Maturazione in vitro, fecondazione e coltura degli embrioni pre-impianto di ovociti di topo

Sommario

Questo protocollo descrive procedure per la maturazione in vitro degli ovociti di topo, la fecondazione in vitro e la successiva coltura embrionale fino allo stadio di blastocisti.

Abstract

La maturazione in vitro degli ovociti di topo, combinata con la fecondazione in vitro e la successiva coltura embrionale, consente la generazione di embrioni pre-impianto in condizioni definite. Queste procedure facilitano l'indagine delle funzioni biologiche e dei meccanismi molecolari alla base della maturazione, fecondazione e sviluppo embrionale precoce. Tuttavia, l'applicazione efficace di questo approccio dipende da una gestione attenta di ovociti e spermatozoi, condizioni di coltura adeguate e una valutazione accurata della progressione dello sviluppo in ogni fase. Qui descriviamo metodi per isolare complessi cumulo-ovocitario (COC) immaturi dalle ovaie del topo, la maturazione in vitro degli ovociti, la fecondazione in vitro e la coltura in vitro degli embrioni fino allo stadio di blastocisti. Queste procedure includono la preparazione e l'equilibrio di substrati e piatti di coltura, l'isolamento e la selezione dei COC dopo la dissezione ovarica, la raccolta e la capacitazione dello spermatozoo, l'esecuzione dell'inseminazione in condizioni standardizzate e successivamente la coltivazione degli embrioni per la valutazione dello sviluppo. La progressione dello sviluppo viene valutata utilizzando criteri morfologici, tra cui la formazione dei pronuclei maschili e femminili, la clivatura allo stadio bicellulare e la formazione di blastocisti. Questo protocollo può essere integrato negli studi sulla maturazione degli ovociti e sulla funzione dei fattori materni, fornendo uno strumento prezioso per la ricerca di base nella biologia riproduttiva dei mammiferi.

Introduzione

Comprendere la qualità degli ovociti e la competenza nello sviluppo è essenziale per una fecondazione di successo e per lo sviluppo embrionale^{successivo 1,2}. La maturazione degli ovociti richiede non solo una segregazione cromosomica accurata durante la maturazione nucleare, ma anche la maturazione citoplasmatica, inclusa la redistribuzione degli organelli e l'accumulo di mRNA e proteine^{materne 3}. Lo sviluppo embrionale precoce si basa su mRNA e proteine fornite dalla madre, e le riserve materne nell'ovocita sostengono lo sviluppo pre-impiantamento. Tuttavia, le identità e le funzioni di molti regolatori materni dell'embriogenesi nei mammiferi rimangono incompletamente^{comprese 4}. Pertanto, sono necessari ulteriori studi sistematici per chiarire i meccanismi alla base della maturazione, fecondazione e sviluppo embrionale degli ovociti.

Il topo è un sistema modello ampiamente utilizzato per studiare lo sviluppo embrionale pre-impianto. La maturazione in vitro (IVM) si riferisce alla raccolta di ovociti immaturi dall'ovaio e alla loro maturazione in condizioni di laboratorio^{controllate 5}. Successivamente, la fecondazione in vitro (FIV) permette agli ovociti maturi di essere co-incubati con spermatozoi capaci per generare zigoti per studi precoci sullo sviluppo embrionale. Tuttavia, rispetto alla FIV convenzionale che utilizza ovociti maturi in vivo, gli ovociti derivati dalla IVM spesso mostrano tassi di maturazione e fecondazione inferiori e una minore competenza nello sviluppo⁶. Queste limitazioni sono in gran parte attribuite all'asincronia tra la maturazione nucleare e citoplasmatica in condizioni di coltura in vitro . Inoltre, la stabilità del fuso meiotico negli ovociti di topo è sensibile alle variazioni di pH e temperatura durante la IVM, e il disturbo del fuso può contribuire all'arresto della^{maturazione 7}. Di conseguenza, la ridotta competenza degli ovociti derivati dalla IVM rimane un ostacolo importante, limitando una produzione efficiente di embrioni per studi di sviluppo e meccanicistici.

