Lo scopo di questo studio era identificare i principali componenti attivi di Coptis chinensis e chiarire la sua azione nell'intervento della paralisi cerebrale (CP) tramite ultrafiltrazione di affinità e verifica sperimentale.
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Lo scopo di questo studio era identificare i principali componenti attivi di Coptis chinensis e chiarire la sua azione nell'intervento della paralisi cerebrale (CP) tramite ultrafiltrazione di affinità e verifica sperimentale.
Lo scopo di questo studio era identificare i componenti attivi chiave di Coptis chinensis e chiarire i suoi meccanismi d'azione nell'intervento della paralisi cerebrale (PC) tramite l'ultrafiltrazione per affinità. Utilizzando l'acetilcolinesterasi (AChE) come bersaglio, la coptisina è stata selezionata dall'estratto di C. chinensis come componente con la maggiore capacità di legame, che ha mostrato un tasso di legame del 21,9% e un'attività inibitoria significativa in vitro (IC₅₀ = 3,24 μg/mL). Le simulazioni di docking molecolare e dinamica molecolare hanno dimostrato che la coptisina poteva legarsi stabilmente alla tasca attiva di AChE. Successivamente, sono stati condotti esperimenti di verifica su un modello neonatale di ratto per danni cerebrali ipossico-ischemici (HIBD). I risultati hanno mostrato che l'intervento con coptisina (10 mg/kg) ha migliorato significativamente l'apprendimento spaziale e i deficit di memoria negli animali modello, aumentato il flusso sanguigno cerebrale nell'emisfero lesionato, alleviato i danni patologici ai tessuti cerebrali e inibito l'attivazione anomala dell'AChE nel cervello. In sintesi, questo studio ha combinato la tecnologia di ultrafiltrazione affine e ha confermato che la coptisina, identificata dall'estratto di C. chinensis, può inibire l'AChE ed esercitare effetti neuroprotettivi e effetti di miglioramento del flusso sanguigno cerebrale. Essa rappresenta la base materiale chiave per C. chinensis per mitigare i deficit neurologici simili alla CP, fornendo così molecole candidate e prove scientifiche per lo sviluppo di farmaci correlati.
La paralisi cerebrale (PC) è una sindrome permanente causata da danni non progressivi al cervello in via di sviluppo di feti o neonati, caratterizzata principalmente da disfunzioni motorie e anomalie posturali. Sebbene attualmente siano disponibili molteplici approcci terapeutici clinici per la paralisi cerebrale, rimane la mancanza di farmaci ideali in grado di riparare fondamentalmente i deficit neurologici con effetti collaterali minimi. A differenza dei farmaci chimicamente sintetizzati, che solitamente agiscono su singoli bersagli e presentano un potenziale tossico relativamente elevato, le medicine tradizionali cinesi (MTC), con i loro vantaggi di regolamentazione multicomponente, multi-bersaglio e olistica, nonché i profili di sicurezza favorevoli dimostrati nella pratica clinica a lungo termine, offrono nuove intuizioni e un serbatoio di candidati farmaci per il trattamento di disturbi cerebrali complessi1, 2,3,4,5,6. Pertanto, esplorare componenti chimici altamente efficaci e a bassa tossicità provenienti dalle MTC ha un significativo significato scientifico e un valoreclinico significativo 7.
Tra i complessi meccanismi patologici della paralisi cerebrale, la disfunzione del sistema nervoso colinergico svolge un ruolo fondamentale 8,9. L'acetilcolinesterasi (AChE) è un enzima chiave che idrolizza il neurotrasmettitore acetilcolina (ACh). Un'attività eccessivamente alta di questo enzima porta alla deplezione dell'ACh, compromette la trasmissione del segnale colinergico e di conseguenza aggrava il controllo motorio e le disfunzioni cognitive. Pertanto, l'AChE è emerso come un importante e ben consolidato bersaglio farmacologico per lo sviluppo di agenti neuroprotettivi. Inibire l'attività dell'AChE per aumentare i livelli di ACh nella fissura sinaptica è riconosciuto come una delle strategie efficaci per alleviare i deficit neurologici correlati alla PC. Nel contesto della lesione cerebrale ipossico-ischemica, la perturbazione della neurotrasmissione colinergica può aggravare ulteriormente la disfunzione neuronale, contribuendo così a deficit motori e cognitivi rilevanti per la PC. Pertanto, l'AChE è stata selezionata in questo studio non solo come bersaglio neurofunzionale classico, ma anche come punto di ingresso meccanicicamente rilevante per lo screening di composti bioattivi con potenziali effetti anti-CP.
