L'efficacia diagnostica del plasma miR-362-3p combinato con l'ecografia Doppler nella diagnosi del cancro al seno

Sommario

Il tasso di diagnosi di cancro al seno è relativamente basso. Il metodo della tabella a quattro partite è stato utilizzato per analizzare il valore diagnostico del miR-362-3p combinato con l'ecografia Doppler per il cancro al seno. La combinazione dell'ecografia Doppler e del miR-362-3p ha efficacemente aumentato l'efficacia diagnostica, offrendo un metodo promettente per la diagnosi del tumore al seno.

Abstract

Il cancro al seno è il secondo tumore maligno più comune al mondo, minacciando seriamente la vita delle donne e imponendo un enorme onere economico. Questo studio mira a esplorare il valore del miR-362-3p combinato con l'ecografia Doppler nella diagnosi del cancro al seno. In questo studio sono state incluse in totale 182 pazienti affette da cancro al seno e 147 pazienti con malattia benigna al seno. I livelli plasmici di miR-362-3p dei pazienti sono stati misurati utilizzando la reazione a catena quantitativa della polimerasi a fluorescenza in tempo reale (RT-qPCR). Il test chi-quadrato è stato utilizzato per analizzare le differenze nei parametri dell'ecografia Doppler tra i due gruppi di pazienti. La curva della caratteristica operatore del ricevitore (ROC) è stata utilizzata per valutare l'efficacia diagnostica di miR-362-3p, Indice di Resistenza (RI) e Indice di Pulsatilità (PI). L'efficienza diagnostica dell'ecografia Doppler combinata con plasma miR-362-3p nel cancro al seno è stata analizzata tramite il metodo della tabella a quattro punte. I livelli di miR-362-3p sono stati notevolmente diminuiti nelle pazienti con tumore al seno. Sono state riscontrate differenze significative nei parametri dell'ecografia bidimensionale. miR-362-3p, RI e PI hanno un valore diagnostico per il cancro al seno. Il valore diagnostico combinato dei tre fattori era più alto. L'ecografia combinata con miR-362-3p ha migliorato significativamente sensibilità, accuratezza e valore predittivo negativo nella diagnosi di cancro al seno. L'ecografia Doppler combinata con miR-362-3p potrebbe migliorare l'efficienza diagnostica del cancro al seno, che potrebbe fornire uno strumento diagnostico non invasivo e potenzialmente ausiliario per il cancro al seno.

Introduzione

Secondo le statistiche dell'Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro, il tasso di incidenza del cancro al seno ha superato quello del cancro ai polmoni nel 2020^. Il tumore al seno è un tumore maligno che si manifesta comunemente ed è una delle principali cause di morte correlata al cancro nelle donne^{a livello globale.} Una diagnosi tempestiva del tumore al seno è vantaggiosa per la prognosi delle pazienti. La biopsia tissutale è il punto di riferimento per la diagnosi del cancro al seno. Tuttavia, si tratta di un tipo di diagnosi invasiva e non si applica alle pazienti con tumore al seno in fase^{iniziale 2}.

L'ecografia Doppler è una tecnica di imaging comunemente utilizzata per lo screening del tumore al seno e la diagnosi^{ausiliaria 3}. L'ecografia Doppler può valutare con precisione la dimensione dei noduli, i segnali di flusso sanguigno e lo stato delle metastasi dei^{linfonodi 4}. L'ecografia Doppler al seno, grazie ai suoi vantaggi come l'assenza di radiazioni ionizzanti, la sicurezza e la non invasività, nonché la possibilità di esami ripetuti, è diventata una delle tecniche di imaging più utilizzate nello screening e nella diagnosi del cancro^{al seno 5}. Tuttavia, l'ecografia Doppler è soggetta a essere interferita dal tessuto di fondo nel rilevamento di tumori al seno a bassa densità o di piccolo volume, causando un calo significativo della sensibilità diagnostica e rendendo difficile soddisfare le esigenze cliniche per una diagnosi^{precoce 6}. Pertanto, è necessario sviluppare biomarcatori plasmici che possano superare i limiti della tecnologia di ultrasuoni Doppler. Se la combinazione dei due metodi potesse aumentare la sensibilità della diagnosi per il cancro al seno, avrà un valore clinico significativo e un significato pratico.

