L'estratto di ZeLan ha migliorato i fenotipi endocrini e metabolici nei ratti con PCOS indotta da DHEA. L'integrazione di sequenziamento 16S rRNA e metabolomica sierica ha mostrato un ripristino parziale della diversità alfa microbica intestinale, alterazioni nella composizione microbica e variazioni dei metaboliti che coinvolgono ormoni steroidei, acidi biliari e acidi grassi a catena corta.
Articolo di ricerca
Lycopus lucidus Estratto Migliora la Sindrome dell'Ovaio Policistico Sperimentale con la Rimodellazione del Microbiota Intestinale e del Metaboloma
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo studio ha indagato gli effetti terapeutici dell'estratto di ZeLan sul sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) e ne ha valutato l'associazione con la rimodellazione del microbiota intestinale e del metaboloma. Ventiquattro ratti femmine Sprague-Dawley sono stati suddivisi casualmente in gruppi Controllo, Modello di PCOS indotto da deidroepiandrosterone (DHEA) e trattamento con ZeLan (n = 8 ciascuno). Dopo 28 giorni di intervento, i livelli ormonali nel siero sono stati misurati mediante ELISA; la composizione del microbiota intestinale è stata analizzata mediante sequenziamento del gene 16S rRNA e i profili metabolici sierici sono stati caratterizzati mediante UHPLC-Q-TOF-MS. È stata eseguita un'analisi di correlazione di Spearman con controllo della multipla verifica degli errori per esplorare le associazioni tra microbiota e metaboloma. ZeLan ha migliorato significativamente i fenotipi associati alla PCOS, riducendo il peso corporeo, i livelli di testosterone (0,92 rispetto a 1,85 ng/mL, P < 0,05), il rapporto LH/FSH e i livelli di insulina rispetto al gruppo Modello. Il sequenziamento ha mostrato che ZeLan ha ripristinato parzialmente la diversità microbica alfa (indice di Shannon: 5,79 rispetto a 4,19) e ha ridotto il rapporto Firmicutes/Bacteroidetes. ZeLan è stato associato a un arricchimento di Lactobacillus e Ruminococcus e a una minore abbondanza di Bacteroides, Prevotella ed Escherichia. L'analisi metabolomica ha identificato 52 caratteristiche metaboliche alterate, con cambiamenti chiave che coinvolgevano ormoni steroidei, acidi biliari come l'acido litocolico e acidi grassi a catena corta come l'acido butirrico. Questi risultati suggeriscono che ZeLan attenua i disturbi endocrini e metabolici associati alla PCOS ed è correlato alla rimodellazione dei profili microbici intestinali e metabolici sierici.
Introduzione
La sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) rappresenta uno dei disturbi endocrini più comuni che colpiscono le donne in età riproduttiva, con una prevalenza globale stimata tra il 6% e il 20% a seconda dei criteri diagnostici utilizzati1. Questo complesso disturbo metabolico e riproduttivo è caratterizzato da un insieme di manifestazioni cliniche, tra cui iperandrogenismo, disfunzione ovulatoria e morfologia ovarica policistica, che insieme contribuiscono a conseguenze riproduttive, metaboliche e psicologiche significative2. Oltre al suo impatto diretto sulla fertilità, la PCOS è sempre più riconosciuta come una condizione sistemica associata a complicanze sanitarie a lungo termine, tra cui diabete mellito di tipo 2, malattie cardiovascolari e carcinoma dell'endometrio, imponendo così un notevole carico sia sui singoli pazienti sia sui sistemi sanitari mondiali3. La fisiopatologia della PCOS non è ancora completamente compresa, sebbene si ritenga generalmente che coinvolga interazioni complesse tra predisposizione genetica, fattori ambientali e determinanti dello stile di vita, che portano alle alterazioni ormonali e metaboliche tipiche osservate nei soggetti colpiti4.
Gli approcci terapeutici contemporanei per la sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) si concentrano principalmente sulla gestione sintomatica attraverso interventi farmacologici, tra cui contraccettivi orali per la regolazione del ciclo mestruale, metformina per la sensibilizzazione all'insulina e anti-androgeni per il controllo dell'irsutismo5. Tuttavia, questi trattamenti convenzionali spesso offrono un sollievo incompleto dei sintomi e sono frequentemente associati a effetti avversi che ne limitano l'applicabilità a lungo termine, in particolare nelle donne con desiderio di fertilità6. Di conseguenza, negli ultimi anni è cresciuto l'interesse verso l'uso di medicine complementari e alternative, in particolare la medicina tradizionale cinese (MTC), che vanta secoli di esperienza empirica nel trattamento dei disturbi ginecologici grazie a meccanismi regolatori olistici7. Tra i numerosi farmaci botanici studiati per la gestione della PCOS, Lycopus lucidus Turcz. (comunemente noto come ZeLan nella medicina cinese) ha attirato notevole attenzione per le sue applicazioni tradizionali nel promuovere la circolazione sanguigna, risolvere la stasi e regolare il ciclo mestruale8. Studi fitochimici pubblicati indicano che L. lucidus contiene frazioni ricche di polifenoli e flavonoidi dotate di attività antiossidante e antinfiammatoria8,9. Pertanto, nel presente studio il contenuto standardizzato di flavonoidi totali è stato utilizzato come indice chimico di controllo qualità per l'estratto, sebbene l'identificazione dei singoli monomeri attivi responsabili della regolazione del microbiota e del metabolismo richieda analisi fitochimiche mirate in futuro.
La microflora intestinale si è affermata come un regolatore fondamentale del metabolismo e della funzione endocrina dell'ospite, con crescenti evidenze a sostegno del suo coinvolgimento nella patogenesi di diverse malattie metaboliche, tra cui la sindrome dell'ovaio policistico (PCOS)10. È stato proposto il concetto di asse intestino-ovaio per descrivere la comunicazione bidirezionale tra i microrganismi intestinali e la funzione ovarica, mediata da metaboliti microbici, segnalazione immunitaria e vie neuroendocrine11. Si è costantemente osservato che le donne con PCOS presentano una disbiosi intestinale caratterizzata da ridotta diversità microbica, alterato rapporto Firmicutes/Bacteroidetes e abbondanza diminuita di batteri benefici come le specie di Lactobacillus e Bifidobacterium12. Si ritiene che queste alterazioni microbiche contribuiscano alla fisiopatologia della PCOS attraverso diversi meccanismi, tra cui un'aumentata permeabilità intestinale, un'infiammazione sistemica di basso grado e un alterato metabolismo degli acidi biliari e degli acidi grassi a catena corta (SCFA), che influenzano successivamente la sensibilità all'insulina e la biosintesi degli androgeni13. In modo significativo, interventi mirati alla microflora intestinale, tra cui probiotici, prebiotici e modifiche dietetiche, hanno mostrato risultati promettenti nel migliorare i sintomi della PCOS, sostenendo così l'asse intestino-ovaio come potenziale bersaglio terapeutico14.
