Un saggio in vitro per la degradazione di LpxC da parte della proteasi FtsH legata alla membrana e dell'adattatore LapB da Escherichia coli

Sommario

Escherichia coli regola la biosintesi del lipopolisaccarido (LPS) principalmente controllando la degradazione della LpxC, la deacetilasi che catalizza il primo passo dedicato della sintesi della LPS. L'obiettivo di questo protocollo è stabilire un saggio sensibile e quantitativo di degradazione in vitro per LpxC, utilizzando la proteasi AAA+ ricostituita FtsH e LapB adattatore nei proteolisomi.

Abstract

Questo protocollo presenta un saggio sensibile e quantitativo di degradazione in vitro di LpxC utilizzando proteasi AAA+ (ATPasi associata a diverse attività cellulari) ricostituita FtsH e LapB adattatore nei proteolisomi. Le proteasi AAA+ sono macchine molecolari dipendenti da ATP che mantengono l'omeostasi proteica e regolano diversi processi cellulari nel citoplasma o nelle membrane cellulari. Rispetto alle loro controparti citoplasmatiche, le proteasi AAA+ vincolate a membrana rimangono scarsamente caratterizzate a causa di difficoltà tecniche nel ricostituire e misurare la loro attività in vitro. Qui utilizziamo il sistema FtsH–LapB–LpxC come modello per sviluppare un saggio di degradazione basato sulla fluorescenza nei proteolisome. FtsH e LapB vengono ricostituiti in proteoliosomi per imitare l'ambiente membranario nativo, e LpxC viene marcato covalentmente con il colorante fluorescente Atto488. La degradazione viene avviata combinando proteoliosomi con LpxC e ATP marcati e termina con acido tricloroacetico (TCA). Un saggio di successo è definito da un aumento della fluorescenza dipendente dal tempo nella frazione supernadante solubile dopo la precipitazione del TCA, corrispondente al rilascio di frammenti peptidici fluorescenti generati dalla proteolisi LpxC. Questo segnale consente la quantificazione diretta dei tassi di degrado iniziali in condizioni definite. Rispetto ai tradizionali saggi basati su elettroforesi in gel di dodecile solfato di sodio e poliacrilammide (SDS-PAGE), questo metodo offre una sensibilità sostanzialmente migliorata e consente l'analisi cinetica quantitativa. Inoltre, il sistema proteoliosoma consente un'indagine sistematica su come componenti proteici, come adattatori e anti-adattatori, così come la composizione lipidica, influenzino la degradazione della LpxC. Sebbene sviluppato per il sistema FtsH–LapB–LpxC, questo saggio è facilmente adattabile ad altre proteasi AAA+ e substrati legati alla membrana, fornendo una piattaforma generale per lo studio della proteolisi associata alla membrana in vitro.

Introduzione

Le proteasi AAA+ sono macchine molecolari conservate, dipendenti dall'ATP, che svolgono ruoli centrali nel controllo della qualità delle proteine e nella proteolisi^{regolatoria 1,2}. Queste macchine contengono un anello esumerico di dominio AAA+ ATPasi, che idrolizza ATP, riconosce, svela e trasloca i substrati nel dominio proteasi compartimentale per la^{degradazione 1}. Mentre le proteasi citoplasmatiche AAA+ come ClpXP³ e Lon⁴ sono state ampiamente caratterizzate tramite saggi in vitro ben affermati, le proteasi AAA+ legate alla membrana rimangono relativamente poco comprese. Questa lacuna riflette in gran parte le sfide tecniche associate alla ricostituzione delle proteine di membrana in ambienti lipidici definiti e alla misurazione quantitativa della loro attività proteolitica in vitro. L'obiettivo generale di questo metodo è stabilire saggi sensibili e quantitativi per indagare l'attività proteolitica delle proteasi legate alla membrana.

FtsH è l'unica proteasi AAA+ essenziale in Escherichia coli e funge da proteasi AAA+ prototipica legata alla^{membrana 5,6,7}. Ancorata alla membrana interna da eliche transmembranari N-terminali, FtsH degrada un ampio insieme di substrati citoplasmatici e associati alla membrana, regolando così il controllo della qualità delle proteine di membrana, le risposte allo stress e l'omeostasi^lipidica 8,9,10,11. Uno dei suoi substrati meglio caratterizzati è il LpxC, una deacetilasi solubile che catalizza il primo passo dedicato nella biosintesi dei lipopolisaccaridi (LPS^{) 12,13}. La degradazione efficiente di LpxC da parte di FtsH richiede la proteina di membrana LapB, che funge da adattatore per riconoscere specificamente LpxC e consegnarla alla proteasi 14,15,16,17,18.

