Sviluppo di un protocollo di ricostituzione delle vescicole COPII senza cellule per indagare l'ordinamento STING in un sistema basato su celle HEK-293

Summary

Questo protocollo descrive un sistema ottimizzato senza cellule per ricostituire l'incorporazione di STING nelle vescicole COPII, consentendo un'analisi biochimica controllata dello smistamento del carico durante l'esportazione di RE.

Abstract

La via cGAS–STING è un componente centrale dell'immunità innata. All'attivazione, la proteina residente nel reticolo endoplasmatico (ER) STING viene confezionata nelle vescicole COPII e trasportata all'apparato di Golgi per avviare la segnalazione a valle. Nonostante l'importanza di questo processo, i meccanismi molecolari che governano la selezione STING nelle vescicole COPII rimangono incompletamente compresi. Qui viene presentato un flusso di lavoro ottimizzato per la ricostituzione in vitro delle vescicole COPII per facilitare un'analisi controllata della selezione del carico. Viene descritto un metodo scalabile per preparare citosol ad alta concentrazione (30–40 mg/mL) da cellule di sospensione HEK-293F, combinato con una procedura semplice per generare cellule HEK-293T semipermeabilizzate come fonte di membrana definita. Rispetto ai tradizionali sistemi basati su celle aderenti, questo approccio migliora la scalabilità, riduce i costi e ne aumenta la riproducibilità. Utilizzando STING come carico modello, la gemmazione delle vescicole COPII e l'incorporazione del carico sono validate dall'analisi Western blot, con un'efficienza di confezionamento basale di circa il 20% in condizioni definite. Questo sistema consente la manipolazione controllata dei parametri biochimici, inclusa la stimolazione dei nucleotidi, per valutarne gli effetti sull'incorporazione del carico. Questo protocollo fornisce una piattaforma robusta e adattabile per indagare lo smistamento delle merci mediato da COPII e può essere esteso allo studio di ulteriori proteine transmembrana e fattori regolatori coinvolti nell'esportazione di RE.

Introduction

La via di segnalazione cGAS-STING funge da meccanismo fondamentale del sistema immunitario innato, rilevando il DNA citosolico a doppio filamento (dsDNA) per avviare una risposta antivirale. Rilevando dsDNA, l'enzima cGAS produce il dinucleotide ciclico cGAMP, che agisce come un secondo messaggero che si lega allo STING ^1,2. In modo cruciale, STING risiede come un dimero inattivo nel reticolo endoplasmatico (RE) in condizioni di stato^{stazionario 3}. La sua attivazione richiede una rapida e altamente regolata traslocazione dall'ER all'apparato di Golgi. È al Golgi che STING recluta e attiva le chinasi a valle TBK1 e IRF3, portando alla produzione di interferoni di tipo I e citochine^{pro-infiammatorie 4}.

Il trasporto di STING è mediato da vescicole rivestite di COPII, i veicoli universali per l'esportazione proteica dell'ER⁵. L'assemblaggio del mantello COPII—composto dal piccolo GTPase Sar1, dal complesso interno Sec23/24 e dal complesso esterno Sec13/31—è responsabile sia della deformazione della membrana ER in vescicole sia del reclutamento selettivo del carico ^6,7. Sec22b viene ordinato in vescicole COPII tramite un epitopo strutturale riconosciuto dal complesso Sec23/24 di COPII⁸. Altri carichi includono la famiglia p24 e il marcatore ERGIC ERGIC-53, entrambi dipendenti da un motivo diidrofobo diidrofobo C-terminale per la^{classificazione del 9}. Al contrario, alcune proteine ancorate al RE, come la riboforina I (RPN1), rimangono confinate all'ER e fungono da marcatori delle strutture RE intatte, poiché non vengono trasportate tramite vescicole^{COPII 10}. Di conseguenza, negli esperimenti di ricostituzione della vescicola COPII senza cellule, Sec22b e p24 sono spesso considerati carichi COPII, mentre la riboborina funge da marcatore per monitorare la contaminazione da ER nelle preparazioni di vescicole. Sebbene il meccanismo generale del trasporto COPII sia ben caratterizzato, i segnali molecolari specifici che innescano la sequestrazione selettiva dello STING attivato in queste vescicole rimangono sfuggenti. Comprendere questi meccanismi di selezione è fondamentale, poiché la disregolazione del trasporto STING è collegata a varie malattie autoimmuni e autoinfiammatorie, come la vascolopatia associata alla STING con esordio infantile (SAVI) e la sindrome^{COPA 11}. Tuttavia, studiare questi eventi transitori e altamente dinamici nelle celle intatte rimane tecnicamente impegnativo.