La metabolomica, l'analisi completa dei metaboliti a basso peso molecolare nei sistemi biologici, rappresenta un approccio potente per caratterizzare le perturbazioni metaboliche associate a stati patologici e per valutare gli effetti biochimici di interventi terapeutici15. L'integrazione del sequenziamento del gene 16S rRNA per il profilo del microbioma con la metabolomica non mirata consente un'indagine sistematica delle relazioni tra le comunità microbiche intestinali e il metabolismo dell'ospite, offrendo spunti sulle interazioni tra microbiota e metaboloma che potrebbero accompagnare sia la patogenesi delle malattie sia le risposte al trattamento. Nonostante la giustificazione teorica per il targeting dell'asse intestino-ovaio nella gestione della PCOS e le indicazioni tradizionali di ZeLan per disturbi ginecologici, ad oggi nessuno studio ha indagato sistematicamente se l'estrazione di ZeLan moduli l'interfaccia tra microbiota intestinale e metaboloma nella PCOS. Questa lacuna conoscitiva limita la nostra comprensione delle risposte biologiche associate a ZeLan e ostacola l'ottimizzazione razionale di questo intervento botanico per il trattamento della PCOS.
Lo studio attuale è stato progettato per indagare l'efficacia terapeutica dell'estratto di ZeLan in un modello di ratto di PCOS indotta da DHEA e per valutare le relative alterazioni del microbiota intestinale e del metaboloma mediante sequenziamento integrato del 16S rRNA e analisi metabolomica non mirata. In particolare, abbiamo valutato gli effetti dell'estratto di ZeLan su fenotipi correlati alla PCOS, inclusi peso corporeo, testosterone sierico, rapporto tra ormone luteinizzante e ormone follicolo-stimolante (LH/FSH) e livelli di insulina; abbiamo caratterizzato le alterazioni nella composizione del microbiota intestinale e nella diversità alfa in seguito al trattamento con ZeLan; abbiamo identificato caratteristiche differenziali dei metaboliti sierici e percorsi metabolici arricchiti associati all'intervento con ZeLan; ed abbiamo esplorato le correlazioni tra specifici taxa microbici intestinali e metaboliti chiave. Affrontando questi obiettivi, abbiamo cercato di fornire evidenze associative di tipo multi-omico riguardo alla modulazione dell'asse intestino-ovaio da parte di ZeLan nella PCOS.
Protocollo
Tutte le procedure sperimentali del presente studio sono state condotte in conformità con le linee guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (Numero di approvazione: IACUC-2023-0156).
Animali
Ratti femmina Sprague-Dawley (n = 24, 6 settimane di età, peso corporeo 180–200 g) sono stati ottenuti dal Centro per gli Animali da Laboratorio dell'istituzione affiliata e allevati in condizioni ambientali controllate (temperatura 22 ± 2°C, umidità 50 ± 10%, ciclo luce/buio di 12 ore) con libero accesso a mangime standard per roditori e acqua purificata. Dopo un periodo di ambientamento di una settimana, gli animali sono stati assegnati casualmente a tre gruppi sperimentali (n = 8 per gruppo): Controllo, Modello PCOS e Trattamento ZeLan. La dimensione del campione è stata determinata sulla base di studi precedenti che hanno indagato le alterazioni della microbiota intestinale nei modelli di PCOS, con un'analisi della potenza statistica che ha indicato come 8 animali per gruppo garantiscano una potenza dell'80% nel rilevare una differenza di 1,5 volte negli indici di diversità alfa a α = 0,05.
Stabilimento del modello di PCOS e protocollo di trattamento
Il modello di PCOS è stato stabilito seguendo un protocollo ben validato che prevede l'iniezione sottocutanea di deidroepiandrosterone (DHEA; Sigma-Aldrich, USA) disciolto in olio di sesamo nella regione dorsale del collo, a un dosaggio di 6 mg/100 g di peso corporeo, somministrato quotidianamente per 21 giorni consecutivi. Gli animali del gruppo di controllo hanno ricevuto volumi equivalenti di olio di sesamo come veicolo. L'intera durata sperimentale comprendeva 7 giorni di acclimatazione, 21 giorni di induzione del modello e 28 giorni di intervento, con il prelievo finale al giorno 56 del protocollo, inclusi i giorni di acclimatazione (Figura 1). L'estratto ZeLan è stato preparato a partire dall'erbaceo autentificato Lycopus lucidus Turcz. mediante estrazione acquosa ed è stato standardizzato per contenere un totale di flavonoidi non inferiore al 2,5%, determinato mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni, che ha costituito il criterio di controllo qualitativo chimico dell'estratto botanico. A partire dal completamento della fase di induzione del modello mediante DHEA, i ratti del gruppo ZeLan hanno ricevuto per via orale l'estratto ZeLan a un dosaggio di 200 mg/kg di peso corporeo, somministrato quotidianamente per 28 giorni consecutivi, mentre i gruppi Controllo e Modello hanno ricevuto volumi equivalenti di acqua distillata. Il dosaggio di 200 mg/kg è stato scelto come dose farmacologica esplorativa in base all'esperienza pregressa nell'uso di estratti botanici in modelli animali e a considerazioni preliminari di tollerabilità; una valutazione formale della risposta dose-dipendente non faceva parte del presente disegno sperimentale. Il peso corporeo è stato registrato settimanalmente per tutta la durata dell'esperimento. In questo disegno sperimentale, la corretta induzione del modello di PCOS è stata valutata sulla base del protocollo di induzione con DHEA insieme a fenotipi endocrini e metabolici finali, inclusi il peso corporeo, il testosterone sierico, il rapporto LH/FSH e l'insulina a digiuno. L'esame istopatologico ovarico, il conteggio dei follicoli, la quantificazione dei corpi lutei e il monitoraggio seriale del ciclo estrale non sono stati inclusi come endpoint di conferma del modello; pertanto, l'interpretazione della disfunzione ovarica si è basata su parametri endocrini e metabolici piuttosto che su una valutazione diretta a livello tissutale.
Raccolta ed elaborazione del campione
I campioni (siero e feci) sono stati raccolti da tutti e tre i gruppi (n = 8 per gruppo) per successive analisi biochimiche, di microbiota e di metabolomica. Le raccolte finali sono state effettuate al mattino dopo un digiuno notturno per ridurre la variabilità legata al ritmo circadiano e all'alimentazione. I campioni di sangue sono stati prelevati dall'aorta addominale sotto anestesia e centrifugati a 3.000 × g per 15 minuti a 4°C per ottenere il siero, che è stato suddiviso in aliquote e conservato a -80°C fino alle analisi ormonali e metabolomiche. I campioni fecali freschi sono stati raccolti direttamente dal cieco in condizioni asettiche in cryotubi sterili, mantenuti sul ghiaccio secco durante il trasferimento, congelati rapidamente in azoto liquido entro 10 minuti dal prelievo e conservati a -80°C fino al sequenziamento del gene 16S rRNA.