Ricerche moderne hanno dimostrato che le piante medicinali hanno una vasta gamma di valori di attività farmacologica. Come medicina tradizionale cinese classica per eliminare il calore e l'asciugare dell'umidità, Coptis chinensis costituisce un sistema complesso ricco di vari alcaloidi isochinolini. Oltre alla ben nota berberina, contiene anche una serie di componenti con strutture simili e attività farmacologiche diverse, come coptisina, epiberberina, palmatina ejatrorrhizina 10. Questi alcaloidi costituiscono collettivamente la base materiale degli effetti farmacologici di C. chinensis. Studi precedenti hanno dimostrato che C. chinensis e i suoi alcaloidi possiedono proprietà antinfiammatorie, antiossidanti e potenziali proprietà neuroprotettive. Tuttavia, dato un sistema di componenti così complesso, i metodi di ricerca tradizionali sono difficili da identificare rapidamente e con precisione i principali componenti attivi che colpiscono direttamente l'AChE, il che limita notevolmente l'elucidazione approfondita dei meccanismi alla base degli effetti di C. chinensis sulla lesionecerebrale 11.
Rispetto all'isolamento guidato dall'attività convenzionale, che di solito richiede frazionamenti ripetuti, test di bioattività e purificazione e può portare alla perdita o alla trascuratezza di composti di bassa abbondanza ma alta affinità, l'ultrafiltrazione per affinità consente uno screening rapido dei liganti di legame al bersaglio direttamente da miscele complesse. Questa tecnica consente una pesca efficiente e rapida di liganti attivi che si legano a obiettivi specifici (ad esempio, AChE) direttamente dagli estratti di greggio multicomponente delle MTC. È particolarmente adatto per sistemi con componenti alcaloidi multipli, come C. chinensis, permettendo l'identificazione accurata dei componenti efficaci che interagiscono direttamente con il bersaglio dalla miscelacomplessa 12. Combinato con approcci computazionali che includono l'aggancio molecolare e le simulazioni di dinamica molecolare, può prevedere intuitivamente la modalità di legame, i tipi di interazione e la complessa stabilità tra componenti e proteine target a livello atomico, fornendo così solide prove teoriche e spiegazioni meccanicistiche per i risultati dello screeningsperimentale 13.
Sulla base di quanto sopra, questo studio propone la seguente ipotesi scientifica: tra i vari alcaloidi presenti in C. chinensis, esistono componenti attivi che possono inibire specificamente l'AChE, e questi componenti costituiscono la base materiale per i suoi potenziali effetti anti-paralisi cerebrali. Per verificare questa ipotesi, abbiamo integrato tecniche di screening moderne con metodi di validazione farmacologica: innanzitutto, utilizzando AChE come bersaglio, è stata impiegata la tecnologia di ultrafiltrazione per affinità per selezionare rapidamente potenziali inibitori dall'estratto multi-alcaloide di C. chinensis; Inoltre, sono state utilizzate simulazioni di aggancio molecolare e dinamica molecolare per chiarire il meccanismo di legame a livello atomico; Infine, sono stati condotti esperimenti su animali in vivo per verificare gli effetti miglioranti dei componenti sottoposti allo screening sul comportamento, sulla patologia del tessuto cerebrale e sull'attività AChE dei ratti con PC.
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Tutte le procedure per il benessere animale e le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Etico per il Benessere degli Animali di Laboratorio del Primo Ospedale Popolare di Zunyi (Etica n. 2025-2-362). Durante il periodo di modellazione e trattamento, le condizioni corporee e la sopravvivenza degli animali venivano registrate quotidianamente.