Per affrontare queste sfide, è stato sviluppato un sistema ottimizzato di ricostituzione senza cellule per esaminare i requisiti molecolari dello smistamento dei carichi mediato da COPII. Sebbene i test di gemma in vitro siano da tempo un pilastro della biologia^{cellulare 12}, la loro ampia adozione è spesso limitata dall'elevato costo e dalla complessità della preparazione di componenti di alta qualità. In questo studio viene introdotto un flusso di lavoro semplificato che utilizza cellule di sospensione HEK-293F come fonte economica di citosol attivo e cellule HEK-293T semipermeabilizzate come solido donatore di membrana. Il flusso di lavoro complessivo del sistema di ricostituzione della vescicola COPII senza cellule è illustrato nella Figura 1. In questo sistema, Sec22b veniva utilizzato come controllo positivo per confermare l'incorporazione del carico nelle vescicole, mentre RPN1 veniva utilizzato come controllo negativo per monitorare ed escludere contaminazioni da membrana RE. Utilizzando STING come carico proof-of-concept, questo studio ha dimostrato che il sistema modella efficacemente gli aspetti biochimici essenziali dello smistamento STING. Questa piattaforma forniva uno strumento versatile e scalabile per identificare fattori citosolici e segnali di membrana che governano l'ordinamento STING, con potenziali applicazioni per lo studio di un'ampia gamma di altri percorsi di trasporto vescicolari.

Protocol

Le linee cellulari HEK-293F (RRID: CVCL_6642) e HEK-293T (RRID: CVCL_0063) sono state ottenute dal Cell Resource Center del Peking Union Medical College. Entrambe le linee cellulari sono state autenticate tramite profilazione a breve ripetizione tandem (STR) e confermate libere da contaminazione da micoplasmi. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

Non sono stati coinvolti partecipanti umani né animali vertebrati in questo studio. Pertanto, non era richiesta un'approvazione etica. Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con le linee guida istituzionali sulla biosicurezza.

1. Preparazione del citosolo delle cellule HEK-293F

1. Cellule HEK-293F a una densità di 1 × 10⁶ cellule/mL in un mezzo di coltura mammifero definito da 100 mL, integrato con penicillina–streptomicina all'1%. Coltivare le cellule in una fiaschetta conica da 500 mL.
2. Incubare la coltura di sospensione a 37 °C con il 5% di CO₂ in un incubatore a scuotere per 60 ore.
3. Prelevare le celle tramite centrifugazione a 300 × g per 5 minuti a 4 °C. Determina il numero totale delle celle utilizzando un contatore automatico.
4. Lava il pellet cellulare con 50 mL di soluzione salina fosfatata (PBS) fredda come il gelo. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
5. Risospendere la pellet cellulare in un volume uguale di tampone di B88 gelida (20 mM HEPES, pH 7,3; 250 mM sorbitolo; 150 mM acetato di potassio; 5 mM acetato di magnesio).
6. Lisa le celle sul ghiaccio passando la sospensione attraverso una siringa da 5 mL dotata di ago calibro 22 per più di 100 colpi.
7. Esaminare la lisi cellulare tramite microscopia ottica. Rimuovere i detriti cellulari tramite centrifugazione a 20.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
8. Trasferire il sovrantato su tubi ultracentrifughe. Centrifugare a 100.000 × g per 1 ora a 4 °C.
   ATTENZIONE: Assicurarsi che i tubi delle ultracentrifughe siano correttamente bilanciati per prevenire danni alle apparecchiature e pericoli per la sicurezza.
9. Raccogli il soprannatante chiarito. Concentrare il campione utilizzando un dispositivo di ultrafiltrazione a corte molecolare (MWCO) di 3 kDa a 4.000 × g a 4 °C.
10. Misurare la concentrazione proteica utilizzando un saggio di acido bicinconinico (BCA). Regola la concentrazione a 30–40 mg/mL.
    ATTENZIONE: Maneggiare l'azoto liquido con l'attrezzatura protettiva adeguata per evitare danni criogenici.
11. Aliquota il citosol. Congelare rapidamente le aliquote in azoto liquido e conservarle a −80 °C (Figura 2A)
    ATTENZIONE: Evita più di due cicli di congelamento-disgelo. Conserva le aliquote a −80 °C per un massimo di 6 mesi.