Misurazioni ormonali nel siero
Le concentrazioni sieriche di testosterone, ormone luteinizzante (LH), ormone follicolo-stimolante (FSH) e insulina sono state quantificate utilizzando kit per saggio immunoenzimatico (ELISA) disponibili in commercio (Cusabio Biotech, Wuhan, Cina) secondo le istruzioni del produttore. Il rapporto LH/FSH è stato calcolato come indice composito di squilibrio gonadotropinico caratteristico del PCOS. Tutti i campioni sono stati analizzati in duplicato e le misurazioni con coefficienti di variazione superiori al 15% sono state ripetute. I coefficienti di variazione intra-saggio e inter-saggio dovevano rimanere rispettivamente al di sotto del 10% e del 15%. Eventuali valori anomali sono stati verificati confrontandoli con i dati originali e le informazioni sul rendimento del saggio, e nessun valore è stato escluso esclusivamente per motivi statistici senza una motivazione tecnica documentata.
Sequenziamento del gene dell'RNA ribosomiale 16S e analisi bioinformatica
Il DNA genomico batterico totale è stato estratto dai contenuti ciecali utilizzando il QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Germania) seguendo il protocollo del produttore. La qualità e la quantità del DNA sono state valutate mediante spettrofotometria NanoDrop ed elettroforesi su gel di agarosio, e gli estratti di DNA sono stati conservati a -80°C prima della costruzione delle librerie. Le regioni ipervariabili V3-V4 del gene 16S rRNA sono state amplificate utilizzando i primer universali 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') e 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') con sequenze adattatrici Illumina. Le librerie di ampliconi sono state costruite, purificate, quantificate, raggruppate in concentrazioni equimolari e sequenziate sulla piattaforma Illumina NovaSeq 6000 (Novogene, Pechino, Cina) utilizzando letture paired-end di 250 bp.
Le letture di sequenziamento grezze sono state elaborate utilizzando la pipeline QIIME2 (versione 2022.2). Le letture paired-end sono state demultiplexate, unite, filtrate per qualità utilizzando una soglia del punteggio Phred di almeno 20 ed elaborate con DADA2 per rimuovere le sequenze chimere e generare varianti di sequenza dell'amplicone (ASV). La classificazione tassonomica è stata effettuata confrontando con la base di dati di riferimento SILVA 138 mediante un classificatore bayesiano naïve. Sono state calcolate metriche di diversità alfa, inclusi l'indice di Shannon, l'indice di Simpson e lo stimatore di Chao1, per valutare la diversità e la ricchezza all'interno dei campioni. I risultati relativi alla profondità di sequenziamento, inclusi riepiloghi delle letture, tabelle di abbondanza delle ASV, copertura di Good e file delle curve di rarefazione, sono stati considerati parte del set di dati del microbioma descritto nella sezione Disponibilità dei Dati. L'analisi lineare della dimensione dell'effetto (LEfSe) è stata utilizzata per identificare i taxa associati alla malattia nel confronto tra Controllo e Modello, utilizzando una soglia del punteggio LDA maggiore di 2,0 e P < 0,05; il ripristino associato a ZeLan è stato valutato confrontando la direzione delle variazioni di abbondanza tassonomica nel gruppo ZeLan rispetto al gruppo Modello.
Analisi di metabolomica non mirata
Il profilo metabolomico del siero è stato eseguito mediante cromatografia liquida ad altissime prestazioni abbinata a spettrometria di massa con analizzatore a quadrupolo e tempo di volo (UHPLC-Q-TOF-MS; Agilent 1290 Infinity II/6550, USA). I campioni di siero (100 μL) sono stati mescolati con 400 μL di metanolo freddo:acetonitrile (1:1, v/v) contenente standard interni, vortexati e incubati a -20°C per 1 ora per precipitare le proteine. Dopo centrifugazione a 14.000 × g per 15 minuti, i soprannatanti sono stati essiccati sotto flusso di azoto e ricostituiti in 100 μL di acetonitrile:acqua (1:1, v/v) per l'analisi. La separazione cromatografica è stata effettuata su una colonna ACQUITY UPLC HSS T3 (2,1 × 100 mm, 1,8 μm) mantenuta a 40°C, utilizzando acqua contenente acido formico allo 0,1% come fase mobile A e acetonitrile contenente acido formico allo 0,1% come fase mobile B, a un flusso di 0,30 mL/min. È stato utilizzato un programma a gradiente che incrementa la fase organica dal 5% al 95%, seguito da lavaggio della colonna e re-equilibrazione, per la separazione dei metaboliti. I dati spettrometrici di massa sono stati acquisiti sia in modalità di ionizzazione elettrospray positiva che negativa, con un intervallo di scansione di m/z 50–1200; i parametri della sorgente includevano una tensione del capillare di 3,5 kV, un flusso del gas di essiccazione di 10 L/min, una temperatura del gas di essiccazione di 325°C, una pressione del nebulizzatore di 35 psi e una tensione del fragmentor di 120 V.
I file di dati grezzi sono stati convertiti in formato mzXML ed elaborati utilizzando il pacchetto XCMS in R per la rilevazione dei picchi, l'allineamento dei tempi di ritenzione e l'integrazione dell'area dei picchi. Campioni di controllo della qualità, preparati unendo aliquote uguali di tutti gli estratti sierici, sono stati inseriti lungo tutta la sequenza analitica per monitorare la stabilità dello strumento. Le caratteristiche con un'elevata percentuale di dati mancanti o con riproducibilità instabile nei controlli di qualità sono state eliminate prima della modellizzazione statistica. L'identificazione dei metaboliti è stata effettuata confrontando la massa esatta, il tempo di ritenzione e i modelli di frammentazione MS/MS con quelli presenti nel Human Metabolome Database (HMDB), METLIN e librerie spettrali interne. Analisi statistiche multivariate sono state condotte utilizzando MetaboAnalyst 5.0. Le caratteristiche metaboliche conservate per la successiva segnalazione sono state selezionate in base a un criterio combinato che includeva il contributo discriminatorio multivariato, la direzione del fold-change e l'evidenza statistica; i valori P sono stati corretti mediante il metodo di Benjamini-Hochberg per tenere conto dei test multipli. La tabella completa annotata di segnalazione, contenente 52 caratteristiche metaboliche, è fornita come Tabella Supplementare 1. L'analisi dell'arricchimento di pathway è stata effettuata utilizzando il database Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).
Analisi statistica
Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando SPSS versione 26.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA) e il software R (versione 4.2.1). I dati continui sono stati espressi come media ± deviazione standard (SD) e sono stati valutati per la normalità mediante il test di Shapiro-Wilk prima dei test inferenziali. Per i dati distribuiti normalmente, è stata utilizzata l'analisi della varianza a un fattore (ANOVA) seguita dal test post hoc di Tukey per i confronti tra più gruppi; per i dati non distribuiti normalmente, è stato utilizzato il test di Kruskal-Wallis con test post hoc di Dunn. Le correlazioni tra i taxa microbici intestinali e i metaboliti sierici sono state valutate mediante il coefficiente di correlazione dei ranghi di Spearman e visualizzate come heatmap gerarchicamente raggruppate. I valori P delle correlazioni sono stati corretti per i test multipli utilizzando il metodo del tasso di scoperte false di Benjamini-Hochberg, e sono state interpretate solo le correlazioni concordi nel verso e statisticamente significative. Un valore P a due code < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo, salvo indicazione di una soglia di valore P aggiustata.