Nonostante la sua importanza fisiologica, l'analisi quantitativa della proteolisi in vitro mediata da FtsH è stata limitata, in particolare per substrati citoplasmatici come LpxC. I tradizionali saggi di degradazione in vitro utilizzano FtsH purificato in micelle^{detergenti 13,19}, che non forniscono l'ambiente di membrana per la proteasi ancorata alla membrana. Inoltre, i saghi di degradazione spesso si basano sulla rilevazione basata su SDS–PAGE della scomparsa del^{substrato 13}, che può essere laboriosa, a bassa produttività e insufficientemente sensibile per le analisi cinetiche. Più recentemente, FtsH ricostituito in bicelle è stato utilizzato per studiare la degradazione dei substrati a membrana, come avviato dal gruppo²⁰ di Heedeok Hong; tuttavia, manca un sistema comparabile per l'analisi dei substrati citoplasmatici. Qui adattiamo la ricostituzione della bicelle di Heedeok Hong alla ricostituzione dei proteoliosomi per imitare l'ambiente della membrana. Inoltre, il substrato solubile in acqua, LpxC, è marcato in fluorescenza, il che consente una misurazione sensibile e quantitativa della cinetica della degradazione dipendente da FtsH/LapB di LpxC in vitro.

Questo metodo dovrebbe essere utilizzato quando i ricercatori devono misurare quantitativamente la proteolisi mediata da FtsH dei substrati solubili in acqua. Offre diversi vantaggi rispetto agli approcci esistenti. Innanzitutto, la rilevazione dei prodotti proteolitici basata sulla fluorescenza, piuttosto che la scomparsa del substrato, migliora sostanzialmente la sensibilità e la gamma dinamica, facilitando confronti quantitativi dell'attività proteolitica. In secondo luogo, l'uso di proteolisomi preserva il contesto membranario necessario per la funzione di FtsH, consentendo un controllo preciso sulla composizione proteica e^{lipidica 18}. Infine, sebbene sviluppato utilizzando il sistema FtsH–LapB–LpxC, questo protocollo è facilmente adattabile ad altre proteasi AAA+ legate a membrana e ai loro substrati citoplasmatici che richiedono meccanismi di degradazione associati alla membrana.

Protocollo

1. Etichettatura LpxC con Atto488

1. Preparazione LpxC
   1. Esprimi e purificare la proteina LpxC come riportato^{in precedenza, 18}. Sostituire il tampone di LpxC purificato da Tris a un tampone fosfato da 50 mM, pH 7,6 (6 mM_{NaH 2}PO₄, 44 mM Na_{2HPO 4}, 150 mM NaCl) tramite filtrazione su gel utilizzando una colonna di filtrazione gel ad alta risoluzione (ad esempio, colonna Superdex 200 Increase 10/300 GL).
   2. Concentrare LpxC utilizzando una colonna di ultrafiltrazione fino a una concentrazione finale di almeno 5 mg/mL a 4 °C.
2. Etichettatura LpxC con Atto488
   1. Diluire 0,5 mg di LpxC in un tampone fosfato da 50 mM, pH 7,6, fino a un volume finale di 225 μL. Aggiungere 25 μL di 1 M bicarbonato di sodio per regolare il pH a circa 8,3.
   2. Dissolvere 0,24 mg di colorante reattivo Atto488 in 20 μL di tampone bicarbonato di sodio 0,1 M per preparare una soluzione di stocco (0,012 mg/μL). Preparare una soluzione operativa diluendo 2 μL della soluzione originale con 18 μL di tamponamento bicarbonato di sodio 0,1 M, ottenendo una concentrazione finale di 0,0012 mg/μL.
   3. Aggiungere immediatamente 4 μL della soluzione operativa Atto488 alla soluzione proteica (corrispondente a un rapporto molare di LpxC: Atto488 di 3:1). Avvolgi il tubo con carta stagnola e incuba a 4 °C per 2 ore con una delicata agitazione (18 giri/min).
      NOTA: Sia il materiale Atto488 che le soluzioni operative possono essere congelati rapidamente in azoto liquido e conservati a -80 °C.
3. Separazione di LpxC–Atto488 dal colorante libero
   1. Bilanciare una colonna di desalinizzazione PD-10 con 10 mL di acqua ultrapura, seguita da 15 mL di tampone fosfato da 50 mM, pH 7,6.
   2. Applica la miscela di reazione di etichettatura sulla colonna e lascia che entri completamente nella resina.
   3. Eluto con 5 mL di tampone fosfatico da 50 mM, pH 7,6. Dovrebbero diventare visibili due bande distinte corrispondenti a LpxC–Atto488 (prima banda) e colorante libero Atto488 (seconda banda). Raccogli frazioni dalla prima banda in ~0,5 mL aliquote.
   4. Analizza le frazioni eluate tramite SDS-PAGE. Visualizza la fluorescenza sotto illuminazione UV prima della colorazione con Coomassie Brilliant Blue (CBB).
   5. Raccogliere le frazioni contenenti LpxC–Atto488 e concentrare la proteina marcata a circa 2 mg/mL.
   6. Stima l'efficienza dell'etichettatura misurando la concentrazione di proteine e Atto488 utilizzando uno spettrofotometro a microvolume.
      NOTA: Un rapporto tra la concentrazione di Atto488 (in pmol/μL) e la concentrazione di LpxC (in mg/mL) nell'intervallo 2–5 indica un livello di marcatura appropriato. Questo corrisponde a un rapporto molare di Atto488 a LpxC che varia da 1:15 a 1:6 dopo l'etichettatura.
   7. LpxC–Atto488 in tubi microcentrifughe da 1,5 mL, congelati rapidamente in azoto liquido e conservati a -80 °C. A questo punto, il protocollo può essere sospeso fino a 3 mesi.
      ATTENZIONE: L'azoto liquido è estremamente freddo; maneggialo con l'attrezzatura protettiva adeguata (guanti criogenici, protezione per gli occhi).

