Gli esosomi derivati dalla placenta mitigano l'apoptosi dei trofoblasti indotta dall'ipossia e la progressione infiammatoria tramite SASH1

Sommario

La proteina 1 contenente i domini SAM e SH3 (SASH1) è identificata come un regolatore chiave dell'apoptosi e dell'infiammazione dei trofoblasti nella preeclampsia (PE). Gli esosomi derivati dalla placenta (P-EXOS) attenuano il danno indotto dall'ipossia sopprimendo l'espressione di SASH1. Questi risultati rivelano un nuovo meccanismo alla base della patogenesi della PE e suggeriscono SASH1 come possibile bersaglio terapeutico.

Abstract

SASH1 è una proteina adattatrice di segnale coinvolta nella crescita cellulare, nell'apoptosi e nella regolazione immunitaria, ed è stata oggetto di crescenti studi in cellule tumorali e immunitarie. Evidenze emergenti suggeriscono che SASH1 svolge un ruolo importante nelle risposte infiammatorie e nell'omeostasi cellulare, processi strettamente associati allo sviluppo della PE. Questo studio si è proposto di determinare se SASH1 contribuisca all'apoptosi dei trofoblasti e alle risposte infiammatorie nella PE e se gli P-EXOS esercitino effetti protettivi attraverso la regolazione di SASH1. In questo studio, sono stati analizzati tre dataset trascrittomici associati alla PE (GSE75010, GSE10588 e GSE60438) per identificare geni differenzialmente espressi (DEG) comuni, seguiti da analisi di arricchimento per Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Sono stati inoltre applicati algoritmi di apprendimento automatico per selezionare geni candidati chiave, e sono stati utilizzati dati di sequenziamento dell'RNA a singola cellula per caratterizzare l'eterogeneità cellulare nel tessuto placentare e determinare i modelli di espressione specifici per tipo cellulare. SASH1 è stato identificato come gene candidato consensuale ed è risultato significativamente upregolato nelle cellule trofoblastiche provenienti da campioni di PE. In vitro, è stato sviluppato un modello cellulare di trofoblasto HTR-8/SVneo trattato con ipossia, combinato con silenziamento di SASH1, sovraespressione di SASH1 e co-coltura con P-EXOS. Esperimenti funzionali hanno mostrato che il silenziamento di SASH1 ha significativamente inibito l'apoptosi dei trofoblasti indotta dall'ipossia e ridotto la secrezione di citochine pro-infiammatorie, tra cui IL-6, IL-1β e TNF-α, mentre la sovraespressione di SASH1 ha promosso apoptosi e risposte infiammatorie. Inoltre, il trattamento con P-EXOS ha notevolmente ridotto l'espressione di SASH1 a livello di mRNA e di proteina e attenuato il danno trofoblastico indotto dall'ipossia, mentre la sovraespressione di SASH1 ha in gran parte annullato questi effetti protettivi. Nel complesso, questi risultati indicano che SASH1 svolge un ruolo cruciale nell'apoptosi dei trofoblasti e nelle risposte infiammatorie nella PE. Gli P-EXOS potrebbero alleviare il danno trofoblastico indotto dall'ipossia sopprimendo l'espressione di SASH1, fornendo nuove prospettive sui meccanismi molecolari e su potenziali bersagli terapeutici per la PE.

Introduzione

La PE è un disturbo multisistemico specifico della gravidanza che si verifica tipicamente dopo le 20 settimane di gestazione ed è clinicamente caratterizzata da ipertensione, proteinuria e disfunzione multiorgano. Essa rimane una delle principali cause di morbilità e mortalità materne e perinatali a livello mondiale¹. Nonostante i continui progressi nella gestione clinica, il trattamento definitivo della PE rimane il parto e l'espulsione della placenta, a dimostrazione della comprensione ancora incompleta della sua patogenesi e della necessità urgente di identificare nuovi meccanismi molecolari e cellulari, nonché potenziali bersagli terapeutici^2,3.

Un'adeguata invasione del trofoblasto e la promozione di uno sviluppo placentare normale sono meccanismi fondamentali alla base della patogenesi della PE⁴. Durante una gravidanza normale, le cellule trofoblastiche invadono la decidua uterina e rimodellano le arterie spirali per stabilire una circolazione a bassa resistenza e ad alta capacità. Un'invasione e una migrazione alterate delle cellule trofoblastiche portano a una ridotta perfusione placentare, determinando un ambiente persistente di ipossia e stress ossidativo. L'ipossia influisce direttamente sull'apoptosi cellulare, e il rilascio anomalo di mediatori pro-infiammatori altera l'omeostasi all'interfaccia materno-fetale, aggravando ulteriormente la disfunzione placentare⁵. L'infiammazione è inoltre un importante fattore scatenante della PE. Si è osservato che IL-17, IL-6 e TNF-α sono marcatamente aumentati nella placenta e nel sangue periferico dei pazienti con PE⁶. Ipossia e infiammazione si rafforzano reciprocamente, creando un circolo vizioso che amplifica l'infiammazione sistemica, provoca danni endoteliali e contribuisce ad anomalie placentari. Le reti molecolari sottostanti che regolano l'apoptosi del trofoblasto e le risposte infiammatorie rimangono in gran parte sconosciute.

SASH1 è un membro della famiglia di proteine tampone intracellulari SLy/SASH1 che funziona da adattatore di segnalazione⁷. SASH1 è stata principalmente caratterizzata come un soppressore tumorale che inibisce la transizione epitelio-mesenchimale (EMT), la migrazione cellulare e l'invasione attraverso interazioni con partner di segnalazione come CRKL e la via PI3K-Akt-mTOR^8,9. Oltre ai suoi ruoli di soppressore tumorale, evidenze emergenti suggeriscono che SASH1 partecipa alla segnalazione infiammatoria e alla regolazione immunitaria⁷. Tuttavia, l'espressione e la funzione di SASH1 nella placenta, in particolare nel contesto della biologia dei trofoblasti e della PE, non sono state ancora investigate.

Gli esosomi si sono affermati come importanti mediatori cellulari e vengono studiati con crescente attenzione nel contesto della gravidanza¹⁰. Gli esosomi trasportano diversi carichi bioattivi, inclusi proteine, lipidi e RNA non codificanti, per modulare la funzione delle cellule riceventi. Un numero crescente di evidenze suggerisce che gli P-EXOS svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione immunitaria durante la gravidanza e che la loro attività e il loro carico subiscono alterazioni significative nella PE, potenzialmente aggravando lo stato infiammatorio¹¹. Si è inoltre dimostrato che gli esosomi sono coinvolti nella regolazione dello stress ossidativo¹² e nell'angiogenesi¹³, esercitando potenzialmente effetti benefici nelle complicanze legate alla gravidanza. Tuttavia, i loro bersagli molecolari e i meccanismi d'azione nella PE non sono ancora completamente compresi.

Si è ipotizzato che SASH1 sia disregolato nella placenta con PE e svolga una funzione da fattore chiave nell'apoptosi dei trofoblasti e nelle risposte infiammatorie, e che gli P-EXOS possano esercitare effetti protettivi contro il danno ai trofoblasti modulando l'espressione di SASH1. Per verificare questa ipotesi, sono stati integrati diversi dataset trascrittomici di PE e dati di sequenziamento dell'RNA a singola cellula con apprendimento automatico basato su più algoritmi per identificare geni candidati chiave. Utilizzando un modello cellulare di trofoblasto HTR-8/SVneo trattato con ipossia e esperimenti di intervento basati sugli esosomi, è stato indagato il ruolo funzionale di SASH1 nella disfunzione del trofoblasto e il potenziale terapeutico degli P-EXOS nella PE.