Risultati
Effetti dell'estratto di ZeLan sui fenotipi clinici della PCOS
L'amministrazione di DHEA ha indotto nei ratti fenotipi endocrini e metabolici simili alla sindrome dell'ovaio policistico (PCOS), come dimostrato da significativi aumenti del peso corporeo, della concentrazione sierica di testosterone, del rapporto LH/FSH e dei livelli di insulina a digiuno rispetto al gruppo di controllo (tutti P < 0,05). La valutazione della distribuzione mediante il test di Shapiro-Wilk ha supportato l'analisi parametrica per i principali parametri relativi al peso corporeo e agli ormoni riassunti nella Tabella 1. Il trattamento con estratto di ZeLan per 28 giorni ha significativamente migliorato tali alterazioni metaboliche e ormonali. Il peso corporeo è stato registrato al termine del periodo di trattamento, al giorno 56 del protocollo, compreso il periodo di acclimatamento di 7 giorni. Come mostrato nella Tabella 1, il peso corporeo nel gruppo Modello (291,12 ± 15,35 g) era notevolmente più elevato rispetto a quello del gruppo Controllo (227,45 ± 10,12 g, P < 0,05), mentre il trattamento con ZeLan ha ridotto significativamente il peso corporeo a 245,25 ± 10,21 g (P < 0,05 rispetto al Modello). I livelli sierici di testosterone erano marcatamente aumentati nei ratti modello di PCOS (1,85 ± 0,21 ng/mL) rispetto ai controlli (0,51 ± 0,05 ng/mL) e l'intervento con ZeLan ha ridotto il testosterone a 0,92 ± 0,12 ng/mL. Il rapporto LH/FSH era significativamente aumentato nel gruppo Modello (3,28 ± 0,25) rispetto al gruppo Controllo (1,25 ± 0,11) ed è stato parzialmente normalizzato dal trattamento con ZeLan (1,85 ± 0,15). I livelli di insulina a digiuno erano elevati negli animali modello (28,95 ± 2,35 mIU/L rispetto a 12,55 ± 1,12 mIU/L nei controlli) e sono stati significativamente ridotti dopo l'amministrazione di ZeLan (18,82 ± 1,55 mIU/L) (Figura 2). Questi risultati hanno confermato il corretto sviluppo di un fenotipo simile alla PCOS dal punto di vista endocrino-metabolico; tuttavia, in questo studio non sono state effettuate analisi istopatologiche ovariche, conteggi dei follicoli, analisi dei corpi lutei né monitoraggio del ciclo estrale.
L'estrazione di ZeLan ha ripristinato l'alpha diversità del microbiota intestinale
L'analisi degli indici di diversità alfa ha rivelato alterazioni sostanziali nella struttura della comunità microbica intestinale associate al PCOS e al suo trattamento. Come mostrato in Tabella 2 e in Figura 3, l'indice di diversità di Shannon era significativamente più basso nei ratti modello di PCOS (4,19 ± 0,35) rispetto ai controlli sani (6,51 ± 0,28; P < 0,05), indicando una riduzione della diversità microbica alfa nello stato patologico. Il trattamento con ZeLan ha ripristinato parzialmente la diversità microbica, con l'indice di Shannon che è aumentato a 5,79 ± 0,26 (P < 0,05 rispetto al Modello). Risultati coerenti sono stati osservati per l'indice di Simpson, che è diminuito da 0,98 ± 0,01 nei controlli a 0,82 ± 0,03 negli animali modello, ripristinandosi a 0,93 ± 0,02 dopo l'intervento con ZeLan. L'indice Chao1, che riflette la ricchezza specifica, ha mostrato un andamento simile: l'induzione del PCOS ha ridotto notevolmente il valore di Chao1 da 1215,3 ± 45,4 a 665,8 ± 52,1, mentre il trattamento con ZeLan ha aumentato la ricchezza a 963,5 ± 38,6. Nel complesso, questi risultati indicano che il PCOS è associato a una disbiosi microbica intestinale caratterizzata da ridotta diversità alfa e ricchezza, e che l'estratto di ZeLan può ripristinare parzialmente la struttura della comunità microbica avvicinandola al profilo del gruppo di controllo.
Alterazioni nella composizione della microbiota intestinale
Il profilo tassonomico a livello di phylum ha rivelato differenze compositive distinte tra i gruppi sperimentali. Come illustrato nella Figura 4, Firmicutes e Bacteroidetes erano i phyla dominanti in tutti i gruppi, rappresentando complessivamente oltre l'85% della comunità batterica totale. Il gruppo Modello mostrava un abbondanza notevolmente aumentata di Firmicutes (circa il 75%) associata a una ridotta proporzione di Bacteroidetes (circa il 15%), rispetto al gruppo Controllo (Firmicutes circa il 40%, Bacteroidetes circa il 45%), determinando un rapporto Firmicutes/Bacteroidetes (F/B) marcatamente aumentato, caratteristico di una disbiosi metabolica. Il trattamento con ZeLan ha modulato questo squilibrio, riducendo l'abbondanza di Firmicutes al circa 52% e aumentando quella di Bacteroidetes al circa 35%, riportando parzialmente il rapporto F/B verso i livelli del gruppo controllo.
L'analisi LEfSe è stata utilizzata per identificare i taxa batterici che differenziavano i gruppi Controllo e Modello, definendo così la firma microbica associata alla malattia. Come mostrato nella Figura 5, a livello di genere, il gruppo Modello PCOS ha mostrato abbondanze significativamente elevate di Bacteroides (punteggio LDA > 3,5), Prevotella (punteggio LDA > 3,0) ed Escherichia (punteggio LDA > 2,5), tutti generalmente associati in precedenza a disfunzioni metaboliche e infiammazione. Al contrario, il gruppo Controllo ha mostrato un arricchimento di generi benefici, tra cui Lactobacillus (punteggio LDA > 3,0) e Ruminococcus (punteggio LDA > 2,5), entrambi riconosciuti per il loro ruolo nel mantenere l'integrità della barriera intestinale e nella produzione di metaboliti benefici come gli acidi grassi a catena corta. Il gruppo ZeLan non è stato visualizzato come una classe LEfSe separata nella Figura 5 perché questa analisi si è concentrata sui taxa che distinguono la malattia dalla salute; gli effetti legati a ZeLan sono stati interpretati dagli spostamenti nell'abbondanza verso il profilo del gruppo Controllo e dalle correlazioni tra microbioma e metaboloma.