Preparazione dell'estratto di C. chinensis
In questo studio, è stato utilizzato un estrattore accelerato di solventi per l'estrazione accelerata della frazione di n-butanolo da materiali medicinali di C. chinensis . Un totale di 1 g di polvere secca di C. chinensis è stato pesato accuratamente e inserito in celle di estrazione di 40 mL, rispettivamente. Guarnizioni metalliche e membrane filtranti in fibra di vetro venivano posizionate sequenzialmente sopra e sotto la cella di estrazione per filtrare il campione, e il campione veniva avvolto con sabbia di quarzo. Durante il processo di estrazione, temperatura e pressione sono state impostate rispettivamente a 90 °C e 100 bar. L'estratto accelerato veniva raccolto e il solvente per l'estrazione veniva evaporato fino a diventare secco utilizzando un evaporatore rotativo per ottenere estratti essiccati di diverse frazioni polari. Metanolo:acqua (50:50, v/v) è stato scelto come solvente per la ricostituzione. L'estratto è stato filtrato attraverso una membrana microporosa da 0,45 μm e conservato a 4 °C. Prima della rilevazione del campione, è stata indagata l'attività inibitoria del solvente di ricostituzione a vuoto sull'AChE. I risultati hanno mostrato che il suo effetto inibitorio era trascurabile, indicando che la selezione del solvente di ricostituzione in questo esperimento non avrebbe influenzato i risultati sperimentali.
Saggio di inibizione dell'acetilcolinesterasi
L'esperimento è stato condotto su una piastra a 96 pozzi. Prima è stato aggiunto PBS, seguito da campioni di AChE (0,1 U/mL) e C. chinensis in sequenza. Dopo l'incubazione a 37 °C per 10 minuti, sono stati aggiunti 5,5′-Dithiobis (2-nitrobenzoico acido) (DTNB) soluzione cromogenica (2,5 mmol/mL) e substrato ATChI (10 mmol/mL). La miscela è stata incubata a 37 °C per altri 10 minuti, e la reazione è stata terminata aggiungendo 60 μL di dodecile solfato di sodio (SDS) al 1%. L'assorbanza è stata misurata a 405 nm. Ogni campione di C. chinensis è stato composto da 4 gruppi: gruppo di controllo a: PBS (120 μL), soluzione AChE (20 μL), soluzione DTNB (40 μL), soluzione ATChI (40 μL) e soluzione SDS (60 μL) sono stati aggiunti in sequenza; Gruppo di controllo vuoto b: PBS (120 μL), soluzione DTNB (40 μL), soluzione ATChI (40 μL) e soluzione SDS (80 μL); Gruppo campione c: PBS (80 μL), estratto di C. chinensis (20 μL), soluzione AChE (20 μL), soluzione DTNB (40 μL), soluzione ATChI (40 μL) e soluzione SDS (60 μL); Campione di gruppo bianco d: PBS (100 μL), estratto di C. chinensis (20 μL), soluzione DTNB (40 μL), soluzione ATChI (40 μL) e soluzione SDS (60 μL). L'Huperzina A è stata utilizzata come controllo positivo con una concentrazione iniziale di circa 2,5 mg/mL. La concentrazione iniziale dell'estratto della frazione di n-butanolo era di circa 1 mg/mL. Sia huperzina A che i campioni sono stati diluiti con un gradiente del 60%. Il tasso di inibizione è stato calcolato utilizzando la seguente formula: Tasso di inibizione (%) = [1 - (c - d)/(a - b)] × 100%, dove rispettivamente a, b, c e d rappresentano i valori di assorbanza del gruppo di controllo a, del gruppo di controllo vuoto b, del gruppo campione c e del gruppo del campione vuoto d.
Il tasso inibitorio a ciascuna concentrazione testata è stato calcolato utilizzando la formula descritta sopra. Le curve concentrazione-inibizione sono state quindi costruite tracciando il tasso inibitorio rispetto al logaritmo della concentrazione del composto. I valori di IC20, IC50 e IC80 sono stati calcolati tramite adattamento di regressione non lineare utilizzando il software GraphPad Prism basato sulle curve concentrazione-risposta adattate, e sono stati definiti come le concentrazioni necessarie a produrre rispettivamente un'inibizione del 20%, 50% e 80% dell'attività AChE.
