Un algoritmo di analisi della forma quantifica la morfologia spaziale e il contesto della coltura cellulare da 2D a 3D per una nuova quantificazione dei fenotipi

Summary

Questo articolo spiega come nuove caratteristiche morfologiche in cellule e organoidi possano essere quantificate utilizzando la trasformata linearizzata delle coordinate polari compresse (LCPC), un algoritmo spaziale che cattura proprietà che metriche tradizionali, come area, volume e superficie superficiale, non possono essere. Vengono discusse le migliori pratiche per l'orientamento e l'allineamento della forma.

Abstract

Numerosi studi hanno dimostrato che il fenotipo morfologico di una cellula o di un organoide è correlato alla sua suscettibilità agli agenti anticancerosi. Tuttavia, i metodi tradizionali di misurazione del fenotipo si basano su metriche spaziali come area, volume, perimetro e intensità del segnale, che funzionano ma sono limitate. Questi approcci non possono misurare molte caratteristiche cruciali del contesto spaziale, come la chiralità, una proprietà della mancina e della destrorsità. Il volume non può essere usato per registrare la chiralità perché le scarpe sinistra e destra hanno lo stesso volume. Sebbene il contesto spaziale sotto forma di chiralità, direzione gravitazionale e asse di polarità sia intuitivo per gli esseri umani, le metriche tradizionali utilizzate da biologi cellulari, patologi, radiologi e operatori di apprendimento automatico fino ad oggi non riescono a catturare queste nozioni fondamentali. La trasformata linearizzata delle coordinate polari compresse (LCPC) è un algoritmo innovativo che può catturare il contesto spaziale come qualsiasi altra metrica. La trasformata LCPC traduce un contorno bidimensionale (2D) in un'onda sinusoidale discreta sovrapponendo un sistema a griglia che traccia i punti di intersezione tra il contorno e le linee della griglia. Trasforma il contorno in una sequenza di coppie di coordinate discrete, con la coordinata indipendente (coordinata x) corrispondente a posizioni consecutive nello spazio 2D. Ogni coordinata dipendente (coordinata y) consiste nella distanza tra un'intersezione tra il contorno e la linea della griglia e l'origine o la linea di base del sistema a griglia. Sotto forma di un'onda sinusoidale discreta, la Trasformata di Fourier Veloce viene quindi applicata ai dati. In questo modo, le forme delle cellule in colture 2D e 3D sono rappresentate in modo sistematico e multidimensionale, permettendo una robusta stratificazione quantitativa che rivelerà intuizioni sulla resistenza ai trattamenti.

Introduction

La coltura organoide tridimensionale (3D) si è dimostrata superiore alla coltura cellulare bidimensionale (2D) nel simulare la biologia in vivo ^1,2. Gli organoidi sono diventati indispensabili nella ricerca sul cancro per lo screening di trattamenti efficaci e per ottenere informazioni sulla progressione della^malattia 3,4,5,6. Sebbene sia ben noto in biologia del cancro che le distinzioni morfologiche siano correlate a un comportamento biologico distinto di cellule e tessuti, il campo si basa su metriche di forma tradizionali che sono limitate nell'ambito. Questo studio descrive un innovativo algoritmo spaziale che quantifica oggettivamente le caratteristiche morfologiche sottili con precisione senza precedenti, superando approcci tradizionali come area, volume e superficie.

La trasformata delle coordinate polari compresse linearizzate (LCPC) è stata inventata per descrivere oggettivamente e quantitativamente morfologie complesse osservate in istopatologia tissutale, con l'obiettivo di migliorare la gradazione dei polipi del^{colon 7}. Il desiderio di poi ampliare questo approccio per catturare caratteristiche spaziali basate su risonanza magnetica macroscopica in patologie cerebrali, come il disturbo bipolare e il morbo di Alzheimer, ha portato ad aumenti che lo hanno ulteriormente potenziato. Questo studio descrive il protocollo passo dopo passo e le migliori pratiche per l'applicazione di due versioni della trasformata LCPC: il sistema a griglia parallela e il sistema a griglia radiale, entrambe con script open-source e video tutorial.

Oltre ai metodi geometrici tradizionali, esistono molteplici astrazioni che si sono rivelate efficaci per misurare le forme complesse di cellule e organi. Questi includono la misurazione di eccentricità, inclinazione, contrasto e curtosi, insieme ai momenti di Zernike per catturare circolarità, asimmetria, irregolarità dei bordi e struttura globale^{dei contorni 8,9,10}. L'analisi frattale è stata utile anche per ridurre contorni complessi in valori scalari, come la Dimensione Frattale, che misura quanto è irregolare il contorno, e la lacunarità, che misura quanto appaiono eterogeneamente irregolari i gap nel^{contorno 11,12}. Per misurare la texture, il metodo Gray Level Co-occurrence Matrix (GLCM) è popolare per misurare contrasto, energia, omogeneità, correlazione ed^{entropia 13,14}. Sebbene tutti questi metodi siano utili, nessuno di essi è stato progettato per catturare il contesto spaziale, come la direzione della gravità, la destrezza o la posizione della struttura di supporto centrale che influenza la direzione del cambio di forma. Inoltre, molti di essi producono un singolo valore scalare o solo una manciata di valori scalari per rappresentare informazioni spaziali, motivo per cui gli studi citati spesso li usano in combinazione per valutare forme complesse.

La trasformata LCPC è stata progettata per produrre molte caratteristiche da una sola misurazione e per permettere l'aggiunta di marcatori spaziali che codificano il contesto spaziale nella forma, come la direzione di gravità. Il metodo più vicino alla trasformata^{LCPC 7} fu pubblicato un anno dopo^{il 15}, condividendo la stessa idea centrale come punto di partenza: applicare la trasformata di Fourier ai contorni delle celle per misurare la forma sotto forma di uno spettro di frequenza. Tuttavia, la trasformata LCPC è stata sviluppata indipendentemente per essere applicata tramite sistemi a griglia distinti, pensati per essere utilizzati insieme alla conoscenza del contesto spaziale al di fuori della forma misurata. Inoltre, l'inventore della trasformata LCPC spiega in questo manoscritto che lo spettro di frequenze risultante contiene enormi quantità di informazioni spaziali nascoste. Il Supplementary File 1 contiene una discussione estesa sui contesti spaziali in biologia spesso trascurati quando si usano i metodi citati e su come la trasformata LCPC possa essere applicata per catturare questo contesto. Per i lettori i cui dati sulla forma non mostrano differenze tra gruppi di controllo e quelli sperimentali, se i loro occhi possono vedere una differenza nelle forme, o i cui dati sulla forma mostrano pochissima differenza, anche se sospettano che debba esserci una differenza maggiore, dovrebbero provare la trasformata LCPC.