2. Preparazione di cellule HEK-293T semipermeabilizzate

1. Placcare cellule HEK-293T che esprimono STING umano a lunghezza intera a una densità di 3 × 10⁶ cellule per piatto da 15 cm in 15 mL di DMEM integrato con 10% di siero fetale bovino e 1% di penicillina–estreptomicina. Incubare a 37 °C con il 5% di CO₂ per 48 ore.
2. Preleva le cellule a circa il 60% di confluenza.
3. Aspira il mezzo e lava le cellule due volte con 10 mL di PBS gelato.
4. Aggiungere 2 mL di tripsina–EDTA allo 0,25%. Incubare a temperatura ambiente per 2–3 minuti per staccare le cellule.
5. Aggiungi 200 μL di inibitore della tripsina di soia (1 mg/mL) per fermare la tripsinizzazione. Risospendere le cellule in un tampone KHM gelato da 10 mL (20 mM HEPES, pH 7,2; 110 mM acetato di potassio; 2 mM acetato di magnesio).
6. Granula le celle centrifugando a 250 × g per 3 minuti. Scartate il soprannatante.
   ATTENZIONE: La digitonina è tossica. Maneggiare in una cappa con l'attrezzatura di protezione individuale appropriata.
7. Risospendere le celle in un buffer KHM ghiacciato da 6 mL. Aggiungere 6 μL di soluzione di stocco di digitonina (40 mg/mL in DMSO).
8. Mescola delicatamente per inversione. Incubare sul ghiaccio per 5 minuti.
9. Aggiungi 8 mL di buffer KHM per diluire la digitonina. Centrifugare a 250 × g per 3 minuti per raccogliere cellule permeabilizzate.
10. Risospendere il pellet in un tampone HEPES gelido da 14 mL (50 mM HEPES, pH 7,3; 90 mM acetato di potassio). Incubare sul ghiaccio per 10 minuti.
11. Centrifuga a 250 × g per 3 minuti. Risospendere il pellet in 1 mL di KHM· ghiacciato. Buffer Cl (20 mM HEPES, pH 7,3; 110 mM KCl; 2 mM MgCl₂).
12. Centrifugare a 10.000 × g per 15 secondi. Scartate il soprannatante.
13. Risospendere il pellet a 50 μL KHM· Buffer di CL. Misura la concentrazione proteica utilizzando un saggio BCA e aggiusta a 5–7 mg/mL.

3. Esperimento di ricostituzione della vescicola COPII senza cellule

1. Prepara tutti i reagenti elencati nella Tabella dei Materiali. Aliquota e conserva a −80 °C.
2. Prepara una miscela di reazione da 50 μL contenente 110 mM di KCl, 20 mM HEPES (pH 7,2), 2 mM di MgCl₂, un cocktail inibitore di proteasi (1×), 0,2 mM GTP e un sistema di rigenerazione ATP (40 mM creatina fosfato, 0,2 mg/mL creatina fosfocinasi, 1 mM ATP).
3. Aggiungi cGAMP a una concentrazione finale di 10 μM. Incuba la reazione a temperatura ambiente per 15 minuti.
4. Aggiungere 50 μg di cellule HEK-293T semipermeabilizzate. Mescola delicatamente.
5. Aggiungere 80 μg di citosolo HEK-293F per iniziare la formazione della vescicola. Incubare a 37 °C per 45 minuti.
6. Posiziona la reazione sul ghiaccio per interrompere la gemiola. Centrifugare a 12.000 × g per 20 minuti a 4 °C.
7. Raccogli le vescicole contenenti il soprandante. Conserva il pellet contenente organelli.
8. Ultracentrifugare il soprandanante a 100.000 × g per 1 ora a 4 °C. Risospendere il pellet della vescicola in un buffer di carico proteico da 30 μL.
9. Riscaldare a 95 °C per 5 minuti. Centrifuga a 20.000 × g per 5 minuti per rimuovere i precipitati.
10. Eseguire SDS-PAGE e trasferire proteine alle membrane PVDF. Prova con anticorpi contro Sec22b, STING e RPN1.