Saggio di ultrafiltrazione per affinità
È stata eseguita un'ultrafiltrazione di affinità per selezionare i composti leganti l'AChE dall'estratto di C. chinensis . In breve, la soluzione AChE (0,1 U/mL in PBS, pH 7,4) è stata utilizzata come enzima attivo. Il controllo enzimatico inattivato è stato preparato riscaldando la stessa soluzione di AChE in un bagno d'acqua bollente per 10 minuti. Per ogni reazione, 200 μL di soluzione di estratto di C. chinensis sono stati miscelati con 200 μL di soluzione attiva o inattivata di AChE e incubati a 37 °C per 30 minuti. Dopo l'incubazione, la miscela è stata trasferita in un tubo centrifugo di ultrafiltrazione da 30 kDa e centrifugata a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C. Il complesso enzima-ligando trattenuto è stato lavato tre volte con 200 μL di PBS nelle stesse condizioni di centrifugazione per rimuovere i componenti non legati. Successivamente, sono stati aggiunti 200 μL di metanolo al 90% per dissociare ed eluire i liganti legati all'AChE, seguiti da incubazione per 10 minuti e centrifugazione a 12.000 × g per 10 minuti. L'eluato veniva raccolto, filtrato e analizzato tramite cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). I composti arricchiti nel gruppo enzimatico attivo rispetto al controllo enzimatico inattivato erano considerati componenti potenziali di legameall'AChE 14.
Analisi HPLC dei principali alcaloidi metaboliti
L'analisi cromatografica è stata effettuata utilizzando un sistema HPLC dotato di pompa quaternaria, autocampionatore, forno a colonna e rivelatore ultravioletto-visibile (UV-Vis). La separazione è stata ottenuta su una colonna cromatografica C18 (250 × 4,6 mm, 5 μm) mantenuta a 25 °C. La fase mobile era composta da acetonitrile (A) e una soluzione di bicarbonato di ammonio da 30 mmol/L contenenti lo 0,7% di ammoniaca e lo 0,25% di trietilamine (B), erogata a una portata di 1,0 mL/min. Il programma di eluzione gradiente era il seguente: 0–15 minuti, 90%–75% B; 15–25 minuti, 75%–70% B; 25–50 minuti, 70%–55% B. Il volume di iniezione era di 5 μL e il rilevamento UV veniva eseguito a 270 nm.
Per l'analisi quantitativa dei principali alcaloidi in C. chinensis, ogni campione (0,02 g) è stato pesato con precisione ed estratto a ultrasuoni con 10 mL di soluzione di acido cloridrico-metanolo (1:100, v/v) per 30 minuti. Dopo la filtrazione, la perdita di peso veniva compensata con lo stesso solvente di estrazione del peso originale, e la soluzione finale veniva filtrata attraverso una membrana da 0,45 μm prima dell'analisi HPLC. Otto standard di riferimento autentici, tra cui magnoflorina, glaucina, jatrorrizina, columbamina, epiberberina, coptisina, palmatina e berberina, sono stati analizzati nelle stesse condizioni cromatografiche. Sono state costruite curve di calibrazione per questi analiti utilizzando soluzioni di riferimento. Poiché i livelli di abbondanza e le risposte dei rivelatori degli otto alcaloidi differivano notevolmente, l'intervallo di calibrazione per ciascun analita è stato ottimizzato individualmente in base a rapporti letterari ed esperimenti preliminari, piuttosto che applicare uno schema identico di diluizione a tutti i composti. Pertanto, i rapporti di concentrazione alta-bassa degli intervalli lineari non erano previsti identici tra gli otto aliti. I limiti di rilevamento (LOD) e i limiti di quantificazione (LOQ) sono stati stimati con rapporti segnale-rumore di circa 3 e 10, rispettivamente.