La trasformata LCPC offre un livello di precisione senza precedenti nella misurazione delle informazioni spaziali perché rappresenta forme in molteplici dimensioni. A differenza dei metodi tradizionali, come area e volume, che producono un solo valore scalare per forma (cioè 25 cm²), i risultati della trasformata LCPC possono produrre indici multipli, ciascuno correlato a un aspetto morfologico diverso di una forma (cioè, rotondità vs. nitidezza degli angoli, levigatura vs. irregolarità degli spigoli). La trasformata LCPC descrive una forma 2D sovrapponendo una griglia di linee rette che ne intersecano il contorno. Ogni sistema a griglia ha un'origine (Figura 1) o una linea di base (Figura 2) da cui misurare la distanza lineare. Consulta le Figure 1B e 2B per diagrammi di flusso semplificati che descrivono l'algoritmo. Ogni punto di intersezione tra le linee della griglia e il contorno della forma viene rilevato. La distanza di ogni intersezione viene poi calcolata rispetto a una linea di base o origine. In questo modo, la trasformazione LCPC converte le forme 2D in una serie di coppie consecutive di coordinate x-y. La coordinata x rappresenta la posizione della linea della griglia da zero all'infinito, mentre la coordinata y rappresenta la distanza dell'intersezione dalla linea di base o dall'origine. In questa forma, che è un'onda sinusoide discreta, viene poi applicata la trasformata di Fourier Veloce (FFT) per convertire i dati dal "dominio della posizione" al dominio della frequenza. Se la coordinata x rappresentasse il tempo, allora il "dominio della posizione" sarebbe equivalente al "dominio del tempo" nelle applicazioni standard della FFT.

Mentre il sistema a griglia radiale misura la distanza di ogni intersezione dall'origine della griglia radiale (Figura 1A), il sistema a griglia parallela misura sempre la distanza delle intersezioni con riferimento a una linea immaginaria a sinistra della forma (Figura 2A). Lo script open-source determina la posizione di questa linea immaginaria trovando il pixel più a sinistra del contorno e poi spostando 10 pixel a sinistra di questa posizione. Qui, la coordinata x di questa posizione diventa la retta di riferimento da cui vengono calcolate tutte le intersezioni. Questa regola dei 10 pixel è arbitraria, ma è per questo che tutti i contorni analizzati dallo script open-source per il sistema a griglia parallela devono avere almeno 15 pixel di spazio bianco su tutti e quattro i lati.

Per forme 2D con pieghe o strati multipli, le linee di griglia possono intersecare il contorno più di una volta. In questo caso, le distanze di tutte le intersezioni lungo una griglia vengono sommate in un unico valore. Quindi, ogni linea di griglia ha una sola coordinata x e una coordinata y. Questa somma è rappresentata dal termine "compresso" nel nome trasformata LCPC. La rappresentazione di una forma 2D non lineare in un'onda sinusoide discreta è rappresentata dal termine "linearizzato" nel nome dell'algoritmo. Infine, il termine "coordinate polari" è nel nome dell'algoritmo perché il primo sistema a griglia concepito era una griglia radiale a 180 gradi di coordinate^{polari 7}. Anche dopo aver capito che le coordinate polari e cartesiane sono intercambiabili, il nome dell'algoritmo è rimasto così com'è. La sezione ringraziamenti descrive le ragioni personali che hanno motivato l'invenzione e l'aumento della trasformazione LCPC.

Il Protocollo 1 era la sequenza per ottenere i dati mostrati nella Figura 3B, mentre il Protocollo 2 era la sequenza per ottenere i dati mostrati nella Figura 3C–D. I passaggi di questi protocolli sono implementati in singoli script Python disponibili nel repository GitHub "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"¹⁶. Il Protocollo 1 è un esempio dei passaggi di pre-elaborazione per derivare la "forma pura" in preparazione alla trasformata LCPC. Il Protocollo 2 è un esempio di passaggi di pre-elaborazione per misurare forme "in scala", cioè alle loro scale originali l'una rispetto all'altra.

La segmentazione può essere effettuata manualmente in software di elaborazione immagini, come Preview su Mac o Paint di Microsoft, oppure utilizzando metodi basati su soglia. Se fatto manualmente, si dovrebbe scegliere uno dei seguenti quattro colori: blu, verde, rosa/magenta o rosso. Il repository GitHub chiamato "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"¹⁶ contiene una cartella chiamata "color extraction scripts". Questa cartella contiene quattro file Jupyter Notebook con codice Python che estraggono i quattro colori menzionati e li convertono in maschere blu su sfondo bianco. Questo processo può essere eseguito anche sogliando il colore del contorno in un software di elaborazione immagini come Fiji/ImageJ. Per le immagini che contengono contorni con bordi a contatto o bordi sovrapposti (ad esempio, un diagramma di Venn), dovranno essere separate tramite software di elaborazione delle immagini, in modo che diventino oggetti indipendenti nell'immagine composita a maschera contenente più contorni organoidi. Questo non si applica alle immagini che contengono un solo organoide o più organoidi che non si toccano tra loro.

Protocol

Le cellule umane primarie utilizzate in questo studio sono state prelevate e coltivate secondo le approvazioni etiche e le procedure di consenso informato precedentemente^{riportate 17}. Le immagini presentate qui sono state generate da quelle colture cellulari approvate e sono state pubblicate per la prima volta. I campioni di tessuto sono stati raccolti presso il Brigham and Women's Hospital e l'Università della California, San Francisco, secondo protocolli approvati dall'Institutional Review Board (IRB), da pazienti che hanno fornito un consenso informato per l'uso in ricerca dei loro tessuti, come descritto^{in precedenza 17}. Non è stata effettuata alcuna raccolta aggiuntiva di esemplari umani per questo studio.

1. Estrazione della forma pura dei contorni organoidi 2D per la trasformata LCPC

1. Segmenta il bordo esterno di ogni organoide utilizzando qualsiasi software di elaborazione immagini, come Paint di Microsoft, Preview di MacOS o Fiji/ImageJ.
2. Estrarre i contorni degli organoidi come maschere aperte che sono linee blu su uno sfondo bianco.
3. Isola ogni contorno blu su una tela bianca a parte.
   NOTA: Questo passaggio è necessario solo se un'immagine contiene più di un contorno.
4. Ritaglia ogni contorno in modo che abbia un margine di un pixel su tutti e quattro i lati dell'oggetto blu.
5. Aggiungi 100 pixel di spazio bianco su tutti e quattro i lati per creare nuovi margini.
6. Ruota gli oggetti in modo che la lunghezza interna più lunga sia orizzontale.
   NOTA: Questo passaggio trasforma la linea interna più lunga all'interno di ogni oggetto nella larghezza dell'oggetto. Sono disponibili due copioni per questo scopo. Per forme chiuse, usa il Jupyter Notebook chiamato "Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length_v2.ipynb". Per forme aperte o con più componenti, usa il Jupyter Notebook chiamato "Rotate Green Line_v3.ipynb". Lo strumento Ruota la Linea Verde ha un tutorial video collegato nel file ReadMe contenuto nella stessa cartella del file .ipynb.
7. Ritaglia ogni immagine in modo che abbia un margine di un pixel su tutti e quattro i lati dell'oggetto blu.
   NOTA: Questo è lo stesso passo 1.4. Lo scopo del taglio questa volta, però, è che il passaggio di ridimensionamento successivo ridimensiona l'intera tela, non solo l'oggetto blu al suo interno. Così, rendendo l'oggetto blu quasi della stessa larghezza e altezza della tela stessa, ridimensionare la tela a 400 pixel di larghezza si ridimensiona anche l'oggetto fino a quasi 400 pixel. Esiste un Jupyter Notebook chiamato "Margine di taglio a bordo di 1-pixel.ipynb".
8. Ridimensionare la larghezza della tela di ogni immagine a 400 pixel, limitando anche il rapporto d'aspetto.
   NOTA: Questo passaggio fa sì che ogni oggetto abbia la stessa larghezza. Limitare il rapporto d'aspetto impedisce di distorcere l'oggetto durante il ridimensionamento. Esiste un Jupyter Notebook chiamato "Resize width to 400 pixel but limitare image ratio.ipynb".
9. Aggiungi 100 pixel di spazio bianco su tutti e quattro i lati per creare nuovi margini.
10. Ruota ogni immagine di 90 gradi in senso orario o antiorario per rendere verticale la lunghezza interna più lunga, seguendo la scelta per tutte le immagini.
    NOTA: Nella sequenza sopra, la forma pura si ottiene implementando sequenzialmente i Passaggi 1.6, 1.7, 1.8 e 1.9. Aggiungere spazio di margine nello Passo 1.9 è necessario per evitare errori negli script di trasformazione LCPC che verranno eseguiti successivamente, ma non è coinvolto nell'estrazione della forma pura. Gli utenti che desiderano misurare forme "in scala" non devono eseguire i Passaggi 1.6, 1.7 e 1.8 nella sequenza sopra, anche se dovrebbero comunque pre-elaborare le immagini della maschera per ottenere un'orientazione ottimale prima di applicare la trasformata LCPC.
11. Esegui la trasformata LCPC su ogni contorno. Usa script Python forniti per il metodo radiale^{grid 18} o il metodo parallel^{grid 19}.