2. Ricostituzione di FtsH/LapB in proteoliosomi

1. Preparazione dei liposomi
   1. Trasferire 100 mg di 1-Palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) in cloroformio in una provetta di vetro. Evaporare il solvente sotto un delicato getto di N₂, seguito da asciugatura notturna sotto vuoto.
      NOTA: Il POPC ha una temperatura di transizione di fase di ~-2 °C ed è ampiamente utilizzato nella biofisica delle membrane, nelle formulazioni di liposomi e nei sistemi di modelli cellulari.
      ATTENZIONE: Il cloroformio può danneggiare occhi, pelle, fegato, reni e sistema nervoso. Durante la manipolazione è necessario un adeguato equipaggiamento protettivo (guanti, protezione per gli occhi, mascherina). Maneggialo in un cappuccio usando una siringa di vetro.
   2. Aggiungere 1.315 μL di tampone A (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl) al film POPC essiccato. Risospendere i lipidi alternando 1 minuto di sonicazione a bagno d'acqua con 1 minuto di vortice alla massima velocità per un totale di ~15 minuti, o fino a dispersione completa. (concentrazione finale di lipidi: 100 mM).
      NOTA: Per migliorare la ristampa lipidica, regolare la profondità di immersione del tubo di vetro nel sonicatore a bagno d'acqua per massimizzare l'agitazione. I lipidi risospesi possono essere conservati a -20 °C. A questo punto, il protocollo può essere sospeso fino a 1 mese.
   3. Aloquota la sospensione liposoma in porzioni da 200 μL e conserva a -20 °C.
2. Estrusione dei liposomi
   1. Scongelare un'aliquota liposoma da 200 μL in un bagno d'acqua a temperatura ambiente e diluire con 800 μL di tampone A fino a un volume finale di 1 mL.
   2. Sottoponi i liposomi a tre cicli di congelamento-disgelo alternando tra azoto liquido e un bagno d'acqua a temperatura ambiente.
   3. Risciacquo siringhe, due supporti filtro e una membrana in policarbonato da 200 nm con tampone A. Assembla il mini-estrusore ed estrusa i liposomi 20 volte.
      NOTA: La sospensione del liposoma dovrebbe apparire trasparente dopo l'estrusione.
   4. Dividere la sospensione estrusa di liposoma da 1 mL in tre tubi (330 μL per tubo) e diluire ciascuno con 600 μL di buffer A.
3. Titolazione del gonfiore Triton X-100
   NOTA: Il Triton X-100 è un detersivo a bassa concentrazione critica di micella (CMC) e si è dimostrato il più efficace in molti^{casi 21}
   ATTENZIONE: Il Triton X-100 è una sostanza chimica pericolosa, che causa principalmente gravi danni agli occhi, irritazione cutanea ed effetti nocivi se ingerita. Durante la manipolazione è necessario un adeguato equipaggiamento protettivo (guanti, protezione per gli occhi).
   1. Preparare il 10% (v/v) del Triton X-100 mescolando 100 μL di Triton X-100 con acqua ultrapura da 900 μL, e incubandolo in uno shaker per dissolvere completamente il Triton X-100.
   2. Misura l'assorbanza dei liposomi a 540 nm (A₅₄₀) utilizzando uno spettrofotometro.