Analisi del profilo metabolomico e identificazione dei metaboliti differenziali
L'analisi di metabolomica non mirata ha identificato notevoli perturbazioni metaboliche associate al PCOS e al suo trattamento con estratto di ZeLan. Il diagramma a vulcano in Figura 6 mostra la distribuzione delle caratteristiche dei metaboliti tra i gruppi Modello e Controllo, con le caratteristiche sovra- e sotto-regolate evidenziate in base alla direzione del rapporto di variazione e alla significatività statistica. Un totale di 52 caratteristiche di metaboliti annotati è stato mantenuto nella tabella completa di reporting metabolomico per il confronto tra Modello e Controllo. L'elenco completo, che include il nome del metabolita, l'identificatore HMDB, la classe biochimica, il log2 del rapporto di variazione, il valore P e la direzione della regolazione, è fornito come Tabella Supplementare 1. Tabella 3 presenta metaboliti annotati rappresentativi con elevata rilevanza biologica per il PCOS.
Tabella 3 riassume i principali metaboliti differenziali rappresentativi con elevati punteggi VIP e rilevanza biologica nella fisiopatologia della PCOS. Gli ormoni steroidei, tra cui il testosterone (VIP = 2,56, P < 0,001) e l'androstenedione (VIP = 2,34, P < 0,001), erano significativamente aumentati negli animali modello di PCOS, in accordo con lo stato di iperandrogenismo caratteristico di questa condizione. Anche il metabolismo degli acidi grassi risultava alterato, con aumenti significativi di acido palmitico (VIP = 2,12) e acido arachidonico (VIP = 1,89), mentre il mediatore lipidico pro-infiammatorio prostaglandina E2 risultava analogamente upregolato (VIP = 2,05). Al contrario, nei modelli animali di PCOS si osservava una riduzione dei metaboliti associati all’attività benefica del microbiota intestinale: l’acido litocolico, un acido biliare secondario prodotto tramite biotrasformazione microbica, diminuiva in modo sostanziale (VIP = 2,45), così come l’acido grasso a catena corta acido butirrico (VIP = 2,21). Inoltre, l’acido succinico e l’amminoacido essenziale L-triptofano mostravano riduzioni nel gruppo Modello, suggerendo un’alterata fermentazione microbica e un modificato metabolismo degli amminoacidi.
Analisi dell'arricchimento dei pathway KEGG
L'analisi dell'arricchimento dei percorsi metabolici tramite il database KEGG ha rivelato diversi percorsi metabolici sierici significativamente alterati nella PCOS e modulati dal trattamento con ZeLan. Come mostrato nella Figura 7, la biosintesi degli ormoni steroidei si è rivelata il percorso maggiormente arricchito (Fattore di arricchimento = 0,80, P < 0,01), in accordo con il fenotipo iperandrogenico della PCOS. Anche il percorso di steroidogenesi ovarica è risultato fortemente arricchito (Fattore di arricchimento = 0,75, P < 0,01), a indicare il coinvolgimento della sintesi alterata di androgeni nella disfunzione ovarica. La biosintesi degli acidi biliari primari ha mostrato un significativo arricchimento (Fattore di arricchimento = 0,62, P < 0,02), indicando una circolazione enteroepatica degli acidi biliari alterata, potenzialmente correlata a modificazioni del microbiota intestinale. Il metabolismo dell'acido arachidonico (Fattore di arricchimento = 0,56, P < 0,03) e il percorso della resistenza all'insulina (Fattore di arricchimento = 0,40, P < 0,04) sono risultati anch'essi significativamente arricchiti, confermando la presenza di alterazioni infiammatorie e metaboliche tipiche della PCOS. Il percorso di biosintesi degli acidi grassi ha mostrato un arricchimento moderato (Fattore di arricchimento = 0,30), suggerendo un coinvolgimento della disregolazione del metabolismo lipidico.
Analisi della correlazione tra microbioma e metaboloma
Per valutare le relazioni funzionali tra la composizione del microbiota intestinale e le alterazioni metaboliche, è stata effettuata un'analisi della correlazione di Spearman con controllo del tasso di falsa scoperta tra i generi batterici differenzialmente abbondanti e i metaboliti chiave. La mappa termica delle correlazioni, raggruppata gerarchicamente, presentata in Figura 8 rivela schemi distinti di associazioni tra microbiota e metaboloma. Batteri benefici, tra cui Lactobacillus e Ruminococcus, hanno mostrato forti correlazioni positive con l'acido litocolico (r = 0,72 e 0,68, rispettivamente) e con l'acido butirrico (r = 0,65 e 0,60, rispettivamente), mentre hanno evidenziato correlazioni negative con il testosterone (r = -0,75 e -0,80) e con l'androstenedione (r = -0,68 e -0,72). Questi risultati suggeriscono che i batteri benefici identificati nell'analisi tassonomica erano associati a metaboliti legati agli androgeni e all'attività metabolica correlata agli acidi grassi a catena corta (SCFA).
Al contrario, i generi associati alla PCOS Bacteroides, Prevotella ed Escherichia hanno mostrato schemi di correlazione opposti. Questi batteri erano positivamente correlati con il testosterone (r = 0.85, 0.82 e 0.60, rispettivamente), l'androstenedione (r = 0.78, 0.75 e 0.55) e l'acido palmitico (r = 0.65, 0.60 e 0.45), mentre presentavano correlazioni negative con metaboliti benefici, tra cui l'acido litocolico e l'acido butirrico. Questi schemi di correlazione supportano associazioni funzionali tra specifici taxa microbici intestinali e le alterazioni metaboliche caratteristiche della PCOS, ma non stabiliscono una relazione di causalità diretta.
Disponibilità dei dati:
I set di dati generati e analizzati durante questo studio comprendono metadati dei campioni, dati fenotipici di origine, indici di diversità alfa 16S, riepiloghi dell'abbondanza a livello di phylum, risultati relativi ai taxa batterici differenziali, tabelle di analisi differenziale di metabolomica, risultati rappresentativi dei metaboliti, risultati di arricchimento dei percorsi KEGG e la matrice di correlazione tra microbiota e metaboliti. Questi dati di origine sottostanti sono forniti come File Supplementare 1 allegato. Il set di dati elaborato sui metaboliti differenziali è fornito come Tabella Supplementare 1.