2. Estrazione della forma in scala dei contorni organoidi 2D per la trasformata LCPC

NOTA: Il metodo passo dopo passo per estrarre la forma in scala degli oggetti è simile a quello per estrarre la forma pura nel Protocollo 1 sopra. I passaggi sono nominati allo stesso modo in entrambi i protocolli per facilitare l'abbinamento. Si prega di consultare le note nel Protocollo 1 per ogni passaggio. La principale differenza tra forma pura e forma in scala è che la forma in scala non richiede i passaggi 1.6, 1.7 e 1.8, che sono i passaggi di ridimensionamento.

1. Segmenta il bordo esterno di ogni organoide. Utilizza un approccio computazionale oppure lo fai manualmente tramite un software base di editing immagini, come Paint di Microsoft, Preview di MacOS o Fiji/ImageJ.
2. Estrarre i contorni degli organoidi come maschere aperte che sono linee blu su una tela bianca. Usa Fiji/ImageJ per estrarre le maschere o lo script Python^{fornito 16}.
3. Isola ogni contorno blu su una tela bianca a parte. Usa Fiji/ImageJ per estrarre le maschere o lo script Python^{fornito 16}.
4. Ritaglia ogni contorno in modo che abbia un margine di un pixel su tutti e quattro i lati dell'oggetto blu. Usa Fiji/ImageJ o lo script Python^{fornito 16}.
5. Aggiungi 100 pixel di spazio bianco su tutti e quattro i lati per creare nuovi margini. Usa Fiji/ImageJ o lo script Python^{fornito 16}.
6. Ruota ogni contorno in modo che la linea interna più lunga sia verticale. Usa Fiji/ImageJ o lo script Python^{fornito 16}.
7. Esegui la trasformata LCPC su ogni contorno. Usa script Python forniti per il metodo radiale^{grid 18} o il metodo parallel^{grid 19}.

Results

La trasformata radiale a griglia LCPC applicata agli organoidi del tumore al seno

Gli organoidi e i tumori 3D possono assumere una varietà di forme, alcune delle quali sono ovviamente diverse all'occhio umano, anche se le metriche tradizionali producono differenze statisticamente insignificanti. D'altra parte, gli organoidi possono anche mostrare forme che sembrano eterogenee, e quindi insignificanti, all'occhio umano, mascherando morfologie sottili ricorrenti che rappresentano sottotipi distinti. Gli organoidi primari umani del seno sono stati estratti dai pazienti e coltivati in 3D seguendo un protocollo^{precedentemente pubblicato} 17,20,21. La Figura 3A mostra tre categorie morfologiche accessibili in base all'ispezione visiva: un fenotipo cistico, un fenotipo policistico e un fenotipo policistico denso. La Figura 3B mostra che i contorni esterni di questi organoidi venivano segmentati manualmente e la loro forma pura veniva estratta, il che elimina l'effetto della dimensione sulle loro forme. Poiché i contorni erano di natura circolare, la trasformata radiale della griglia LCPC è stata applicata alle forme pure, seguita dalla PCA. Si noti che i contorni sovrapposti sulla Figura 3B sono stati ruotati in modo che la linea interna più lunga sia verticale, il che significa che le loro orientazioni non sono le stesse delle immagini sorgente. La Figura 3B mostra un dot plot dei primi due componenti principali (PC), e il clustering K-means ha identificato tre cluster: 0, 1 e 2. I Silhouette Scores (SS) hanno confermato la probabile esistenza di due cluster separati tra Cluster 0 vs. 1 (SS = 0,68) e Cluster 1 vs. 2 (SS = 0,69), indicando al contempo una debole separazione tra Cluster 0 vs 2 (SS = 0,27). Nonostante il debole Silhouette Score tra i Cluster 0 e 2, etichettare i punti dati con la forma pura di ciascun punto giustifica che il Cluster 2 rappresenta il fenotipo più distinto: contorni altamente asimmetrici e non circolari (in questo caso lo spessore dei contorni non conta).

Sebbene la forma pura elimini l'effetto della dimensione sulla forma, cosa impossibile quando si misura area e volume, misurare i contorni organoidi su scala rivela anche intuizioni interessanti. La Figura 3C mostra un grafico puntuale 3D dei primi tre PC risultante dalla trasformata radiale della griglia LCPC eseguita sui contorni mentre venivano segmentati dalle immagini senza alcuna ridimensionamento. Questo approccio significa che la trasformata LCPC misura contemporaneamente sia la forma che la dimensione degli organoidi. La Figura 3C mostra che gli organoidi policistici e policistici densi sono meno densamente compatti rispetto agli organoidi cistici. Per quantificare questa espansione, la Figura 3D mostra la dispersione di ciascun fenotipo nel suo spazio condiviso PCA. La distanza media K-Nearest Neighbor (KNND) viene calcolata per ciascun fenotipo, il che supporta la valutazione visiva della densità decrescente dei punti che vanno dagli organoidi cistici (KNND = 1,061) agli organoidi policistici (KNND = 1,575) fino agli organoidi policistici densi (KNND = 2,247); questa diminuzione della densità di punti può anche essere interpretata come un aumento dell'eterogeneità morfologica dei contorni esterni. Infine, per un confronto della trasformata LCPC con la metrica tradizionale dell'area, la Figura 3E mostra che, sebbene vi sia una significatività statistica tra l'area degli organoidi cistici e quella degli organoidi policistici densi (p = 0,016, Wilcoxon Rank-Sum Test), non vi è alcuna indicazione, basata sull'area, che esistano tre gruppi morfologici distinti tra i fenotipi identificati dal K-means Clustering dopo l'analisi pura della forma LCPC (Figura 3B) oppure che vi sia una crescente eterogeneità morfologica come mostrato dall'analisi LCPC su scala (Figura 3C–D). La Figura 3E mostra una dispersione decrescente dei punti dati che vanno da organoidi cistici a policistici a policistici densi, che è l'opposto di quanto osservato dall'analisi LCPC su scala (Figura 3C), evidenziando che le informazioni spaziali catturate dalla trasformata LCPC sono diverse da quelle catturate dall'area.