Results

Durante la preparazione del citosolo delle cellule HEK-293F, sono stati valutati due parametri per valutare la qualità del citosol. Le cellule HEK-293F sono state coltivate ad alta densità, producendo estratti citosolici con elevate concentrazioni proteiche. Inoltre, l'entità della disordinazione cellulare dopo la lisi basata su siringa è stata valutata tramite microscopia lucina, confermando l'efficienza della lisi cellulare nelle condizioni applicate (Figura 2B

Discussion

La ricostituzione delle reazioni biochimiche essenziali in vitro ha gettato le basi per sistemi senza cellule, che sono stati fondamentali in numerose scoperte fondamentali. Questi includono l'identificazione del cGAS come sensore di DNA^{citosolico 14,15}, l'elucidazione del ruolo del citocromo c nell'apoptosi e la scoperta della prima demetilasi, JHDM1^16,17. Tali ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Siringhe sterili da 5 mL	WEGO	V526273	Utilizzato per la lisi cellulare meccanica
Adenosina 5′-trifosfato (ATP)	MCE	HY-B2176	100 mM di stock in acqua, pH 7,3, conservato a − 80 ° C
Adobe Illustrator	Adobe Systems Incorporated	SCR_010279	Utilizzato per creare illustrazioni concettuali e diagrammi schematici
Sistema di rigenerazione ATP (10 volte)	—	—	Miscela rigenerante di energia contenente creatina fosfato, creatina chinasi e ATP
Kit per il test proteico BCA	Thermo Fisher	23227	Saggio proteico colorimetrico
BioRender	BioRender	SCR_018361	Utilizzato per creare illustrazioni concettuali e diagrammi schematici
BSA	Biorigine	BN20815	Reagente bloccante
Incubatore a scuotimento di anidride carbonica	ZhiChu	ZCZY-CS8	Mantiene la temperatura, CO2 e agitazione per la coltura della sospensione
Incubatore CO2	Thermo Fisher	3110	Mantiene la temperatura e la CO2 per la coltura aderente
Microscopio convenzionale	Olympus	CX43	Utilizzato per valutare la lisi e la morfologia cellulare
Creatina chinasi	Roche	CKRO	20 mg/mL di scorte in buffer, conservato a e meno; 80 ° C
Creatina fosfato	Roche	CRPHO-RO	Componente del sistema di rigenerazione ATP
Centrifuga da scrivania	Eppendorf	5810R	Utilizzato per centrifugazione a bassa velocità
Digitonina	Sigma	D5628	Scorta da 40 mg/mL in DMSO, conservata a e meno; 20 & deg; C
DMEM	Corning	10-013-CMR	Mezzo di crescita per le cellule HEK-293T
D-Sorbitolo	Sangon	A100691	Soluzione di stock da 1 milione in acqua, conservata a 4 gradi; C
Reagente di rilevamento ECL	Biorigine	BN16009	Substrato chemiluminescente
Serbatoio per elettroforesi	Bio-Rad	1658001	Apparecchiatura per SDS-PAGE
Siero fetale bovino (FBS)	Corning	35-015-CV	Integratore siero
Rotore ad angolo fisso (TFT 80.2)	Thermo Fisher	54456	Rotore per ultracentrifugazione
Celle FreeStyle 293-F	Thermo Fisher	R79007	Utilizzato per la preparazione del citosol
Capra anti-topo IgG (H+L)	Invitrogen	31430	Anticorpo secondario coniugato con HRP
Capre anti-coniglio IgG (H+L)	Invitrogen	31460	Anticorpo secondario coniugato con HRP