Protocollo

Dichiarazione etica

Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Quarto di Shijiazhuang (Numero di approvazione: 20200031). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i donatori di tessuto placentare prima della raccolta dei campioni. Tutte le procedure che coinvolgevano partecipanti umani sono state condotte in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Una lista completa di reagenti, materiali di consumo, attrezzature e software utilizzati in questo protocollo è fornita nella Tabella dei Materiali.

Raccolta dei dati

I dati di RNA-seq sono stati ottenuti dal database GEO. I set di dati includevano GSE75010, che contiene dati di espressione genica provenienti da 157 placenti con PE e 173 placenti senza PE (N = 330). GSE10588 contiene dati di espressione genica da 26 placenti normali e 17 placenti con PE grave (N = 43). GSE60438 contiene dati di profilazione del trascrittoma della decidua basalis provenienti da pazienti con pre-eclampsia e da gravidanze normotesive (N = 125). I dati del trascrittoma monocellulare sono stati ottenuti dal set di dati GEO GSE183338. Esso include campioni di singoli nuclei dei villi coriali/interfaccia materno-fetale da gravidanze con PE e da gravidanze sane.

Analisi dei geni differenzialmente espressi

I DEG associati alla PE, i dataset GSE75010, GSE10588 e GSE60438 sono stati prima preelaborati e normalizzati. Successivamente, è stata effettuata un'analisi differenziale utilizzando il pacchetto R “limma”¹⁴ basato sulle informazioni di raggruppamento dei campioni. Sono stati selezionati i geni con p < 0,05 e |log2FC| > 0,5. I grafici a vulcano dei DEG sono stati generati utilizzando il pacchetto R ggplot2. Le mappe termiche dei primi 20 DEG sono state realizzate utilizzando il pacchetto R pheatmap. Successivamente, è stata calcolata l'intersezione dei DEG selezionati dai tre dataset ed è stata costruita una rete di interazione proteina-proteina (PPI) per i geni candidati utilizzando la piattaforma online STRING, con un punteggio di interazione ≥0,15. I primi 20 geni hub sono stati ulteriormente identificati da questa rete PPI in base al loro grado di connettività, ordinati utilizzando il software Cytoscape. I risultati della rete PPI sono stati visualizzati utilizzando il software Cytoscape o STRING.

Analisi di arricchimento

L'analisi di arricchimento genico è stata eseguita utilizzando i pacchetti ClusterProfiler e DOSE in combinazione con il sito web Metascape. I database sono stati ottenuti da GO e KEGG. L'analisi di arricchimento è stata condotta utilizzando la funzione “EnrichGO”. I percorsi con p < 0,05 sono stati considerati significativamente arricchiti. I risultati dell'arricchimento sono stati visualizzati utilizzando i pacchetti “ggplot2” e “ggpubr”.

Apprendimento automatico

Per identificare geni differenzialmente espressi (DEG) robusti e biologicamente significativi associati alla preeclampsia, è stata eseguita un'analisi di selezione delle caratteristiche basata su un approccio multi-modello di apprendimento automatico, utilizzando il set di dati trascrittomici pubblicamente disponibile GSE60438 (piattaforma: GPL6884). Questo set di dati contiene il profilo di espressione di campioni di decidua basalis raccolti da gravidanze preeclamptiche e normotesive durante taglio cesareo. I DEG prefiltrati sono stati standardizzati e la matrice di espressione, insieme alle informazioni corrispondenti di raggruppamento clinico, è stata utilizzata come input per quattro distinti algoritmi di apprendimento automatico, al fine di ridurre il bias del modello e migliorare la stabilità della selezione delle caratteristiche.

I quattro algoritmi sono stati applicati simultaneamente, senza un ordine specifico. L'analisi LASSO è stata eseguita utilizzando il pacchetto “glmnet” per condurre un'analisi di regressione e selezionare i geni caratteristici importanti. È stato aggiunto un termine di regolarizzazione L1 alla funzione di perdita, che riduce a zero i coefficienti delle caratteristiche meno importanti, consentendo così la selezione delle caratteristiche. SVM-RFE è stato implementato utilizzando il pacchetto “e1071” per costruire una macchina a vettori di supporto con eliminazione ricorsiva delle caratteristiche. Inizialmente è stato addestrato un classificatore mediante SVM, quindi le caratteristiche meno informative sono state rimosse iterativamente in base ai pesi delle caratteristiche, ottenendo un sottoinsieme ottimale di caratteristiche. XGBoost è stato applicato utilizzando il pacchetto “xgboost” per costruire più alberi decisionali. Ogni albero si adatta ai residui dell'albero precedente e gli output pesati vengono accumulati per ottenere la previsione finale. Boruta è stato eseguito utilizzando il pacchetto “randomForest”, generando caratteristiche ombra che competono con le caratteristiche reali nell'addestramento di una foresta casuale. Sono state mantenute le caratteristiche i cui valori di importanza risultavano significativamente superiori al rumore casuale.

Analisi dei dati del trascrittoma a singola cellula

I dati del trascrittoma a singola cellula sono stati ottenuti dal database GEO e la matrice di conteggio grezza è stata recuperata da GSE183338. La matrice di conteggio è stata importata utilizzando la funzione "Read10X" del pacchetto Seurat e convertita in formato dgCMatrix. Gli oggetti individuali sono stati uniti in un unico oggetto aggregato mediante la funzione "merge" e le etichette delle cellule sono state rese univoche utilizzando "RenameCells". Le cellule di bassa qualità sono state filtrate in base ai seguenti criteri: sono stati rimossi i geni espressi in meno di tre cellule ed escluse le cellule che esprimevano meno di 200 geni. Le cellule controllate per la qualità sono state normalizzate e sono stati identificati i geni altamente variabili. È stata applicata una normalizzazione globale di scala mediante "LogNormalize" (fattore di scala = 10.000), sono stati selezionati i geni altamente variabili (n = 2.000) utilizzando "FindVariableFeatures" e i dati sono stati scalati mediante "ScaleData". È stata eseguita un'analisi delle componenti principali sulle caratteristiche altamente variabili e sono state mantenute le prime 30 componenti principali. Gli effetti di batch tra i campioni sono stati corretti utilizzando il metodo Harmony. Le cellule sono state visualizzate e ridimensionate utilizzando UMAP. Sono stati costruiti grafi di vicini più prossimi condivisi utilizzando "FindNeighbors" e "FindClusters" basati sull'algoritmo di Louvain. Il parametro di risoluzione in "FindClusters" è stato ottimizzato tra 0,1 e 1. L'albero di clustering è stato visualizzato utilizzando la funzione "clustree" ed è stata selezionata una risoluzione di 0,9 per definire i cluster cellulari. I potenziali doublet sono stati rimossi utilizzando l'algoritmo Scrublet. I cluster cellulari sono stati annotati identificando i geni marcatore differenzialmente espressi mediante la funzione "FindAllMarkers". È stato applicato il test non parametrico di Wilcoxon con correzione di Bonferroni. Le identità cellulari sono state assegnate in base ai marcatori di superficie, alla letteratura pertinente e al Cell Classification Database¹⁵.

Cultura cellulare

Le cellule della linea cellulare di trofoblasto HTR-8/SVneo sono state coltivate in mezzo RPMI-1640 integrato con siero fetale bovino al 10% e penicillina/streptomicina all'1%. Le condizioni ipossiche sono state create coltivando le cellule al 1% di O₂, 5% di CO₂ e 94% di N₂ per 24 ore; i controlli normossici sono stati mantenuti al 20% di O₂ e 5% di CO₂¹⁶. Tutte le procedure di coltura cellulare devono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologica di Classe II utilizzando tecniche asettiche. I mezzi di coltura, i reagenti per la trasfezione e i rifiuti cellulari devono essere smaltiti in conformità con le linee guida istituzionali per la sicurezza biologica.