Lo stesso approccio si applica alle singole forme 2D nella Figura 3, e la Figura Supplementare 1 si applica anche al contorno delle cellule in colture cellulari 2D: singole cellule (come i globuli rossi) o gruppi di cellule (come nei Pap test cervicali). Gli studi pilota per ciascuno di questi casi sono descritti nei video: analisi della forma degli organoidi cerebrali che mostrano diversi gradi di piegamento nel loro contorno^{esterno 22}; analisi della forma degli alveoli polmonari in situ, gli stessi principi possono essere applicati all'analisi della coltura cellulare^{2D 23}; analisi della forma del tessuto cervicale tramite Pap test in cui sia il contorno del nucleo che della membrana cellulare sono quantificati simultaneamente tramite la trasformata radiale LCPC²⁴; analisi della forma dei globuli rossi infettati dalla malaria e delle cellule adiacenti alle cellule infette ma che non sono esse stesse^{infette 25}; analisi della forma dei globuli rossi colpiti dalla Anemia^{Falciforme 26}.

Il sistema a griglia parallela per misurare la densità o la texture come indice delle informazioni spaziali

L'informazione spaziale coinvolge più delle nozioni usuali di forma, come quadratezza, rotondità e curvatura, perché comprende concetti come texture e densità. Reti tubulari complesse, come i vasi sanguigni, o reti ramificate, come i filamenti del citoscheletro, non si inseriscono nella nozione di forma nello stesso senso della nostra intuizione geometrica delle forme, come cerchi e poligoni. Tuttavia, densità e consistenza sono concetti molto utili delle informazioni spaziali per comprendere la struttura e la funzione di cellule, organoidi e tumori. Nel lavorare su come quantificare reti complesse nell'imaging a fluorescenza, i biologi cellulari misurano caratteristiche come l'intensità media del segnale all'interno di un'immagine o la percentuale dell'area totale di un'immagine che contiene un segnale. Questi approcci riconoscono che c'è molto di più nell'informazione spaziale rispetto a quanto descritto in termini di motivi geometrici.

Il modello delle reti vascolari all'interno di tessuti, tumori e organi su un chip non è facilmente definito dai motivi geometrici tradizionali, ma trae beneficio dall'interpretazione come texture e densità. Il rimodellamento vascolare nello sviluppo tumorale e nella resistenza al trattamento è una caratteristica ben consolidata del cancro (revisionata nel²⁷). Sono state analizzate sezioni istopatologiche di 458 tumori neuroblastici^{primari in 28}, caratterizzando la densità, la dimensione e la forma dei vasi sanguigni totali e dei segmenti vascolari. Hanno riscontrato che i vasi sanguigni erano più grandi, più abbondanti e di forma più irregolare nei tumori di pazienti con fattori prognostici sfavorevoli rispetto ai tumori della coorte favorevole. Curiosamente, un termine chiamato "vasi che incapsulano i cluster tumorali" (VETC)²⁹ è stato coniato per descrivere un modello di vasi sanguigni che circondano gruppi di piccoli tumori all'interno di un carcinoma epatocellulare più ampio e sono associati a tassi più elevate di metastasi e recidiva. Lo stesso gruppo che coniò il termine in seguito scoperte che il carcinoma epatocellulare VETC-positivo era correlato a una risposta positiva al trattamento con l'inibitore della chinasi Sorafenib³⁰. Pertanto, la capacità di quantificare i modelli vascolari è cruciale per la prognosi e la comprensione dei meccanismi di resistenza.

Per quantificare reti dense di tubi, isole e rami, il sistema a griglia parallela della trasformata LCPC è utile per misurare quella che può essere chiamata densità di texture, invece che forma. Come esempio di come la trasformata LCPC a griglia parallela possa fare ciò, la Figura 4A mostra i modelli di microvascolatura cardiaca da uno studio sulla vascolatura^{cardiaca 31}: a occhio nudo, distinguere oggettivamente e quantitativamente i modelli tra le aree infarttate e quelle in una regione lontana dal sito della lesione è molto difficile. Estraendo la maschera dei vasi sanguigni (Figura 4A Passo 1) e applicando la trasformata LCPC a griglia parallela, si possono osservare differenze quantitative. Per prima cosa, per migliorare la pulizia dei dati, ogni immagine è stata ritagliata con un cerchio di diametro uniforme, centrato al centro dell'immagine quadrata (Figura 4A Passo 2), che garantisce che ogni immagine abbia la stessa altezza e larghezza indipendentemente dalle rotazioni. Successivamente, le immagini ritagliate vengono ruotate in modo che l'asse principale dei vasi (frecce doppie rosse nella Figura 4A Passo 1) sia verticale (Figura 4A Passo 3). Successivamente, viene applicata una linea blu alla circonferenza dell'immagine per garantire che anche le immagini con motivi vascolari radi abbiano lo stesso diametro in termini di pixel blu (Figura 4A Passo 4). I passaggi 3 e 4 sono stati eseguiti utilizzando il software Fiji/ImageJ (v2.14.0). Infine, si applica la trasformata LCPC a griglia parallela (Figura 4A Passo 5). Analizzando i risultati tramite PCA e tracciando i primi tre PC, si scopre che le regioni infartate si raggruppano separatamente dalle regioni remote (Figura 4B). I calcoli della distanza smussato (CD) quantificano i modelli visivi esibiti dai grafici. A 1 giorno dall'infortunio, il sito infarttato presenta un modello vascolare più distante dalla condizione basale (basale vs. 1Day_infarct: CD = 83,89) rispetto al sito non lesionato (basale vs 1Day_remote: CD = 53,95). A 1 giorno dopo l'infortunio, il sito remoto non lesionato è più vicino al sito lesionato (1Day_remote vs 1Day_infarcxt: CD = 34,48) che alla condizione basale. A 3 giorni dalla lesione, i modelli vascolari del sito lesionato e del sito remoto non lesionato associato mostrano una drastica deviazione dalla condizione basale e tra loro (Basale vs. 3Days_Infarct: CD = 240,63; Basal vs. 3Days_Remote: CD = 67,28; 3Days_Remote contro 3Days_Infarct: CD = 168,35). Molto interessante, a 7 giorni dall'infortunio, i modelli vascolari del sito lesionato e del sito remoto non lesionato occupano uno spazio 3D approssimativamente ortogonale alla condizione basale, mentre sono allineati tra loro a una distanza più vicina rispetto a un giorno dopo l'infortunio (CD = 24,76 per il giorno 7 rispetto a 34,48 per il giorno 1). I dati suggeriscono due cose: (1) con il progredire della guarigione, il modello vascolare del sito lesionato e del sito remoto non lesionato adotta schemi distinti dalla condizione basale; (2) Il programma di ricostruzione attivato nel sito danneggiato innesca, anche cambiamenti morfologici simili nei siti remoti non danneggiati associati.

