Articolo metodologico

Test di protezione amikacin per la quantificazione e visualizzazione dell'invasione delle cellule di Escherichia coli

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DOI:

10.3791/71108

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3 luglio 2026

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1Department of Internal Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, 3Howard Hughes Medical Institute, University of Texas Southwestern Medical Center, 4Department of Microbiology, University of Texas Southwestern Medical Center

In questo articolo

Sommario

La resistenza agli antibiotici tra i ceppi di Escherichia coli invasivi in adesione pone difficoltà nella valutazione dell'invasione batterica utilizzando il tradizionale saggio protettivo per la gentamicina. Viene descritto un metodo migliorato per valutare quantitativamente l'invasione batterica enumerando le unità formative di colonie e qualitativamente tramite la visualizzazione delle cellule infette tramite microscopia confocale a immunofluorescenza.

Abstract

L'invasione delle cellule epiteliali è un fenotipo chiave per molti patogeni enterici, tra cui Salmonella, Shigella e Vibrio. Un patogeno invasivo emergente è Escherichia coli (AIEC), che è implicata nella patogenesi della malattia infiammatoria intestinale (IBD). I ceppi AIEC non hanno fattori di virulenza comunemente associati ad altri patogeni invasivi, rendendo difficile l'identificazione genetica. Di conseguenza, i ceppi AIEC sono classificati fenotipicamente in base alla loro capacità di invadere le cellule epiteliali utilizzando un saggio di protezione contro la gentamicina standard sul campo. Tuttavia, poiché i ceppi AIEC sono spesso isolati da pazienti con IBD che ricevono vari antibiotici come parte del loro regime di trattamento, l'aumento degli isolati resistenti alla gentamicina ha reso questo saggio meno affidabile per la classificazione AIEC. Per aggirare questo problema, è stato sviluppato un saggio alternativo di protezione basato sull'amikacina per quantificare e visualizzare l'invasione delle cellule AIEC. Questo saggio utilizza amikacina, un aminoglicoside semisintetico ad ampio spettro che colpisce efficacemente ceppi resistenti ad altri aminoglicosidi pur rimanendo extracellulare alle cellule ospiti eucariotiche. Di conseguenza, i batteri extracellulari vengono uccisi durante l'infezione mentre quelli intracellulari sono "protetti". Questo costituisce la base di un saggio quantitativo per confrontare l'invasività dei ceppi, misurata come percentuale di punteggio di invasione utilizzando unità formanti colonie (CFU) recuperate dopo l'infezione. Questo saggio può anche essere utilizzato come misurazione qualitativa dell'invasione tramite immunocolorazione delle cellule epiteliali infette e la visualizzazione di queste cellule tramite microscopia confocale. Questo metodo funge da strumento diagnostico per lo screening dei pazienti affetti da IBD per l'AIEC, che può essere applicato anche ad altri patogeni multi-resistenti ai farmaci per valutare l'invasione cellulare, un indicatore di virulenza e patogenicità.

Introduzione

La malattia infiammatoria intestinale (IBD), che include il morbo di Crohn (CD) e la colite ulcerosa, è una condizione infiammatoria gastrointestinale cronica che colpisce milioni di personein tutto il mondo. Nonostante l'aumento dell'incidenza globale della MII, la sua eziologia precisa rimane poco chiara, a causa della complessa interazione di fattori genetici, ambientali, microbici eimmunologici 2,3. Una caratteristica distintiva della IBD è la composizione microbica intestinale alterata, spesso determinata da fattori ambientali, come una dieta ricca di zuccheri e grassi comune nei paesiindustrializzati 4,5. Il microbiota dei pazienti con IBD è spesso caratterizzato da una ridotta diversità microbica, arricchimento di Gammaproteobatteri patogeni e esaurimento dei Firmicutesprotettivi 6,7. Nei pazienti con MC, Escherichia coli (E. coli) è arricchita nella microbiota intestinale, si associa e invade la mucosa intestinale e si correla positivamente con una malattia attiva e grave8,9. Questo patotipo emergente di E. coli associato alla CD è chiamato Escherichia coli adhesivo-invasiva (AIEC).

Gli AIEC sono patogeni gram-negativi opportunisti che colonizzano la mucosa ileale dei pazienti con disfunzione cardiopulmonare con una propensione maggiore rispetto ai controllisani 10. I ceppi AIEC isolati da pazienti con disfunzione del giorno sono geneticamente diversi, spesso comprendendo tutti i filogruppi di E. coli che includono sia E. coli comensale che patogeno E. coli 11. A differenza di patogeni come Shigella e Salmonella, che si basano sull'uso di sistemi di secrezione di tipo III per facilitare l'invasione delle cellule ospiti, l'AIEC non dispone di questi sistemi di virulenzaconservati 12. Pertanto, la nostra comprensione della virulenza AIEC si basa in gran parte sul suo fenotipo in vitro, caratterizzato dalla sua capacità di aderire e invadere le cellule epiteliali e sopravvivere all'interno deimacrofagi 10.

L'invasione delle cellule epiteliali da parte dell'AIEC è mediata da molteplici fattori di virulenza, tra cui il pilus di tipo 1 e le fimbrie polari lunghe. FimH, situato all'estremità del pilus di tipo 1, media l'adesione ai residui di mannoso sul recettore dell'ospite fortemente glicosilato CEACAM613. Questo legame favorisce l'ingresso dell'AIEC negli enterociti e ne supporta la replicazioneintracellulare 14. AIEC aderisce anche alle cellule microfold (M), cellule epiteliali specializzate situate sopra le chiazze di Peyer, attraverso le interazioni tra le sue lunghe fimbrie polari e la proteina della superficie delle cellule M glicoproteina 215,16. Questa adesione permette all'AIEC di traslocare tra le cellule M, raggiungere i macrofagi sottostanti e stimolare l'espressione di citochine pro-infiammatorie come il TNF-α, che non solo promuove l'infiammazione ma supporta anche la replicazione batterica all'interno deimacrofagi 17,18. Si ipotizza che questi meccanismi patogeni perpetuino l'infiammazione cronica nell'ospite, come osservato nella CD.