Trasfezione cellulare

Sono stati sintetizzati plasmidi contenenti sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 e OE-NC. Le cellule HTR-8/SVneo sono state seminate a una densità di 5 × 10⁵ cellule per pozzetto in piastre a sei pozzetti. Successivamente, le cellule sono state trasfettate con 2 µg di plasmide sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 o OE-NC per pozzetto, utilizzando un reagente di trasfezione secondo le istruzioni del produttore. In breve, il DNA plasmidico e il Reagente P3000 sono stati diluiti in Opti-MEM, mescolati con Lipofectamine 3000 diluito separatamente in Opti-MEM, incubati per 15 minuti a temperatura ambiente e aggiunti alle cellule con una confluenza del 70–80%. Quarantotto ore dopo la trasfezione, l'espressione di SASH1 è stata valutata mediante RT-qPCR e Western blot. Le sequenze bersaglio dell'RNA a interferenza utilizzate per l'abbattimento di SASH1 sono elencate nella Tabella Supplementare 1.

PCR quantitativa in tempo reale

L'RNA totale è stato estratto da cellule HTR-8/SVneo e retrotrascritto in cDNA utilizzando un kit di retrotrascrizione a 42 °C per 30 min, seguito da 85 °C per 5 min. La PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) è stata eseguita utilizzando una miscela maestra di SYBR Green con le seguenti condizioni di ciclaggio: 95 °C per 10 min, seguiti da 40 cicli di 95 °C per 15 s e 60 °C per 1 min. L'espressione relativa dell'mRNA è stata calcolata mediante il metodo ΔΔCt, utilizzando β-actin come riferimento interno. Le sequenze dei primer utilizzate in questo esperimento sono elencate nella Tabella Supplementare 2.

Saggio di immunoblotting

Le proteine totali sono state estratte da cellule HTR-8/SVneo utilizzando il buffer di lisi. I lisati cellulari sono stati raccolti, incubati sul ghiaccio e centrifugati a 12.000 × g per 30 min a 4 °C per rimuovere i detriti insolubili. La concentrazione proteica è stata determinata utilizzando uno spettrofotometro. Quantità uguali di proteine (50 µg) sono state separate mediante elettroforesi su gel di SDS-PAGE e successivamente trasferite su membrane in PVDF. Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% e incubate con gli anticorpi primari durante la notte a 4 °C. Dopo il lavaggio, le membrane sono state incubate con gli anticorpi secondari corrispondenti e le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando un sistema di rilevamento chemiluminescente migliorato.

Per la rilevazione delle proteine, gli anticorpi primari utilizzati includevano anti-SASH1 e β-actina. Sono stati impiegati opportuni anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) — anti-coniglio e anti-topo di capra. La β-actina è stata utilizzata come controllo interno del caricamento per garantire un uguale caricamento proteico. L'intensità delle bande proteiche è stata misurata e quantificata mediante il software ImageJ.

Isolamento di P-EXOS

P-EXOS sono stati isolati da tessuto villottico placentare ottenuto da placenti a termine di donne sane sottoposte a taglio cesareo elettivo. Il tessuto villottico placentare è stato lavato accuratamente con PBS sterile, tritato in frammenti di circa 1 mm³ frammenti, e coltivati in mezzo RPMI-1640 integrato con FBS privo di esosomi al 10% a 37 °C in un'atmosfera con 5% di CO₂₂ per 48 h. Il mezzo condizionato è stato sottoposto a centrifugazione differenziale come segue: 300 × g per 10 min per rimuovere cellule e detriti tissutali; 2.000 × g per 20 min per rimuovere i detriti cellulari; e 10.000 × g per 30 min per rimuovere i microvescicoli, il tutto a 4 °C. Il sopranatante ottenuto è stato sottoposto a ultracentrifugazione a 120.000 × g per 70 min a 4 °C per ottenere il pellet degli esosomi. Il pellet è stato lavato una volta con PBS e successivamente riultracentrifugato a 120.000 × g per 70 min a 4 °C. Il pellet finale è stato risospeso in PBS. Gli esosomi isolati sono stati caratterizzati mediante analisi Western blot per i marcatori degli esosomi (PLAP, CD63 e TSG101, con GM130 come controllo negativo) e ulteriormente esaminati mediante microscopia elettronica a trasmissione per l'osservazione morfologica.

Esperimento sull'assorbimento cellulare di P-EXOS

Per confermare l'internalizzazione cellulare dei P-EXOS, gli esosomi sono stati marcati con un colorante fluorescente PKH67, un colorante lipofilico per membrane, seguendo il protocollo del produttore. In breve, i P-EXOS sono stati incubati con PKH67 (4 µM) nel Diluente C per 5 min a temperatura ambiente, e la reazione è stata interrotta aggiungendo un volume uguale di albumina sierica bovina (BSA) al 1%. Gli esosomi marcati sono stati quindi re-isolati mediante ultracentrifugazione (120.000 × g, 70 min, 4 °C) per rimuovere il colorante non legato. I P-EXOS marcati con PKH67 (50 µg/mL) sono stati quindi aggiunti alle cellule HTR-8/SVneo e co-incubati per 24 h in condizioni normossiche o ipossiche (1% O₂). Le cellule sono state successivamente lavate tre volte con PBS, fissate con paraformaldeide al 4% per 15 min e i nuclei sono stati contrastati con DAPI (1 µg/mL). L'internalizzazione degli esosomi marcati con PKH67 è stata visualizzata mediante microscopia a scansione laser confocale (CLSM; eccitazione 490 nm, emissione 502 nm). Per esperimenti funzionali di co-coltura, le cellule HTR-8/SVneo sono state trattate con P-EXOS a una concentrazione di 50 µg/mL (equivalente proteico) in mezzo RPMI-1640 completo integrato con FBS privo di esosomi al 10% in condizioni ipossiche (1% O₂) per 24 h.

Saggio immunoenzimatico (ELISA)

I supernatanti di coltura cellulare sono stati raccolti e i livelli di IL-6, IL-1β e TNF-α sono stati misurati utilizzando rispettivamente il kit ELISA per IL-6, il kit ELISA per IL-1β e il kit ELISA per TNF-α, seguendo le istruzioni del produttore. L'assorbanza a 450 nm è stata misurata mediante un lettore di micropiastre e le concentrazioni effettive sono state calcolate a partire dalle curve standard.

Etichettatura degli estremi frammentati mediante TdT-dUTP (TUNEL)

Le cellule apoptotiche sono state rilevate utilizzando il kit per saggio TUNEL secondo le istruzioni del produttore. In breve, le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente, permeabilizzate con Triton X-100 0,1% in PBS per 5 minuti sul ghiaccio e incubate con la miscela di reazione TUNEL per 60 minuti a 37 °C al buio. I nuclei sono stati controstainati con DAPI e le cellule TUNEL-positive sono state visualizzate mediante microscopio a fluorescenza e quantificate contando la percentuale di cellule TUNEL-positive in almeno cinque campi scelti casualmente per ogni campione.