Come riferimento per la versatilità della trasformata LCPC, sono state calcolate le metriche tradizionali di area percentuale (Figura 5A) e perimetro totale (Figura 5B) dei vasi sanguigni. Sebbene area e perimetro rivelano variazioni tra punti nel corso temporale, non forniscono una quantificazione coerente di disposizioni spaziali distinte delle navi. Area e perimetro sono astrazioni che possono rappresentare molte diverse disposizioni vascolari e quindi non sono informative su come la disposizione spaziale dei vasi stia cambiando nelle condizioni di trattamento e nel corso del tempo. Con n = 3 per ogni gruppo, il test t e il test di Wilcoxon sono inaffidabili. Il Delta di Cliff è non parametrico e funziona bene per mostrare uno spostamento nella dimensione dell'effetto. La differenza principale rivelata dalla misurazione della percentuale di area dei vasi sanguigni è tra la condizione basale e i punti temporali di 7 giorni; Per il perimetro totale dei vasi sanguigni, le differenze sono tra la condizione basale vs. 1-day e la condizione basale vs. 7-day. Tuttavia, area e perimetro non forniscono alcuna indicazione che vi siano differenze tra i siti infartati e i loro siti remoti non feriti, il che è molto sorprendente dato che il sito infarttato è stato intenzionalmente ferito. Qui emerge la versatilità della trasformata LCPC rispetto alle metriche tradizionali. Per ogni campione, i risultati della FFT come parte della trasformata LCPC producono un insieme di grandenze associate a un insieme di frequenze. Le grandenze di ciascun binario di frequenza possono essere mediate e poi confrontate tra i gruppi di trattamento (Figura supplementare 1). Questo permette una valutazione semplice di quali bins di frequenza presentino le differenze maggiori tra i gruppi di trattamento. La Figura 5C mostra sei contenitori che mostrano chiare differenze di dimensione dell'effetto tra i vari gruppi di trattamento, specialmente tra i siti infarttati e i relativi siti remoti non lesionati, che l'area e il perimetro indicavano non presentare differenze. I valori indipendenti in questi sei contenitori forniscono indici multipli che mostrano differenze quantitative tra le condizioni di trattamento. Curiosamente, il pattern tra i gruppi per il Bin 1 dei risultati della trasformata LCPC è simile a quello ottenuto misurando il perimetro totale. Gli altri indici, tuttavia, rivelano differenze quantitative nascoste sia nell'area che nel perimetro. Indici unici per la condizione basale: Bin 49, Bin 56, Bin 21. Indici unici tra i gruppi del Giorno 1: Bin 1, Bin 6, Bin 49. Indici unici dei gruppi del Giorno 3: Bin 6, Bin 112, Bin 49. Indici unici dei gruppi del Giorno 7: Bin 6, Bin 49, Bin 112. Questi dati evidenziano la versatilità e la precisione della trasformazione LCPC rispetto agli approcci tradizionali di area e perimetro.

