin MicrofluidicsPT-T983-12-25Usato per punzonare fori di ingresso/uscita nei canali microfluidici PDMS. 
Candeggina (Chlorox)ULINES-19719Usato per sterilizzare il sistema di controllo del flusso. Diluire al 1% in acqua ultrapura.
Aghi con punta smussata (Jensen Global, 21 gauge)QSourceJG21-10HPX-J004Usato per collegare la tubazione alle siringhe. Sterilizzato tramite autoclavaggio per 30 min.
Bruciatore BunsenHumboldtH-5970Usato per mantenere un ambiente di lavoro sperimentale sterile.
Cloruro di calcio diidrato (CaCl2·2H2O, Fisher Chemical, CAS: 10035-04-8)Fisher ScientificC79Usato per media e soluzioni sperimentali.
Acido Casamino (Fisher BioReagents, peptone di caseina acida)Fisher ScientificBP1424Usato per media sperimentale.
Densitometro cellulare (WPA Biowave CO8000)Avantor490005-906Usato per misurare l'OD600 delle colture batteriche. 
Nastro adesivo trasparente (Scotch Magic)ULINES-10223Usato per evitare che la polvere si attacchi ai canali microfluidici PDMS.
Cloruro di cobalto (II) esaidrato (CoCl2·6H2O, CAS: 7791-13-1)Sigma-Aldrich255599Usato per media e soluzioni sperimentali.
Azoto compressoAirgasNIUHP300Usato per asciugare i componenti del reattore microfluidico.
Tubo conico (Falcon, volume 15 mL, polipropilene)Fisher Scientific14-959-49BUsato per soluzioni influenti e campioni ICP-MS. Pre-sterilizzato.
Tubo conico (Falcon, volume 50 mL, polipropilene)Fisher Scientific14-432-22Usato per la precoltura LB. Pre-sterilizzato.
Solfato di rame (II) pentaidrato (CuSO4·5H2O, CAS: 7758-99-8)Sigma-AldrichC8027Usato per media e soluzioni sperimentali.
Tappetino da taglioULINES-18543Usato per tagliare i canali microfluidici PDMS e punzonare i fori di ingresso/uscita.
Cuvetta (Fisherbrand, volume 1,5 mL, polistirene)Fisher Scientific 14-955-127Usato per misurare l'OD600 delle colture batteriche. 
Fotocamera digitale (Hamamatsu ORCA-Fusion)Nikon77054115Usato per l'imaging time-lapse a colori in campo chiaro degli esperimenti microfluidici.
Valvola di distribuzione (MUX)ElveflowMUX-D-12Usato per iniettare sequenzialmente più fluidi.
Software Elveflow Smart Interface (ESI)Elveflow --Usato per controllare il feedback di flusso/pressione tra il controller di flusso e il sensore di flusso e per eseguire lo switching della valvola di distribuzione.
Bicchiere Erlenmeyer (Fisherbrand, volume 50 mL)Fisher ScientificFB50050Usato per la coltura in fase esponenziale media. Sterilizzato tramite autoclavaggio per 30 min.
Etanolo (Fisher Chemical, alcool reagente, purezza 90%, CAS: 64-17-5)Fisher ScientificA962P-4Usato per pulire PDMS e cover slip per la fabbricazione del reattore. Diluito al 70% in acqua ultrapura.
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, CAS: 60-00-4)Sigma-AldrichEDSUsato per media e soluzioni sperimentali.
Raccordo senza flangia (1/4-28 per tubazione OD 1/16-in)ElveflowKFI-17Usato per collegare la tubazione ai componenti hardware Elveflow. Il kit include rondelle e dadi filettati.
Controller di flusso (OB1 MK3+)ElveflowOB1-2000Usato per fornire feedback di flusso/pressione per l'iniezione controllata di fluidi.
Sensore di flusso (MFS2)ElveflowMFS-D-2Usato per mantenere un flusso stabile per gli esperimenti microfluidici utilizzando il feedback di pressione dal controller di flusso.
Rack di serbatoio di fluido ElveflowKPT-4SUsato per pressurizzare i fluidi influenti. Compatibile con tubi conici Falcon da 15 mL.
Cover slip in vetro (1,42-in x 2,36-in, spessore #1)Ted Pella260460-100Incollato a plasma al

Riferimenti

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  2. Tebo, B. M., et al. Biogenic manganese oxides: properties and mechanisms of formation. Annu Rev Earth Planet Sci. 32, 287-328 (2004).
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