   3. Aggiungere 5 μL aliquote di Triton X-100 al 10% in sequenza, mescolando delicatamente dopo ogni aggiunta, e misurare A₅₄₀. Continuare ad aggiungere Triton X-100 finché A₅₄₀ non raggiunge un massimo, poi aggiungere Triton X-100 altre 4–5 volte finché l'assorbanza non scende a circa il 60% del valore di picco.
   4. In base alla curva di titolazione, si gonfiano i liposomi aggiungendo 35 μL di Triton X-100 al 10% e si incubano a temperatura ambiente per 1 ora con una leggera agitazione.
4. Ricostituzione di FtsH/LapB in liposomi
   1. Esprimi e purificare le proteine FtsH e LapB come descritto in^{precedenza, 18}.
   2. Lavare ~2 g di un adsorbente di polistirene non polare (ad esempio, Bio-Beads SM-2) una volta con 10 volumi di metanolo, una volta con 10 volumi di etanolo e dieci volte con 10 volumi di acqua ultrapura. Conserva l'adsorbente lavato nel buffer A a 4 °C.
   3. Per ogni tubo di liposomi gonfio Triton X-100, aggiungere 3 μL di 500 mM di tris(2-carbosossietil)fosfina (TCEP), 22,5 μg di FtsH e 22,5 μg di LapB. Regola il volume totale a 1 mL con il buffer A e incuba a RT per 1 ora con una leggera agitazione.
      NOTA: Rapporti proteina-lipidi di 1:20 a 1:200 (peso/peso) sono stati usati di routine durante la ricostituzione dei proteoliosomi²¹. Qui viene utilizzato un rapporto di 1:100.
   4. Rimuovere il detersivo tramite incubazione sequenziale con adsorbente di polistirene non polare: 40 mg a RT per 0,5 ore, seguiti da 40 mg a RT per 1 ora, poi 40 mg a 4 °C durante la notte e infine 40 mg a 4 °C per 1 ora.
   5. Centrifuga brevemente per pelletare l'adsorbente di polistirene non polare a 4 °C (400 × g per 3 secondi). Trasferire il sovrantato su tubi ultracentrifughe. Lavare l'adsorbente di polistirene non polare con 1 mL di tampone A e unire il lavaggio con il soprandante. Aggiungi un buffer aggiuntivo A a un volume finale di ~6 mL.
      NOTA: Per sicurezza, i tubi delle ultracentrifughe devono contenere almeno 6 mL di liquido.
   6. Bilanciare i tubi e l'ultracentrifuga a 250.000 × g a 4 °C per 45 minuti in un rotore ad angolo fisso (ad esempio, MLA-80) per pelletare i proteolisomi.
   7. Scartare il soprantantante e risospendere il pellet proteoliosoma in 70 μL di buffer A integrato con 1 mM di TCEP.
      NOTA: Il volume finale dei proteoliosomi è di circa 100 μL.
   8. Congelare rapidamente i proteoliosomi in azoto liquido e conservarli a -80 °C.
      NOTA: A questo punto, il protocollo può essere sospeso fino a 1 mese.
5. Analisi SDS-PAGE dei proteolisomi
   1. Mescolare accuratamente i proteoliosomi e combinare 5 μL del campione con 5 μL di 2× tampone di carico SDS (0,1 M Tris-HCl, pH 6,8, 5% SDS, 20% glicerolo, 0,01% blu di bromofenolo, 200 mM DTT).
   2. Carica campioni di proteoliosomi insieme a 525 ng di FtsH (corrispondenti a 0,06 μM di esamero FtsH in 20 μL) su un gel SDS-PAGE al 4–20%.
   3. Tingi il gel con CBB.
   4. Scansiona il gel e quantifica l'intensità della banda di FtsH per ogni campione. Calcola il volume della sospensione di proteoliosomi equivalente a 525 ng di FtsH.