Figura 1: Descrizione del sistema a griglia radiale della trasformata LCPC. (A) Passo 1: La forma di interesse viene segmentata ed estratta come una maschera blu. Passo 2: Per la maschera viene determinata una scatola di delimitazione (nota anche come il rettangolo più piccolo che racchiude e tocca l'oggetto su tutti e quattro i lati). Un sistema di linee radiali a griglia che partono dal centro della scatola di delimitazione viene sovrapposto alla maschera. La decisione di scegliere il centro della scatola delimitata invece del centroide dell'oggetto come origine era arbitraria. Passo 3: La distanza di ogni intersezione tra una linea di griglia e la forma viene calcolata rispetto all'origine. Le linee di griglia che hanno più di una intersezione sommano tutte queste distanze di intersezione in un unico valore per quella linea di griglia. Passo 4: La FFT viene applicata per convertire i dati del Passo 3 in un grafico di frequenza, una rappresentazione statica multidimensionale (Passo 5) della forma del Passo 1. Passaggio 6: Un valore scalare può essere creato dal Passo 5 tramite un indice. Vedi la Figura 10 per una discussione sui tipi di indici da calcolare. (B) Un diagramma di flusso che mostra una descrizione semplificata dei passaggi della trasformata LCPC per il sistema a griglia radiale. (C) Temi di forma di esempio per i quali il sistema a griglia radiale è ottimale. Le forme sono state disegnate in Microsoft PowerPoint. Queste immagini sono create dagli autori e non richiedono alcuna licenza di pubblicazione o permessi di copyright. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Descrizione del sistema a griglia parallela della trasformata LCPC. (A) Passo 1: La forma di interesse viene segmentata manualmente ed estratta come maschera binaria. Passo 2: Un sistema a griglia parallela viene sovrapposto alla forma, che viene ruotata in modo che la base sia orizzontale. Passo 3: La distanza di ciascuna intersezione tra una linea di griglia e la forma viene calcolata rispetto alla linea di base. Le linee di griglia che hanno più di una intersezione sommano tutte queste distanze di intersezione in un unico valore per quella linea di griglia. Passo 4: La FFT viene applicata per convertire i dati del Passo 3 in un grafico di frequenza, una rappresentazione statica multidimensionale della forma del Passo 1. Passaggio 6: Un valore scalare può essere creato dal Passo 5 tramite un indice. Vedi la Figura 10 per una discussione sui tipi di indici da calcolare. (B) Un diagramma di flusso che fornisce una descrizione semplificata dei passaggi di trasformazione LCPC per il sistema a griglia parallela. (C) Esempi di temi di forma per i quali il sistema a griglia parallela è ottimale. Le forme sono state disegnate in Microsoft PowerPoint. Queste immagini sono create dagli autori e non richiedono alcuna licenza di pubblicazione o permessi di copyright. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: La trasformata LCPC identifica oggettivamente sottotipi morfologici degli organoidi del tumore al seno. (A) Gli organoidi primari umani del seno sono stati derivati come precedentemente^riportato 17,20,21 e come descritto nel File Supplementare 1. Sono stati osservati e classificati tre fenotipi basandosi sull'ispezione visiva: cistico, policistico e policistico denso. Barra di scala = 50 μm. (B) I contorni esterni degli organoidi venivano segmentati manualmente (Figura Supplementare 2; criteri descritti nel File Supplementare 1), e si otteneva la forma pura di questi contorni. Si noti che i contorni nel diagramma sono tutti ruotati in modo che la linea interna più lunga sia verticale; di conseguenza, non corrispondono alle loro orientazioni originali. Successivamente è stata applicata la trasformata LCPC a griglia radiale e i risultati sono stati analizzati tramite PCA. Il clustering K-means identificò tre cluster (0, 1 e 2), e furono calcolati i Silhouette Scores (SS) per confermarne l'esistenza. Cluster 0 contro 1, SS: 0,68; Cluster 0 vs 2, SS: 0,27; Cluster 1 contro 2, SS: 0,69. (C) I contorni esterni degli organoidi sono stati anch'essi misurati utilizzando la trasformata radiale della griglia LCPC sulle loro forme in scala, cioè le forme così come appaiono nelle immagini l'una rispetto all'altra, senza alcuna ridimensionamento. L'inset è ingrandito per mostrare il paccheggio più lasco degli organoidi policistici e densi rispetto agli organoidi cistici. Per B e C: Verde = cistico, Viola = policistico, Giallo = policistico denso. (D) I primi tre valori di PC vengono tracciati separatamente per ogni fenotipo, e la KNND media viene calcolata per mostrare che il fenotipo cistico è più densamente impacchettato, mentre i fenotipi policistici e policistici densi mostrano una densità inferiore (il che significa maggiore eterogeneità). Sebbene rappresentati separatamente, tutti e tre i fenotipi condividono lo stesso spazio PCA. Per il fenotipo cistico, la KNND media è stata calcolata dall'inset perché gli valori anomali presenti solo in questo fenotipo distorcono il calcolo. Tentativi di Sangue Rossi: Cistico, 1,061; Policistico, 1,575; Policistico denso, 2.247. (E) I diagrammi a scatola dell'area degli organoidi mostrano una dispersione decrescente dei punti dati da organoidi cistici a policistici a policistici densi, che è l'opposto di quanto osservato nell'analisi LCPC su scala (Figura 3C), evidenziando che le informazioni spaziali catturate dalla trasformata LCPC differiscono da quelle catturate dall'area. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Misurazione della densità di texture con la trasformata LCPC a griglia parallela. (A) Le fotomicrografie della microvascolarizzazione nel tessuto cardiaco erano state precedentemente ottenute in uno studio^{diverso 31,32}. Le immagini non sono riprodotte da questi studi in sé; piuttosto, rappresentano nuove viste generate dallo stesso dataset originale di imaging^{3D riportato 31} e fornito da Gkontra. Sebbene il dataset sia già stato pubblicato, le immagini specifiche qui mostrate sono state pubblicate per la prima volta. Le immagini dei siti remoti che non sono stati feriti in ogni momento non vengono mostrate. Passo 1: Viene generata una maschera 2D e viene determinato l'asse generale di allineamento dei vasi (doppia freccia rossa). Passo 2: Si ottiene una regione circolare centrata sul punto medio dell'immagine per costringere ogni immagine ad avere la stessa altezza dopo che le immagini sono state ruotate in misura variabile nel passaggio successivo (ruotare le immagini quadrate in gradi variabili altererà l'altezza dell'immagine a seconda del grado di rotazione). Passo 3: Ogni immagine viene ruotata in modo che l'asse generale di allineamento determinato nel Passo 1 sia verticale. Passo 4: Un bordo blu uniforme viene applicato attorno a ogni immagine per garantire che ogni immagine abbia lo stesso diametro, poiché le immagini con densità più rade possono essere più corte (esempio: vedi "7 giorni dopo l'infarto miocardico" nel Passo 3). Passo 5: Viene applicata la trasformata LCPC a griglia parallela. (B) Grafici a punto dei primi tre PC dell'uscita dalla trasformata LCPC a griglia parallela (Viola: condizione basale, Verde: sito infartato, Giallo: sito non lesionato remoto dal sito infartato). Vedi la sezione risultati per i calcoli della distanza di smusso in ogni punto temporale tra le tre condizioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: La trasformata LCPC misura le caratteristiche nascoste nell'area e nel perimetro. Per confronto con le metriche di forma tradizionali, sono stati misurati (A) la percentuale di area e (B) il perimetro totale delle reti vascolari. (C) Per mostrare la precisione che si può ottenere dal risultato della trasformata LCPC, è stato confrontato il valore dei singoli bini di frequenza risultanti dalla FFT (Figura supplementare 1). Sono stati scelti sei bins di frequenza come indici per quantificare oggettivamente le differenze tra i gruppi di trattamento. Per tutti i pannelli, a causa della dimensione limitata del campione di ciascun gruppo (n = 3), è stato calcolato il Delta di Cliff non parametrico per la dimensione dell'effetto invece di un p-valore dal Wilcoxon Rank-Sum Test. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: L'importanza di orientare sistematicamente le forme per estrarre dati puliti. (A) Un esempio di forme identiche che sono immagini speculari l'una dell'altra, e come il sistema a griglia parallela determini la loro orientazione distinta, producendo quindi risultati diversi. (B) Un esempio di come capovolgere orizzontalmente la Forma 2, in modo che la sua orientazione corrisponda ora alla Forma 1 e diventi un confronto più equo con la Forma 1. In questa configurazione, la trasformata LCPC a griglia parallela produce gli stessi risultati sia per Forma 1 che per Forma 2. Questa alterazione dell'orientamento dovrebbe avvenire solo se non esiste un contesto spaziale che suggerisca che la Forma 2 non debba essere modificata. (C) Un esempio di quattro varianti di oggetti che assomigliano al numero "3", alcuni di essi che sono rivolti nella direzione sbagliata. (D) Un esempio di come orientare ogni oggetto per massimizzare la pulizia dei dati che risulteranno dalla trasformata LCPC a griglia parallela. (E) Un esempio di misurazione del rigonfiamento più ampio degli elementi nel Pannello C basandosi sulle stesse regole di orientamento del Pannello D. (F) Un esempio di misurazione delle grandi lampade degli elementi nel Pannello C mantenendo il loro contesto di allineamento come nel Pannello D. La motivazione per mantenere le regole di allineamento nel Pannello D è di analizzare il contributo delle informazioni spaziali nel rigonfiamento più ampio rispetto al contributo del rigonfiamento più stretto all'interno di queste regole. Vedi la Figura Supplementare 3 per gli spettri FFT associati a C–F. Le immagini in A–B sono icone di Microsoft PowerPoint. Le forme in C-F venivano disegnate in Microsoft PowerPoint. Queste immagini sono create dagli autori e non richiedono alcuna licenza di pubblicazione o permessi di copyright. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: L'incapacità delle metriche tradizionali di forma di registrare un contesto ovvio. (A) La serie di segni di spunta ha la stessa forma ma aumenta di dimensione da sinistra a destra. In questa serie, l'area di ogni segno di spunta è diversa mentre il concetto di forma rimane lo stesso: cioè, restano lo stesso stile di segni di spunta. (B) Un quadrato viene ruotato attorno al suo centro di 45 gradi finché il suo concetto di forma non diventa ciò che gli esseri umani chiamano diamante. Sebbene il concetto di forma di quadrato sia molto distinto da quello di un diamante, le rotazioni intermedie sono soggettivamente interpretate come "quadrati inclinati" o "rombi inclinati". La trasformata LCPC può misurare oggettivamente e con precisione la differenza in ogni passaggio di questa serie. Le forme sono state disegnate in Microsoft PowerPoint. Queste immagini sono create dagli autori e non richiedono alcuna licenza di pubblicazione o permessi di copyright. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Spiegazione della forma pura vs. della forma in scala. Misurare oggetti "At-Scale" significa misurare la forma degli oggetti in base alle loro dimensioni originali rispetto l'uno all'altro. "Forma Pura", invece, significa misurare la forma di oggetti diversi a una scala simile, rimuovendo così l'effetto della dimensione sulla forma. È importante trovare un modo oggettivo per ridimensionare gli oggetti confrontati. La linea interna più lunga è spesso una scelta ottimale (Passo 1). Entrambi gli oggetti sono ruotati in modo che la linea interna più lunga sia orizzontale (Passo 2). In questo caso, i due oggetti vengono anch'essi ruotati in modo che il lato incavato sia rivolto verso il basso. Successivamente, la larghezza di ogni oggetto, che ora è della stessa magnitudine della linea interna più lunga di ciascun oggetto, viene ridimensionata per essere larga 400 pixel, limitando anche il rapporto d'aspetto per evitare distorsioni degli oggetti (Passo 3). Infine, è opzionale ruotare gli oggetti ridimensionati di 90 gradi (Passo 4) (in questo caso, in senso antiorario) prima di applicare la trasformazione LCPC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Esempio di marcatori spaziali per la ricerca sul cancro. (A) Un esempio ipotetico di cellule che migrano in coltura 2D espandendo i loro lamellipolidi nella direzione della migrazione. Nel contesto della morfologia migratoria delle cellule epiteliali, orientare il contorno di ciascuna cellula in modo che la linea interna più lunga che si allinea con l'asse di migrazione sia verticale ha più senso per catturare il contesto spaziale. (B) Esempi ipotetici di tumori o lesioni precancerose che crescono all'interno di un involucro che non cambia forma. La lesione cresce da un peduncolo, che è la struttura centrale di supporto. Man mano che la lesione cresce o si irrigzisse, il suo contorno si sposta verso o lontano dalla parete interna dell'involucro. Le linee tratteggiate rappresentano un modo razionale e oggettivo per definire quanto dell'involucro debba essere tracciato (linea arancione), in modo che non vengano aggiunte né troppo poco né troppe informazioni aggiuntive. (C) L'opzione 1 mostra la trasformata LCPC a griglia parallela applicata al contorno delle lesioni senza contesto della posizione dell'involucro. L'opzione 2 mostra lo stesso, ma includendo il contesto spaziale di dove si trova l'involucro. Ad esempio, i punti rossi rappresentano le intersezioni tra la linea della griglia (freccia nera, linea verde) e il contorno. L'Opzione 2 fa sì che ogni linea della griglia crei una quarta intersezione che non esiste nell'Opzione 1, il che aggiunge quantitativamente un contesto spaziale al risultato dell'Opzione 2, completamente assente nell'Opzione 1. Le forme sono state disegnate in Microsoft PowerPoint. Queste immagini sono create dagli autori e non richiedono alcuna licenza di pubblicazione o permessi di copyright. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Risultati ipotetici delle FFT e indici comuni che possono essere derivati da essi. (A) Viene mostrato il grafico di frequenza risultante dalla FFT di due forme ipotetiche. Poiché le grandenze nel Bin 3 e nel Bin 4 mostrano una tendenza opposta, un rapporto tra questi due bin sarà un buon indice che rappresenti una differenza tra queste due forme. Le linee tratteggiate rosse e verdi rappresentano altri bins di frequenza che potrebbero essere usati per ottenere buoni indici. (B) Un istogramma di due forme ipotetiche i cui profili FFT mostrano una tendenza decrescente a passo a passo come rappresentazione delle loro differenze morfologiche. (C) Un istogramma di due forme ipotetiche i cui profili FFT differiscono maggiormente nella regione centrale lungo l'intervallo dei bins di frequenza. (D) Esempi di caratteristiche morfologiche ipotetiche che possono fornire indici correlati alla loro presenza. Le forme sono state disegnate in Microsoft PowerPoint. Queste immagini sono create dagli autori e non richiedono alcuna licenza di pubblicazione o permessi di copyright. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Grafici a scatola che confrontano le grandenze di vari bins di frequenza attraverso i risultati della trasformata LCPC delle reti vascolari. La trasformata LCPC delle reti vascolari mostrata nelle Figure 4 e 5 fornisce un insieme di bins di frequenza e le loro magnitudini che rappresentano ogni immagine. Grafici a scatola e baffi delle grandenze in ogni contenitore vengono utilizzati per confrontare tutti i gruppi di trattamento, identificando quale contenitore funge meglio da indice per stratificare la densità di texture misurata tramite la trasformata LCPC. Ogni grafico box-whisker è composto da n = 3 immagini indipendenti. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Esempio di organoidi segmentati per tumori al seno. Gli organoidi venivano segmentati manualmente da un esperto che li coltivava regolarmente e li osservava al microscopio. Questa figura mostra esempi di contorni organoidi segmentati. La barra di scala per tutte le immagini microscopiche è di 50 μm. Le cellule umane primarie utilizzate in questo studio sono state prelevate e coltivate secondo approvazioni etiche e procedure di consenso informato^{riportate 21}. Le immagini presentate qui derivano da quelle colture cellulari approvate e sono pubblicate per la prima volta. Non fu effettuata alcuna raccolta aggiuntiva di esemplari umani. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Spettri FFT per le forme nella Figura 6. I risultati delle FFT per le forme nella Figura 6 sono forniti qui, così i lettori possono comprendere l'effetto dell'alterazione dell'orientamento della forma sulle loro informazioni spaziali. La colonna sinistra dei grafi ha assi y non alterati, mentre la colonna di destra ha assi troncati in modo che i valori del bin più piccoli possano essere visualizzati. (A) Gli spettri provenienti dalla trasformata LCPC a griglia parallela delle quattro forme nella Figura 6C come sono visualizzate, il che significa che non si può riorientare. (B) Spettri dalla trasformata LCPC a griglia parallela delle forme nella Figura 6D, che sono state riorientate come descritto nel testo. (C) Spettri dalla trasformata LCPC a griglia parallela delle forme nella Figura 6E. (D) Spettri dalla trasformata LCPC a griglia parallela delle forme nella Figura 6F per il confronto con quelli della Figura 6E. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 1: dettagli approfonditi sulle migliori pratiche per la trasformazione LCPC. Questo fascicolo supplementare offre una discussione approfondita sulle migliori pratiche e ulteriori note metodologiche. La struttura del documento è la seguente: Sezione 1 - Contesto spaziale che area, volume, perimetro e rugosità non possono catturare. Sezione 2 - Migliori pratiche per l'uso della trasformata LCPC e per l'interpretazione dei risultati. Sezione 3 - Comprendere la polarità intrinseca della natura per massimizzare la trasformazione LCPC. Sezione 4 - Interpretazione degli spettri FFT risultanti dalla trasformata LCPC. Sezione 5 - Come orientare le forme prima di misurarle con la trasformata LCPC. Sezione 6 - Cosa significa "Forma Pura" vs. "Forma in scala"? Sezione 7 - Note metodologiche sui metodi statistici. Sezione 8 - Note metodologiche sulla coltura cellulare e segmentazione degli organoidi. Sezione 9 - Parametri della FFT per coloro che codificano la propria trasformazione LCPC. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Come per qualsiasi strumento computazionale, la qualità dell'output dipende dal fatto che gli input rispettino o meno le regole attese attorno alle quali lo strumento è stato progettato. Le seguenti regole devono essere seguite e utilizzate come controlli di qualità quando si utilizzano gli script Python forniti. Per prima cosa, assicurati che le maschere aperte siano linee blu su sfondo bianco. Il blu è stata una decisione arbitraria e non ha importanza, ma gli script che esegueno la trasformata LCPC sono stati scritti per cercare pixel blu su uno sfondo bianco. In secondo luogo, non eseguire gli script di trasformazione LCPC su immagini che hanno spazi bianchi inferiori a 10 pixel su tutti e quattro i lati. Guarda questo video per una spiegazione del perché: "Il parametro di spessore del margine - Come preparare i contorni delle forme^"33. In terzo luogo, questo script presuppone che i contorni del tuo oggetto siano pixel blu su uno sfondo bianco. Lo spessore della linea dovrebbe essere compreso tra 5 e 10 pixel. Guarda questo video per una spiegazione del perché: "Il parametro dello spessore della linea - Come preparare i contorni delle forme^"34. Quarto, non eseguire gli script di trasformazione LCPC su immagini vuote. Questo causerà un errore nello script. Quinto, non eseguire gli script di trasformazione LCPC su immagini che consistono solo in un puntino di detriti. Questo causerà un errore perché il sistema a griglia potrebbe non rilevare il speck e quindi tentare di analizzare un'immagine vuota. Sesto, non eseguire gli script di trasformazione LCPC su immagini che contengono puntini di detriti indesiderati. I detriti altereranno l'altezza e la larghezza dell'oggetto con maschera aperta e quindi causeranno risultati imprecisi. Settimo, guarda questo video per capire perché è importante comprendere la scala dei tuoi oggetti prima di analizzarli con la trasformata LCPC: "Il parametro di scala - Come preparare i contorni delle forme^"35.