I microRNA (miRNA) sono una classe di molecole di RNA non codificanti con una lunghezza di circa 20-24^{nucleotidi 7,8}. Una delle caratteristiche dei miRNA è un alto grado di conservazione durante il processo evolutivo. I miRNA hanno una vasta distribuzione tissutale, che non solo viene espressa specificamente in varie cellule del tessuto umano, ma può anche esistere stabilmente in più fluidi corporei come sangue e^{saliva 9}. Queste caratteristiche di distribuzione offrono vantaggi per lo sviluppo di marcatori diagnostici non invasivi. Dal punto di vista funzionale, i miRNA degradano l'mRNA legandosi in modo complementare alle 3' Regioni Non Tradotte (UTR)^10,11, partecipando a una serie di processi patologici e fisiologici chiave come risposte infiammatorie cellulari, stress ossidativo, apoptosi e proliferazione e differenziazione¹². Un gran numero di studi ha confermato che i cambiamenti anomali nei profili di espressione dei miRNA erano strettamente correlati all'occorrenza e allo sviluppo del tumore al^{seno 13,14}. La disregolazione dell'espressione dei miRNA può favorire la trasformazione maligna delle cellule epiteliali mammarie regolando le reti di espressione degli oncogeni o dei geni soppressori tumorali. miR-362-3p è un fattore tipico che inibisce la progressione tumorale. Numerosi rapporti hanno rilevato che miR-362-3p inibiva la progressione del cancro al seno 15,16,17. Assiri et al. hanno riportato che la bassa espressione di miR-362-3p era strettamente associata a una prognosi scadente e a una sopravvivenza complessiva più breve nelle pazienti con cancro al^{seno 15}. Meccanicamente, il miR-362-3p ha esercitato un effetto antitumorale nel cancro al seno mirando all'elicase DEAD-box 5 (DDX5) per promuovere la proliferazione, l'invasione e la migrazione delle cellule^{tumorali 16}. Inoltre, il team guidato da Kang ha anche rilevato che miR-362-3p era significativamente sottoregolata nei tessuti del cancro al seno, e che una regolazione mirata dell'espressione di miR-362-3p potrebbe rappresentare una nuova potenziale strategia terapeutica per la gestione^{del cancro al seno 17}. Tuttavia, non sono stati segnalati se miR-362-3p possa fungere da marcatore diagnostico precoce per il cancro al seno.

Questo studio ha misurato il livello di espressione di miR-362-3p nel plasma e ha analizzato contemporaneamente i parametri chiave dell'ecografia Doppler in pazienti con cancro al seno. Lo studio ha esplorato a fondo il valore combinato di applicazione dei livelli di espressione plasmatica di miR-362-3p e dei parametri dell'immagine Doppler, dimostrando chiaramente l'efficacia di questo approccio diagnostico combinato nello screening del cancro al seno e nella diagnosi differenziale tra malattie benigne e maligne al seno.

Protocollo

Questo studio è stato condotto in linea con i principi della Dichiarazione di Helsinki. L'approvazione è stata concessa dal Comitato Etico dell'Ospedale Affiliato della Seconda Università Medica dello Shandong, Scuola di Medicina Clinica, Seconda Università Medica dello Shandong (numero di approvazione: wyfy-2023-ky-124). Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i soggetti coinvolti nello studio. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Soggetti sperimentali

Il calcolo della dimensione del campione è stato effettuato utilizzando il software G*Power 3.1 basato su un test t indipendente del campione. Sono stati impostati un effetto di dimensione media (d di Cohen = 0,5, ampiamente utilizzato in studi osservazionali clinici), un test a due code, α = 0,05, e una potenza (1 − β) = 0,95. Il calcolo indicava che erano necessari almeno 105 partecipanti per gruppo. Infine, sono state arruolate 182 pazienti con cancro al seno e 147 pazienti con lesioni benigne al seno, e la dimensione effettiva del campione di entrambi i gruppi ha superato di gran lunga la dimensione minima richiesta, garantendo una potenza statistica sufficiente a supportare le conclusioni dello studio e controllando il rischio di errore di tipo II entro un intervallo accettabile. Tutti i partecipanti sono stati iscritti in modo rigoroso e consecutivo secondo criteri unificati di inclusione ed esclusione.