Gli embrioni di preimpianto di topo possono anche essere ottenuti raccogliendo zigoti derivati in vivo e coltivandoli in vitro (IVC). Gli zigoti derivati in vivo raccolti dagli ovidotti forniscono un punto di partenza relativamente sincronizzato per esperimenti focalizzati sugli eventi post-fecondazione⁸. Tuttavia, la maturazione degli ovociti e l'accumulo di fattori materni avvengono prima della fecondazione in vivo; Pertanto, gli zigoti derivati in vivo sono meno adatti alla manipolazione sperimentale delle condizioni di maturazione o delle riserve materne per valutarne gli effetti sullo sviluppo embrionale^{successivo 4}. Pertanto, ottimizzare i protocolli di IVM e IVF e adottare procedure operative standardizzate con rigoroso controllo qualità (ad esempio, gestione rigorosa di temperatura, pH e pratiche di manipolazione) sono essenziali per minimizzare la variabilità procedurale e proteggere la competenza nello sviluppo di ovociti ed embrioni.

Qui descriviamo un protocollo IVM–IVF–IVC che dettaglia la preparazione dei media, l'isolamento e la selezione dei COC, le procedure di IVM e IVF, e la coltura embrionale in vitro (Figura 1). Il protocollo incorpora checkpoint pratici e specifici per stadio per il controllo di qualità di routine, inclusi l'estrusione del primo corpo polare (PB1), la formazione di pronuclei maschili e femminili (2PN), la scissione a due cellule e la formazione di blastocisti. Questo protocollo consente la generazione riproducibile ed efficiente di embrioni pre-impianto in condizioni definite, supportando studi meccanicistici, ottimizzazione delle colture e applicazioni a valle nella biologia dello sviluppo e riproduttiva.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali della Northwest A&F University, Cina (numero di permesso: 20230503).

1. Manutenzione degli animali

1. Acquisire femmine selvatiche C57BL/6 e maschi DBA/2 e mantenerle in condizioni specifiche prive di patogeni (SPF), con un ciclo chiaro-buio di 12 ore a una temperatura di 20–22 °C e umidità del 55% ± 10%. Fornisci una dieta riproduttiva e acqua ad libitum. I maschi di casa sono singoli (un maschio per gabbia).

2. Preparazione dei media

1. Per preparare una soluzione operativa PMSG da 50 IU/mL, sciogliere gonadotropina sierologica (PMSG) di 5.000 UI in 100 mL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS).
   NOTA: Liquida la soluzione in porzioni monouso da 1 mL e conservale a –20 °C. Scongela ogni aliquota a temperatura ambiente immediatamente prima dell'uso.
2. Per preparare il mezzo di coltura IVM, aggiungere gli ingredienti elencati nella Tabella 1 a 100 mL di base Medium 199 (M199). Regolare il pH a 7,3–7,4, poi filtrare il mezzo sterile attraverso un filtro da 0,22 μm in bottiglie di mezzo sterile. Etichetta la bottiglia "IVM" con iniziali, data di fabbricazione e data di scadenza, e conserva a 4 °C per un massimo di 1 mese.
3. Per preparare una soluzione di ialuronidasi allo 0,1% (w/v), sciogliere 10 mg di ialuronidasi in 10 mL di mezzo M2.
   NOTA: Conservare in aliquote monouso di 1 mL a –20 °C e riscaldare a 37 °C prima dell'uso.

3. Preparazione dei piatti (Figura 2)

NOTA: Regolare il numero di gocce IVM, IVF e IVC in base al numero atteso di COC ed embrioni, utilizzando 20–30 COC per 100 μL di goccia per IVM e IVF e 20–30 embrioni per 100 μL di goccia per la coltura embrionale.