Uno degli aspetti più sorprendenti della trasformata LCPC è la sua capacità di catturare il contesto spaziale. La biologia è ricca di contesto spaziale cruciale per comprendere la natura. Ad esempio, le cellule epiteliali hanno polarità^{apicale-basale} 36,37,38,39. Inoltre, la direzione della gravità, che viene alterata in condizioni di microgravità, ha effetti significativi sia sulla fisiologia degli^{astronauti 40,41} sia sulla morfologia delle cellule^tumorali 42,43,44. Infine, la preneoplasia e la neoplasia in situ possono crescere in lumens tramite un fusto che funge da struttura di supporto centrale, fornendo accesso all'apporto sanguigno. Quindi, quando queste lesioni regrediscono, regrediscono sia lontano dalla cavità luminale sia verso il fusto^45,46. Poiché è stata progettata per farlo, la trasformata LCPC è altamente sensibile al contesto spaziale e può quindi introdurre un'eterogeneità extra se l'utente non è attento. La Figura 6 descrive come orientare sistematicamente le forme prima di applicare la trasformata LCPC. La Figura 7 descrive come la geometria tradizionale non possa misurare concetti di forma che sono ovvi agli esseri umani. La Figura 8 fornisce un diagramma che visualizza la differenza tra misurare la forma pura e la forma in scala. La Figura 9 descrive che il contesto spaziale viene spesso trascurato quando si quantificano forme in cultura 2D, istologia e slice 2D dall'imaging 3D. Si noti che, a causa di limitazioni di spazio, il File Supplementare 1 contiene una discussione estesa sulla Figura 6 e la Figura 7 nella Sezione 5, e sulla Figura 8 e la Figura 9 nella Sezione 6.

