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Articolo di ricerca
L'estratto di ZeLan ha migliorato i fenotipi endocrini e metabolici nei ratti con PCOS indotta da DHEA. L'integrazione di sequenziamento 16S rRNA e metabolomica sierica ha mostrato un ripristino parziale della diversità alfa microbica intestinale, alterazioni nella composizione microbica e variazioni dei metaboliti che coinvolgono ormoni steroidei, acidi biliari e acidi grassi a catena corta.
Questo studio ha indagato gli effetti terapeutici dell'estratto di ZeLan sul sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) e ne ha valutato l'associazione con la rimodellazione del microbiota intestinale e del metaboloma. Ventiquattro ratti femmine Sprague-Dawley sono stati suddivisi casualmente in gruppi Controllo, Modello di PCOS indotto da deidroepiandrosterone (DHEA) e trattamento con ZeLan (n = 8 ciascuno). Dopo 28 giorni di intervento, i livelli ormonali nel siero sono stati misurati mediante ELISA; la composizione del microbiota intestinale è stata analizzata mediante sequenziamento del gene 16S rRNA e i profili metabolici sierici sono stati caratterizzati mediante UHPLC-Q-TOF-MS. È stata eseguita un'analisi di correlazione di Spearman con controllo della multipla verifica degli errori per esplorare le associazioni tra microbiota e metaboloma. ZeLan ha migliorato significativamente i fenotipi associati alla PCOS, riducendo il peso corporeo, i livelli di testosterone (0,92 rispetto a 1,85 ng/mL, P < 0,05), il rapporto LH/FSH e i livelli di insulina rispetto al gruppo Modello. Il sequenziamento ha mostrato che ZeLan ha ripristinato parzialmente la diversità microbica alfa (indice di Shannon: 5,79 rispetto a 4,19) e ha ridotto il rapporto Firmicutes/Bacteroidetes. ZeLan è stato associato a un arricchimento di Lactobacillus e Ruminococcus e a una minore abbondanza di Bacteroides, Prevotella ed Escherichia. L'analisi metabolomica ha identificato 52 caratteristiche metaboliche alterate, con cambiamenti chiave che coinvolgevano ormoni steroidei, acidi biliari come l'acido litocolico e acidi grassi a catena corta come l'acido butirrico. Questi risultati suggeriscono che ZeLan attenua i disturbi endocrini e metabolici associati alla PCOS ed è correlato alla rimodellazione dei profili microbici intestinali e metabolici sierici.
La sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) rappresenta uno dei disturbi endocrini più comuni che colpiscono le donne in età riproduttiva, con una prevalenza globale stimata tra il 6% e il 20% a seconda dei criteri diagnostici utilizzati1. Questo complesso disturbo metabolico e riproduttivo è caratterizzato da un insieme di manifestazioni cliniche, tra cui iperandrogenismo, disfunzione ovulatoria e morfologia ovarica policistica, che insieme contribuiscono a conseguenze riproduttive, metaboliche e psicologiche significative2. Oltre al suo impatto diretto sulla fertilità, la PCOS è sempre più riconosciuta come una condizione sistemica associata a complicanze sanitarie a lungo termine, tra cui diabete mellito di tipo 2, malattie cardiovascolari e carcinoma dell'endometrio, imponendo così un notevole carico sia sui singoli pazienti sia sui sistemi sanitari mondiali3. La fisiopatologia della PCOS non è ancora completamente compresa, sebbene si ritenga generalmente che coinvolga interazioni complesse tra predisposizione genetica, fattori ambientali e determinanti dello stile di vita, che portano alle alterazioni ormonali e metaboliche tipiche osservate nei soggetti colpiti4.