Dal 2023 al 2024, tutti i pazienti sono stati iscritti presso l'Ospedale Affiliato della Seconda Università Medica dello Shandong, Scuola di Medicina Clinica, Università Medica Secondaria dello Shandong. Lesioni benigne: Le lesioni non maligne sono state confermate dalla patologia. Tumore al seno: i tumori maligni sono stati confermati dalla patologia. Dopo il digiuno notturno sono stati prelevati campioni di sangue venoso da tutti i partecipanti. I campioni venosi di sangue venivano anticoagulati e centrifugati per separare il plasma, rispettando rigorosamente le procedure standard, e poi trasferiti a −80 °C per una conservazione a lungo termine, che fu successivamente utilizzata per l'estrazione di miRNA. Tutti i campioni di plasma erano strettamente limitati a non più di due cicli di congelamento-scongelamento prima dell'estrazione dell'RNA per prevenire la degradazione del miRNA. Tutti i pazienti sono stati pienamente informati sul protocollo dello studio e hanno fornito volontariamente un consenso scritto informato prima dell'iscrizione.

Criteri di inclusione per le pazienti con tumore al seno: (1) Pazienti con carcinoma materno primario patologicamente confermato. (2) Nessun trattamento chirurgico prima dell'iscrizione. (3) Non ha ricevuto radioterapia o chemioterapia prima della raccolta del campione.

Criteri di inclusione per pazienti con malattia benigna del seno: (1) Lesioni mammarie benigne patologicamente confermate. (2) Senza altri tumori maligni sistemici o lesioni precancerose. (3) Non gravida e non allattante. (4) Nessuna grave infezione acuta o malattia infiammatoria cronica.

Criteri di esclusione per le pazienti con cancro al seno e lesioni benigne al seno: (1) Grave infezione mammaria o malattia critica acuta. (2) Grave disfunzione epatica o renale, o malattia autoimmune. (3) Pazienti che hanno ricevuto terapia ormonale entro 6 mesi.

2. Esame Doppler a ultrasuoni

Il seno bilaterale della paziente è stato esaminato accuratamente in quattro quadranti tramite ecografia Doppler. È stata utilizzata una scansione ecografica bidimensionale per registrare le caratteristiche della lesione, inclusi confini, forma, eco interno, onde ecografiche posteriori e rapporto d'aspetto della lesione. È stata applicata l'imaging a flusso Doppler a colori per valutare i parametri del flusso sanguigno della lesione, inclusi indice di resistenza (RI), indice di pulsatilità (PI) e velocità massima del flusso sanguigno (V_max). I segnali del flusso sanguigno sono stati valutati secondo un sistema di classificazione^{precedentemente segnalato 18}: Grado 0: Nessun segnale di flusso sanguigno; Grado I: segnale di flusso sanguigno minimo; Grado II: La lunghezza del segnale di flusso sanguigno supera metà del diametro della lesione; Grado III: segnale di abbondante flusso sanguigno.

3. Definizione positiva per la diagnosi ecografica del cancro al seno

Questi includevano (1) confini ambigui; (2) Forma irregolare; (3) Eco interna disomogenea; (4) Eco posteriore indebolito; (5) Rapporto d'aspetto >1; (6) RI > 0,70; (7) PI > 1,50; (8) Flusso sanguigno massimo (Vmax)> 18,00 cm/s; (9) Segnale di flusso sanguigno ≥ grado II. Qualsiasi lesione che soddisfi uno qualsiasi dei criteri sospetti sopra indicati è classificata come ecografica positiva, mentre quelle senza caratteristiche sospette sono classificate come ecografia negativa.