Per l'analisi degli eluati di ultrafiltrazione di affinità, i liganti dissociati dall'AChE dopo l'ultrafiltrazione sono stati raccolti da esperimenti ripetuti e concentrati prima dell'analisi HPLC per garantire un'intensità del segnale adeguata per la rilevazione. Gli eluati concentrati sono stati poi analizzati utilizzando le stesse condizioni HPLC descritte sopra. I picchi cromatografici negli eluati sono stati assegnati tramite confronto mirato con gli otto standard di riferimento autentici e con il profilo cromatografico dell'estratto di C. chinensis ottenuto in condizioni analitiche identiche. Pertanto, la presente analisi non era destinata all'elucidazione strutturale de novo di composti sconosciuti, ma alla determinazione mirata se gli alcaloidi principali noti in C. chinensis fossero arricchiti nell'enzima attivo eluato rispetto al controllo dell'enzima inattivato.
Saggio di attracco molecolare
Nel presente studio, l'analisi del docking si è concentrata sulla coptisina perché è stata identificata come il costituente di legame AChE di maggior rango per ultrafiltrazione di affinità e ha anche mostrato la più forte attività inibitoria in vitro tra i principali alcaloidi. I cristalli proteici sono stati recuperati dalla Protein Data Bank (PDB). I cristalli proteici con liganti co-cristallizzati sono stati selezionati come recettori finali di aggancio, e tutti i cristalli proteici target sono stati derivati da esseri umani. Il file dei recettori veniva aperto usando il software PyMOL, e i file di recettori e liganti venivano separati e salvati; il recettore veniva aperto con il software MGLTools, seguito dalla rimozione delle molecole d'acqua, dall'aggiunta di atomi e cariche di idrogeno, dalla fusione degli atomi di idrogeno non polari, dal calcolo delle cariche atomiche locali, ecc., e poi salvato in formato pdbqt; il file ligando veniva aperto con il software MGLTools, venivano aggiunti atomi e cariche di idrogeno e salvato come file in formato pdbqt; La scatola della griglia fu aperta, la spaziatura impostata a 1.000, il numero di punti della griglia fu impostato, le coordinate dei punti centrali della scatola furono selezionate secondo il ligando co-cristallizzato e salvate come fileGPF 15,16.
Le strutture dei componenti chimici sono state inizialmente raccolte dal database SciFinder e salvate in formato cdx; ogni struttura molecolare tridimensionale veniva visualizzata utilizzando il modulo ChemBio3D Ultra, l'ottimizzazione energetica veniva eseguita con il campo di forza MM2, salvata in formato mol2 e i parametri di carica venivano rimossi. Utilizzando AutoDock, il file in formato mol2 veniva aperto con il software MGLTools, venivano aggiunti atomi e cariche di idrogeno al ligando, venivano osservati legami chimici rotanti e salvati come file in formato pdbqt. Il modello AutoDock Vina (versione 1.2.5) è stato applicato per eseguire la valutazione del docking molecolare.
Saggio di simulazione della dinamica molecolare
I software Gaussian 16 e GaussView 6 sono stati utilizzati per l'ottimizzazione della struttura dei ligandi. Dopo aver importato il file mol2 della struttura del ligando in GaussView 6, il tipo di compito fu impostato su Ottimizzazione, lo stato della molecola target fu selezionato come Stato fondamentale, il metodo di calcolo era la teoria del funzionale di densità (DFT), la molteplicità di spin era predefinita su Spin Predefinito, il funzionale usato era B3LYP, il modello del solvente era IEFPCM, E il solvente era acqua. Dopo il completamento dell'ottimizzazione della struttura molecolare, la Gaussian 16 veniva utilizzata per convertire il file chk generato in un file fch, che veniva poi importato nel software Multiwfn per calcolare la carica RESP del ligando.