1. Prepara un numero appropriato di piastre per la raccolta degli ovociti da 35 mm, ciascuna contenente 2 mL di mezzo M2 integrato con 0,2 mM di 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX). Usa una soffietta per la puntura ovarica e la raccolta del COC (una ciotola ogni due femmine), e un'altra per lavare le COC. Preriscalda i piatti a 37 °C prima dell'uso.
2. Prepara piatti per la IVM.
   1. In un piatto da 60 mm, preparare cinque gocce da 100 μL di mezzo IVM per il lavaggio (etichettare il piatto come "lavaggio IVM").
   2. In un vaso separato da 60 mm, preparare più gocce da 100 μL di mezzo IVM per la maturazione (etichettare il piatto come "IVM").
   3. Aggiungi con cura abbastanza olio minerale per coprire le gocce e bilancia i piatti a 37 °C in un incubatore al 5% di_CO-2 per almeno 2 ore prima di iniziare la raccolta degli ovociti.
3. Prepara piatti per la fecondazione in vitro.
   1. In una ciotola da 60 mm, preparare una o due gocce da 300 μL di mezzo di coltura embrionale pre-bilanciato per il rilascio e la capacità dello spermatozoo (etichettare la ciotola come "Capacitazione dello spermatozoo").
      NOTA: La seconda goccia di capacità viene preparata come riserva per i casi in cui la motilità dello spermatozoo nella prima goccia è insufficiente, deve essere raccolto e capotato un nuovo campione di spermatozoo epididimale, oppure la concentrazione di spermatozoi deve essere regolata prima dell'inseminazione.
   2. Prepara due piastre separate da 60 mm, ciascuna contenente cinque gocce da 100 μL di mezzo di coltura prebilanciata per il lavaggio (etichetta la ciotola come "lavaggio IVF").
      NOTA: Usa una ciotola "IVF wash" per lavare i COC maturi in IVM prima dell'inseminazione, e usa l'altra ciotola "IVF wash" per lavare gli zigoti presuntivi dopo la co-incubazione per rimuovere cellule cumulus e spermatozoi residui.
   3. In una ciotola separata da 60 mm, preparare più gocce da 100 μL di mezzo di coltura embrionale preequilibrata per l'inseminazione (etichettare la ciotola come "IVF").
      NOTA: Il mezzo di coltura embrionale preequilibrato è utilizzato sia per la capacità che per l'inseminazione degli spermatozoi per mantenere condizioni costanti durante la preparazione e la feconditazione degli spermatozoi.
   4. Aggiungi con attenzione abbastanza olio minerale per coprire le gocce e bilancia i piatti a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per almeno 12 ore prima di iniziare la procedura di capacitazione dello spermatozo.
4. Prepara i piatti IVC.
   1. In una ciotola da 60 mm, preparare cinque gocce da 100 μL di mezzo di coltura embrionale pre-equilibrata per lavare gli embrioni (etichettare la ciotola come "IVC wash").
   2. In un vaso separato da 60 mm, preparare più gocce da 100 μL di mezzo di coltura embrionale preequilibrata per coltura embrionale (etichettare il piatto come "IVC").
   3. Aggiungi con cura abbastanza olio minerale per coprire le gocce e bilancia i piatti a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per almeno 12 ore prima di iniziare la coltura embrionale.

4. Collezione ovaie

1. Somministrare 10 IU di PMSG intraperitoneale a topi femmine di C57BL/6 di 8–10 settimane.
2. A 48 ore dall'iniezione PMSG, si sopporta il topo con una lussazione cervicale e posizionalo supino. Spruzza l'addome con etanolo al 70% per bagnare il pelo e impedirne di entrare nella cavità addominale.
3. Usando forbici fine da sezionamento, fai una piccola incisione nella parte bassa della pelle addominale e apri delicatamente la pelle con mani guantate per esporre la membrana peritoneale.
4. Apri la membrana peritoneale e sposta delicatamente l'intestino da parte. Individua il corno uterino e seguilo verso l'ovaio. Identifica l'ovaio vicino al rene, solitamente racchiuso da un cuscinetto adiposo.
5. Usa forbici fine per sezionare l'ovaio dal corno uterino e taglia via il tessuto connettivo e il grasso in eccesso.
6. Trasferire immediatamente le ovaie a un mezzo M2 preriscaldato integrato con IBMX. Ripeti la procedura per prelevare l'ovaio controlaterale e trasferirlo nello stesso piatto.
7. Metti il piatto sotto uno stereomicroscopio e procedi con la puntura folliccolare e la raccolta dei COC.