3. Degradazione in vitro di LpxC–Atto488

1. Eseguire saggi di degradazione in vitro in una reazione da 20 μL contenente proteolisomi FtsH/LapB (corrispondenti a 0,06 μM FtsH) e 0,5, 1, 2, 2,5, 5, 10, 20, 40 μM LpxC-Atto488 in tampone di degradazione (50 mM Tris-acetato, pH 8,0, 10 mM Mg-acetato, 5 mM ATP, 25 μM Zn-acetato, 80 mM NaCl, 1,4 mM β-mercaptoetanolo).
2. Per la misurazione di ogni concentrazione di substrato, si prepara una reazione di 70 μL.
   1. Prendi una frazione da 20 μL e temprala mescolandola immediatamente con 48 μL di acido tricloroacetico (TCA) al 5% in tubi microcentrifuga da 1,5 mL (0 min). Prendi la seconda e la terza frazione e tempinale rispettivamente a 10 e 20 minuti.
   2. In parallelo, preparare reazioni di controllo corrispondenti prive di proteoliosomi per la sottrazione di fondo.
      NOTA: Sono raccomandate tre misurazioni replicate per ottenere risultati affidabili.
      Minimizzare l'esposizione alla luce quando si maneggia LpxC–Atto488.
      ATTENZIONE: Il TCA è una sostanza chimica altamente corrosiva che provoca gravi ustioni cutanee, danni oculari permanenti e intensa irritazione respiratoria all'inalazione. Maneggialo con l'attrezzatura protettiva adeguata (guanti, protezione per gli occhi, mascherina).
3. Incubare i campioni a 37 °C per 30 minuti per precipitare le proteine, poi centrifugare a 18.800 × g a temperatura ambiente per 20 minuti.
4. Neutralizza i campioni trasferendo 50 μL di soprantantante in un tubo contenente 60 μL di 500 mM Tris-HCl, pH 8,8. Mescola bene e trasferisci 100 μL su una piastra nera a 96 pozzi. Misurare la fluorescenza utilizzando un lettore di placche con eccitazione a 498 nm ed emissione a 520 nm.

Risultati

Per migliorare la sensibilità del saggio di degradazione in vitro , il substrato LpxC è stato etichettato con il colorante fluorescente Atto488. Il gruppo estere succinimidile di Atto488 reagisce efficacemente con i gruppi amminomici primari di LpxC in condizioni lievemente alcaline. Poiché il tampone Tris contiene ammine primarie che interferiscono con questa reazione, il LpxC purificato nel tampone Tris veniva sostituito in tampone fosfato tramite filtrazione su gel prima dell...

Discussione

Il primo passo critico di questo protocollo è l'etichettatura Atto488 di LpxC. Un'etichettatura moderata è fondamentale per misurare con precisione l'attività di degradazione in vitro . Secondo i nostri esperimenti di ottimizzazione, un rapporto molare tra LpxC e Atto488 tra 9:1 e 3:1 è ottimale. Un eccesso di Atto488 provoca un sovra-etichettamento, che probabilmente perturba lo stato nativo di LpxC. In queste condizioni, la differenza nella degradazione di LpxC–Atto488 da part...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1.5 mL microcentrifuge tube	USA scientific	1415-2500
200 nm polycarbonate membrane	Avanti Polar Lipids	610006
4-20% SDS-PAGE			Home made
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma	A26209
Atto 488 Protein Labeling Kit	Sigma	38371
Bio-Beads SM-2	Bio-Rad	152-8920	Nonpolar polystyrene adsorbent
Black 96-well plate	Costar	3915
Bromophenol blue	Sigma	114391
Coomassie Brilliant Blue R250	Sigma	1.12553
DTT	Sigma	D9779
Ethanol	Sigma	459844
Filter support	Avanti Polar Lipids	610014
Glass syringe	Avanti Polar Lipids	610017
Glass test tube	KIMBLE	45066-16150
Glycerol	Avantor	2136-01
Magnesium acetate tetrahydrate	Sigma	228648
Methanol	Sigma	179337
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75-002-436
Mini-extruder	Avanti Polar Lipids	610000
MLA-80 rotor	Beckman	367096	Fixed-angle rotor
Plate reader	Tecan	Infinite M1000 PRO
POPC	Avanti Polar Lipids	850457C
Refrigerated microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002559
SDS	American Bio	AB01920-00500
Sodium bicarbonate	Sigma	S6014
Sodium chloride	Sigma	S9888
Sodium dihydrogen phosphate	Sigma	38400100
Sodium phosphate dibasic	Sigma	567547
Sonicator	Fisherbrand	FB-11201
Spectrophotometer	SCILOGEX	SCI-V1000
Superdex 200 Increase 10/300 GL	Cytiva	28990944	High-resolution gel filtration column
Tabletop ultracentrifuge	Beckman	Optima MAX-XP
TCEP HCl	Gold Biotechnology	TCEP1
Trichloroacetic acid	Sigma	T6399
Tris Base	Sigma	252859
Triton X-100	Sigma	T8787
Ultracentrifuge tubes	Beckman	355647
Ultrafiltration column	Millipore	UFC8030
Vortex-Genie 2 Mixer	Scientific Industries	SI-0236
Zinc acetate dihydrate	Sigma	379786
β-mercaptoethanol	Sigma	444203