Analisi statistica

Tutti i dati sono stati analizzati utilizzando R e GraphPad Prism. Le variabili continue sono riportate come media ±DS. Il confronto tra due gruppi è stato effettuato mediante il test t di Student, mentre i confronti tra più gruppi sono stati eseguiti mediante ANOVA a un fattore seguita dal test post hoc di Tukey. La significatività statistica per le variabili categoriali è stata valutata mediante il test del chi-quadrato o il test esatto di Fisher. A meno che non indicato diversamente, le correlazioni tra le molecole sono state calcolate mediante analisi della correlazione di Spearman. Gli esperimenti di caratterizzazione degli esosomi sono stati effettuati utilizzando P-EXOS isolati da tre donatori placentari indipendenti. Gli esperimenti su cellule sono stati eseguiti in tre replicati biologici indipendenti, rappresentanti esperimenti indipendenti condotti in occasioni distinte utilizzando cellule HTR-8/SVneo a passaggi diversi, con ciascun replicato che ha utilizzato P-EXOS isolati da un diverso donatore placentario. Un valore di p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

Analisi trascrittomica di pazienti sani e con PE

Per analizzare le differenze di espressione genica tra il gruppo normale (Normale) e i pazienti con PE, è stata eseguita un'analisi di espressione differenziale mediante il pacchetto R limma nei dataset uniti. Sono stati identificati complessivamente 89 geni differenzialmente espressi (DEG) (p < 0,05 e |log₂FC| > 0,5), di cui 69 geni upregolati e 20 geni downregolati per GSE75010 (Figura 1A). Sono presenti 2.097 geni differenzialmente espressi, di cui 1.121 upregolati e 976 downregolati (Figura 1B). Per il dataset GSE60438 sono stati rilevati 7.633 DEG, con 3.371 geni upregolati e 4.262 geni downregolati (Figura 1C). Le notevoli differenze nel numero di DEG tra i tre dataset riflettono probabilmente variazioni nella dimensione del campione, nell'origine del tessuto (villocapillari placentari rispetto a decidua basalis) e nella classificazione della gravità della PE, evidenziando ulteriormente l'importanza di considerare l'intersezione tra i dataset per identificare DEG comuni e robusti.

Analisi dell'arricchimento funzionale dei DEG

Per l'identificazione sistematica dei principali DEG associati alla PE, è stata effettuata un'analisi di Venn sui DEG provenienti dai dataset PE GSE75010, GSE10588 e GSE60438, identificando infine 56 DEG comuni (Figura 2A). È stata costruita una rete PPI per questi 56 DEG comuni utilizzando la piattaforma online STRING (punteggio di interazione ≥0,15) e i 20 geni centrali principali sono stati ulteriormente identificati in base al loro grado di connettività all'interno della rete, ordinati mediante il software Cytoscape (Figura 2B). Sulla base di tali geni, è stata inoltre eseguita un'arricchimento GO per esplorare le potenziali funzionalità in BP, CC e MF (Figura 2C). I DEG risultavano maggiormente arricchiti nella secrezione ormonale e nella regolazione della segnalazione dei recettori transmembrana serina/treonina chinasi. Per quanto riguarda le cellule, i geni erano principalmente localizzati nelle adesioni focali, nelle giunzioni cellula-substrato e in una varietà di geni correlati a vescicole e lisosomi. Per quanto concerne le funzioni molecolari, i termini arricchiti erano l'attività di prolil idrossilasi, l'attività ormonale e il trasporto transmembrana di molecole correlate ai lipidi. Questi risultati suggeriscono che i DEG potrebbero svolgere ruoli importanti nella segnalazione cellulare placentare, nell'interazione cellula-matrice e nel mantenimento di funzioni endocrine correlate. Allo stesso tempo, si è scoperto che l'arricchimento del percorso KEGG ha prodotto un arricchimento dei DEG principalmente nell'interazione citochina-recettore della citochina, nell'interazione delle molecole di adesione cellulare e nei percorsi di segnalazione TGF-β e HIF-1 (Figura 2D). L'arricchimento di alcuni termini correlati ai virus (ad esempio, virus dell'epatite, Ebolavirus) riflette probabilmente un'overlapping non specifica con geni regolatori immunitari condivisi piuttosto che un'associazione biologica diretta con la PE; l'attenzione interpretativa rimane quindi sui percorsi correlati a infiammazione, adesione e ipossia. Questi percorsi sono associati alla risposta infiammatoria, alla segnalazione mediata dall'adesione cellulare e ai processi correlati all'ipossia e potrebbero influenzare la progressione della PE modificando lo stato immuno-infiammatorio e la comunicazione tra cellule nel microambiente placentare.

Il machine learning identifica SASH1 come gene chiave nella PE

Per identificare i geni prognostici chiave, sono stati applicati quattro metodi di apprendimento automatico per la selezione delle caratteristiche. La regressione LASSO con validazione incrociata ha mostrato che il modello raggiungeva l'errore minimo di validazione incrociata quando log(λ.min) = -3,8075. I geni con coefficienti non nulli a questo valore di λ sono stati selezionati come caratteristiche principali identificate dal metodo LASSO (Figura 3A–B). L'algoritmo Boruta valuta l'importanza delle caratteristiche confrontandole con caratteristiche fittizie (shadow features). I geni con valori di importanza superiori a shadowMax sono stati etichettati come Confermati e considerati geni candidati chiave, mentre quelli con valori di importanza inferiori a shadowMin sono stati etichettati come Rifiutati e considerati privi di contributo significativo. I geni compresi tra queste due soglie sono stati etichettati come Provvisori, indicando un'importanza potenziale ma incerta (Figura 3C). L'analisi SVM-RFE ha dimostrato che quando venivano mantenute 40–50 caratteristiche, l'accuratezza della validazione incrociata raggiungeva il livello più alto o prossimo al massimo, suggerendo una prestazione predittiva ottimale a questa scala di caratteristiche (Figura 3D). L'accuratezza moderata della validazione incrociata (~0,6) indica che nessun singolo algoritmo ha ottenuto prestazioni ottimali su questo dataset; pertanto, è stata adottata una strategia di intersezione multi-algoritmo per aumentare la robustezza della selezione delle caratteristiche. XGBoost ha quantificato l'importanza relativa dei geni utilizzando i valori di Gain, identificando così le caratteristiche con maggiore contributo alla previsione del modello (Figura 3E). L'analisi dell'intersezione di Venn sui risultati dei quattro metodi ha identificato SASH1 come l'unico gene sovrapposto. Sebbene SASH1 fosse classificato come Provvisorio dall'algoritmo Boruta, la sua selezione coerente in tutti e tre gli altri algoritmi ne sostiene l'identificazione come gene candidato consensuale (Figura 3F).

Analisi a singola cellula

È stata analizzata l'eterogeneità cellulare e i processi molecolari nei tessuti placentari di PE. Le cellule sono state sottoposte a un filtro di qualità in base al numero di geni rilevati, al numero di conteggi di RNA e alla percentuale di espressione dei geni mitocondriali. Sono state eliminate le cellule di bassa qualità (con meno di 200 geni rilevati o con un contenuto di geni mitocondriali superiore al 20%) per ottenere un campione singolo di alta qualità destinato all'analisi successiva. Le metriche di controllo qualità e l'identificazione dei geni altamente variabili sono mostrate nella Figura supplementare 1A–B. Dopo la normalizzazione e l'identificazione dei geni altamente variabili, è stata eseguita un'analisi delle componenti principali (PCA) utilizzando i primi 2.000 geni altamente variabili e le componenti principali significative, mediante analisi JackStraw e analisi ElbowPlot (Figura supplementare 2A–B).

Sulla base delle componenti principali, è stata utilizzata la tecnica di riduzione della dimensionalità nota come uniform manifold approximation and projection (UMAP) per eseguire un raggruppamento non supervisionato, grazie alla quale tutte le cellule sono state classificate in 22 cluster, evidenziando l'elevata eterogeneità cellulare nel tessuto placentare (Figura 4A). Analizzando l'espressione dei geni marcatore specifici per ogni cluster e visualizzando i geni differenzialmente espressi (DEG) in una mappa termica (Figura 4B), ciascun cluster è stato annotato in base a un marcatore canonico e proiettato nuovamente sull'incorporamento UMAP (Figura 4C). Sulla base di queste popolazioni cellulari principali, sono state identificate cellule B/cellule plasmatiche, cellule endoteliali, fibroblasti/cellule stromali, macrofagi/cellule dendritiche, cellule natural killer, cellule T e cellule trofoblastiche. Il confronto tra i gruppi di controllo e quelli con preeclampsia (PE) rivela che diversi tipi cellulari presentano una distribuzione relativa significativamente alterata nelle placente con PE, suggerendo un rimodellamento del microambiente placentario (Figura 4D).