5. Collezione e cultura dei COC

1. Sotto uno stereomicroscopio, si punge delicatamente i follicoli antrali visibili con un ago sterile per rilasciare i COC nel mezzo M2.
   NOTA: Quando si raccolgono ovociti in stadio GV del muro, si prendono preferibilmente i follicoli antrali visibilmente grandi sulla superficie ovarica, che tipicamente appaiono gonfiati e semi-traslucidi con una cavità antrale trasparente.
2. Utilizzando una pipetta Pasteur in vetro finemente estratto, raccogli i COC rilasciati e trasferiscili in una piastra pulita da 35 mm contenente mezzo M2 preriscaldato integrato con IBMX.
3. Lavare i COC tramite trasferimento seriale in un'area pulita del piatto da 35 mm secondo necessità per rimuovere cellule di granulosa staccate e detriti tissuti, lasciando detriti ad ogni trasferimento (Figura 3).
   NOTA: Utilizzare solo COC con tre o più strati compatti di cellule cumulo e citoplasma uniformemente granulato senza spazi liberi per i passaggi^{successivi 9,10}. Gli ovociti GV snudi e gli ovociti GV parzialmente racchiusi nel cumulus sono esclusi da questo protocollo. Nelle nostre condizioni sperimentali, sono stati ottenuti in media 26 COC immaturi per ogni femmina di topo.
4. Dopo la rimozione dei detriti, trasferire i COC nella piastra IVM e lavarli tramite trasferimento sequenziale attraverso cinque gocce da 100 μL di mezzo IVM.
   NOTA: Durante i trasferimenti, minimizzare il volume di trasferimento per evitare contaminazione incrociata tra le gocce.
5. Trasferire i COC lavati in gocce da 100 μL di mezzo IVM (20–30 COC per goccia) e coltura a 37 °C in 5% di CO₂ per 14 ore.
   NOTA: Raccogliere, lavare e trasferire i COC su un mezzo IVM con ritardo minimo per aiutare a mantenere il potenziale di sviluppo.
6. (Opzionale) Dopo la IVM, incubare brevemente i COC con 1 mg/mL di ialuronidasi e pipetarli delicatamente con una micropipetta finché le cellule cumulus non sono completamente rimossi.
   NOTA: Limitare l'esposizione all'ialuronidasi a non più di 3 minuti, poiché un'esposizione prolungata potrebbe danneggiare gli ovociti.
7. (Opzionale) Lavare gli ovociti spogliati in mezzo M2 fresco su un palcoscenico riscaldato, poi valutare la maturazione degli ovociti al microscopio stereomicroscopio.
8. (Opzionale) Gli ovociti con un primo corpo polare estuso sono considerati maturi e allo stadio di metafase II (MII). Calcola il tasso di maturazione come il numero di ovociti con un primo corpo polare estuso diviso per il numero totale di ovociti coltivati.
   NOTA: I passaggi 5.6–5.8 sono utilizzati per valutare la maturazione degli ovociti dopo la IVM, privando una coorte di valutazione designata prima del punteggio PB1. Questi passaggi non sono necessari per i COC che procedono direttamente alla FIV.

6. Raccolta e preparazione dello sperma

NOTA: Questa sezione descrive la raccolta e la capacità dello spermatozoo fresco. Prima dell'inseminazione, gli spermatozoi appena rilasciati devono essere incubati in un mezzo di coltura embrionale preequilibrato a 37 °C per 1 ora per consentire la capacitazione.

1. Eutanasiate un maschio adulto DBA/2 topi (10–16 settimane di età) e rimuovete i suoi epididimidi della cauda, evitando il più possibile grasso, sangue e liquido tissutale (Figura 4).
2. Per ogni maschio, trasferire entrambi gli epididimi della cauda in una caduta di 300 μL di mezzo G-IVF preequilibrato per il rilascio e la capacità dello spermatozoo.
3. Immobilizza l'epididimo della cauda usando una pinza, effettua da cinque a sette tagli nell'epididime della cauda con un ago sterile di siringa e stringi delicatamente il tessuto per rilasciare spermatozoi concentrati.
   NOTA: Valutare la motilità degli spermatozoi e procedere solo quando la maggior parte degli spermatozoi mostra motilità progressiva (PR), definita come movimento attivo in avanti, piuttosto che motilità non progressiva (NP) o immotilit๹.
4. Incubare il piatto a 37 °C al 5% di CO₂ per 1 ora per permettere la capacità degli spermatozoi.

7. Fecondazione in vitro

1. Dopo 14 ore di IVM, lavare i COC tramite trasferimento sequenziale attraverso cinque gocce da 100 μL di mezzo di lavaggio IVF, poi trasferire i COC lavati nelle gocce di inseminazione IVF (20–30 COC per 100 μL di goccia).
2. Preincubare la ciotola di fertilizzazione contenente COC a 37 °C con 5% di CO₂ per 30 minuti prima dell'inseminazione.
3. Dopo la capacitazione, si determina la concentrazione di spermatozoi utilizzando un emocitometro.
4. In base alla concentrazione di spermatozoi, calcola il volume di inoculo richiesto e aggiungi spermatozoi capaci a ogni goccia di fecondazione per ottenere una concentrazione finale di 4 ×^{10 5} –1 × 10⁶ spermatozoi/mL.
   NOTA: Dopo l'aggiunta di spermatozoi, confermare che in ogni goccia di inseminazione siano presenti spermatozoi mobili.
5. Incubare i piatti di fecondazione in vitro contenenti COC e spermatozoi a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per 4–6 ore.