Figura 1: Progettazione sperimentale e linea temporale del trattamento. Rappresentazione schematica del flusso di lavoro sperimentale che illustra il periodo di acclimatazione di 7 giorni, il periodo di 21 giorni di iniezioni di DHEA o veicolo, il trattamento di 28 giorni con estratto ZeLan o veicolo e la raccolta finale dei campioni di siero e fecali al giorno 56 del protocollo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Effetti dell'estratto di ZeLan sui parametri endocrini e metabolici. Diagrammi a scatola che mostrano (A) la concentrazione sierica di testosterone, (B) il rapporto LH/FSH e (C) il peso corporeo nei gruppi Controllo, Modello e Trattamento con ZeLan al termine del periodo di intervento. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Diversità microbica alfa a livello intestinale. Confronto dell'indice di diversità di Shannon tra i gruppi Controllo, Modello e trattato con ZeLan, che illustra le differenze nella diversità microbica alfa intestinale. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Composizione della microbiota intestinale a livello di phylum. Grafico a barre sovrapposte che mostra l'abbondanza relativa dei phyla batterici predominanti nella microbiota intestinale dei gruppi Controllo, Modello e trattamento con ZeLan. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Taxa batterici differenziali identificati mediante analisi LEfSe. L'analisi della dimensione dell'effetto tramite discriminante lineare (LEfSe) evidenzia i generi batterici che distinguono i gruppi di Controllo e Modello. I punteggi LDA indicano la dimensione dell'effetto dei taxa con abbondanza differenziale. Le variazioni associate a ZeLan sono descritte nei Risultati in base alle modifiche nell'abbondanza rispetto al gruppo Modello. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Profilazione differenziale dei metaboliti. Grafico a vulcano che mostra le caratteristiche dei metaboliti differenzialmente espressi tra i gruppi Modello e Controllo. I punti rossi e blu rappresentano rispettivamente le caratteristiche dei metaboliti significativamente sovraespressi e sottoregolati, in base alla variazione di espressione e al livello di significatività statistica. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Analisi dell'arricchimento dei pathway KEGG. Grafico a bolle che mostra i pathway metabolici arricchiti in modo significativo identificati a partire dai metaboliti differenziali. La dimensione delle bolle rappresenta il numero di metaboliti mappati, mentre il colore delle bolle indica la significatività statistica (valore P) dell'arricchimento del pathway. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Correlazione tra microbiota intestinale e metaboliti sierici. Mappa termica raggruppata gerarchicamente che mostra i coefficienti di correlazione di Spearman tra generi batterici differenzialmente abbondanti e metaboliti sierici rappresentativi. Il rosso indica correlazioni positive, mentre il blu indica correlazioni negative. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Gruppo | N | Peso corporeo (g) | Testosterone (ng/mL) | Rapporto LH/FSH | Insulina (mIU/L) |
| Controllo | 8 | 227,45 ± 10,12 | 0,51 ± 0,05 | 1,25 ± 0,11 | 12,55 ± 1,12 |
| Modello | 8 | 291,12 ± 15,35a | 1,85 ± 0,21a | 3,28 ± 0,25a | 28,95 ± 2,35a |
| ZeLan | 8 | 245,25 ± 10,21b | 0,92 ± 0,12b | 1,85 ± 0,15b | 18,82 ± 1,55b |
| Nota: I dati sono espressi come media ± DS. a = p < 0,05 rispetto al gruppo di controllo; b = p < 0,05 rispetto al gruppo modello. | |||||
Tabella 1: Parametri endocrini e metabolici nei ratti con PCOS. Sono stati misurati peso corporeo, testosterone sierico, rapporto LH/FSH e livelli di insulina a digiuno nei gruppi di controllo, modello e trattamento con ZeLan. I dati sono espressi come media ± DS.
| Gruppo | Indice di Shannon | Indice di Simpson | Stimatore Chao1 |
| Controllo | 6,51 ± 0,28 | 0,98 ± 0,01 | 1215,3 ± 45,4 |
| Modello | 4,19 ± 0,35a | 0,82 ± 0,03a | 665,8 ± 52,1a |
| ZeLan | 5,79 ± 0,26b | 0,93 ± 0,02b | 963,5 ± 38,6b |
| Nota: I dati sono espressi come media ± DS. a = p < 0,05 rispetto al gruppo Controllo; b = p < 0,05 rispetto al gruppo Modello. | |||
Tabella 2: Indici di diversità microbica alfa a livello intestinale. Confronto tra l'indice di Shannon, l'indice di Simpson e lo stimatore Chao1 tra i gruppi di controllo, modello e trattamento con ZeLan. I dati sono espressi come media ± DS.
| Nome del metabolita | ID HMDB | Classe | Trend (Modello vs Controllo) | Valore p | Punteggio VIP |
| Testosterone | HMDB0000286 | Steroid | Up ↑ | < 0.001 | 2.56 |
| Androstenedione | HMDB0000055 | Steroid | Up ↑ | < 0.001 | 2.34 |
| Palmitic acid | HMDB0000220 | Fatty Acid | Up ↑ | < 0.001 | 2.12 |
| Arachidonic acid | HMDB0001043 | Fatty Acid | Up ↑ | 0.003 | 1.89 |
| Prostaglandin E2 | HMDB0001036 | Lipid | Up ↑ | < 0.001 | 2.05 |
| Lithocholic acid | HMDB0000752 | Bile Acid | Down ↓ | < 0.001 | 2.45 |
| Butyric acid | HMDB0000039 | SCFA | Down ↓ | < 0.001 | 2.21 |
| Succinic acid | HMDB0000254 | Organic Acid | Down ↓ | 0.021 | 1.65 |
| L-Tryptophan | HMDB0000929 | Amino Acid | Down ↓ | 0.015 | 1.58 |
| Nota: VIP = Importanza Variabile nella Proiezione (VIP > 1 considerato significativo). | |||||
Tabella 3: Metaboliti sierici differenziali rappresentativi. Metaboliti annotati rappresentativi associati al PCOS e regolati dall'estratto di ZeLan, inclusi identificatori HMDB, classe del metabolita, tendenza di regolazione, valore P e punteggio VIP. L'elenco completo delle 52 caratteristiche di metaboliti annotati è fornito nella Tabella Supplementare 1.
Tabella Supplementare 1: Set di dati metaboliti completi annotati. Elenco completo delle 52 caratteristiche di metaboliti annotati conservate per la relazione di metabolomica, inclusi il nome del metabolita, identificatore HMDB, classe biochimica, cambio di fold, valore P e direzione della regolazione. Cliccare qui per scaricare il file.
File supplementare 1: Dati di origine a supporto delle analisi sperimentali, del microbioma e di metabolomica. Questo cartellone contiene le informazioni sui campioni, le misurazioni dei fenotipi clinici, gli indici di diversità del sequenziamento dell'RNA ribosomiale 16S, l'abbondanza relativa microbica a livello di phylum, l'analisi dei taxa differenziali con LEfSe, l'analisi differenziale di metabolomica, i metaboliti rappresentativi, l'analisi dell'arricchimento dei percorsi KEGG, la matrice di correlazione e il riassunto della verifica dei dati utilizzati per generare le figure e le tabelle presentate nel manoscritto.Cliccare qui per scaricare il file.
Discussione
Lo studio attuale fornisce evidenze che l'estratto di ZeLan migliora i fenotipi endocrini e metabolici associati alla PCOS in un modello di ratto indotto da DHEA e che questi effetti sono associati a modifiche favorevoli nella composizione del microbiota intestinale e nei profili metabolici sierici. L'approccio integrato basato su multi-omics ha mostrato che il trattamento con ZeLan migliora l'iperandrogenemia, il rapporto elevato tra LH e FSH e la resistenza all'insulina, ripristinando parzialmente la diversità alfa del microbiota intestinale, riequilibrando la composizione microbica e normalizzando diverse vie metaboliche coinvolte nella fisiopatologia della PCOS. Questi risultati ampliano la comprensione attuale delle risposte biologiche alle medicine botaniche tradizionali cinesi e supportano ulteriori indagini sull'asse intestino-ovaio come potenziale bersaglio per interventi sulla PCOS.
La riduzione del testosterone sierico e del rapporto LH/FSH dopo il trattamento con ZeLan è in linea con precedenti studi che dimostrano le proprietà anti-androgeniche di estratti botanici contenenti flavonoidi e composti fenolici16. Una revisione completa di studi clinici sull'uso di medicina erboristica nella PCOS ha riassunto i miglioramenti endocrini e metabolici osservati con diversi interventi botanici17. Il meccanismo attraverso cui ZeLan modula la biosintesi degli androgeni potrebbe coinvolgere effetti diretti sui percorsi steroidogenici ovarici, effetti sistemici anti-infiammatori e sensibilizzanti all'insulina, oppure effetti indiretti associati ai metaboliti microbici intestinali; il disegno dello studio attuale non consente di distinguere pienamente tra queste possibilità. Il miglioramento del rapporto LH/FSH indica un parziale ripristino della funzione dell'asse ipotalamo-ipofisi-gonadi, comunemente alterato nella PCOS18. Revisioni sistematiche di esperimenti su animali con formule di medicina tradizionale cinese per la PCOS hanno inoltre riportato miglioramenti negli indici riproduttivi ed endocrini19. Il contemporaneo miglioramento degli indici correlati all'insulina suggerisce che ZeLan potrebbe esercitare benefici metabolici oltre la regolazione endocrina, potenzialmente attraverso un potenziamento della segnalazione insulinica periferica o una riduzione di mediatori infiammatori che compromettono la funzione del recettore dell'insulina20.
Il ripristino della diversità microbica intestinale alfa dopo il trattamento con ZeLan è coerente con una risposta associata al microbioma. La ridotta diversità alfa osservata nei ratti modello di PCOS è in accordo con l'ampia letteratura esistente che documenta una disbiosi intestinale sia nei modelli sperimentali di PCOS sia nelle popolazioni cliniche21. Insenser et al. hanno inoltre riportato che i profili della microbiota intestinale nel PCOS sono influenzati dal sesso, dagli ormoni sessuali e dall'obesità22. La nostra osservazione che il trattamento con ZeLan ha ripristinato parzialmente l'indice di Shannon da 4,19 a 5,79 suggerisce che questo estratto botanico possa sostenere la struttura della comunità microbica. Effetti simili di ripristino della diversità sono stati riportati per altri estratti vegetali ricchi di polifenoli, che potrebbero promuovere selettivamente popolazioni batteriche benefiche mentre inibiscono taxa potenzialmente patogeni23. Le variazioni tassonomiche osservate a livello di phylum, in particolare la riduzione del rapporto Firmicutes/Bacteroidetes dopo il trattamento con ZeLan, sono rilevanti data l'associazione accertata tra elevati rapporti F/B e disfunzione metabolica, inclusi obesità e resistenza all'insulina24. Altri studi, tra cui il lavoro di Jobira et al. su adolescenti con PCOS, hanno riportato alterazioni della biodiversità microbica gastrointestinale, sostenendo la rilevanza biologica della composizione microbica sul metabolismo dell'ospite25.
L'identificazione di generi batterici specifici associati in modo differenziale alla PCOS e al trattamento con ZeLan fornisce un contesto biologico per le associazioni microbiota-metaboloma osservate in questo studio. L'arricchimento di Lactobacillus e Ruminococcus nei controlli sani e il loro impoverimento negli animali con PCOS sono in accordo con precedenti studi che evidenziano il ruolo protettivo di questi generi.26Le specie di Lactobacillus sono note per la produzione di acido lattico e peptidi antimicrobici che mantengono l'integrità della barriera intestinale e inibiscono batteri patogeni, mentre le specie di Ruminococcus sono importanti produttrici di acidi grassi a catena corta attraverso la fermentazione delle fibre alimentari.27Il ripristino di questi generi benefici dopo il trattamento con ZeLan potrebbe migliorare la funzione della barriera intestinale e potenziare l'attività metabolica associata agli acidi grassi a catena corta (SCFA), come indicato dall'aumento dei livelli di acido butirrico osservato nell'analisi metabolomica. Al contrario, l'aumentata abbondanza di Bacteroides, Prevotella ed Escherichia negli animali con PCOS è in linea con studi che associano questi generi a disturbi infiammatori e metabolici.28. Le specie di Escherichia, in particolare Escherichia coli, possono produrre lipopolisaccaridi, che potrebbero indurre infiammazione sistemica e resistenza all'insulina attraverso il segnale del recettore Toll-like 4, rappresentando un possibile collegamento tra disbiosi intestinale e disfunzione metabolica associata al PCOS29.
I risultati metabolomici forniscono evidenze di associazioni tra il microbiota intestinale e il metabolismo dell'ospite in seguito al trattamento con ZeLan. Le variazioni negli acidi biliari secondari, come l'acido litocolico, sono biologicamente rilevanti poiché questi metaboliti vengono prodotti attraverso l'attività enzimatica batterica30. Gli acidi biliari svolgono un ruolo non solo nell'assorbimento dei lipidi, ma anche come molecole di segnale che regolano il metabolismo del glucosio e dei lipidi attraverso il recettore X farnesoide e il recettore accoppiato a proteina G Takeda 5, suggerendo che la normalizzazione dei profili degli acidi biliari possa contribuire a un miglioramento dell'omeostasi metabolica. Analogamente, il ripristino dei livelli di acido butirrico è rilevante data la sua molteplicità di effetti benefici, tra cui il potenziamento della funzione della barriera intestinale, le proprietà antinfiammatorie e il miglioramento della sensibilità all'insulina. Le correlazioni osservate tra batteri benefici e metaboliti protettivi, in contrasto con le associazioni tra batteri patogeni e metaboliti dannosi, forniscono un supporto di tipo associativo all'ipotesi dell'asse intestino-ovaio, sottolineando al contempo la necessità di una validazione meccanicistica diretta.
Le implicazioni cliniche di questi risultati devono essere interpretate entro i limiti di un disegno sperimentale preclinico esplorativo. I risultati sostengono una valutazione ulteriore dell'estrazione di ZeLan come approccio complementare nella gestione della PCOS, in particolare nel contesto di interventi botanici che potrebbero influenzare sia gli indici endocrino-metabolici che il microambiente intestinale. L'identificazione di biomarcatori microbici e metabolici associati alla risposta al trattamento potrebbe aiutare a indirizzare futuri studi meccanicistici e traslazionali. Inoltre, l'asse intestino-ovaio potrebbe in futuro supportare strategie combinate che integrino ZeLan con probiotici o modifiche dietetiche, ma tali strategie richiedono una validazione controllata prima dell'applicazione clinica.
Diversi limiti del presente studio richiedono di essere riconosciuti. In primo luogo, sebbene il modello di ratto indotto da DHEA riproduca diverse caratteristiche del PCOS umano, non cattura appieno l'eterogeneità dei fenotipi del PCOS umano, inclusi i sottotipi magri, obesi, resistenti all'insulina e infiammatori; pertanto, la traduzione clinica richiede una validazione in popolazioni di pazienti ben caratterizzate. In secondo luogo, lo studio ha utilizzato un'unica dose di ZeLan senza un gradiente dose-risposta né un controllo farmacologico positivo come la metformina, quindi la gamma di dosi efficaci, l'efficacia comparativa e il ciclo ottimale di somministrazione devono ancora essere determinati. In terzo luogo, il campionamento è stato effettuato soltanto al termine dello studio, limitando l'interpretazione dei cambiamenti temporali dinamici nella microbiota, nei metaboliti e nei profili ormonali durante il periodo di intervento. In quarto luogo, l'istopatologia ovarica, il conteggio dei follicoli, la quantificazione del corpo luteo e il monitoraggio seriale del ciclo estrale non sono stati inclusi nel disegno sperimentale; pertanto, il recupero della funzione ovarica è stato dedotto da indici endocrini e metabolici piuttosto che da valutazioni dirette a livello tissutale e del ciclo. In quinto luogo, lo studio ha identificato correlazioni tra taxa microbici e metaboliti, ma non ha incluso trapianto di microbiota fecale, esperimenti su animali privi di germi, integrazione mirata di metaboliti, saggi sui marcatori infiammatori o misurazioni degli enzimi steroidogenici ovarici come CYP17A1, CYP19A1 e StAR; di conseguenza, i meccanismi causali non possono essere confermati dai dati attuali. In sesto luogo, la metabolomica non mirata fornisce evidenze a livello di scoperta, ed è richiesta una futura validazione quantitativa mirata di metaboliti chiave come l'acido litocolico, l'acido butirrico e il testosterone. In settimo luogo, la visualizzazione della beta-diversità, la previsione funzionale microbica e la modellizzazione integrata del percorso microbiota-metabolita-gene non erano disponibili per la presente sottomissione, limitando la capacità di costruire una rete regolatoria completa. Infine, l'estratto di ZeLan è stato standardizzato in base al contenuto totale di flavonoidi, ma è ancora necessaria una caratterizzazione fitochimica qualitativa e quantitativa completa dei monomeri attivi.
In conclusione, l'estratto di ZeLan ha migliorato i fenotipi endocrini e metabolici associati alla PCOS in un modello ratto ed è stato correlato al parziale ripristino della diversità alfa del microbiota intestinale, a modifiche nella composizione microbica e alla modulazione di vie metaboliche sieriche, tra cui la biosintesi degli ormoni steroidei, il metabolismo degli acidi biliari e il metabolismo correlato agli acidi grassi a catena corta. Le correlazioni osservate tra batteri benefici e metaboliti protettivi, in contrasto con le associazioni tra batteri arricchiti nella PCOS e metaboliti dannosi, supportano un'associazione biologicamente plausibile lungo l'asse intestino-ovaio. Questi risultati forniscono una base per futuri studi meccanicistici e traslazionali sull'estratto di ZeLan nella gestione della PCOS, sottolineando al contempo la necessità di una validazione causale e di una caratterizzazione fitochimica più ampia.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.
Ringraziamenti
Questo studio è stato finanziato dal Progetto di Pianificazione della Ricerca Scientifica dell'Amministrazione Provinciale della Medicina Tradizionale Cinese di Hebei (Grant No. 2021316).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acetonitrile | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A955-4 | Grado Optima LC-MS, 4 L; fase mobile e riconstituzione del campione |
| Colonna ACQUITY UPLC HSS T3 | Waters Corporation | 186003539 | 100 Å, 1,8 μm, 2,1 × 100 mm; separazione UHPLC |
| Sistema di elettroforesi su gel di agarosio | Bio-Rad Laboratories | 1704486 | Sistema di elettroforesi orizzontale Mini-Sub Cell GT; valutazione della qualità del DNA |
| Agilent 1290 Infinity II/6550 UHPLC-Q-TOF-MS | Agilent Technologies | G7120A/G7167B/G7116B/G6550B | Modulo UHPLC 1290 Infinity II abbinato a spettrometro di massa 6550 iFunnel Q-TOF; piattaforma per metabolomica non mirata del siero |
| Algoritmo DADA2 | Bioconductor | Versione 1.24.0 | Generazione di ASV e rimozione di chimere; versione dedotta per corrispondere al flusso di lavoro R 4.2.1/Bioconductor 3.15 |
| Deidroepiandrosterone (DHEA) | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | D4000 | Induzione del modello di PCOS; 6 mg/100 g di peso corporeo; CAS 53-43-0 |
| Acqua distillata | Invitrogen / Thermo Fisher Scientific | 10977015 | Acqua distillata UltraPure priva di DNasi/RNasi; veicolo per gavaggio orale nei gruppi Controllo e Modello |
| Acido formico | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A117-50 | Grado Optima LC-MS, 50 mL; additivo allo 0,1% per fasi mobili LC-MS |
| Database del Metaboloma Umano | Università dell'Alberta / HMDB | HMDB 5.0 | Database per l'annotazione dei metaboliti |
| Piattaforma Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | 20012850 | Sistema di sequenziamento utilizzato dal fornitore di servizi per il sequenziamento a estremità unite di 250 bp dell'RNA 16S |
| Erba di Lycopus lucidus Turcz. | Beijing Tongrentang Chinese Medicine Co., Ltd. | Lotto ZL-20230315 | Materia prima botanica autenticata per l'estrazione acquosa di ZeLan |
| Metanolo | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A456-4 | Grado Optima LC-MS, 4 L; precipitazione proteica per la metabolomica del siero |
| Database METLIN | Scripps Research | METLIN Classic 2023 | Database di annotazione spettrale di massa dei metaboliti |
| Spettrofotometro NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Spettrofotometro microvolume NanoDrop One UV-Vis; valutazione quantità e purezza del DNA |
| QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit | Qiagen | 51604 | Estrazione del DNA dal contenuto cecale; kit per estrazione DNA da feci, 50 preparazioni |
| QIIME2 | Sviluppatori di QIIME2 | Versione 2022.2 | Elaborazione delle sequenze di RNA 16S |
| Software R | Fondazione R | Versione 4.2.1 | Analisi statistica ed elaborazione con XCMS |
| Kit ELISA per siero per testosterone, LH, FSH e insulina | Cusabio Biotech | CSB-E05100r; CSB-E12654r; CSB-E06869r; CSB-E05070r | Kit ELISA per ratto per testosterone, LH, FSH e insulina, per la quantificazione ormonale e dell'insulina nel siero |
| Olio di sesamo | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | S3547 | Veicolo per iniezione di DHEA |
| Pentobarbital sodico | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | P3761 | Anestesia; 50 mg/kg per via intraperitoneale |
| Software SPSS | IBM Corporation | Versione 26.0 | Analisi statistica |
| Primers universali per RNA 16S 338F/806R | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Sintesi su misura: 338F/806R | Amplificazione delle regioni V3-V4; 338F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG, 806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT |
| Pacchetto XCMS | Bioconductor / R | Versione 3.18.0 | Rilevamento dei picchi, allineamento dei tempi di ritenzione e integrazione |
| Estratto ZeLan | Estratto acquoso prodotto in laboratorio | Lotto ZLE-20230402 | Trattamento con gavaggio orale; flavonoidi totali standardizzati ≥2,5% |
Riferimenti
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