Dopo il calcolo della carica RESP, il file chg generato veniva importato nel software sobtop_1.0 (dev5) per generare il file topologico dei liganti necessario per la simulazione della dinamica molecolare. La simulazione della dinamica molecolare è stata eseguita utilizzando il software GROMACS 2019.6 con il campo di forza AMBER99. I file strutturali della molecola proteica e della piccola molecola sono stati importati nel software, è stata stabilita una scatola triclinica con un bordo periodico di 1,0 nm e per il riempimento è stato utilizzato il modello d'acqua TIP3P. Il metodo Particle Mesh Ewald (PME) veniva impiegato per calcolare interazioni elettrostatiche a lungo raggio, e il comando gmx geion veniva usato per introdurre un numero appropriato di ioni sodio e ioni cloruro per neutralizzare la carica dell'intero sistema. La simulazione è stata eseguita a una temperatura costante di 298 K e a una pressione atmosferica standard di 100 kPa. Per la minimizzazione dell'energia, è stato implementato il metodo della discesa più ripida (ripida). I comandi gmx grompp e gmx mdrun sono stati utilizzati per eseguire 10.000 passi di equilibrio NVT (ensemble isotermico-isocorico) e equilibrio NPT (ensemble isotermico-isobarico), con la costante di accoppiamento di temperatura e la costante di accoppiamento di pressione impostate rispettivamente a 0,1 ps e 0,5 ps, e la durata della simulazione di equilibrio era di 100 ps. Dopo che il sistema raggiunse l'equilibrio, il passo temporale fu impostato a 2 fs e fu eseguita una simulazione della dinamica molecolare di 10 ns sul complesso, con dati di traiettoria salvati ogni 2 ps. La produzione di 10 ns è stata scelta come lunghezza esplorativa di simulazione per fornire una valutazione dinamica su scala temporale breve del complesso coptisina–AChE agganciato, piuttosto che un campionamento conformazionale esaustivo. Questa impostazione veniva utilizzata per valutare se il complesso dockato potesse mantenere una modalità di binding relativamente stabile nel tempo. I comandi gmx rms, gmx rmsf, gmx gyrate e gmx hbonds sono stati ulteriormente utilizzati per calcolare la deviazione quadratica media (RMSD), la fluttuazione quadratica media (RMSF), il raggio di giro della proteina, i legami idrogeno e l'area superficiale accessibile al solvente. QTgrace è stato utilizzato per la visualizzazione dei risultati.
Verifica degli esperimenti sugli animali
Sono stati selezionati diciotto cuccioli di ratto neonatali sani di Sprague-Dawley (SD) (7 giorni postnatale) di entrambi i sessi. Tutti gli animali sperimentali erano ospitati in una struttura sperimentale specifica per animali privi di patogeni (SPF). Questa struttura era dotata di un rigido sistema di barriera, che poteva prevenire efficacemente l'invasione di microrganismi e parassiti. I parametri ambientali della stanza abitativa venivano monitorati e regolati automaticamente da un sistema di controllo centrale: temperatura 22 ± 2 °C, umidità relativa 55% ± 10%, ciclo luminoso di 12 ore e ciclo di luce di 12 ore di luce e 12 ore di buio. Un modello neonatale di ratto di danno cerebrale ipossico-ischemico (HIBD) modificato con il classico metodo Rice-Vannucci è stato utilizzato per simulare le caratteristiche patologiche e comportamentali della PC.
In breve, i cuccioli di ratto postnatali al settimo giorno sono stati anestetizzati con il 2–3% di isoflurano per l'induzione e l'1–2% per il mantenimento. Dopo un'adeguata anestesia, è stata effettuata un'incisione cervicale nella linea mediana e l'arteria carotide comune sinistra è stata accuratamente isolata e legata permanentemente. L'incisione è stata poi suturata, e i cuccioli sono stati lasciati recuperare su un tappetino riscaldante per 1 ora. Successivamente, i cuccioli del gruppo modello e coptisina sono stati esposti all'ipossia in una camera contenente 8% di O₂ bilanciato con il 92% di N₂ per 2 ore a 37 °C, inducendo una lesione cerebrale ipossico-ischemica. Gli animali operati da simulazione hanno subito la stessa anestesia ed esposizione chirurgica senza legatura carotide o trattamento ipossico. Dopo l'ipossia, i cuccioli sono stati restituiti alle madri e monitorati quotidianamente per le condizioni generali, la sopravvivenza e il comportamento alimentare durante tutto il periodo sperimentale.
I ratti sperimentali sono stati divisi casualmente in 3 gruppi: gruppo Sham: solo l'arteria carotide comune sinistra è stata separata senza legatura o trattamento per l'ipossia, e un volume uguale di solvente è stato somministrato postoperatoriamente; Gruppo modello: è stato eseguito un intervento chirurgico di modellazione del danno cerebrale ipossico-ischemico e somministrato un volume uguale di solvente postoperatorio; Gruppo coptisina: dopo la modellazione, coptisina (10 mg/kg) è stata somministrata tramite gavage. La dose di coptisina (10 mg/kg) è stata selezionata come dose in vivo sulla base di studi in vivo/farmacocinetici precedentemente riportati sulla coptisina17. I farmaci sono stati somministrati una volta al giorno a un orario fisso per 14 giorni consecutivi di intervento.