L'origine del tessuto e lo stato della malattia sono stati utilizzati per tracciare le cellule nello stesso embedding UMAP in base alla provenienza tissutale (decidua rispetto a villi) e al raggruppamento per malattia (controllo rispetto a PE) (Figura 4E). La distribuzione del numero di cellule era parzialmente separata in base all'origine tissutale, mentre le cellule appartenenti a diversi gruppi di malattia erano fortemente interconnesse. Questo suggerisce che la PE non riorganizza sostanzialmente l'intera struttura trascrittomica, ma potrebbe avere effetti su specifiche popolazioni cellulari o su particolari caratteristiche molecolari. L'espressione di SASH1 è stata mappata sull'UMAP per esplorarne la distribuzione tra le popolazioni cellulari placentari (Figura 4F–G). SASH1 mostra un'espressione fortemente specifica per tipo cellulare, con differenze rilevanti tra le popolazioni cellulari deciduali e villotte. Il confronto statistico dell'espressione di SASH1 tra i gruppi PE e controllo attraverso i diversi tipi cellulari (test della somma dei ranghi di Wilcoxon) ha rivelato differenze significative in molteplici popolazioni cellulari placentarie, con l'aumento più marcato osservato nelle cellule trofoblastiche dei campioni PE (Figura 4H). Questo risultato fornisce evidenze a livello di singola cellula che la disregolazione di SASH1 è particolarmente pronunciata nel compartimento trofoblastico, supportando l'utilizzo della linea cellulare trofoblastica HTR-8/SVneo per esperimenti funzionali successivi.

La riduzione di SASH1 inibisce l'apoptosi dei trofoblasti indotta dall'ipossia e le risposte infiammatorie

Per convalidare le previsioni bioinformatiche, è stato stabilito un modello cellulare di trofoblasto associato alla PE in condizioni di ipossia (1% O₂). Sono state eseguite analisi di qPCR e Western blot per valutare l'espressione di SASH1 (Figura 5A–B). Rispetto alle cellule HTR-8/SVneo in condizioni normossiche, le cellule trattate con ipossia hanno mostrato livelli significativamente aumentati di espressione di mRNA e proteina SASH1, fornendo una prima convalida sperimentale dei risultati bioinformatici. Per valutare l'effetto del silenziamento di SASH1 sui processi patologici associati alla PE, SASH1 è stato silenziato in cellule HTR-8/SVneo trattate con ipossia. Le analisi di PCR quantitativa e Western blot (Figura 5C–D) hanno mostrato che l'espressione di SASH1 era significativamente ridotta in tutti i gruppi sh-SASH1 rispetto al gruppo sh-NC. Tra questi, sh-SASH1#3 ha mostrato l'efficienza di silenziamento più elevata ed è stato pertanto selezionato per esperimenti successivi. Sono state eseguite colorazione TUNEL e saggio ELISA in tre condizioni: controllo normossico (Normale), ipossia con shRNA di controllo negativo (Ipossia + sh-NC) e ipossia con silenziamento di SASH1 (Ipossia + sh-SASH1). Rispetto al gruppo Normale, il gruppo Ipossia + sh-NC ha mostrato un aumento significativo dell'apoptosi e una maggiore secrezione delle citochine pro-infiammatorie IL-1β, IL-6 e TNF-α, confermando il danno trofoblastico indotto dall'ipossia. Il silenziamento di SASH1 ha attenuato in modo marcato questi effetti, riducendo l'apoptosi (Figura 5E) e i livelli di citochine (Figura 5F) fino a valori prossimi a quelli del gruppo Normale, suggerendo che il silenziamento di SASH1 può in gran parte ripristinare l'apoptosi trofoblastica e le risposte infiammatorie indotte dall'ipossia. Per stabilire ulteriormente il ruolo causale di SASH1, sono stati effettuati esperimenti di tipo gain-of-function. qPCR e Western blot hanno confermato un'espressione sovraespressa di SASH1 nelle cellule HTR-8/SVneo (Figura 5G–H). In condizioni normossiche, la sovraespressione di SASH1 (OE-SASH1) ha aumentato significativamente l'apoptosi trofoblastica e la secrezione di citochine pro-infiammatorie rispetto al gruppo OE-NC, riproducendo il fenotipo indotto dall'ipossia (Figura 5I–J). Nel complesso, i dati di loss-of-function e gain-of-function dimostrano che SASH1 è sia necessario che sufficiente per indurre l'apoptosi trofoblastica e le risposte infiammatorie, confermandone il ruolo causale nella patologia associata alla PE.

P-EXOS sopprime l'apoptosi dei trofoblasti indotta dall'ipossia e le risposte infiammatorie modulando SASH1

Si ritiene che P-EXOS abbia un potenziale valore terapeutico nella PE. In questo studio, un'analisi bioinformatica ha suggerito che SASH1 è associato a vie di segnalazione correlate agli esosomi (come indicato dall'arricchimento GO e KEGG, Figura 2C–D), portandoci a ipotizzare che P-EXOS possa esercitare un effetto protettivo nella PE regolando SASH1. Prima degli studi funzionali, gli P-EXOS isolati sono stati inizialmente caratterizzati. L'analisi mediante Western blot ha confermato la presenza delle proteine marcatrici degli esosomi PLAP, CD63 e TSG101, senza espressione rilevabile del marcatore del Golgi GM130, indicando un'elevata purezza delle vescicole isolate. La microscopia elettronica a trasmissione ha inoltre rivelato strutture vescicolari tipiche a forma di coppa (Figura 6A–B). Per verificare se P-EXOS potessero essere internalizzati in modo efficiente dalle cellule bersaglio, è stata eseguita una colorazione mediante immunofluorescenza per valutare l'assorbimento cellulare di P-EXOS. Rispetto al gruppo di controllo, le cellule HTR-8/SVneo trattate con P-EXOS hanno mostrato segnali di co-localizzazione evidenti nelle immagini sovrapposte, indicando che P-EXOS sono stati internalizzati efficacemente dalle cellule HTR-8/SVneo (Figura 6C).

Successivamente, le cellule HTR-8/SVneo sono state co-coltivate con P-EXOS in condizioni di ipossia. Sia i saggi di PCR quantitativa che quelli di Western blot hanno mostrato una marcata riduzione dei livelli di mRNA e di proteina SASH1 nel gruppo trattato con P-EXOS rispetto ai controlli (Figura 6D–E), fornendo le prime evidenze di un'interazione regolatoria tra P-EXOS e SASH1. In accordo con questi cambiamenti molecolari, la colorazione TUNEL ha rivelato un'ampia attenuazione dell'apoptosi indotta dall'ipossia nelle cellule HTR-8/SVneo dopo il trattamento con P-EXOS (Figura 6F). Allo stesso tempo, i saggi ELISA hanno dimostrato una riduzione notevole nella secrezione di citochine pro-infiammatorie, tra cui IL-6, IL-1β e TNF-α (Figura 6G).

Per determinare se gli effetti protettivi di P-EXOS dipendono meccanicamente dalla soppressione di SASH1, è stato eseguito un esperimento di recupero in condizioni di ipossia. Le cellule che overesprimono SASH1 (OE-SASH1 + P-EXOS) sono state confrontate con cellule di controllo negative (OE-NC + P-EXOS). L'overespressione di SASH1 ha significativamente annullato gli effetti protettivi di P-EXOS, come dimostrato da un aumento dell'apoptosi (Figura 6H) e da una maggiore secrezione di citochine pro-infiammatorie (Figura 6I) rispetto al gruppo OE-NC + P-EXOS. Questi risultati dimostrano che l'effetto protettivo di P-EXOS è mediato specificamente attraverso la soppressione di SASH1, piuttosto che attraverso vie parallele, sottolineando il potenziale terapeutico di P-EXOS nella PE.

DISPONIBILITÀ DEI DATI:

I set di dati che supportano i risultati di questo studio sono disponibili pubblicamente ed sono stati ottenuti dal database Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), con i numeri di accessione GSE75010, GSE10588, GSE60438 e GSE183338. L'annotazione dei tipi cellulari è stata eseguita facendo riferimento al Cell Classification Database (https://ngdc.cncb.ac.cn/celltaxonomy/). Le immagini non ritagliate dei Western blot e tutti gli altri dati sperimentali grezzi che supportano i risultati di questo studio sono forniti nella cartella Dati grezzi supplementari.

Figura 1: Identificazione di geni differenzialmente espressi (DEG) nei tessuti placentari e deciduali della PE in tre dataset indipendenti. (A) Diagramma a vulcano dei DEG tra 157 campioni placentari di PE e 173 campioni placentari non PE del dataset combinato GSE75010. (B) Diagramma a vulcano dei DEG tra campioni placentari di PE grave (n = 17) e campioni placentari normali (n = 26) del dataset GSE10588. (C) Diagramma a vulcano dei DEG tra campioni deciduali di PE e campioni deciduali di controllo normotesi del dataset GSE60438. I DEG sono stati identificati utilizzando p < 0,05 e |log₂FC| > 0,5. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Analisi di arricchimento funzionale e di interazione proteina-proteina (PPI) dei DEG comuni associati alla pre-eclampsia. (A) Diagramma di Venn dei DEG identificati nei dataset relativi alla PE GSE75010, GSE10588 e GSE60438. (B) Rete PPI dei primi 20 geni hub selezionati dai 56 DEG comuni in base al grado di connettività, ordinati mediante il software Cytoscape (punteggio di interazione STRING ≥0,15). (C) Le analisi di arricchimento GO e KEGG dei DEG comuni sono presentate come istogrammi. (D) Le analisi di arricchimento GO e KEGG dei DEG comuni, presentate come diagrammi a corde. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Analisi di screening basata sull'apprendimento automatico per identificare geni hub candidati associati alla pre-eclampsia. (A) Analisi di regressione LASSO che mostra i profili dei coefficienti dei geni candidati. (B) Selezione del parametro ottimale di regolarizzazione (λ) mediante regressione LASSO con validazione incrociata. (C) Algoritmo Boruta. (D) Analisi SVM-RFE. (E) Algoritmo XGBoost. (F) Diagramma di Venn che mostra l'intersezione dei geni candidati identificati dagli algoritmi LASSO, Boruta, SVM-RFE e XGBoost. Abbreviazioni: LASSO = least absolute shrinkage and selection operator; SVM-RFE = support vector machine recursive feature elimination. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: L'analisi trascrittomica a singola cellula rivela modelli di espressione specifici per tipo cellulare del gene SASH1 nella pre-eclampsia. (A) Raggruppamento UMAP del dataset a singola cellula. (B) Analisi dei primi cinque marcatori annotati nel dataset trascrittomica a singola cellula della pre-eclampsia GSE183338. (C) Annotazione delle sottopopolazioni cellulari. (D) Istogramma che mostra la distribuzione delle proporzioni cellulari nei campioni di controllo e nella pre-eclampsia (PE). (E) Grafico UMAP colorato in base all'origine tissutale (decidua e villi) e allo stato della malattia (controllo e PE). (F) Grafico UMAP che mostra l'espressione di SASH1 nelle popolazioni cellulari placentari raggruppate per origine tissutale (decidua e villi). (G) Grafico UMAP che mostra l'espressione di SASH1 nelle popolazioni cellulari placentari raggruppate per stato della malattia (controllo e PE). (H) Grafico a violino che mostra la distribuzione dell'espressione di SASH1 tra diversi tipi cellulari placentari. ns p > 0.05; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. Abbreviazioni: UMAP = uniform manifold approximation and projection; ns = non significativo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: SASH1 regola l'apoptosi e l'infiammazione dei trofoblasti indotte da ipossia. (A) Analisi di espressione dell'mRNA di SASH1 mediante qPCR e quantificazione densitometrica dei livelli proteici di SASH1 in cellule HTR-8/SVneo in condizioni normali e ipossiche. (B) Immagini rappresentative di Western blot corrispondenti ai dati densitometrici mostrati in (A). (C) Analisi di espressione dell'mRNA di SASH1 mediante qPCR e quantificazione densitometrica dei livelli proteici di SASH1 in cellule HTR-8/SVneo trattate con ipossia e trasfettate con costrutti sh-NC o sh-SASH1 (sh-SASH1#1, sh-SASH1#2 e sh-SASH1#3). (D) Immagini rappresentative di Western blot corrispondenti ai dati densitometrici mostrati in (C). (E) Colorazione TUNEL di cellule HTR-8/SVneo nei gruppi Normale, Ipoxia + sh-NC e Ipoxia + sh-SASH1(#3). Barra della scala = 20 µm. (F) Analisi mediante ELISA di citochine infiammatorie (IL-1β, IL-6 e TNF-α) nei gruppi Normale, Ipoxia + sh-NC e Ipoxia + sh-SASH1(#3). (G) Analisi di espressione dell'mRNA di SASH1 mediante qPCR e quantificazione densitometrica dei livelli proteici di SASH1 in cellule HTR-8/SVneo trasfettate con costrutti OE-NC o OE-SASH1. (H) Immagini rappresentative di Western blot corrispondenti ai dati densitometrici mostrati in (G). (I) Colorazione TUNEL di cellule HTR-8/SVneo nei gruppi Normale + OE-NC e Normale + OE-SASH1. Barra della scala = 20 µm. (J) Analisi mediante ELISA di citochine infiammatorie (IL-1β, IL-6 e TNF-α) nei gruppi Normale + OE-NC e Normale + OE-SASH1. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. I dati sono espressi come media ± DS di tre replicati biologici indipendenti (n = 3). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: I P-EXOS attenuano il danno trofoblastico indotto dall'ipossia mediante la soppressione di SASH1. (A) Analisi mediante Western blot delle proteine marcatrici dei P-EXOS, PLAP, CD63 e TSG101, con GM130 utilizzato come controllo negativo. (B) Analisi della morfologia dei P-EXOS mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Barra della scala = 1,0 µm. (C) Immagini ottenute mediante microscopia confocale a scansione laser che mostrano l'assorbimento dei P-EXOS marcati con PKH67 (verde) nelle cellule HTR-8/SVneo (rosso). I nuclei sono stati contrastati con DAPI (blu). Barra della scala = 20 µm. (D) Analisi mediante qPCR dell'espressione dell'mRNA di SASH1 e quantificazione densitometrica dei livelli proteici di SASH1 nelle cellule HTR-8/SVneo nei gruppi Controllo e P-EXOS. (E) Immagini rappresentative di Western blot corrispondenti ai dati densitometrici mostrati in (D). (F) Colorazione TUNEL delle cellule HTR-8/SVneo nei gruppi Controllo e P-EXOS. Barra della scala = 20 µm. (G) Analisi mediante ELISA delle citochine infiammatorie (IL-1β, IL-6 e TNF-α) in cellule HTR-8/SVneo trattate con ipossia nei gruppi Controllo e P-EXOS. (H) Colorazione TUNEL delle cellule HTR-8/SVneo nei gruppi OE-NC + P-EXOS e OE-SASH1 + P-EXOS. Barra della scala = 20 µm. (I) Analisi mediante ELISA delle citochine infiammatorie (IL-1β, IL-6 e TNF-α) in cellule HTR-8/SVneo trattate con ipossia nei gruppi OE-NC + P-EXOS e OE-SASH1 + P-EXOS. Abbreviazioni: P-EXOS = esosomi derivati dalla placenta; TEM = microscopia elettronica a trasmissione; PLAP = fosfatasi alcalina placentare; TSG101 = gene della suscettibilità tumorale 101. *p < 0,05; **p < 0,01. I dati sono espressi come media ± DS di tre replicati biologici indipendenti (n = 3). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura supplementare 1: Controllo di qualità dei dati di RNA-seq a singola cellula. (A) Grafico a violino dei livelli di espressione genica dopo il controllo di qualità. (B) Grafico delle caratteristiche variabili che mostra i geni altamente variabili identificati dopo il controllo di qualità.Cliccare qui per scaricare il file.