GraphPad Prism	GraphPad Software	SCR_002798	Utilizzato per eseguire analisi statistiche (ANOVA unidirezionale) e generare il grafico a barre quantitativo nella Figura 4D.
Guanosina 5′-trifosfato (GTP)	MCE	HY-113225	10 mM di stock in acqua, pH 7,3, conservato a e meno; 80 ° C
Cellule HEK-293T che esprimono PUNTE umane	—	—	Generati internamente; Utilizzato come sorgente di membrana
Tampone HEPES (1 M, pH 7,3)	Beyotime	C0215	Componente tampone per la preparazione della soluzione
Sistema di imaging	Bio-Rad	12003153	Utilizzato per il rilevamento del segnale
Tetraidrato di acetato di magnesio	Ricerca Hampton	HR2-561	Componente tampone per la preparazione del B88
Cloruro di magnesio esaidrato	Ricerca Hampton	HR2-559	Componente buffer
Microcentrifuga	Eppendorf	5420R	Utilizzato per centrifugazione a media velocità
Microcentrifuga	Eppendorf	5420	Utilizzato per centrifugazioni di routine
Spettrofotometro NanoDrop	Thermo Fisher	840-317400	Utilizzato per la quantificazione delle proteine
Medium OPM-CD Trans293	OPM	P82019	Mezzo privo di siero per la coltura della sospensione HEK-293F
Penicillina e dash; Streptomicina (100 volte)	Servicebio	G4003	Integratore antibiotico per coltura cellulare
Fenilmetil solfonilo fluoruro (PMSF)	Sangon	A610425	Inibitore della proteasi
Inibitori della fosfatasi	Lead di laboratorio	C0104	Prevenire la defosforilazione delle proteine
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Servicebio	G4202	Buffer per il lavaggio delle celle
Acetato di potassio	Sigma	236497	Soluzione di stock da 1 milione in acqua, conservata a 4 gradi; C
Alimentazione elettrica	Bio-Rad	1645052	Fornisce tensione per l'elettroforesi
Cocktail inibitore della proteasi, senza EDTA	Roche	4693132001	Miscela di inibitori proteasi a largo spettro
Membrana PVDF	Millipore	ISEQ00010	Membrana per il Western blotting
Anticorpo RPN1 (mab del coniglio)	Abcam	ab197888	Marcatore ER
Gel SDS-PAGE (4– 20%)	—	—	Utilizzato per la separazione delle proteine
Buffer di caricamento SDS-PAGE (5 volte e volte)	Solarbio	P1040	Buffer per la preparazione del campione proteico
Anticorpo Sec22b (mab del coniglio)	Abcam	ab181076	Marcatore cargo COPII
Inibitore della tripsina di soia (SBTI)	Sigma	T9128	1 mg/mL in PBS, conservato a − 20 & deg; C
Anticorpo per la puntura (mab del coniglio)	CST	13647	Anticorpo primario
Buffer TBST	Servicebio	G0004	Buffer di lavaggio per l'immunoblotting
Thermal cycler	Bio-Rad	186-1096	Utilizzato per riscaldamento e incubazione
Bagno termostatico metallico	DLAB	5062102100	Mantiene una temperatura costante
Cella di trasferimento	Bio-Rad	1703930	Utilizzato per il trasferimento di proteine
Tripsina-EDTA (0,25%)	Servicebio	G4011	Utilizzato per il distacco delle celle
Ultracentrifuga	Thermo Fisher	75000100	Utilizzato per centrifugazione ad alta velocità
Tubi ultracentrifughe (2 mL)	Thermo Fisher	54460	Tubi compatibili con l'ultracentrifugazione
Tubo di ultrafiltrazione (MWCO da 4 mL, 10 kDa)	Millipore	UFC8010	Utilizzato per la concentrazione di citosol