Poiché la FFT produce dati spettrali multidimensionali, è importante che l'utente si senta a proprio agio nel derivare indici da pattern ricorrenti negli spettri. Sebbene questo manoscritto si riferisca alla trasformata LCPC come includendo il passaggio dell'applicazione della FFT, la trasformazione effettiva della LCPC avviene prima del passaggio FFT (Figura 1A–B Passo 4, Figura 2A–B Passo 3). Tuttavia, l'applicazione della FFT rivela intuizioni oggettive e sistematiche dal dominio della frequenza dell'output della trasformata LCPC. Pertanto, la trasformata LCPC non sarebbe altrettanto efficace senza includere la FFT come passaggio finale. Nella trasformata LCPC, la FFT produce una serie di bin e le loro grandenze, tutti rappresentati staticamente multidimensionali dell'ingresso del contorno nello Step 1. Un'analogia di una rappresentazione statica multidimensionale dell'informazione è il numero di telefono a nove cifre che rappresenta il canale di comunicazione telefonica di una persona negli Stati Uniti. Sebbene ingombranti rispetto alle rappresentazioni scalari delle forme (come 85 cm di lunghezza, 56 gradi di larghezza, ecc.), i dati multidimensionali contengono molte più informazioni per estrarre insight. La Figura 10 mostra diversi pattern spettrali osservati applicando la trasformata LCPC e come derivare gli indici da essi. La sezione 4 del Fascicolo Supplementare 1 discute la Figura 10 in modo più approfondito.

Il dominio della frequenza della trasformata LCPC rivela caratteristiche oggettive e quantitative di una forma 2D che a occhio nudo non può percepire facilmente. Differenze molto sottili di curvatura, frastagliamento e tortuosità possono essere quantificate in modo robusto. Tuttavia, una volta identificati i sottotipi morfologici tramite questo metodo, si possono osservare temi visivamente distinti che si correlano con le differenze quantitative. Questa caratteristica rende la trasformata LCPC interpretabile come metodo per estrarre informazioni spaziali per modelli di machine learning (ML) e rende i modelli ML risultanti più interpretabili. Sebbene le reti neurali siano un potente metodo di ML, i loro risultati spesso non sono interpretabili dall'essere umano, il che rappresenta un problema significativo per il campo dell'intelligenza artificiale medica (IA). I medici sono riluttanti a utilizzare un modello ML per le decisioni cliniche se non comprendono perché il modello prende decisioni sbagliate. Inoltre, se nessun essere umano capisce perché o come un modello abbia preso una decisione di parte, allora risolvere questo problema diventa irrisolvibile.

Vale la pena aggiungere alla discussione sulla misurazione della densità della texture (Figure 4 e 5) che l'occhio umano è facilmente confuso da illusioni ottiche o motivi disordinati. L'organizzazione disordinata di schemi complessi è spesso interpretata come casuale, non misurabile o non degna di essere misurata. La trasformata LCPC può misurare differenze riproducibili, oggettive e quantitative in schemi apparentemente casuali. Tuttavia, a meno che l'utilizzatore non sia addestrato a non lasciarsi ingannare da schemi caotici e disordinati che si mascherano da casualità, non si tenterà di misurare il disturbo per scoprire schemi prevedibili. I modelli prevedibili sono un chiaro segnale che il sistema non è completamente casuale. La trasformata LCPC è stata inventata con lo scopo di misurare forme che sono sottilmente diverse o inconcepibilmente diverse a occhio nudo. Poiché molte morfologie in natura presentano differenze minori che sembrano più eterogeneità caotica priva di significato che sottotipi prevedibili di disturbo – ciascuno correlato a funzioni biologiche distinte – è stato sviluppato il seguente quadro concettuale "a quattro fasi" per essere utilizzato insieme alla trasformata LCPC. Innanzitutto, resisti all'idea che un sistema dall'aspetto complicato sia casuale. In secondo luogo, chiamare l'eterogeneità caotica "disturbo" e poi trovare un tipo di ordine che possa servire come condizione di riferimento razionale. Ipotizzare che il disturbo si discosti dal riferimento. Terzo, trovare un modo per misurare oggettivamente il pattern che è il riferimento, come la trasformata LCPC. Quarto, applicare questo stesso metodo oggettivo per misurare ciò che viene considerato il disordine nel sistema.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Add 100 pixels to margins.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html	Used the NearestNeighbors function within the sklearn.neighbors package
BLUE_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Chamfer Distance via scipy version 1.15.1	SciPy	https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html	Used cKDTree function within scipy.spatial package
Cliff's Delta	Tissue Spatial Geometrics Lab	https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta	Created an implementation of Cliff's Delta via the Python language
Enlarge Image Size by 3X.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Fiji/ImageJ v2.14.0	ImageJ.net	https://imagej.net/
Flip images HORIZontally.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Flip images VERTically.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
GREEN_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Isolate Objects Empty Blue.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
MacOS Preview Version 11.0	Apple Inc	https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac
Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Microsoft Paint	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint	Was mentinoed as a potential useful tool for manual segmentation, but not used in this study
Microsoft Powerpoint Version 16.109.3	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc
PINK_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html	Used the PCA function with the sklearn.decomposition package
RED_Color Extraction (Mac).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
RED_Color Extraction (Windows).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate Green Line_v3.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CCW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Thicken Blue Lines.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Trim margin to 1-pixel border.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook