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Articolo di ricerca
* These authors contributed equally
La proteina 1 contenente i domini SAM e SH3 (SASH1) è identificata come un regolatore chiave dell'apoptosi e dell'infiammazione dei trofoblasti nella preeclampsia (PE). Gli esosomi derivati dalla placenta (P-EXOS) attenuano il danno indotto dall'ipossia sopprimendo l'espressione di SASH1. Questi risultati rivelano un nuovo meccanismo alla base della patogenesi della PE e suggeriscono SASH1 come possibile bersaglio terapeutico.
SASH1 è una proteina adattatrice di segnale coinvolta nella crescita cellulare, nell'apoptosi e nella regolazione immunitaria, ed è stata oggetto di crescenti studi in cellule tumorali e immunitarie. Evidenze emergenti suggeriscono che SASH1 svolge un ruolo importante nelle risposte infiammatorie e nell'omeostasi cellulare, processi strettamente associati allo sviluppo della PE. Questo studio si è proposto di determinare se SASH1 contribuisca all'apoptosi dei trofoblasti e alle risposte infiammatorie nella PE e se gli P-EXOS esercitino effetti protettivi attraverso la regolazione di SASH1. In questo studio, sono stati analizzati tre dataset trascrittomici associati alla PE (GSE75010, GSE10588 e GSE60438) per identificare geni differenzialmente espressi (DEG) comuni, seguiti da analisi di arricchimento per Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Sono stati inoltre applicati algoritmi di apprendimento automatico per selezionare geni candidati chiave, e sono stati utilizzati dati di sequenziamento dell'RNA a singola cellula per caratterizzare l'eterogeneità cellulare nel tessuto placentare e determinare i modelli di espressione specifici per tipo cellulare. SASH1 è stato identificato come gene candidato consensuale ed è risultato significativamente upregolato nelle cellule trofoblastiche provenienti da campioni di PE. In vitro, è stato sviluppato un modello cellulare di trofoblasto HTR-8/SVneo trattato con ipossia, combinato con silenziamento di SASH1, sovraespressione di SASH1 e co-coltura con P-EXOS. Esperimenti funzionali hanno mostrato che il silenziamento di SASH1 ha significativamente inibito l'apoptosi dei trofoblasti indotta dall'ipossia e ridotto la secrezione di citochine pro-infiammatorie, tra cui IL-6, IL-1β e TNF-α, mentre la sovraespressione di SASH1 ha promosso apoptosi e risposte infiammatorie. Inoltre, il trattamento con P-EXOS ha notevolmente ridotto l'espressione di SASH1 a livello di mRNA e di proteina e attenuato il danno trofoblastico indotto dall'ipossia, mentre la sovraespressione di SASH1 ha in gran parte annullato questi effetti protettivi. Nel complesso, questi risultati indicano che SASH1 svolge un ruolo cruciale nell'apoptosi dei trofoblasti e nelle risposte infiammatorie nella PE. Gli P-EXOS potrebbero alleviare il danno trofoblastico indotto dall'ipossia sopprimendo l'espressione di SASH1, fornendo nuove prospettive sui meccanismi molecolari e su potenziali bersagli terapeutici per la PE.
La PE è un disturbo multisistemico specifico della gravidanza che si verifica tipicamente dopo le 20 settimane di gestazione ed è clinicamente caratterizzata da ipertensione, proteinuria e disfunzione multiorgano. Essa rimane una delle principali cause di morbilità e mortalità materne e perinatali a livello mondiale1. Nonostante i continui progressi nella gestione clinica, il trattamento definitivo della PE rimane il parto e l'espulsione della placenta, a dimostrazione della comprensione ancora incompleta della sua patogenesi e della necessità urgente di identificare nuovi meccanismi molecolari e cellulari, nonché potenziali bersagli terapeutici2,3.
Un'adeguata invasione del trofoblasto e la promozione di uno sviluppo placentare normale sono meccanismi fondamentali alla base della patogenesi della PE4. Durante una gravidanza normale, le cellule trofoblastiche invadono la decidua uterina e rimodellano le arterie spirali per stabilire una circolazione a bassa resistenza e ad alta capacità. Un'invasione e una migrazione alterate delle cellule trofoblastiche portano a una ridotta perfusione placentare, determinando un ambiente persistente di ipossia e stress ossidativo. L'ipossia influisce direttamente sull'apoptosi cellulare, e il rilascio anomalo di mediatori pro-infiammatori altera l'omeostasi all'interfaccia materno-fetale, aggravando ulteriormente la disfunzione placentare5. L'infiammazione è inoltre un importante fattore scatenante della PE. Si è osservato che IL-17, IL-6 e TNF-α sono marcatamente aumentati nella placenta e nel sangue periferico dei pazienti con PE6. Ipossia e infiammazione si rafforzano reciprocamente, creando un circolo vizioso che amplifica l'infiammazione sistemica, provoca danni endoteliali e contribuisce ad anomalie placentari. Le reti molecolari sottostanti che regolano l'apoptosi del trofoblasto e le risposte infiammatorie rimangono in gran parte sconosciute.
SASH1 è un membro della famiglia di proteine tampone intracellulari SLy/SASH1 che funziona da adattatore di segnalazione7. SASH1 è stata principalmente caratterizzata come un soppressore tumorale che inibisce la transizione epitelio-mesenchimale (EMT), la migrazione cellulare e l'invasione attraverso interazioni con partner di segnalazione come CRKL e la via PI3K-Akt-mTOR8,9. Oltre ai suoi ruoli di soppressore tumorale, evidenze emergenti suggeriscono che SASH1 partecipa alla segnalazione infiammatoria e alla regolazione immunitaria7. Tuttavia, l'espressione e la funzione di SASH1 nella placenta, in particolare nel contesto della biologia dei trofoblasti e della PE, non sono state ancora investigate.
Gli esosomi si sono affermati come importanti mediatori cellulari e vengono studiati con crescente attenzione nel contesto della gravidanza10. Gli esosomi trasportano diversi carichi bioattivi, inclusi proteine, lipidi e RNA non codificanti, per modulare la funzione delle cellule riceventi. Un numero crescente di evidenze suggerisce che gli P-EXOS svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione immunitaria durante la gravidanza e che la loro attività e il loro carico subiscono alterazioni significative nella PE, potenzialmente aggravando lo stato infiammatorio11. Si è inoltre dimostrato che gli esosomi sono coinvolti nella regolazione dello stress ossidativo12 e nell'angiogenesi13, esercitando potenzialmente effetti benefici nelle complicanze legate alla gravidanza. Tuttavia, i loro bersagli molecolari e i meccanismi d'azione nella PE non sono ancora completamente compresi.
Si è ipotizzato che SASH1 sia disregolato nella placenta con PE e svolga una funzione da fattore chiave nell'apoptosi dei trofoblasti e nelle risposte infiammatorie, e che gli P-EXOS possano esercitare effetti protettivi contro il danno ai trofoblasti modulando l'espressione di SASH1. Per verificare questa ipotesi, sono stati integrati diversi dataset trascrittomici di PE e dati di sequenziamento dell'RNA a singola cellula con apprendimento automatico basato su più algoritmi per identificare geni candidati chiave. Utilizzando un modello cellulare di trofoblasto HTR-8/SVneo trattato con ipossia e esperimenti di intervento basati sugli esosomi, è stato indagato il ruolo funzionale di SASH1 nella disfunzione del trofoblasto e il potenziale terapeutico degli P-EXOS nella PE.
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Dichiarazione etica
Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Quarto di Shijiazhuang (Numero di approvazione: 20200031). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i donatori di tessuto placentare prima della raccolta dei campioni. Tutte le procedure che coinvolgevano partecipanti umani sono state condotte in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Una lista completa di reagenti, materiali di consumo, attrezzature e software utilizzati in questo protocollo è fornita nella Tabella dei Materiali.
Raccolta dei dati
I dati di RNA-seq sono stati ottenuti dal database GEO. I set di dati includevano GSE75010, che contiene dati di espressione genica provenienti da 157 placenti con PE e 173 placenti senza PE (N = 330). GSE10588 contiene dati di espressione genica da 26 placenti normali e 17 placenti con PE grave (N = 43). GSE60438 contiene dati di profilazione del trascrittoma della decidua basalis provenienti da pazienti con pre-eclampsia e da gravidanze normotesive (N = 125). I dati del trascrittoma monocellulare sono stati ottenuti dal set di dati GEO GSE183338. Esso include campioni di singoli nuclei dei villi coriali/interfaccia materno-fetale da gravidanze con PE e da gravidanze sane.
Analisi dei geni differenzialmente espressi
I DEG associati alla PE, i dataset GSE75010, GSE10588 e GSE60438 sono stati prima preelaborati e normalizzati. Successivamente, è stata effettuata un'analisi differenziale utilizzando il pacchetto R “limma”14 basato sulle informazioni di raggruppamento dei campioni. Sono stati selezionati i geni con p < 0,05 e |log2FC| > 0,5. I grafici a vulcano dei DEG sono stati generati utilizzando il pacchetto R ggplot2. Le mappe termiche dei primi 20 DEG sono state realizzate utilizzando il pacchetto R pheatmap. Successivamente, è stata calcolata l'intersezione dei DEG selezionati dai tre dataset ed è stata costruita una rete di interazione proteina-proteina (PPI) per i geni candidati utilizzando la piattaforma online STRING, con un punteggio di interazione ≥0,15. I primi 20 geni hub sono stati ulteriormente identificati da questa rete PPI in base al loro grado di connettività, ordinati utilizzando il software Cytoscape. I risultati della rete PPI sono stati visualizzati utilizzando il software Cytoscape o STRING.
Analisi di arricchimento
L'analisi di arricchimento genico è stata eseguita utilizzando i pacchetti ClusterProfiler e DOSE in combinazione con il sito web Metascape. I database sono stati ottenuti da GO e KEGG. L'analisi di arricchimento è stata condotta utilizzando la funzione “EnrichGO”. I percorsi con p < 0,05 sono stati considerati significativamente arricchiti. I risultati dell'arricchimento sono stati visualizzati utilizzando i pacchetti “ggplot2” e “ggpubr”.
Apprendimento automatico
Per identificare geni differenzialmente espressi (DEG) robusti e biologicamente significativi associati alla preeclampsia, è stata eseguita un'analisi di selezione delle caratteristiche basata su un approccio multi-modello di apprendimento automatico, utilizzando il set di dati trascrittomici pubblicamente disponibile GSE60438 (piattaforma: GPL6884). Questo set di dati contiene il profilo di espressione di campioni di decidua basalis raccolti da gravidanze preeclamptiche e normotesive durante taglio cesareo. I DEG prefiltrati sono stati standardizzati e la matrice di espressione, insieme alle informazioni corrispondenti di raggruppamento clinico, è stata utilizzata come input per quattro distinti algoritmi di apprendimento automatico, al fine di ridurre il bias del modello e migliorare la stabilità della selezione delle caratteristiche.
I quattro algoritmi sono stati applicati simultaneamente, senza un ordine specifico. L'analisi LASSO è stata eseguita utilizzando il pacchetto “glmnet” per condurre un'analisi di regressione e selezionare i geni caratteristici importanti. È stato aggiunto un termine di regolarizzazione L1 alla funzione di perdita, che riduce a zero i coefficienti delle caratteristiche meno importanti, consentendo così la selezione delle caratteristiche. SVM-RFE è stato implementato utilizzando il pacchetto “e1071” per costruire una macchina a vettori di supporto con eliminazione ricorsiva delle caratteristiche. Inizialmente è stato addestrato un classificatore mediante SVM, quindi le caratteristiche meno informative sono state rimosse iterativamente in base ai pesi delle caratteristiche, ottenendo un sottoinsieme ottimale di caratteristiche. XGBoost è stato applicato utilizzando il pacchetto “xgboost” per costruire più alberi decisionali. Ogni albero si adatta ai residui dell'albero precedente e gli output pesati vengono accumulati per ottenere la previsione finale. Boruta è stato eseguito utilizzando il pacchetto “randomForest”, generando caratteristiche ombra che competono con le caratteristiche reali nell'addestramento di una foresta casuale. Sono state mantenute le caratteristiche i cui valori di importanza risultavano significativamente superiori al rumore casuale.
Analisi dei dati del trascrittoma a singola cellula
I dati del trascrittoma a singola cellula sono stati ottenuti dal database GEO e la matrice di conteggio grezza è stata recuperata da GSE183338. La matrice di conteggio è stata importata utilizzando la funzione "Read10X" del pacchetto Seurat e convertita in formato dgCMatrix. Gli oggetti individuali sono stati uniti in un unico oggetto aggregato mediante la funzione "merge" e le etichette delle cellule sono state rese univoche utilizzando "RenameCells". Le cellule di bassa qualità sono state filtrate in base ai seguenti criteri: sono stati rimossi i geni espressi in meno di tre cellule ed escluse le cellule che esprimevano meno di 200 geni. Le cellule controllate per la qualità sono state normalizzate e sono stati identificati i geni altamente variabili. È stata applicata una normalizzazione globale di scala mediante "LogNormalize" (fattore di scala = 10.000), sono stati selezionati i geni altamente variabili (n = 2.000) utilizzando "FindVariableFeatures" e i dati sono stati scalati mediante "ScaleData". È stata eseguita un'analisi delle componenti principali sulle caratteristiche altamente variabili e sono state mantenute le prime 30 componenti principali. Gli effetti di batch tra i campioni sono stati corretti utilizzando il metodo Harmony. Le cellule sono state visualizzate e ridimensionate utilizzando UMAP. Sono stati costruiti grafi di vicini più prossimi condivisi utilizzando "FindNeighbors" e "FindClusters" basati sull'algoritmo di Louvain. Il parametro di risoluzione in "FindClusters" è stato ottimizzato tra 0,1 e 1. L'albero di clustering è stato visualizzato utilizzando la funzione "clustree" ed è stata selezionata una risoluzione di 0,9 per definire i cluster cellulari. I potenziali doublet sono stati rimossi utilizzando l'algoritmo Scrublet. I cluster cellulari sono stati annotati identificando i geni marcatore differenzialmente espressi mediante la funzione "FindAllMarkers". È stato applicato il test non parametrico di Wilcoxon con correzione di Bonferroni. Le identità cellulari sono state assegnate in base ai marcatori di superficie, alla letteratura pertinente e al Cell Classification Database15.
Cultura cellulare
Le cellule della linea cellulare di trofoblasto HTR-8/SVneo sono state coltivate in mezzo RPMI-1640 integrato con siero fetale bovino al 10% e penicillina/streptomicina all'1%. Le condizioni ipossiche sono state create coltivando le cellule al 1% di O₂, 5% di CO₂ e 94% di N₂ per 24 ore; i controlli normossici sono stati mantenuti al 20% di O₂ e 5% di CO₂16. Tutte le procedure di coltura cellulare devono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologica di Classe II utilizzando tecniche asettiche. I mezzi di coltura, i reagenti per la trasfezione e i rifiuti cellulari devono essere smaltiti in conformità con le linee guida istituzionali per la sicurezza biologica.
Trasfezione cellulare
Sono stati sintetizzati plasmidi contenenti sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 e OE-NC. Le cellule HTR-8/SVneo sono state seminate a una densità di 5 × 105 cellule per pozzetto in piastre a sei pozzetti. Successivamente, le cellule sono state trasfettate con 2 µg di plasmide sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 o OE-NC per pozzetto, utilizzando un reagente di trasfezione secondo le istruzioni del produttore. In breve, il DNA plasmidico e il Reagente P3000 sono stati diluiti in Opti-MEM, mescolati con Lipofectamine 3000 diluito separatamente in Opti-MEM, incubati per 15 minuti a temperatura ambiente e aggiunti alle cellule con una confluenza del 70–80%. Quarantotto ore dopo la trasfezione, l'espressione di SASH1 è stata valutata mediante RT-qPCR e Western blot. Le sequenze bersaglio dell'RNA a interferenza utilizzate per l'abbattimento di SASH1 sono elencate nella Tabella Supplementare 1.
PCR quantitativa in tempo reale
L'RNA totale è stato estratto da cellule HTR-8/SVneo e retrotrascritto in cDNA utilizzando un kit di retrotrascrizione a 42 °C per 30 min, seguito da 85 °C per 5 min. La PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) è stata eseguita utilizzando una miscela maestra di SYBR Green con le seguenti condizioni di ciclaggio: 95 °C per 10 min, seguiti da 40 cicli di 95 °C per 15 s e 60 °C per 1 min. L'espressione relativa dell'mRNA è stata calcolata mediante il metodo ΔΔCt, utilizzando β-actin come riferimento interno. Le sequenze dei primer utilizzate in questo esperimento sono elencate nella Tabella Supplementare 2.
Saggio di immunoblotting
Le proteine totali sono state estratte da cellule HTR-8/SVneo utilizzando il buffer di lisi. I lisati cellulari sono stati raccolti, incubati sul ghiaccio e centrifugati a 12.000 × g per 30 min a 4 °C per rimuovere i detriti insolubili. La concentrazione proteica è stata determinata utilizzando uno spettrofotometro. Quantità uguali di proteine (50 µg) sono state separate mediante elettroforesi su gel di SDS-PAGE e successivamente trasferite su membrane in PVDF. Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% e incubate con gli anticorpi primari durante la notte a 4 °C. Dopo il lavaggio, le membrane sono state incubate con gli anticorpi secondari corrispondenti e le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando un sistema di rilevamento chemiluminescente migliorato.
Per la rilevazione delle proteine, gli anticorpi primari utilizzati includevano anti-SASH1 e β-actina. Sono stati impiegati opportuni anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) — anti-coniglio e anti-topo di capra. La β-actina è stata utilizzata come controllo interno del caricamento per garantire un uguale caricamento proteico. L'intensità delle bande proteiche è stata misurata e quantificata mediante il software ImageJ.
Isolamento di P-EXOS
P-EXOS sono stati isolati da tessuto villottico placentare ottenuto da placenti a termine di donne sane sottoposte a taglio cesareo elettivo. Il tessuto villottico placentare è stato lavato accuratamente con PBS sterile, tritato in frammenti di circa 1 mm3 frammenti, e coltivati in mezzo RPMI-1640 integrato con FBS privo di esosomi al 10% a 37 °C in un'atmosfera con 5% di CO₂2 per 48 h. Il mezzo condizionato è stato sottoposto a centrifugazione differenziale come segue: 300 × g per 10 min per rimuovere cellule e detriti tissutali; 2.000 × g per 20 min per rimuovere i detriti cellulari; e 10.000 × g per 30 min per rimuovere i microvescicoli, il tutto a 4 °C. Il sopranatante ottenuto è stato sottoposto a ultracentrifugazione a 120.000 × g per 70 min a 4 °C per ottenere il pellet degli esosomi. Il pellet è stato lavato una volta con PBS e successivamente riultracentrifugato a 120.000 × g per 70 min a 4 °C. Il pellet finale è stato risospeso in PBS. Gli esosomi isolati sono stati caratterizzati mediante analisi Western blot per i marcatori degli esosomi (PLAP, CD63 e TSG101, con GM130 come controllo negativo) e ulteriormente esaminati mediante microscopia elettronica a trasmissione per l'osservazione morfologica.
Esperimento sull'assorbimento cellulare di P-EXOS
Per confermare l'internalizzazione cellulare dei P-EXOS, gli esosomi sono stati marcati con un colorante fluorescente PKH67, un colorante lipofilico per membrane, seguendo il protocollo del produttore. In breve, i P-EXOS sono stati incubati con PKH67 (4 µM) nel Diluente C per 5 min a temperatura ambiente, e la reazione è stata interrotta aggiungendo un volume uguale di albumina sierica bovina (BSA) al 1%. Gli esosomi marcati sono stati quindi re-isolati mediante ultracentrifugazione (120.000 × g, 70 min, 4 °C) per rimuovere il colorante non legato. I P-EXOS marcati con PKH67 (50 µg/mL) sono stati quindi aggiunti alle cellule HTR-8/SVneo e co-incubati per 24 h in condizioni normossiche o ipossiche (1% O₂). Le cellule sono state successivamente lavate tre volte con PBS, fissate con paraformaldeide al 4% per 15 min e i nuclei sono stati contrastati con DAPI (1 µg/mL). L'internalizzazione degli esosomi marcati con PKH67 è stata visualizzata mediante microscopia a scansione laser confocale (CLSM; eccitazione 490 nm, emissione 502 nm). Per esperimenti funzionali di co-coltura, le cellule HTR-8/SVneo sono state trattate con P-EXOS a una concentrazione di 50 µg/mL (equivalente proteico) in mezzo RPMI-1640 completo integrato con FBS privo di esosomi al 10% in condizioni ipossiche (1% O₂) per 24 h.
Saggio immunoenzimatico (ELISA)
I supernatanti di coltura cellulare sono stati raccolti e i livelli di IL-6, IL-1β e TNF-α sono stati misurati utilizzando rispettivamente il kit ELISA per IL-6, il kit ELISA per IL-1β e il kit ELISA per TNF-α, seguendo le istruzioni del produttore. L'assorbanza a 450 nm è stata misurata mediante un lettore di micropiastre e le concentrazioni effettive sono state calcolate a partire dalle curve standard.
Etichettatura degli estremi frammentati mediante TdT-dUTP (TUNEL)
Le cellule apoptotiche sono state rilevate utilizzando il kit per saggio TUNEL secondo le istruzioni del produttore. In breve, le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente, permeabilizzate con Triton X-100 0,1% in PBS per 5 minuti sul ghiaccio e incubate con la miscela di reazione TUNEL per 60 minuti a 37 °C al buio. I nuclei sono stati controstainati con DAPI e le cellule TUNEL-positive sono state visualizzate mediante microscopio a fluorescenza e quantificate contando la percentuale di cellule TUNEL-positive in almeno cinque campi scelti casualmente per ogni campione.
Analisi statistica
Tutti i dati sono stati analizzati utilizzando R e GraphPad Prism. Le variabili continue sono riportate come media ±DS. Il confronto tra due gruppi è stato effettuato mediante il test t di Student, mentre i confronti tra più gruppi sono stati eseguiti mediante ANOVA a un fattore seguita dal test post hoc di Tukey. La significatività statistica per le variabili categoriali è stata valutata mediante il test del chi-quadrato o il test esatto di Fisher. A meno che non indicato diversamente, le correlazioni tra le molecole sono state calcolate mediante analisi della correlazione di Spearman. Gli esperimenti di caratterizzazione degli esosomi sono stati effettuati utilizzando P-EXOS isolati da tre donatori placentari indipendenti. Gli esperimenti su cellule sono stati eseguiti in tre replicati biologici indipendenti, rappresentanti esperimenti indipendenti condotti in occasioni distinte utilizzando cellule HTR-8/SVneo a passaggi diversi, con ciascun replicato che ha utilizzato P-EXOS isolati da un diverso donatore placentario. Un valore di p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
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Analisi trascrittomica di pazienti sani e con PE
Per analizzare le differenze di espressione genica tra il gruppo normale (Normale) e i pazienti con PE, è stata eseguita un'analisi dell'espressione differenziale mediante il pacchetto R limma nei dataset uniti. Sono stati identificati complessivamente 89 geni differenzialmente espressi (DEG) (p < 0,05 e |log2FC| > 0,5), di cui 69 geni upregolati e 20 geni downregolati per GSE75010 (
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In questo studio, SASH1 è stato identificato come un gene chiave disregolato nella PE mediante analisi trascrittomica integrata, sequenziamento a singola cellula e apprendimento automatico basato su multipli algoritmi, un approccio particolarmente rilevante considerando che al momento non esistono terapie mirate per la PE17. È stato dimostrato che SASH1 è significativamente sovraespresso nelle cellule trofoblastiche ipossiche ed è specificamente aumentato nel compartimento trofoblastico delle plac...
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Non vi è alcun conflitto di interessi in questo studio.
Questo studio è stato finanziato dal Programma Chiave per la Ricerca Scientifica in Medicina della Commissione Sanitaria della Provincia di Hebei, Cina (n. 20210075).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Mezzo RPMI-1640 | Gibco | 11875085 | |
| Serum bovino fetale (FBS) | Gibco | 16140071 | |
| FBS privo di esosomi | System Biosciences | EXO-FBS-50A-1 | |
| Penicillina/Streptomicina | Thermo Fisher Scientific, CN | 15140122 | |
| Reagente di trasfezione Lipofectamine 3000 (con reagente P3000) | Thermo Fisher Scientific, CN | L3000150 | |
| Mezzo Opti-MEM a ridotto contenuto di siero | Thermo Fisher Scientific, CN | 31985070 | |
| Plasmide shRNA per SASH1 (HuSH) | origene | TL301836 | |
| Plasmide di espressione ORF per SASH1 | origene | RC218866 | |
| Plasmide di controllo vuoto | origene | PS100001 | |
| Kit di trascrizione inversa | Thermo Fisher Scientific, CN | 4368814 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific, CN | A46110 | |
| Primer per SASH1 | Sangon Biotech | Sintetizzati su misura | |
| Primer per β-actina | Sangon Biotech | Sintetizzati su misura | |
| Tampone di lisi cellulare | Beyotime | P0013B | |
| Spettrofotometro NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, CN | NanoDrop Ultra | |
| Membrana PVDF | Thermo Fisher Scientific, CN | 88518 | |
| Anticorpo anti-SASH1 | ABclonal | A15248 | |
| Anticorpo anti-β-actina | Abcam | ab6276 | |
| Anticorpo secondario coniugato con HRP, capra anti-coniglio/anti-topo | Beyotime | A0208 | |
| Software ImageJ | NIH (dominio pubblico) | ImageJ | |
| Kit PKH67 Green Fluorescent Cell Linker (incluso Diluente C) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | MINI67 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | 10711454001 | |
| DAPI | Beyotime | C1002 | |
| Microscopio confocale a scansione laser (CLSM) | Leica | Leica TCS SP8 | |
| Kit ELISA Quantikine per IL-6 umana | R&D Systems | D6050B | |
| Kit ELISA DuoSet per IL-1β/IL-1F2 umana | R&D Systems | DY201 | |
| Kit ELISA Quantikine per TNF-α umano | R&D Systems | DTA00D | |
| Lettore di micropiastre | Thermo Scientific | Multiskan FC | |
| Kit di rilevamento della morte cellulare in situ (Kit per saggio TUNEL) | Roche | 11684795910 | |
| Triton X-100 | Beyotime | P0096 | |
| Paraformaldeide (4%) | Beyotime | P0099 | |
| Microscopio a fluorescenza | Olympus | BX53 | |
| Centrifuga refrigerata (capacità 12.000 × g) | Eppendorf | Eppendorf 5430 R | |
| Ultracentrifuga (capacità 120.000 × g) | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
| Software R | The R Foundation | v4.2.1 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v10.0 | |
| Seurat (pacchetto R) | Satija Lab (open-source) | v4.0.4 | |
| Harmony (pacchetto R, correzione batch) | Open-source | v1.2.0 | |
| Scrublet (pacchetto Python, rilevamento doublet) | Open-source | v0.2.3 | |
| clustree (pacchetto R) | Open-source | v0.5.1 | |
| glmnet (pacchetto R, LASSO) | Open-source | v4.1.8 | |
| e1071 (pacchetto R, SVM-RFE) | Open-source | v1.7-14 | |
| xgboost (pacchetto R) | Open-source | v1.7.7.1 | |
| randomForest (pacchetto R, Boruta) | Open-source | v4.7-1.1 | |
| Database Gene Expression Omnibus (GEO) | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | |
| Database STRING | string-db.org | https://www.string-db.org/ | |
| Metascape | metascape.org | https://metascape.org/ | |
| Software Cytoscape | Cytoscape Consortium | v3.10.4 | |
| ggplot2 (pacchetto R) | Open-source | v3.5.1 | |
| limma (pacchetto R) | Open-source | v3.58.1 | |
| pheatmap (pacchetto R) | Open-source | v1.0.12 | |
| ClusterProfiler (pacchetto R) | Open-source | v4.8.3 | |
| DOSE (pacchetto R) | Open-source | v3.28.2 | |
| ggpubr (pacchetto R) | Open-source | v0.6.0 |
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