Gli approcci terapeutici contemporanei per la sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) si concentrano principalmente sulla gestione sintomatica attraverso interventi farmacologici, tra cui contraccettivi orali per la regolazione del ciclo mestruale, metformina per la sensibilizzazione all'insulina e anti-androgeni per il controllo dell'irsutismo5. Tuttavia, questi trattamenti convenzionali spesso offrono un sollievo incompleto dei sintomi e sono frequentemente associati a effetti avversi che ne limitano l'applicabilità a lungo termine, in particolare nelle donne con desiderio di fertilità6. Di conseguenza, negli ultimi anni è cresciuto l'interesse verso l'uso di medicine complementari e alternative, in particolare la medicina tradizionale cinese (MTC), che vanta secoli di esperienza empirica nel trattamento dei disturbi ginecologici grazie a meccanismi regolatori olistici7. Tra i numerosi farmaci botanici studiati per la gestione della PCOS, Lycopus lucidus Turcz. (comunemente noto come ZeLan nella medicina cinese) ha attirato notevole attenzione per le sue applicazioni tradizionali nel promuovere la circolazione sanguigna, risolvere la stasi e regolare il ciclo mestruale8. Studi fitochimici pubblicati indicano che L. lucidus contiene frazioni ricche di polifenoli e flavonoidi dotate di attività antiossidante e antinfiammatoria8,9. Pertanto, nel presente studio il contenuto standardizzato di flavonoidi totali è stato utilizzato come indice chimico di controllo qualità per l'estratto, sebbene l'identificazione dei singoli monomeri attivi responsabili della regolazione del microbiota e del metabolismo richieda analisi fitochimiche mirate in futuro.
La microflora intestinale si è affermata come un regolatore fondamentale del metabolismo e della funzione endocrina dell'ospite, con crescenti evidenze a sostegno del suo coinvolgimento nella patogenesi di diverse malattie metaboliche, tra cui la sindrome dell'ovaio policistico (PCOS)10. È stato proposto il concetto di asse intestino-ovaio per descrivere la comunicazione bidirezionale tra i microrganismi intestinali e la funzione ovarica, mediata da metaboliti microbici, segnalazione immunitaria e vie neuroendocrine11. Si è costantemente osservato che le donne con PCOS presentano una disbiosi intestinale caratterizzata da ridotta diversità microbica, alterato rapporto Firmicutes/Bacteroidetes e abbondanza diminuita di batteri benefici come le specie di Lactobacillus e Bifidobacterium12. Si ritiene che queste alterazioni microbiche contribuiscano alla fisiopatologia della PCOS attraverso diversi meccanismi, tra cui un'aumentata permeabilità intestinale, un'infiammazione sistemica di basso grado e un alterato metabolismo degli acidi biliari e degli acidi grassi a catena corta (SCFA), che influenzano successivamente la sensibilità all'insulina e la biosintesi degli androgeni13. In modo significativo, interventi mirati alla microflora intestinale, tra cui probiotici, prebiotici e modifiche dietetiche, hanno mostrato risultati promettenti nel migliorare i sintomi della PCOS, sostenendo così l'asse intestino-ovaio come potenziale bersaglio terapeutico14.
La metabolomica, l'analisi completa dei metaboliti a basso peso molecolare nei sistemi biologici, rappresenta un approccio potente per caratterizzare le perturbazioni metaboliche associate a stati patologici e per valutare gli effetti biochimici di interventi terapeutici15. L'integrazione del sequenziamento del gene 16S rRNA per il profilo del microbioma con la metabolomica non mirata consente un'indagine sistematica delle relazioni tra le comunità microbiche intestinali e il metabolismo dell'ospite, offrendo spunti sulle interazioni tra microbiota e metaboloma che potrebbero accompagnare sia la patogenesi delle malattie sia le risposte al trattamento. Nonostante la giustificazione teorica per il targeting dell'asse intestino-ovaio nella gestione della PCOS e le indicazioni tradizionali di ZeLan per disturbi ginecologici, ad oggi nessuno studio ha indagato sistematicamente se l'estrazione di ZeLan moduli l'interfaccia tra microbiota intestinale e metaboloma nella PCOS. Questa lacuna conoscitiva limita la nostra comprensione delle risposte biologiche associate a ZeLan e ostacola l'ottimizzazione razionale di questo intervento botanico per il trattamento della PCOS.
Lo studio attuale è stato progettato per indagare l'efficacia terapeutica dell'estratto di ZeLan in un modello di ratto di PCOS indotta da DHEA e per valutare le relative alterazioni del microbiota intestinale e del metaboloma mediante sequenziamento integrato del 16S rRNA e analisi metabolomica non mirata. In particolare, abbiamo valutato gli effetti dell'estratto di ZeLan su fenotipi correlati alla PCOS, inclusi peso corporeo, testosterone sierico, rapporto tra ormone luteinizzante e ormone follicolo-stimolante (LH/FSH) e livelli di insulina; abbiamo caratterizzato le alterazioni nella composizione del microbiota intestinale e nella diversità alfa in seguito al trattamento con ZeLan; abbiamo identificato caratteristiche differenziali dei metaboliti sierici e percorsi metabolici arricchiti associati all'intervento con ZeLan; ed abbiamo esplorato le correlazioni tra specifici taxa microbici intestinali e metaboliti chiave. Affrontando questi obiettivi, abbiamo cercato di fornire evidenze associative di tipo multi-omico riguardo alla modulazione dell'asse intestino-ovaio da parte di ZeLan nella PCOS.