Figura supplementare 2: Determinazione delle componenti principali statisticamente significative per il raggruppamento a singola cellula. (A) Diagramma a punti JackStraw utilizzato per identificare le componenti principali statisticamente significative. (B) Diagramma a punti del gomito che mostra la varianza spiegata dalle componenti principali.Cliccare qui per scaricare il file.

Tabella supplementare 1: sequenze bersaglio di shRNA utilizzate per il silenziamento di SASH1. Sequenze bersaglio di shRNA (5′–3′) per il controllo negativo (sh-NC) e per tre costrutti diretti contro SASH1 (sh-SASH1#1, sh-SASH1#2 e sh-SASH1#3) utilizzati per il silenziamento genico.Cliccare qui per scaricare il file.

Tabella supplementare 2: Sequenze dei primer utilizzate per la PCR quantitativa. Sequenze dei primer diretti e inversi (5′–3′) per SASH1 e β-actin (controllo interno di riferimento) utilizzate nell'analisi di qPCR.Cliccare qui per scaricare il file.

Discussione

In questo studio, SASH1 è stato identificato come un gene chiave disregolato nella PE mediante analisi trascrittomica integrata, sequenziamento a singola cellula e apprendimento automatico basato su multipli algoritmi, un approccio particolarmente rilevante considerando che al momento non esistono terapie mirate per la PE¹⁷. È stato dimostrato che SASH1 è significativamente sovraespresso nelle cellule trofoblastiche ipossiche ed è specificamente aumentato nel compartimento trofoblastico delle placenti con PE a risoluzione monocellulare. Attraverso esperimenti di perdita e guadagno di funzione, si è stabilito che SASH1 è sia necessario che sufficiente per indurre l'apoptosi trofoblastica e la secrezione di citochine pro-infiammatorie. Inoltre, il trattamento con P-EXOS ha attenuato il danno trofoblastico indotto dall'ipossia, e tale effetto protettivo è stato annullato dall'overespressione di SASH1, confermando che la citoprotezione mediata da P-EXOS dipende meccanicamente dalla soppressione di SASH1.

Inoltre, sono state osservate alterazioni nelle proporzioni di diversi tipi cellulari placentari nella PE, inclusi linfociti B/cellule plasmatiche, cellule endoteliali, fibroblasti/cellule stromali, macrofagi/cellule dendritiche, cellule NK, linfociti T e cellule trofoblastiche. Questi risultati indicano che il microambiente placentare subisce un rimodellamento sostanziale durante la PE. Un tale microambiente infiammatorio non solo peggiora la disfunzione trofoblastica, ma potrebbe anche accelerare la progressione della malattia attraverso interazioni tra il sistema immunitario e la matrice extracellulare¹⁸. Inoltre, di recente si è evidenziato il coinvolgimento delle trappole extracellulari dei neutrofili (NETs) nell'aggravamento dell'infiammazione placentaria nella PE¹⁹. Si ritiene che SASH1 svolga un ruolo significativo nello sviluppo della PE grazie al suo coinvolgimento nei processi di segnalazione infiammatoria, adesione cellulare e risposta all'ipossia. In questo studio, i profili di espressione genica sono stati estratti da campioni placentari di pazienti con PE e di gravidanze normotesive utilizzando il pacchetto limma, e sono stati applicati diversi algoritmi di apprendimento automatico—regressione LASSO, SVM-RFE, XGBoost e Boruta—per la selezione delle caratteristiche. In tutti gli algoritmi, SASH1 si è costantemente rivelato un gene candidato concordante. A livello singola cellula, SASH1 ha mostrato un'espressione specifica per tipo cellulare all'interno di diverse popolazioni cellulari placentari ed ha mantenuto un'espressione elevata nei campioni di PE, con la differenza più marcata osservata nelle cellule trofoblastiche, suggerendo che possa esercitare effetti funzionali distinti in diversi contesti cellulari placentari.

SASH1 è una proteina adattatrice di segnalazione che è stata descritta come partecipante a diversi processi biologici, tra cui la migrazione e l'invasione cellulare, la transizione epitelio-mesenchimale e la regolazione della segnalazione in risposta allo stress^8,9. Per indagare il ruolo funzionale di SASH1 nella patologia associata alla PE, è stato stabilito un modello di trofoblasto indotto da ipossia utilizzando cellule HTR-8/SVneo. I nostri risultati hanno dimostrato che l'esposizione ipossica regola significativamente verso l'alto l'espressione di SASH1, mentre il silenziamento di SASH1 attenua in modo marcato l'apoptosi indotta dall'ipossia e riduce la secrezione di citochine pro-infiammatorie, tra cui IL-1β, IL-6 e TNF-α. Al contrario, la sovraespressione di SASH1 in condizioni normossiche è sufficiente a riprodurre il fenotipo indotto dall'ipossia, dimostrando il ruolo causale di SASH1 nel promuovere il danno trofoblastico. Questi risultati suggeriscono che SASH1 potrebbe regolare negativamente lo stato funzionale del trofoblasto modulando le risposte infiammatorie. Poiché i trofoblasti rappresentano una fonte primaria di mediatori infiammatori placentari²⁰, un'espressione aberrante di SASH1 potrebbe costituire una base molecolare critica per l'amplificazione dell'infiammazione nella PE. È degno di nota che le funzioni pro-apoptotiche e pro-infiammatorie di SASH1 osservate nelle cellule trofoblastiche contrastano con il suo ruolo canonico di soppressore tumorale nelle cellule tumorali, dove tipicamente inibisce la MET e la migrazione^8,9. Questa doppia funzionalità dipendente dal contesto potrebbe riflettere differenze specifiche del tipo cellulare nei partner di interazione di SASH1 e nelle reti di segnalazione a valle, e richiede ulteriori indagini.

Gli esosomi sono riconosciuti come importanti mediatori della comunicazione intercellulare e sono coinvolti nella patogenesi della PE²¹. In particolare, gli P-EXOS potrebbero svolgere un ruolo importante nella regolazione immunitaria durante la gravidanza normale, ad esempio mantenendo la tolleranza immunitaria materno-fetale, il che potrebbe conferire protezione contro la PE²². In questo studio, un'analisi bioinformatica ha rivelato un'associazione tra SASH1 e vie di segnalazione correlate agli esosomi, stimolando ulteriori indagini sul ruolo degli P-EXOS nella regolazione della funzione dei trofoblasti. Esperimenti di co-coltura hanno dimostrato che il trattamento con P-EXOS riduce significativamente i livelli di mRNA e di proteina di SASH1 nelle cellule trofoblastiche trattate con ipossia e attenua in modo marcato l'apoptosi e le risposte infiammatorie indotte dall'ipossia. In modo significativo, la sovraespressione di SASH1 ha annullato questi effetti protettivi, confermando che la citoprotezione mediata dagli P-EXOS dipende meccanicamente dalla soppressione di SASH1 e non agisce attraverso vie parallele.