Rilevamento degli indicatori animali
L'attrezzatura di test del labirinto d'acqua Morris (MWM) consisteva in una grande piscina d'acqua circolare (diametro circa 150 cm) con evidenti segnali visivi sulla parete della piscina. L'acqua della piscina era stratificata in un bianco opaco e lattiginoso e la temperatura dell'acqua era controllata a 23 ± 1 °C. Una piattaforma trasparente fu posizionata nel quadrante bersaglio, sommersa a 1–2 cm sotto la superficie dell'acqua. L'addestramento veniva condotto quattro volte al giorno: gli animali venivano messi in acqua rivolti verso la parete della piscina da quattro diversi punti di ingresso sulla parete, e veniva registrato il tempo necessario per trovare e salire sulla piattaforma nascosta dall'ingresso in acqua, ovvero la "latenza di fuga". Ogni sessione di addestramento era limitata a 60 secondi. Se l'animale trovava la piattaforma entro 60 secondi, poteva rimanere sopra per 15 secondi per consolidare la memoria. Se non veniva trovato, l'animale veniva guidato delicatamente verso la piattaforma e lasciato restare per 15 secondi. Dopo 7 giorni di addestramento, la piattaforma nascosta fu rimossa. Gli animali venivano messi in acqua dal punto d'ingresso opposto alla piattaforma originale e lasciati nuotare liberamente per 60 secondi, mentre la traiettoria di nuoto veniva registrata da un sistema video. Durante il test MWM, sono stati registrati indicatori come la latenza media di fuga, il tempo trascorso nel quadrante bersaglio e il numero di attraversamenti sulla posizione originale della piattaforma.
Per la rilevazione con contrasto laser di macchie (LSCI): dopo l'anestesia, i ratti venivano fissati su uno strumento stereotassico e il cranio veniva esposto e mantenuto umido. Un sistema laser di imaging a flusso sanguigno speckle veniva utilizzato per raccogliere continuamente immagini raw di speckle per 30 secondi direttamente sopra il cranio. È stato utilizzato un software professionale per convertire il contrasto di speckle a variazione spaziale temporale in una mappa di distribuzione dell'unità di perfusione del flusso sanguigno cerebrale (PU). Per l'analisi quantitativa, è stato selezionato un ROI corticale delineato manualmente all'interno dell'emisfero ipsilaterale esposto in ogni immagine in base all'area di perfusione corticale rilevante per la lesione e ai punti di riferimento anatomici visibili, e il valore medio di perfusione all'interno di questo ROI è stato utilizzato per il confronto tra gruppi.
Sono stati raccolti tessuti cerebrali e è stato aggiunto PBS pre-raffreddato secondo il rapporto peso-volume. L'omogeneizzazione meccanica fu eseguita sul ghiaccio, seguita dalla centrifugazione a 8000 × g a 4 °C per 10–15 minuti, e il soprantantante fu raccolto per i test. I tessuti cerebrali sono stati rapidamente inseriti in paraformaldeide al 4% per la fissazione per più di 24 ore al fine di mantenere la morfologia tissutale. La colorazione con ematossilina-eosina (HE) è stata eseguita tramite operazioni come disidratazione, pulizia e immersione della paraffina, e il grado di lesione cerebrale è stato osservato al microscopio ottico.