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Tutte le procedure sperimentali del presente studio sono state condotte in conformità con le linee guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (Numero di approvazione: IACUC-2023-0156).
Animali
Ratti femmina Sprague-Dawley (n = 24, 6 settimane di età, peso corporeo 180–200 g) sono stati ottenuti dal Centro per gli Animali da Laboratorio dell'istituzione affiliata e allevati in condizioni ambientali controllate (temperatura 22 ± 2°C, umidità 50 ± 10%, ciclo luce/buio di 12 ore) con libero accesso a mangime standard per roditori e acqua purificata. Dopo un periodo di ambientamento di una settimana, gli animali sono stati assegnati casualmente a tre gruppi sperimentali (n = 8 per gruppo): Controllo, Modello PCOS e Trattamento ZeLan. La dimensione del campione è stata determinata sulla base di studi precedenti che hanno indagato le alterazioni della microbiota intestinale nei modelli di PCOS, con un'analisi della potenza statistica che ha indicato come 8 animali per gruppo garantiscano una potenza dell'80% nel rilevare una differenza di 1,5 volte negli indici di diversità alfa a α = 0,05.
Stabilimento del modello di PCOS e protocollo di trattamento
Il modello di PCOS è stato stabilito seguendo un protocollo ben validato che prevede l'iniezione sottocutanea di deidroepiandrosterone (DHEA; Sigma-Aldrich, USA) disciolto in olio di sesamo nella regione dorsale del collo, a un dosaggio di 6 mg/100 g di peso corporeo, somministrato quotidianamente per 21 giorni consecutivi. Gli animali del gruppo di controllo hanno ricevuto volumi equivalenti di olio di sesamo come veicolo. L'intera durata sperimentale comprendeva 7 giorni di acclimatazione, 21 giorni di induzione del modello e 28 giorni di intervento, con il prelievo finale al giorno 56 del protocollo, inclusi i giorni di acclimatazione (Figura 1). L'estratto ZeLan è stato preparato a partire dall'erbaceo autentificato Lycopus lucidus Turcz. mediante estrazione acquosa ed è stato standardizzato per contenere un totale di flavonoidi non inferiore al 2,5%, determinato mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni, che ha costituito il criterio di controllo qualitativo chimico dell'estratto botanico. A partire dal completamento della fase di induzione del modello mediante DHEA, i ratti del gruppo ZeLan hanno ricevuto per via orale l'estratto ZeLan a un dosaggio di 200 mg/kg di peso corporeo, somministrato quotidianamente per 28 giorni consecutivi, mentre i gruppi Controllo e Modello hanno ricevuto volumi equivalenti di acqua distillata. Il dosaggio di 200 mg/kg è stato scelto come dose farmacologica esplorativa in base all'esperienza pregressa nell'uso di estratti botanici in modelli animali e a considerazioni preliminari di tollerabilità; una valutazione formale della risposta dose-dipendente non faceva parte del presente disegno sperimentale. Il peso corporeo è stato registrato settimanalmente per tutta la durata dell'esperimento. In questo disegno sperimentale, la corretta induzione del modello di PCOS è stata valutata sulla base del protocollo di induzione con DHEA insieme a fenotipi endocrini e metabolici finali, inclusi il peso corporeo, il testosterone sierico, il rapporto LH/FSH e l'insulina a digiuno. L'esame istopatologico ovarico, il conteggio dei follicoli, la quantificazione dei corpi lutei e il monitoraggio seriale del ciclo estrale non sono stati inclusi come endpoint di conferma del modello; pertanto, l'interpretazione della disfunzione ovarica si è basata su parametri endocrini e metabolici piuttosto che su una valutazione diretta a livello tissutale.
Raccolta ed elaborazione del campione
I campioni (siero e feci) sono stati raccolti da tutti e tre i gruppi (n = 8 per gruppo) per successive analisi biochimiche, di microbiota e di metabolomica. Le raccolte finali sono state effettuate al mattino dopo un digiuno notturno per ridurre la variabilità legata al ritmo circadiano e all'alimentazione. I campioni di sangue sono stati prelevati dall'aorta addominale sotto anestesia e centrifugati a 3.000 × g per 15 minuti a 4°C per ottenere il siero, che è stato suddiviso in aliquote e conservato a -80°C fino alle analisi ormonali e metabolomiche. I campioni fecali freschi sono stati raccolti direttamente dal cieco in condizioni asettiche in cryotubi sterili, mantenuti sul ghiaccio secco durante il trasferimento, congelati rapidamente in azoto liquido entro 10 minuti dal prelievo e conservati a -80°C fino al sequenziamento del gene 16S rRNA.
Misurazioni ormonali nel siero
Le concentrazioni sieriche di testosterone, ormone luteinizzante (LH), ormone follicolo-stimolante (FSH) e insulina sono state quantificate utilizzando kit per saggio immunoenzimatico (ELISA) disponibili in commercio (Cusabio Biotech, Wuhan, Cina) secondo le istruzioni del produttore. Il rapporto LH/FSH è stato calcolato come indice composito di squilibrio gonadotropinico caratteristico del PCOS. Tutti i campioni sono stati analizzati in duplicato e le misurazioni con coefficienti di variazione superiori al 15% sono state ripetute. I coefficienti di variazione intra-saggio e inter-saggio dovevano rimanere rispettivamente al di sotto del 10% e del 15%. Eventuali valori anomali sono stati verificati confrontandoli con i dati originali e le informazioni sul rendimento del saggio, e nessun valore è stato escluso esclusivamente per motivi statistici senza una motivazione tecnica documentata.
Sequenziamento del gene dell'RNA ribosomiale 16S e analisi bioinformatica
Il DNA genomico batterico totale è stato estratto dai contenuti ciecali utilizzando il QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Germania) seguendo il protocollo del produttore. La qualità e la quantità del DNA sono state valutate mediante spettrofotometria NanoDrop ed elettroforesi su gel di agarosio, e gli estratti di DNA sono stati conservati a -80°C prima della costruzione delle librerie. Le regioni ipervariabili V3-V4 del gene 16S rRNA sono state amplificate utilizzando i primer universali 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') e 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') con sequenze adattatrici Illumina. Le librerie di ampliconi sono state costruite, purificate, quantificate, raggruppate in concentrazioni equimolari e sequenziate sulla piattaforma Illumina NovaSeq 6000 (Novogene, Pechino, Cina) utilizzando letture paired-end di 250 bp.
Le letture di sequenziamento grezze sono state elaborate utilizzando la pipeline QIIME2 (versione 2022.2). Le letture paired-end sono state demultiplexate, unite, filtrate per qualità utilizzando una soglia del punteggio Phred di almeno 20 ed elaborate con DADA2 per rimuovere le sequenze chimere e generare varianti di sequenza dell'amplicone (ASV). La classificazione tassonomica è stata effettuata confrontando con la base di dati di riferimento SILVA 138 mediante un classificatore bayesiano naïve. Sono state calcolate metriche di diversità alfa, inclusi l'indice di Shannon, l'indice di Simpson e lo stimatore di Chao1, per valutare la diversità e la ricchezza all'interno dei campioni. I risultati relativi alla profondità di sequenziamento, inclusi riepiloghi delle letture, tabelle di abbondanza delle ASV, copertura di Good e file delle curve di rarefazione, sono stati considerati parte del set di dati del microbioma descritto nella sezione Disponibilità dei Dati. L'analisi lineare della dimensione dell'effetto (LEfSe) è stata utilizzata per identificare i taxa associati alla malattia nel confronto tra Controllo e Modello, utilizzando una soglia del punteggio LDA maggiore di 2,0 e P < 0,05; il ripristino associato a ZeLan è stato valutato confrontando la direzione delle variazioni di abbondanza tassonomica nel gruppo ZeLan rispetto al gruppo Modello.
Analisi di metabolomica non mirata
Il profilo metabolomico del siero è stato eseguito mediante cromatografia liquida ad altissime prestazioni abbinata a spettrometria di massa con analizzatore a quadrupolo e tempo di volo (UHPLC-Q-TOF-MS; Agilent 1290 Infinity II/6550, USA). I campioni di siero (100 μL) sono stati mescolati con 400 μL di metanolo freddo:acetonitrile (1:1, v/v) contenente standard interni, vortexati e incubati a -20°C per 1 ora per precipitare le proteine. Dopo centrifugazione a 14.000 × g per 15 minuti, i soprannatanti sono stati essiccati sotto flusso di azoto e ricostituiti in 100 μL di acetonitrile:acqua (1:1, v/v) per l'analisi. La separazione cromatografica è stata effettuata su una colonna ACQUITY UPLC HSS T3 (2,1 × 100 mm, 1,8 μm) mantenuta a 40°C, utilizzando acqua contenente acido formico allo 0,1% come fase mobile A e acetonitrile contenente acido formico allo 0,1% come fase mobile B, a un flusso di 0,30 mL/min. È stato utilizzato un programma a gradiente che incrementa la fase organica dal 5% al 95%, seguito da lavaggio della colonna e re-equilibrazione, per la separazione dei metaboliti. I dati spettrometrici di massa sono stati acquisiti sia in modalità di ionizzazione elettrospray positiva che negativa, con un intervallo di scansione di m/z 50–1200; i parametri della sorgente includevano una tensione del capillare di 3,5 kV, un flusso del gas di essiccazione di 10 L/min, una temperatura del gas di essiccazione di 325°C, una pressione del nebulizzatore di 35 psi e una tensione del fragmentor di 120 V.
I file di dati grezzi sono stati convertiti in formato mzXML ed elaborati utilizzando il pacchetto XCMS in R per la rilevazione dei picchi, l'allineamento dei tempi di ritenzione e l'integrazione dell'area dei picchi. Campioni di controllo della qualità, preparati unendo aliquote uguali di tutti gli estratti sierici, sono stati inseriti lungo tutta la sequenza analitica per monitorare la stabilità dello strumento. Le caratteristiche con un'elevata percentuale di dati mancanti o con riproducibilità instabile nei controlli di qualità sono state eliminate prima della modellizzazione statistica. L'identificazione dei metaboliti è stata effettuata confrontando la massa esatta, il tempo di ritenzione e i modelli di frammentazione MS/MS con quelli presenti nel Human Metabolome Database (HMDB), METLIN e librerie spettrali interne. Analisi statistiche multivariate sono state condotte utilizzando MetaboAnalyst 5.0. Le caratteristiche metaboliche conservate per la successiva segnalazione sono state selezionate in base a un criterio combinato che includeva il contributo discriminatorio multivariato, la direzione del fold-change e l'evidenza statistica; i valori P sono stati corretti mediante il metodo di Benjamini-Hochberg per tenere conto dei test multipli. La tabella completa annotata di segnalazione, contenente 52 caratteristiche metaboliche, è fornita come Tabella Supplementare 1. L'analisi dell'arricchimento di pathway è stata effettuata utilizzando il database Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).
Analisi statistica
Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando SPSS versione 26.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA) e il software R (versione 4.2.1). I dati continui sono stati espressi come media ± deviazione standard (SD) e sono stati valutati per la normalità mediante il test di Shapiro-Wilk prima dei test inferenziali. Per i dati distribuiti normalmente, è stata utilizzata l'analisi della varianza a un fattore (ANOVA) seguita dal test post hoc di Tukey per i confronti tra più gruppi; per i dati non distribuiti normalmente, è stato utilizzato il test di Kruskal-Wallis con test post hoc di Dunn. Le correlazioni tra i taxa microbici intestinali e i metaboliti sierici sono state valutate mediante il coefficiente di correlazione dei ranghi di Spearman e visualizzate come heatmap gerarchicamente raggruppate. I valori P delle correlazioni sono stati corretti per i test multipli utilizzando il metodo del tasso di scoperte false di Benjamini-Hochberg, e sono state interpretate solo le correlazioni concordi nel verso e statisticamente significative. Un valore P a due code < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo, salvo indicazione di una soglia di valore P aggiustata.
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Effetti dell'estratto di ZeLan sui fenotipi clinici della PCOS
L'amministrazione di DHEA ha indotto nei ratti fenotipi endocrini e metabolici simili alla sindrome dell'ovaio policistico (PCOS), come dimostrato da significativi aumenti del peso corporeo, della concentrazione sierica di testosterone, del rapporto LH/FSH e dei livelli di insulina a digiuno rispetto al gruppo di controllo (tutti P < 0,05). La valutazione della distribuzione mediante il test di Shapiro-Wilk ha s...
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Lo studio attuale fornisce evidenze che l'estratto di ZeLan migliora i fenotipi endocrini e metabolici associati alla PCOS in un modello di ratto indotto da DHEA e che questi effetti sono associati a modifiche favorevoli nella composizione del microbiota intestinale e nei profili metabolici sierici. L'approccio integrato basato su multi-omics ha mostrato che il trattamento con ZeLan migliora l'iperandrogenemia, il rapporto elevato tra LH e FSH e la resistenza all'insulina, ripristinando parzialmente la diversità alfa del...
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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.
Questo studio è stato finanziato dal Progetto di Pianificazione della Ricerca Scientifica dell'Amministrazione Provinciale della Medicina Tradizionale Cinese di Hebei (Grant No. 2021316).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acetonitrile | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A955-4 | Grado Optima LC-MS, 4 L; fase mobile e riconstituzione del campione |
| Colonna ACQUITY UPLC HSS T3 | Waters Corporation | 186003539 | 100 Å, 1,8 μm, 2,1 × 100 mm; separazione UHPLC |
| Sistema di elettroforesi su gel di agarosio | Bio-Rad Laboratories | 1704486 | Sistema di elettroforesi orizzontale Mini-Sub Cell GT; valutazione della qualità del DNA |
| Agilent 1290 Infinity II/6550 UHPLC-Q-TOF-MS | Agilent Technologies | G7120A/G7167B/G7116B/G6550B | Modulo UHPLC 1290 Infinity II abbinato a spettrometro di massa 6550 iFunnel Q-TOF; piattaforma per metabolomica non mirata del siero |
| Algoritmo DADA2 | Bioconductor | Versione 1.24.0 | Generazione di ASV e rimozione di chimere; versione dedotta per corrispondere al flusso di lavoro R 4.2.1/Bioconductor 3.15 |
| Deidroepiandrosterone (DHEA) | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | D4000 | Induzione del modello di PCOS; 6 mg/100 g di peso corporeo; CAS 53-43-0 |
| Acqua distillata | Invitrogen / Thermo Fisher Scientific | 10977015 | Acqua distillata UltraPure priva di DNasi/RNasi; veicolo per gavaggio orale nei gruppi Controllo e Modello |
| Acido formico | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A117-50 | Grado Optima LC-MS, 50 mL; additivo allo 0,1% per fasi mobili LC-MS |
| Database del Metaboloma Umano | Università dell'Alberta / HMDB | HMDB 5.0 | Database per l'annotazione dei metaboliti |
| Piattaforma Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | 20012850 | Sistema di sequenziamento utilizzato dal fornitore di servizi per il sequenziamento a estremità unite di 250 bp dell'RNA 16S |
| Erba di Lycopus lucidus Turcz. | Beijing Tongrentang Chinese Medicine Co., Ltd. | Lotto ZL-20230315 | Materia prima botanica autenticata per l'estrazione acquosa di ZeLan |
| Metanolo | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A456-4 | Grado Optima LC-MS, 4 L; precipitazione proteica per la metabolomica del siero |
| Database METLIN | Scripps Research | METLIN Classic 2023 | Database di annotazione spettrale di massa dei metaboliti |
| Spettrofotometro NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Spettrofotometro microvolume NanoDrop One UV-Vis; valutazione quantità e purezza del DNA |
| QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit | Qiagen | 51604 | Estrazione del DNA dal contenuto cecale; kit per estrazione DNA da feci, 50 preparazioni |
| QIIME2 | Sviluppatori di QIIME2 | Versione 2022.2 | Elaborazione delle sequenze di RNA 16S |
| Software R | Fondazione R | Versione 4.2.1 | Analisi statistica ed elaborazione con XCMS |
| Kit ELISA per siero per testosterone, LH, FSH e insulina | Cusabio Biotech | CSB-E05100r; CSB-E12654r; CSB-E06869r; CSB-E05070r | Kit ELISA per ratto per testosterone, LH, FSH e insulina, per la quantificazione ormonale e dell'insulina nel siero |
| Olio di sesamo | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | S3547 | Veicolo per iniezione di DHEA |
| Pentobarbital sodico | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | P3761 | Anestesia; 50 mg/kg per via intraperitoneale |
| Software SPSS | IBM Corporation | Versione 26.0 | Analisi statistica |
| Primers universali per RNA 16S 338F/806R | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Sintesi su misura: 338F/806R | Amplificazione delle regioni V3-V4; 338F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG, 806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT |
| Pacchetto XCMS | Bioconductor / R | Versione 3.18.0 | Rilevamento dei picchi, allineamento dei tempi di ritenzione e integrazione |
| Estratto ZeLan | Estratto acquoso prodotto in laboratorio | Lotto ZLE-20230402 | Trattamento con gavaggio orale; flavonoidi totali standardizzati ≥2,5% |
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