4. Reazione a catena quantitativa della polimerasi a fluorescenza in tempo reale (RT-qPCR)

I miRNA plasmamici sono stati estratti utilizzando un kit specializzato di estrazione di miRNA. I campioni di RNA estratti con successo sono stati utilizzati per sintetizzare cDNA utilizzando kit specializzati di trascrizione inversa di miRNA. Condizioni della reazione di trascrizione inversa per miR-362-3p: Il volume totale di questa reazione era di 20 μL. La procedura di reazione PCR è stata la seguente: (1) La miscela è stata incubata a 37 °C per 15 minuti, (2) La reazione di trascrizione inversa è stata eseguita per 50 minuti a 42 °C, (3) L'enzima è stato inattivato per 5 minuti a 95 °C. Il prodotto veniva conservato a 4 °C. Le condizioni di reazione qPCR: Il volume totale del sistema di reazione era di 20 μL. Le condizioni di amplificazione sono state eseguite come segue: (1) Il cDNA è stato pre-denaturato e la DNA polimerasi è stata attivata a 95 °C per 2 minuti. (2) I filamenti di DNA si ricottano ed estendono per 30 secondi a 60 °C. I due passaggi sopra elencati sono stati eseguiti per un totale di 40 cicli. L'espressione relativa del gene è stata calcolata con la formula 2^-(ΔΔCt). L'espressione relativa miR-362-3p è stata calibrata da U6. Per giustificare l'uso di U6 come controllo endogeno, la stabilità di U6 è stata valutata utilizzando l'algoritmo BestKeeper nella coorte plasmiche. Il coefficiente di variazione (CV) dei valori di U6 Ct su tutti i campioni era inferiore al 2%, indicando un'elevata stabilità di espressione. Pertanto, U6 è stato convalidato e selezionato come gene di riferimento per la normalizzazione dell'espressione di miR-362-3p nel presente studio. La sequenza a valle degli innesco era fornita dal kit. Le sequenze di primer erano le seguenti:

miR-362-3p: GCCGAGAACACACCTATTCA.

U6: CTCGCTTCGGCAGCACATATAT.

5. Curva della Caratteristica di Funzionamento del Ricevitore (ROC)

L'indice di Youden è stato utilizzato per determinare il valore ottimale di soglia per miR-362-3p nella diagnosi del tumore al seno, calcolando i valori di sensibilità e specificità della curva ROC. Il modello diagnostico combinato è stato costruito utilizzando la regressione logistica binaria in SPSS, con miR-362-3p, RI e PI inseriti come variabili indipendenti. Le variabili sono state incluse dal metodo Enter per generare il valore di probabilità previsto della diagnosi combinata per ciascun soggetto. La formula per la probabilità di previsione (PRE): . Le curve ROC sono state tracciate sulla base del PRE. Il test Delong è stato utilizzato per confrontare le differenze nei valori di Area Under Curve (AUC) tra diverse curve ROC.

6. Definizione dei parametri di risultato

Il parametro principale di esito era l'efficacia diagnostica complessiva del modello combinato di plasma miR-362-3p ed ecografia Doppler per il cancro al seno, con la diagnosi patologica come standard d'oro. I parametri di esito secondario includevano la performance diagnostica dell'ecografia Doppler da sola e della sola miR-362-3p plasmmatica.

7. Statistiche dei dati

I livelli di espressione di miR-362-3p e le curve ROC dei due gruppi di pazienti sono stati analizzati utilizzando software statistico e grafico. Il test t veniva utilizzato per confrontare le differenze nelle variabili continue tra i due gruppi. Il test chi-quadrato e il metodo della tabella a quattro punte sono stati analizzati utilizzando SPSS 26.0. Il test chi-quadrato è stato utilizzato per valutare le differenze statistiche delle variabili categoriche; la combinazione a due indici (miR-362-3p + ecografia Doppler) era considerata l'analisi primaria, rappresentando una conclusione diagnostica qualitativa di routine nella pratica clinica; se vi erano caratteristiche sospette derivate dalla classificazione BI-RADS (Breast Imaging Reporting and Data System), la lesione era definita positiva; il metodo della tabella a quattro punti è stato utilizzato per calcolare la specificità, il valore predittivo positivo, il valore predittivo negativo e l'accuratezza della diagnosi combinata dell'ecografia Doppler e del miR-362-3p. I risultati diagnostici tra l'ecografia Doppler e il miR-362-3p includevano veri positivi (a), falsi positivi (b), falsi negativi (c) e veri negativi (d). Formula di calcolo: Sensibilità = a / (a + c); Specificità = d / (d + b); Valore Predittivo Positivo = a / (a + b); Valore Predittivo Negativo = d / (d + c); Accuratezza = (a + d) / (a + b + c + d). I tre metodi diagnostici (miR-362-3p, ecografia e diagnosi combinata) sono stati eseguiti utilizzando il test Pearson χ² per le tabelle di contingenza R×C. P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

Il livello di miR-362-3p è stato significativamente diminuito nelle pazienti con tumore al seno

Sono state confrontate le informazioni cliniche di base e le caratteristiche patologiche cliniche di 182 pazienti con cancro al seno e 147 pazienti con lesioni benigne al seno. I dati dettagliati sono stati riassunti nella Tabella 1. La RT-qPCR è stata utilizzata per misurare i livelli di miR-362-3p plasmatico in due gruppi di pazie...