I meccanismi molecolari attraverso cui i P-EXOS sopprimono l'espressione di SASH1 devono ancora essere chiariti. È noto che i P-EXOS trasportano carichi bioattivi diversi, tra cui microRNA, proteine e lipidi, in grado di modulare l'espressione genica nelle cellule riceventi¹⁰. Una possibilità è che i P-EXOS consegnino specifici miRNA che bersaglino direttamente o indirettamente SASH1. In alternativa, i P-EXOS potrebbero modulare vie di segnalazione a monte—come NF-κB o PI3K-Akt—che convergono sulla regolazione trascrizionale di SASH1. Poiché è stato dimostrato che SASH1 è coinvolto nella via PI3K-Akt-mTOR nelle cellule tumorali⁸, è plausibile che la modulazione mediata da esosomi di questo asse possa contribuire alla riduzione dell'espressione di SASH1 nelle cellule trofoblastiche. Saranno necessari studi futuri che utilizzino il sequenziamento del carico esosomiale e inibitori specifici per le vie di segnalazione per analizzare la cascata molecolare precisa attraverso cui i P-EXOS regolano l'espressione di SASH1.

In questo studio, il profilo trascrittomico è stato integrato con il sequenziamento dell'RNA a singola cellula per indagare i cambiamenti molecolari nel tessuto placentare nella PE. È stato dimostrato che SASH1 svolge un ruolo chiave nell'apoptosi dei trofoblasti indotta dall'ipossia e nelle risposte infiammatorie, e che gli P-EXOS possono esercitare un effetto protettivo inibendo l'espressione di SASH1, offrendo nuove prospettive sui meccanismi molecolari alla base della PE e suggerendo una potenziale strategia terapeutica. Tuttavia, questo studio presenta diverse limitazioni. In primo luogo, i risultati funzionali sono stati ottenuti principalmente mediante la linea cellulare di trofoblasti immortalata HTR-8/SVneo; pertanto, è necessaria una validazione in cellule trofoblastiche primarie. In secondo luogo, l'espressione proteica di SASH1 non è stata validata nei tessuti placentari clinici di PE mediante immunohistochimica, il che limita l'interpretazione traslazionale dei risultati e dovrà essere affrontato in studi futuri. In terzo luogo, il classificatore SVM-RFE ha mostrato un'accuratezza moderata nella cross-validazione (~0,6), riflettendo l'eterogeneità intrinseca del dataset; saranno necessarie coorti indipendenti più ampie per sviluppare modelli diagnostici più robusti. In quarto luogo, il meccanismo molecolare preciso attraverso cui gli P-EXOS inibiscono l'espressione di SASH1 rimane poco chiaro. In quinto luogo, sono state osservate bande di rilevamento non specifiche nella rilevazione di SASH1 mediante Western blot, probabilmente dovute a una specificità subottimale dell'anticorpo. L'anticorpo utilizzato in questo esperimento è un anticorpo policlonale, che generalmente presenta una specificità inferiore nell'immunorilevamento rispetto agli anticorpi monoclonali. Tuttavia, queste bande non specifiche non influiscono sui risultati relativi alla proteina SASH1 né sulle conclusioni di questo studio. Studi futuri che includano esperimenti in vivo, analisi di campioni clinici e caratterizzazione del carico degli esosomi saranno necessari per chiarire ulteriormente il ruolo funzionale dell'asse P-EXOS-SASH1 nella PE e per valutarne il potenziale traslazionale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Mezzo RPMI-1640	Gibco	11875085
Serum bovino fetale (FBS)	Gibco	16140071
FBS privo di esosomi	System Biosciences	EXO-FBS-50A-1
Penicillina/Streptomicina	Thermo Fisher Scientific, CN	15140122
Reagente di trasfezione Lipofectamine 3000 (con reagente P3000)	Thermo Fisher Scientific, CN	L3000150
Mezzo Opti-MEM a ridotto contenuto di siero	Thermo Fisher Scientific, CN	31985070
Plasmide shRNA per SASH1 (HuSH)	origene	TL301836
Plasmide di espressione ORF per SASH1	origene	RC218866
Plasmide di controllo vuoto	origene	PS100001
Kit di trascrizione inversa	Thermo Fisher Scientific, CN	4368814
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific, CN	A46110
Primer per SASH1	Sangon Biotech	Sintetizzati su misura
Primer per β-actina	Sangon Biotech	Sintetizzati su misura
Tampone di lisi cellulare	Beyotime	P0013B
Spettrofotometro NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, CN	NanoDrop Ultra
Membrana PVDF	Thermo Fisher Scientific, CN	88518
Anticorpo anti-SASH1	ABclonal	A15248
Anticorpo anti-β-actina	Abcam	ab6276
Anticorpo secondario coniugato con HRP, capra anti-coniglio/anti-topo	Beyotime	A0208
Software ImageJ	NIH (dominio pubblico)	ImageJ
Kit PKH67 Green Fluorescent Cell Linker (incluso Diluente C)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN	MINI67
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN	10711454001
DAPI	Beyotime	C1002
Microscopio confocale a scansione laser (CLSM)	Leica	Leica TCS SP8
Kit ELISA Quantikine per IL-6 umana	R&D Systems	D6050B
Kit ELISA DuoSet per IL-1β/IL-1F2 umana	R&D Systems	DY201
Kit ELISA Quantikine per TNF-α umano	R&D Systems	DTA00D
Lettore di micropiastre	Thermo Scientific	Multiskan FC
Kit di rilevamento della morte cellulare in situ (Kit per saggio TUNEL)	Roche	11684795910
Triton X-100	Beyotime	P0096
Paraformaldeide (4%)	Beyotime	P0099
Microscopio a fluorescenza	Olympus	BX53
Centrifuga refrigerata (capacità 12.000 × g)	Eppendorf	Eppendorf 5430 R
Ultracentrifuga (capacità 120.000 × g)	Beckman Coulter	Optima MAX-XP
Software R	The R Foundation	v4.2.1
GraphPad Prism	GraphPad Software	v10.0
Seurat (pacchetto R)	Satija Lab (open-source)	v4.0.4
Harmony (pacchetto R, correzione batch)	Open-source	v1.2.0
Scrublet (pacchetto Python, rilevamento doublet)	Open-source	v0.2.3
clustree (pacchetto R)	Open-source	v0.5.1
glmnet (pacchetto R, LASSO)	Open-source	v4.1.8
e1071 (pacchetto R, SVM-RFE)	Open-source	v1.7-14
xgboost (pacchetto R)	Open-source	v1.7.7.1
randomForest (pacchetto R, Boruta)	Open-source	v4.7-1.1
Database Gene Expression Omnibus (GEO)	NCBI	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Database STRING	string-db.org	https://www.string-db.org/
Metascape	metascape.org	https://metascape.org/
Software Cytoscape	Cytoscape Consortium	v3.10.4
ggplot2 (pacchetto R)	Open-source	v3.5.1
limma (pacchetto R)	Open-source	v3.58.1
pheatmap (pacchetto R)	Open-source	v1.0.12
ClusterProfiler (pacchetto R)	Open-source	v4.8.3
DOSE (pacchetto R)	Open-source	v3.28.2
ggpubr (pacchetto R)	Open-source	v0.6.0