Per la misurazione dell'attività dell'AChE, la corteccia cerebrale dell'emisfero lesionato (ipsilaterale) è stata raccolta e omogeneizzata secondo le istruzioni del produttore. I campioni di tessuto sono stati omogeneizzati in tampone di estrazione e centrifugati a 8000 × g per 10 minuti a 4 °C, e il soprannatante è stato raccolto per l'analisi. L'attività dell'AChE è stata determinata utilizzando un kit commerciale di analisi dell'attività dell'acetilcolinesterasi (metodo micropiastra e colorimetrico). Questo saggio si basa sull'idrolisi dell'acetilcolina tramite AChE, seguita da una reazione con DTNB per generare un prodotto cromogenico, e l'assorbanza è stata misurata a 412 nm per il calcolo dell'attività enzimatica. Poiché questo kit è un test colorimetrico basato sull'attività enzimatica e non un kit convenzionale di immunosorbente legato agli enzimi quantificatori degli antigeni (ELISA), il produttore non ha fornito un intervallo standard di rilevamento e sensibilità analitica. Nel presente studio, i valori misurati di attività AChE nel tessuto corticale si trovavano approssimativamente nell'intervallo di 25–80 nmol/min/mg di proteina.
Analisi statistica
Tutti i dati sperimentali sono stati espressi come deviazione media ± standard (SD) e analizzati utilizzando il software GraphPad Prism. I confronti tra i gruppi sono stati effettuati utilizzando l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguita dal test di confronto multiplo di Tukey. Per il test del labirinto d'acqua di Morris, il risultato finale dell'addestramento e i parametri della prova con la sonda sono stati analizzati utilizzando ANOVA unidirezionale seguiti dal test di confronto multiplo di Tukey. Un valore di P < 0,05 è stato considerato statisticamentesignificativo 18. La correlazione tra la perfusione del flusso sanguigno cerebrale nel ROI e l'attività AChE nella corteccia cerebrale ipsilaterale è stata analizzata tramite l'analisi di correlazione di Pearson. Un valore di P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
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Analisi dei componenti chimici nell'estratto di C. chinensis
Gli alcaloidi sono i principali componenti accumulati e anche i principali componenti attivi dei materiali medicinali di C. chinensis . In questo studio, la tecnologia cromatografica è stata utilizzata per analizzare i principali componenti chimici in C. chinensis (Figura 1A). Come mostrato nella Tabella 1, tutti e otto gli analiti han...
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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.
Questo lavoro è stato supportato dal Progetto Piano Scientifico e Tecnologico Zunyi (Zunshi Kehe Support HZ (2020) No. 110).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) | CATO Research Chemicals Inc. | 416046844 | Assay di inibizione dell'acetilcolinesterasi |
| Acetilcolinesterasi (AChE) | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd | C1682 | Assay di inibizione dell'acetilcolinesterasi |
| Acetiltiocolina ioduro (ATChI) | Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd | 1037408 | Assay di inibizione dell'acetilcolinesterasi |
| Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific Inc | 1162577 | Fase mobile per cromatografia liquida |
| AutoDock Vina | AutoDock | Versione 1.2.5 | |
| Standard di Berberina | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | 110713-201814 | Analisi della composizione chimica |
| Standard di Columbamina | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180712 | Analisi della composizione chimica |
| Standard di Coptisina | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180309 | Analisi della composizione chimica |
| Estrattore accelerato di solventi E-916 | Büchi Labortechnik AG, Switzerland | E916-008 | Estratto della frazione di n-butanolo |
| Standard di Epiberberina | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180309 | Analisi della composizione chimica |
| Acido formico | Thermo Fisher Scientific Inc | 1270563 | Fase mobile per cromatografia liquida |
| GaussView 6 | Gaussian | https://gaussian.com/gaussview6/ | |
| Standard di Glaucina | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180615 | Analisi della composizione chimica |
| Standard di Jatrorrizzina | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180607 | Analisi della composizione chimica |
| Standard di Magnoflorina | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180205 | Analisi della composizione chimica |
| Metanolo | Thermo Fisher Scientific Inc | 1162578 | Fase mobile per cromatografia liquida |
| Membrana microporosa | Millipore Filter Company | 2139547 | Filtrazione degli estratti |
| Standard di Palmatina | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180226 | Analisi della composizione chimica |
| Prism | GraphPad | https://www.graphpad.com/ | |
| PyMOL | PyMOL | https://pymol.org/ | |
| Carbonato di sodio | Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd | 15138805 | Assay di inibizione dell'acetilcolinesterasi |
| Solfato di sodio dodecilico (SDS) | Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd | 11019349 | Assay di inibizione dell'acetilcolinesterasi |