Discussione

Il cancro al seno è uno dei tipi più comuni di tumori maligni, diventando un importante problema di salute pubblica che minaccia la salute^{umana 19,20}. L'elevata incidenza e mortalità non solo causa gravi traumi psicologici alle famiglie dei pazienti, ma comporta anche un enorme peso per la società e l'economia. La maggior parte delle pazienti affette da cancro al seno ha già sperimentato invasione locale o metastasi a distanza al...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
BD Vacutainer K2EDTA Blood Collection Tube (purple cap)	USA	367861	Per la raccolta del sangue venoso e la preparazione del plasma per l'analisi miRNA.
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad Laboratories	1855195	Strumento PCR quantitativa a fluorescenza a 6 canali da 96 pozzetti, che utilizza la conduzione in fibra ottica e l'imaging CCD a freddo, con raccolta sincrona della fluorescenza in ogni pozzetto senza ritardi. L'intervallo dinamico raggiunge 10 ordini di grandezza ed è compatibile sia con qPCR convenzionale che con l'analisi della curva di fusione ad alta risoluzione (HRM). Il software supporta l'esportazione in formato RDML, è compatibile sia con test di ricerca che clinici e viene comunemente utilizzato in esperimenti come la quantificazione dell'espressione genica, il tipaggio SNP e l'analisi della metilazione.
Kirgen 0.1 mL PCR Tubes (or 8-Strip PCR Tubes), Sterile	Shanghai, China	KG0811	Utilizzati per preparare ed eseguire reazioni qPCR.
Kirgen 1.5 mL Microcentrifuge Tubes, Sterile	Kirgen Biotech Co., Ltd.	KG2911	Utilizzati per la conservazione dei campioni, la preparazione dei reagenti e la centrifugazione durante l'estrazione miRNA e la trascrizione inversa.
miRcute miRNA Isolation Kit (Spin Column)	Beijing, China	DP501	Per l'isolamento e la purificazione di RNA totale incluso miRNA da campioni di plasma umano, utilizzando la tecnologia basata su colonne di centrifugazione.
miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit	Beijing, China	KR211	Per la trascrizione inversa di miRNA purificato in cDNA di prima generazione mediante il metodo di coda poli(A).
miRcute Plus miRNA qPCR Kit (SYBR Green)	Beijing, China	FP411	Per la rilevazione PCR in tempo reale quantitativa di miRNA utilizzando la chimica basata su SYBR Green I.
Roche LightCycler 480 Multiwell Plate 96, White	Mannheim, Germany	4729692001	Utilizzato per saggi PCR in tempo reale quantitativi sullo strumento Roche LightCycler 480.
Siemens Acuson 14L5 / 14L5 SP Linear Array Probe	Siemens Healthineers	10041226	Sonda ad array lineare ad alta frequenza, con una gamma di frequenza di 5–14 MHz, appositamente progettata per l'esame di organi superficiali come seno e tiroide. Presenta un'alta risoluzione e un eccellente contrasto dei tessuti, e supporta l'elastografia e la scansione automatica del volume del seno.
Siemens Acuson S2000/S3000/S1000 Ultrasound System	Siemens Healthineers	/	Il sistema di ultrasuoni Doppler a colori supporta l'imaging 3D/4D in tempo reale e le funzioni di imaging dell'elasticità, ed è ampiamente utilizzato in molteplici reparti come addome, cardiovascolare, ginecologia e ostetricia e seno.
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4375786	Strumento PCR a gradiente a 96 canali, Supporta l'ottimizzazione della temperatura del gradiente; ha un'elevata precisione di controllo della temperatura; utilizzato per la sintesi di cDNA e l'amplificazione PCR convenzionale.