8. Coltura embrionale

1. Dopo 4–6 ore di incubazione, si utilizza una pipetta Pasteur in vetro finemente estratta con un diametro interno leggermente superiore a quello dell'ovocita per aspirare gli zigoti presuntivi in volume minimo e trasferirli nelle gocce di lavaggio per la fecondazione in vitro.
2. Lavare gli zigoti presuntivi tramite trasferimento sequenziale attraverso cinque gocce di lavaggio IVF, pipettando delicatamente all'interno di ogni goccia per rimuovere spermatozoi e detriti in eccesso (Figura 5).
3. Trasferire gli zigoti presuntivi lavati nella vasca IVC e lavarli tramite trasferimento sequenziale attraverso cinque gocce di lavaggio con mezzo embrionale preriscaldato, minimizzando il trasferimento del mezzo IVF.
4. Inserire gli zigoti presuntivi nelle gocce di coltura del mezzo per la coltura embrionale e coltura a 37 °C in CO₂ al 5% (20–30 embrioni per goccia da 100 μL).
5. A 6–8 ore dall'inseminazione, si valuta la fecondazione al microscopio stereomicroscopio valutando la presenza di pronuclei maschili e femminili, e si scartano gli ovociti che conservano un solo corpo polare e non mostrano pronuclei visibili.
6. A 24 ore dopo l'inseminazione, si contano il numero di embrioni a due cellule e si calcola il tasso di due cellule come (embrioni a due cellule / ovociti inseminati).
7. Dopo il conteggio, rimuovere e scartare gli embrioni non sfogati e continuare la coltura degli embrioni rimanenti spaccati.
   NOTA: In questa fase, gli embrioni possono essere vitrificati, trasferiti alle femmine riceventi o mantenuti in coltura fino allo stadio di blastocisti.
8. Continuare a coltivare gli embrioni nelle stesse condizioni di incubazione fino a 96 ore dopo l'inseminazione (hpi). Valutare la formazione di blastocisti a 96 hpi basandosi su criteri morfologici.
   NOTA: Non è necessario alcun ulteriore cambio di mezzo durante questo periodo. Un blastocisti normale si identifica dalla presenza di una cavità blastocellola visibile, di una massa cellulare interna distinta e di uno strato trofettodermico intatto.

Risultati

Utilizzando questo protocollo, i COC di topo venivano processati sequencialmente attraverso la maturazione in vitro , la fecondazione in vitro e la successiva coltura embrionale in vitro , risultando in una generazione riproducibile di embrioni pre-impianto e nello sviluppo fino allo stadio di blastocisti nelle condizioni descritte. Dopo 14 ore di IVM, i COC mostravano tipicamente espansione del cumolo e morfologia intatta degli ovociti. La maturazione dei meio...

Discussione

Questo protocollo prevede una procedura standardizzata per la maturazione in vitro degli ovociti di topo, la fecondazione in vitro e la coltura in vitro utilizzando COC immaturi, consentendo la generazione e la valutazione riproducibile degli embrioni pre-impianto attraverso la fase di blastocisti in condizioni in vitro definite. In molti studi, gli esiti della IVM sono sensibili alle differenze specifiche del laboratorio nei substrati, nei tempi di in...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
35 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	150255
60 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	150270
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A8806
Breeding diet (rodent breeder chow)	Keao Xieli (Beijing,China)	N/A
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	HERAcell 150i
D-glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Disposable Pasteur Pipet	Kimble	DWK63A53WT-1000EA
Epidermal growth factor	Gibco	PHG0313
Fine dissecting scissors	Sigma-Aldrich	S3146-1EA
Fine-tip forceps	Rhino	SW14
Follicle-stimulating hormone	Millipore	869001
G-1 PLUS	Vitrolife	10128
G-IVF PLUS	Vitrolife	10136	(preequilibriated) embryo culture medium
Hemocytometer	Millicell	MDH-4N1
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H4274
IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthine)	Selleck	S5836
KnockOut Serum Replacement	Gibco	A3181501
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352
Luteinizing hormone	Millipore	869003
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167
Medium 199	Gibco	11150-059
Micropipette	Gilson	F167350
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410
Phosphate-buffered saline	Gibco	20012027
Pregnant Mare Serum Gonadotropin	Ningbo Second hormone factory (Ningbo, China)	N/A
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P4562
Stereo microscope	Olympus	SZX10
Sterile medium bottles	Nalgene	46600-586
Sterile syringe needle	BD Biosciences	309623	1 mL, 27G1/2
Syringe Filter Unit	Millipore	SLGP033R
Thermo Plate	Tokai Hit	TPi-SZX2X