Gli AIEC sono definiti dal loro fenotipo in vitro , rendendo il saggio protettivo con gentamicina indispensabile per la classificazione dei ceppi e la scoperta dei fattoridi virulenza 8. Questo approccio può essere complicato da isolati resistenti alla gentamicina, che possono portare alla loro errata classificazione comeinvasivo 11. Per aggirare questo problema, sono stati testati antibiotici alternativi che uccidono efficacemente gli isolati resistenti alla gentamicina senza penetrare nelle membrane delle cellule ospiti. Attraverso questo approccio, l'amikacina è stata identificata come un sostituto adatto della gentamicina, offrendo un'efficacia e compatibilità comparabili con i test d'invasione standard, oltre a una citotossicità minima, come dimostrato dalla colorazione con tripano blu in studi precedenti e ulteriormente validato qui tramite un saggio di rilascio di lattato deidrogenasi (Figura supplementare 1)11. L'amikacina è un aminoglicoside semisintetico derivato dalla kanamicina che inibisce la crescita batterica interrompendo la sintesiproteica 19. L'amikacina è particolarmente efficace contro batteri gram-negativi multi-resistenti, tra cui Pseudomonas, Acinetobacter e Escherichia specie19. In particolare, le modifiche strutturali alla spina dorsale della kanamicina rendono l'amikacina meno suscettibile agli enzimi batterici inattivanti degliaminoglicosidi 19. Di conseguenza, l'amikacina rappresenta un'alternativa robusta alla gentamicina per colpire batteri multi-resistenti ai farmaci negli saghi d'invasione. I seguenti protocolli descrivono come valutare il fenotipo d'invasione di E. coli utilizzando sia il ceppo di riferimento NRG857c sia isolati clinici con il test di protezione con l'amikacina.

Protocollo

NOTA: Questo protocollo descrive un metodo per valutare la capacità di invasione dei ceppi AIEC nelle cellule epiteliali Caco-2. La concentrazione di amikacina utilizzata in questo protocollo (240 μg/mL) corrisponde al 10× della concentrazione inibitoria minima (CMI), come determinato utilizzando strisce testari per MIC per amikacin su un panel di 32 isolati clinici AIEC rappresentativi di 13 pazienticon 11 malattie infiammatorie intestinali. Gli investigatori dovrebbero determinare la MIC per i propri isolati AIEC prima di eseguire il test (vedi Tabella dei Materiali), poiché la suscettibilità agli antibiotici può variare tra gli isolati. La Sezione 1 dettaglia il saggio di protezione contro l'amikacina per la quantificazione della percentuale di invasione, mentre la Sezione 2 descrive il saggio di protezione contro l'amikacina per la microscopia confocale.

1. Saggio di Protezione Amikacin per la Quantificazione della Percentuale di Invasione

  1. Rivestimento al collagene delle piastre a 24 pozzi
    1. Diluire 35,29 μL di acido acetico glaciale sterile (vedi Tabella dei materiali) in 30 mL di 1× PBS (vedi Tabella dei materiali) in un tubo conico da 50 mL.
    2. Pipetta 300 μL di collagene (vedi Tabella dei materiali) nel PBS 1× con soluzione di acido acetico.
    3. Soluzione vortice per 10 secondi per mescolare bene.
    4. Dispensare 250 μL della soluzione diluita di collagene in ciascun pozzetto di una piastra sterile trattata con coltura tissutale a 24 pozzi.
      NOTA: La soluzione di collagene da 30 mL è sufficiente a ricoprire circa cinque piastre da 24 pozzi.
    5. Inclina la piastra in tutte le direzioni per assicurarti che la soluzione abbia coperto uniformemente il fondo di ogni pozzo.
    6. Incubare le piastre a 37 °C per 2 ore per permettere al collagene di aderire alla superficie plastica.
    7. Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione di collagene da ciascun pozzo.
    8. Pipetta 1 mL di 1× PBS in ogni pozzetto per lavare via il collagene residuo e aspirare ogni pozzo. Ripeti questo passaggio altre 2 volte (3 lavaggi in totale).
    9. Asciugare le piastre all'interno di un armadietto di sicurezza biologica per assicurarsi che tutta l'umidità visibile sia evaporata.
      NOTA: Le piastre possono essere utilizzate immediatamente per la semina delle cellule o conservate a temperatura ambiente. Quando si conservano i piatti, sigilla il perimetro esterno con parafilm sterile oppure mettili all'interno di un sacchetto zip sterile.

  1. Preparazione di soluzioni di stock amikacina
    1. Pesare 240 mg di dissolfato di amikacina (vedi Tabella dei materiali) e trasferirlo in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
    2. Pipetta 1 mL di acqua sterile e solubilizza l'amikacina tramite vortice, ottenendo una concentrazione finale di 240 mg/mL (1000× stock).
    3. Produrre 20 μL aliquote della soluzione amikacin e conservarle a -20 °C.
      NOTA: L'amikacin è stabile a -20 °C per 6–12 mesi. Prepara aliquote monouso per minimizzare i cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.
  2. Preparazione delle cellule Caco-2
    1. Scongelamento delle celle di Caco-2 da stock congelato
      1. Prepara un mezzo di crescita completo integrando il Medio Eagle Modificato di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio (DMEM, vedi Tabella dei materiali) con siero fetale bovino al 10% (FBS, vedi Tabella dei materiali) e soluzione antibiotico-antimicotica all'1% (vedi Tabella dei materiali).
      2. Preriscaldare il materiale in un bagno d'acqua a 37 °C per 30 minuti.
      3. Mettere la fiala congelata di cellule Caco-2 in un bagno d'acqua a 37 °C e incubare per 1–2 minuti fino a quando le cellule non si scongelano completamente.
      4. Rimuovi la fiala dal bagno d'acqua e spruzza l'esterno della fiala con etanolo al 70%.
      5. All'interno di un armadietto di sicurezza biologica, pipettare le cellule in un tubo conico da 15 mL contenente 9 mL di mezzo di crescita completo.
      6. Centrifugare le celle a 500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
      7. Aspirare il sovrantato e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di mezzo di crescita completo.
      8. Trasferire le cellule in una fiaschettadi coltura tessutale di 75 cm ( T75) contenente 10 mL di mezzo di crescita caldo e completo.
      9. Fai girare la piastra 3 volte per assicurarti che le cellule siano distribuite uniformemente sulla parte inferiore della placca.
      10. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO2 fino a raggiungere il ~90% di confluenza (6–7 giorni).
        NOTA: La confluenza viene stimata tramite approssimazione di visualizzazione delle cellule utilizzando un microscopio ottico. Sostituisci il substrato ogni 3 giorni mentre le cellule si stanno riprendendo.
    2. Semina delle cellule Caco-2
      1. Preriscaldare un mezzo di crescita completo e tripsina-EDTA allo 0,25% (p/v) (vedi Tabella dei Materiali) in un bagno d'acqua a 37 °C.
      2. Quando le cellule Caco-2 raggiungono una confluenza del ~90%, aspirare il substrato di coltura cellulare e aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA. Inclinare la fiaschetta per permettere alla soluzione di tripsina di coprire l'intera superficie inferiore della fiaschetta e assicurarsi che tutte le tracce di FBS siano inattivate.
      3. Aspirare la soluzione di tripsina-EDTA e aggiungere 3 mL di tripsina-EDTA. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO2 per 5–15 minuti. Visualizza le cellule usando un microscopio lucico in vari momenti durante il periodo di incubazione per osservare l'arrotondamento cellulare, indicando che le cellule si sono staccate.
        NOTA: Evita di colpire il lato della fiaschetta per facilitare il distacco cellulare, poiché ciò può causare aggregazioni cellulari.
      4. Pipetta 6 mL di mezzo di crescita completo per disattivare la soluzione di tripsina-EDTA e mescolare pipettando delicatamente su e giù per risospendere le cellule.
      5. Pipetare le celle in un tubo conico da 15 mL e centrifugare a 500 × g per 5 minuti per le celle a pellet.
      6. Aspirare il mezzo e risospendere le cellule in 3 mL di mezzo di crescita completo.
      7. Trasferire 10 μL delle celle Caco-2 sospese in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungere 10 μL di colorante blu Trypan (vedi Tabella dei materiali) al tubo microcentrifuga da 1,5 mL e mescolare pipettando su e giù più volte.
      8. Pipettare 10 μL della miscela blu Caco-2/Trypan su un anti-vetrino cellulare (vedi Tabella dei materiali). Enumerare il numero di cellule vive per calcolare la vitalità cellulare.
        NOTA: Quando si numerano il numero di cellule di Caco-2 presenti, considera solo il numero di cellule vive, non il numero totale di celle da seminare.
      9. Seme le cellule Caco-2 in una piastra a 24 pozzi o in una fiaschetta T75.
      10. Per una piastra a 24 pozzi, segui i passaggi seguenti:
        1. Seed delle cellule Caco-2 a una concentrazione di 1 x 105 cellule/mL usando l'equazione seguente:
          [(1 × 105 celle) (Numero di pozzi che seminano + 2)] / [Concentrazione di cellule vitali (celle/mL)] = celle (mL)
        2. Rimuovi il volume di cellule calcolato sopra dalle celle Caco-2 sospese nel passo 3.2.6 in un tubo conico da 15 mL. Calcola il volume di mezzo di crescita completo da aggiungere alle cellule usando l'equazione qui sotto:
          (Numero di pozzi che seminano + 2 pozzi) - celle (mL) = mezzo (mL)
          NOTA: I "pozzi +2" nel calcolo servono a tenere conto dell'errore di pipettura.
        3. Pipetta il volume del mezzo calcolato sopra nella conica di 15 mL contenente le celle Caco-2 e mescola pipettando su e giù più volte.
        4. Pipetta 1 mL di cellule Caco-2 in un mezzo di crescita completo (concentrazione finale 1 x 105 cellule/mL) in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti rivestita di collagene.
        5. Incubare la piastra a 37 °C con il 5% di CO2 fino a raggiungere il ~90% di confluenza (3–4 giorni).
      11. Per una fiaschetta T75, segui i passaggi seguenti:
        1. Trasferire 7,5 x 105 celle vitali su una fiaschetta T75 usando la seguente equazione:
          [(7,5 × 105 celle)] / [concentrazione di conteggio cellulare vitale (celle/mL)] = celle (mL)
          NOTA: Il numero di cellule vitali da aggiungere alla fiaschetta T75 è stato determinato sulla base delle linee guida ATCC per la coltura cellulare Caco-2.
        2. Rimuovi il volume di celle calcolato sopra e trasferisci in una fiaschetta T75. Calcola il volume di mezzo di crescita completo da aggiungere alle cellule usando l'equazione qui sotto:
          15 mL - volume di celle aggiunte alla fiaschetta = mezzo (mL)
        3. Pipetta il volume di materiale calcolato sopra alla fiaschetta T75.
        4. Fai roteare delicatamente la piastra più volte per disperdere uniformemente le cellule sul fondo della fiaschetta. Incubare a 37 °C con il 5% diCO2 fino a raggiungere il ~90% di confluenza (3–4 giorni).
  3. Saggio di Protezione Amikacin
    NOTA: Assicurarsi che tutto il materiale di coltura cellulare sia preriscaldato a 37 °C prima dell'inizio dell'esperimento.
    1. Preparazione dei batteri
      1. Utilizzando un bastoncino di legno sterile o una punta di pipetta sterile, raschia delicatamente i batteri da un glicerol batterico congelato conservato a -80 °C e lascia una striatura su una piastra di agar di LB per le singole colonie. Incubare il piatto a 37 °C durante la notte.
      2. Utilizzando un bastoncino di legno sterile o una punta di pipetta sterile, prendi una singola colonia dalla piastra di agar e inocula in 3 mL di brodo di LB. Incubare la coltura a 37 °C con agitazione a 200 giri durante la notte.
      3. Eseguire una diluizione 1:10 della coltura notturna in un brodo da 1 mL LB e misurare la densità ottica a 600 nm (OD600) della coltura utilizzando uno spettrofotometro.
    2. Calcolo della molteplicità dell'infezione (MOI)
      1. Trasferire 100 μL della coltura notturna in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare a 6000 × g per 10 minuti a 4 °C.
      2. Aspira con attenzione il sovrandanzante per non disturbare la pellet cellulare. Risospendere il pellet in 1 mL di siero e substrato senza antibiotici antimicotici.
        NOTA: Si tratta di una diluizione 1:10 della coltura batterica durante la notte. Per il calcolo del MOI, si utilizza il valore grezzo OD600 calcolato per la coltura diluita durante la notte al passo 4.1.3, non il valore OD600 corretto per il fattore di diluizione.
      3. Calcola il volume di sospensione batterica da aggiungere dal passaggio 4.2.2 per infettare le cellule Caco-2 con un MOI di 10 usando il seguente calcolo:
        [1 unità OD/2,4 × 109 batteri] × [10 batteri/cellula] × [1 mL × OD 1:10] × 1 ×105 ×103 = volume (uL)
        NOTA: Annota con attenzione il volume calcolato per ogni campione, poiché questo valore sarà utilizzato successivamente per calcolare il CFU/mL dell'inoculo. Questo volume di sospensione batterica riguarda solo un pozzo all'interno della piastra a 24 pozzi.
      4. Prepara il mezzo infettivo trasferendo il volume calcolato della sospensione batterica dal passaggio 4.2.3 in un tubo sterile per microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungi 1 mL di siero e substrato senza antibiotici-antimicotici. Mescola delicatamente pipettando su e giù più volte.
    3. Infezione da cellule Caco-2
      1. Rimuovere la piastra a 24 pozzetti contenente i monostrati delle cellule Caco-2 dall'incubatore e aspirare l'intero mezzo.
      2. Pipetta 1 mL di siero e substrati antimicotici senza antibiotici in ciascun pozzo e aspira per rimuovere tracce di substrati contenenti siero. Ripeti questo passaggio un'altra volta (2 lavaggi in totale).
        NOTA: Ridurre la pressione del vuoto durante l'aspirazione per evitare di disturbare il monostrato della cella.
      3. Pipetta 1 mL del mezzo infettivo dal passaggio 4.2.4 in ciascun pozzo della piastra a 24 pozzi contenente le cellule Caco-2.
      4. Centrifugare la piastra a 24 pozzi a 500 × g per 15 minuti a temperatura ambiente per sincronizzare il contatto batterico con le cellule epiteliali.
      5. Incubare la piastra a 24 pozzi a 37 °C con il 5% diCO2 per 3 ore per consentire l'invasione batterica.
      6. Durante il periodo di incubazione, determinare la CFU/mL della coltura diluita durante la notte dal passaggio 4.2.2 eseguendo diluizioni seriali di 10 volte in PBS sterile 1× utilizzando una piastra a 96 pozzi.
        1. Per preparare ogni diluizione, trasferire 200 μL della coltura diluita durante la notte dal passaggio 4.2.2 al primo pozzo della piastra di scherzo.
        2. Pipetta 20 μL della coltura alla fila successiva che contiene 180 μL di 1× PBS. Mescola pipettando su e giù 10 volte. Ripeti finché le diluizioni non raggiungono 10-6 usando una punta di pipetta nuova per il trasferimento ogni volta.
        3. La lastra 10 μL di diluizioni spot in triplicata dalle diluizioni 10-2 fino a 10-6 su piastre di agar LB. Lascia che le macchie vengano assorbite nell'agar sotto la fiamma.
        4. Incubare le piastre durante la notte a 27–30 °C per prevenire la crescita eccessiva delle colonie e garantire colonie singole chiare e separate.
          NOTA: La placcatura spot in triplicata migliora la precisione della quantificazione e consente la rilevazione su una gamma di concentrazioni batteriche. Una temperatura di incubazione più bassa rallenta la crescita batterica, consentendo una stima più accurata della CFU da campioni ad alta concentrazione.
      7. Prepara il substrato contenente antibiotici aggiungendo 240 μg/mL di amikacina a un siero preriscaldato e a un substrato senza antibiotici-antimicotici.
      8. Dopo che l'infezione di 3 ore è completata, aspirare il substrato dai monostrati delle cellule Caco-2. Aggiungi 1 mL di siero e substrato senza antibiotici in ciascun pozzo. Ripeti questo passaggio un'altra volta (2 lavaggi in totale).
      9. Pipetta 1 mL di substrato contenente amikacina da 240 μg/mL in ogni pozzo e incuba a 37 °C con il 5% diCO2 per 1 ora per eliminare i batteri extracellulari.
      10. Aspirare il substrato di ogni pozzo e aggiungere 1 mL di 1× PBS per lavare via i batteri aderenti uccisi dall'amikacina. Ripeti questo passaggio un'altra volta (2 lavaggi in totale).
      11. Pipetta 200 μL di 1% Triton-X-100 (vedi Tabella dei Materiali) diluita in 1× PBS in ciascun pozzo. Incubare su uno shaker orbitale a 90 giri al minuto per 10 minuti per lisare le cellule epiteliali.
      12. Si staccano le celle dalla piastra a 24 pozzi pipettando su e giù circa 30 volte per pozzo.
        NOTA: Poiché rivestire le piastre con collagene migliora l'adesione cellulare, è importante assicurarsi che il monostrato si sia staccato dalla placca. Questo può essere confermato visivamente confrontando un pozzo lisato rispetto a uno non lisato e un pozzo senza cellule Caco-2, che apparirà limpido.
      13. Eseguire diluizioni seriali a 10 volte dei lisati cellulari in una piastra a 96 pozzi utilizzando 1× PBS.
        NOTA: Esegui diluizioni seriali fino alla diluizione 10-3 .
      14. Lastra da 10 μL di diluizioni spot in triplice, che vanno dalle non diluite a 10-3 diluizioni, su piastre di agar LB. Lascia che le macchie vengano assorbite nell'agar sotto la fiamma. Incubare le placche durante la notte a 27–30 °C per prevenire la crescita eccessiva delle colonie e garantire colonie singole chiare e separate.
    4. Conteggio delle colonie e calcolo della percentuale di invasione
      1. Dopo l'incubazione notturna, contare il numero di colonie in ogni diluizione macchiosa proveniente dalla coltura diluita durante la notte e dal lisato recuperato. Seleziona una diluizione in cui ogni punto contiene più di 7 colonie isolate. Usa la stessa diluizione tra i triplicati per calcolare un numero medio di colonie batteriche prelevate per quella diluizione.
        NOTA: Contare le diluizioni spot contenenti colonie singole ben isolate ed evitare di contare quelle che contengono colonie a contatto.
      2. Calcola la CFU/mL dell'inoculo, la CFU/mL recuperata e la percentuale di invasione utilizzando le seguenti equazioni di seguito:
        CFU dell'inoculo (CFU/mL):
        Inoculo CFU = (numero medio di colonie) (fattore di diluizione)(volume dal mezzo infettivo (μL) x 100
        CFU recuperato (CFU/mL):
        CFU recuperata = (numero medio di colonie)(fattore di diluizione) x 100
        Percentuale di invasione (%):
        Invasione (%) = [(CFU consultato)/(inoculo CFU)] × 100

2. Saggio di protezione con amikacina per microscopia confocale

  1. Preparazione di coperture sterili rivestite in poli-L-lisina
    1. In un armadietto di sicurezza biologica si usano pinze sterili per posizionare le coperture rivestite di poli-L-lilina (vedi Tabella dei materiali) su un assorbente di carta imbevuto al 70% di etanolo.
    2. Spruzzare entrambe le vetri delle coperte con il 70% di etanolo, usando pinze sterili per capovolgere la copertura ai lati.
    3. Lascia asciugare le coperture sotto la luce UV nell'armadietto di sicurezza biologica fino a quando non si asciugano completamente.
  2. Seminare le celle Caco-2 in una piastra a 6 pozzi
    1. In un armadietto di sicurezza biologica, inserire 1 copertura rivestita di poli-L-lisina in ogni pozzo di una piastra a 6 pozzi.
    2. Ripeti i passaggi 3.2.1–3.2.8 della sezione "Semina delle celle Caco-2".
    3. Seme le cellule Caco-2 a una concentrazione di 1 x 105 cellule/mL in una piastra a 6 pozzi usando l'equazione seguente:
      [(1 × 105 celle) (Numero di pozzi che seminano + 2)] / [Concentrazione di conteggio cellulare vitale (celle/mL)] × 2 = celle (mL)
      NOTA: Questo valore viene moltiplicato per 2 per compensare l'aggiunta di 2 mL di materiale per pozzo quando si utilizza una piastra a 6 pozzi.
    4. Rimuovi il volume di cellule calcolato sopra in un tubo conico da 15 mL. Calcola il volume di mezzo di crescita completo da aggiungere alle cellule usando l'equazione qui sotto:
       (Numero di pozzi che seminano + 2 pozzi) x 2 - celle (mL) = mezzo (mL)
    5. Pipetta il volume del mezzo calcolato sopra nella conica di 15 mL contenente le celle Caco-2 e mescola pipettando su e giù più volte.
    6. Aggiungere 2 mL di cellule Caco-2 in mezzo di crescita completo a ciascun pozzo della lastra a 6 pozzi (concentrazione finale 1 × 105 cellule/mL).
    7. Incubare la piastra a 37 °C con il 5% di CO2 fino a raggiungere il ~90% di confluenza (2–3 giorni).
  3. Saggio di protezione con amikacina
    1. Eseguire il test di protezione per l'amikacin come indicato nella Sezione 1, Passaggi 4.1-4.3.10
  4. Colorazione immunofluorescenza
    1. Fissazione e permeabilizzazione delle cellule Caco-2
      1. Fissare le celle aggiungendo 1 mL di paraformaldeide al 4% diluito in 1X PBS (vedi Tabella dei Materiali) a ciascun pozzo. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio.
      2. Aspira ogni pozzo e aggiungi 1 mL di 1× PBS alle cellule di lavaggio. Ripeti questo passaggio altre 2 volte (3 lavaggi in totale).
        NOTA: Le cellule possono essere conservate per diversi giorni in 1X PBS a 4 °C.
      3. Aggiungi 1 mL di 0,1% di Triton-X-100 in ciascun pozzo e incuba per 10 minuti a temperatura ambiente per permeabilizzare le cellule.
      4. Aspirare la soluzione di Triton-X-100 e aggiungere 1 mL di 1× PBS a ciascun pozzo. Incuba le cellule con 1× PBS per 5 minuti. Ripeti questo passaggio altre 2 volte (3 lavaggi in totale).
    2. Bloccaggio e colorazione degli anticorpi
      1. Per prevenire il legame degli anticorpi aspecifici, preparare una soluzione bloccante utilizzando albumina sirica bovina (BSA) all'1%, 22,52 mg/mL di glicina in 1× PBS + 0,1% Tween20 (vedi Tabella dei materiali).
      2. Aggiungi 1 mL di soluzione bloccante in ogni pozzo e incuba per 1 ora a temperatura ambiente.
        NOTA: Il passaggio di blocco può essere eseguito anche a 4 °C per 16 ore.
      3. Aspirare la soluzione bloccante e incubare le cellule con anticorpo primario anti-Rabbit E. coli (vedi Tabella dei materiali) diluito (diluizione raccomandata 1:500) in soluzione bloccante per 1 ora a temperatura ambiente.
        NOTA: L'incubazione con l'anticorpo primario può essere effettuata anche a 4 °C per 16 ore.
      4. Aspirare la soluzione primaria di anticorpi e aggiungere 1 mL di 1× PBS + 0,1% Tween20. Incubare le cellule in 1× PBS + 0,1% Tween20 per 5 minuti. Ripeti questo passaggio altre 2 volte (3 lavaggi in totale).
      5. Incubare le cellule con anticorpo secondario anti-Rabbit Alexa Fluor 488 (vedi Tabella dei Materiali) diluito (diluizione raccomandata 1:1000) in soluzione bloccante per 1 ora a temperatura ambiente. Avvolgi la piastra in carta stagnola per proteggere il fluoroforo dalla luce.
      6. Aspirare la soluzione secondaria di anticorpi e aggiungere 1 mL di 1× PBS + 0,1% Tween20. Incubare le cellule in 1× PBS + 0,1% Tween20 per 5 minuti. Ripeti questo passaggio altre 2 volte (3 lavaggi in totale).
    3. Controcolorazione e montaggio del copertino
      1. Per colorare il DNA dell'ospite e batterico e l'actina dell'ospite, preparare una diluizione combinata utilizzando 10 mg/mL di Hoechst (diluizione raccomandata 1:2000, vedi Tabella dei Materiali) e Rhodamina-falloidina (diluizione raccomandata 1:1000, vedi Tabella dei Materiali) in 1× PBS.
      2. Aggiungi 1 mL di soluzione di colorante in ogni pozzo e incuba per 10 minuti.
      3. Rimuovere la soluzione di colorante e aggiungere 1 mL di 1× PBS in ciascun pozzo. Ripeti questo passaggio un'altra volta (2 lavaggi in totale).
      4. Aggiungi 1 mL di 1× PBS e lascia le cellule sommerse nella soluzione.
      5. Posiziona una goccia di mezzo di montaggio (vedi Tabella dei materiali) sulla slide etichettata.
      6. Sollevare con attenzione il copertino dalla piastra a 6 pozzi usando un ago piegato e invertire il copertino in modo che il lato contenente le celle sia rivolto verso il vetrino contenente il supporto di montaggio.
      7. Posiziona il copertino sul supporto di montaggio. Assicurati che il supporto di montaggio sia distribuito uniformemente su tutto il copertore.
      8. Incuba i vetri montati a temperatura ambiente durante la notte al buio.
      9. Sigilla i bordi del copricapo usando uno smalto trasparente e conserva i vetrini a 4 °C in una scatola per svegli.
      10. Immagini i campioni montati utilizzando i canali appropriati che corrispondono ai coloranti/fluorofori usati con un microscopio confocale.

Risultati

Per valutare l'efficacia del trattamento con amikacina nell'eliminare batteri extracellulari e visualizzare l'invasione intracellulare, abbiamo condotto esperimenti di infezione utilizzando monostrati di cellule Caco-2. Come mostrato nella Figura 1, il trattamento con gentamicina o amikacin dopo l'infezione da E. coli NRG857c (controllo positivo) o E. coli DH5α (controllo negativo) ha portato a profili di invasione simili. Questi risultati indicano che l'amikacina è efficace quanto la gentamicina nell'eliminare i batteri extracellulari e riflette con precisione il carico batterico intracellulare, supportandone l'uso come antibiotico alternativo per i saggi d'invasione. Un intervallo di recupero di ~4-10% di NRG857c e <1% per E. coli DH5α è considerato accettabile per un'interpretazione accurata dei fenotipi di invasione rispetto a ceppi mutanti o altri isolati clinici, coerente con osservazioniprecedenti 11. Se i punteggi percentuali di invasione per i controlli positivi e negativi sono al di fuori di questo intervallo di recupero atteso, i risultati devono essere interpretati con cautela e il test deve essere ripetuto.

Per dimostrare che l'amikacina può colpire efficacemente isolati clinici di E. coli resistenti alla gentamicina, sono stati condotti in parallelo saggi di protezione con gentamicina e amikacina e sono stati esaminati i profili di invasione degli isolati. Come mostrato nella Figura 2, il trattamento degli isolati resistenti alla gentamicina con gentamicina ha portato a valori di recupero altamente variabili, che variano dal 21,52% al 2788,50%. Al contrario, il trattamento con amikacina ha ridotto drasticamente il recupero su tutti gli isolati, mettendone in evidenza l'efficacia e permettendo misurazioni di invasione più accurate e affidabili.

Infine, per valutare il fenotipo intracellulare di AIEC durante l'invasione, le cellule Caco-2 sono state infettate con E. coli NRG857c. La Figura 3 mostra un'immagine rappresentativa di una cellula Caco-2 infetta con batteri (verde) colorati da immunofluorescenza, actina ospite (rosso) e DNA (blu) visualizzati controcolorando con rodamina-falloidina e Hoechst, rispettivamente. A 4 ore dall'infezione, si osserva la replica di NRG857c nel citoplasma, localizzandosi vicino al nucleo e all'interno dei confini dell'actina, confermando la natura intracellulare di questi batteri.

figure-results-1
Figura 1: L'aggiunta di gentamicina o amikacina alle cellule Caco-2 infettate con il ceppo AIEC NRG857c porta a profili di invasione comparabili. I monostrati di cellule Caco-2 sono stati infettati dal ceppo AIEC NRG857c ed E. coli DH5α con un MOI di 10. Dopo 3 ore di infezione, le cellule sono state trattate per 1 ora con gentamicina (100 μg/mL) o amikacina (240 μg/mL) per eliminare i batteri extracellulari. Le cellule sono state quindi lisate con Triton-X-100 all'1%, e gli omogeneati sono stati diluiti serialmente e placcati su agar LB per l'enumerazione delle CFU. L'invasione è stata espressa come la percentuale di batteri recuperati rispetto all'inoculo iniziale. I dati rappresentano tre esperimenti indipendenti (n = 3); le barre di errore indicano la deviazione standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: L'amikacina colpisce efficacemente ceppi di E. coli resistenti alla gentamicina. I monostrati a cellule Caco-2 sono stati infettati da ceppi di E. coli isolati da pazienti con IBD con un MOI di 10. Dopo 3 ore di infezione, le cellule sono state trattate per 1 ora con gentamicina (100 μg/mL) o amikacina (240 μg/mL) per eliminare i batteri extracellulari. Le cellule sono state quindi lisate con Triton-X-100 all'1%, e gli omogeneati sono stati diluiti serialmente e placcati su agar LB per l'enumerazione delle CFU. L'invasione è stata espressa come la percentuale di batteri recuperati rispetto all'inoculo iniziale. I dati rappresentano tre esperimenti indipendenti (n = 3); le barre di errore indicano la deviazione standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Visualizzazione dell'invasione delle cellule epiteliali da parte di E. coli. Micrografie confocali rappresentative di cellule Caco-2 hanno infettato E. coli NRG857c. Le cellule Caco-2 sono state infettate per 3 ore seguite da un'incubazione di 1 ora con amikacina (240 μg/mL). L'actina ospite è stata colorata con rodamina-Phallodin (rosso), e il DNA ospite e batterico è stato colorato con Hoechst (blu). E. coli (verde) è stata rilevata utilizzando un anticorpo primario anti-coniglio E. coli e un anticorpo secondario anti-coniglio Alexa Fluor 488. Le immagini sono state acquisite su un obiettivo 63× con uno zoom di 3× utilizzando un microscopio confocale Leica. Barre di scala = 10 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Diagramma di flusso dello studio. (A)I ceppi AIEC sono stati coltivati durante la notte, lavati e aggiunti ai monostrati Caco-2 con un MOI di 10. Dopo 3 ore di infezione e 1 ora di trattamento con amikacina, i batteri intracellulari sono stati recuperati e quantificati impiegando diluizioni seriali in triplice. (B) I monostrati infetti sono stati fissati, colorati con anticorpi e fotografiati tramite microscopia a fluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Il trattamento con amikacina porta a una citotossicità minima nelle cellule epiteliali. Le cellule Caco-2 sono state trattate con gentamicina (100 μg/mL) o amikacina (240 μg/mL) per 1 ora. La citotossicità è stata determinata misurando il lattato deidrogenasi rilasciato nel mezzo di coltura. Le barre di errore indicano la deviazione standard della media (n = 3). Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Il saggio di protezione amikacina è un approccio modificato per valutare l'invasione di E. coli nelle cellule epiteliali. Diversi passaggi sono fondamentali per il successo di questo saggio, tra cui il rivestimento a collagene delle piastre, il mantenimento dell'integrità del monostrato e l'efficiente lisi cellulare. Le cellule Caco-2 sono una linea cellulare aderente che può attaccarsi alla plastica trattata in coltura tissutale e formaremonostrati 20. Tuttavia, durante l'infezione, l'uso di substrati senza siero e lavaggi ripetuti possono influenzare il distacco cellulare, portando a una sotto-rappresentazione dell'invasionebatterica 21. Per risolvere questo problema, rivestire le piastre con componenti della matrice extracellulare, come il collagene di tipo IV, può favorire l'attacco cellulare e la formazione di uno strato monostrato stabile e confluente durante l'infezione21. Questo è importante poiché è stato dimostrato che la deformazione AIEC LF82 interrompe giunzioni strette durante l'invasione, e la formazione incompleta di monostrato può bypassare questo passaggio, portando a risultatidistorti 22. Infine, la lisi cellulare efficiente è un altro passo chiave che influisce sul recupero batterico, poiché la lisi incompleta potrebbe mascherare l'invasività, confondendo i risultati delsaggio 23. Per aggirare questo problema, è importante risospendere completamente il lisato cellulare dopo l'incubazione con Triton-X-100.

Oltre alle sfide tecniche che potrebbero contribuire alla variabilità del test d'invasione, la percentuale di inoculi recuperati dopo l'infezione per il ceppo AIEC LF82 è stata dimostrata variare tra lo 0,61 e il 17,25%8. Questa variabilità potrebbe essere influenzata dall'assenza di alcuni segnali ambientali, come sali biliari, mucina e altri metaboliti intestinali in questo test in vitro, noti per contribuire alla virulenzaAIEC 24,25,26. In particolare, è stato dimostrato che i sali biliari inducono l'espressione di lunghe fimbrie polari, che aumentano l'attacco e la traslocazione dell'AIEC attraverso le celluleM 27. Altri patogeni gastrointestinali, come Vibrio e Shigella, sono noti per regolare i loro sistemi di secrezione di tipo III in risposta alla bile per mediare l'invasione delle cellule epiteliali28,29. La sottocoltivazione con sali biliari per indurre l'espressione del fattore di virulenza è standard nei protocolli di protezione contro la gentamicina per altri patogeni, e la crescita di AIEC con questi segnali ambientali può stabilizzare l'invasione e produrre profili piùcoerenti 30,31.

Un'altra limitazione di questo saggio è che l'invasione batterica viene valutata in un unico momento temporale, che, sebbene standard sul campo, probabilmente semplifica eccessivamente il processodi invasione 12. L'invasione batterica è un processo dinamico che coinvolge aderenza, interiorizzazione, replicazione intracellulare e fuga dalla cellulaospite 32. Poiché i nuovi geni che contribuiscono all'invasione dell'AIEC sono stati difficili da identificare, l'uso di un singolo saggio temporale potrebbe sotto-rappresentare il numero di geni che contribuiscono a questoprocesso 12. Gli saghi di invasione temporale, quindi, sono stati utilizzati per valutare come geni specifici contribuiscano all'invasione e per studiare la replicazione AIEC nelle cellule I-407 eHep-2 8,33. Sebbene l'uso di un saggio di invasione temporale sia prezioso per caratterizzare il contributo dei singoli geni all'invasione, è laborioso, soprattutto nello screening di molti isolati clinici. Per questo motivo, un singolo punto temporale viene utilizzato per valutare l'invasione.

Inoltre, lo stile di vita intracellulare dell'AIEC non è stato molto ben caratterizzato. La maggior parte degli studi utilizza l'invasione percentuale come lettura primaria per rilevare i cambiamenti nella CFU di vari mutanti con delezione del fattoredi virulenza 14,34. La visualizzazione delle cellule ospiti infette può fornire intuizioni uniche sulla biologia dell'AIEC che vengono trascurate quando si utilizzasolo l'enumerazione 35 della CFU. Pertanto, per valutare in modo completo il ruolo dei diversi geni nell'invasione cellulare, la microscopia immunofluorescenza delle cellule infette dovrebbe essere effettuata in parallelo all'enumerazione delle CFU. Questo è importante perché può portare all'identificazione di geni che funzionano nella sopravvivenza e fuga endosomica, che mirano al citoscheletro dell'ospite o che mostrano differenze nel carico batterico per cellula, che potrebbero essere trascurate solo con il recupero della CFU. È importante notare che l'uso del protocollo di colorazione immunofluorescente descritto qui per rilevare batteri intracellulari non distingue tra batteri veramente interiorizzati e quelli aderiti alla superficie cellulare. Un approccio di colorazione differenziale, in cui i batteri extracellulari vengono marcati con un anticorpo secondario distinto prima della permeabilizzazione e i batteri intracellulari vengono colorati dopo la permeabilizzazione, affronterebbe questa limitazione e potrebbe essere implementato in studi futuri per distinguere in modo più definitivo questepopolazioni 36.

L'importanza di questo metodo risiede principalmente nella capacità di screening degli isolati di E. coli multi-resistenti a farmaci da pazienti con IBD sottoposti a diversi trattamentiantibiotici 11. La gentamicina viene utilizzata per trattare pazienti con IBD ad insorgenza precoce e può essere somministrata per trattare altre infezionibatteriche 37. L'emergere di isolati resistenti alla gentamicina escluderebbe l'uso del test standard, rendendo l'amikacina un'alternativa piùaffidabile 11. L'utilizzo dei protocolli descritti in questo articolo permetterà una caratterizzazione più approfondita della biologia delle infezioni AIEC e aiuterà a identificare nuovi geni che possono contribuire all'invasione. Questi metodi sono importanti nel contesto della patogenesi batterica e della ricerca sull'interazione ospite-patogeno, poiché permettono la scoperta di nuovi fattori di virulenza, la caratterizzazione del ciclo vitale intracellulare batterico e l'interrogazione delle vie dell'ospite prese di mira durante l'infezione. Inoltre, sono ampiamente applicabili allo studio di altri patogeni invasivi utilizzando modelli cellulari epiteliali in vitro .

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non esserci conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Howard Hughes Medical Institute Emerging Pathogens Initiative (K.O., J.N.), sovvenzione della Welch Foundation 1-561 (K.O.), Once Upon a Time Foundation (K.O.), grant NIH R35 GM134945 (K.O.), grant NIH NIDDK K08-DK-123316 (J.N.), Burroughs Wellcome Fund Career Awards for Medical Scientists - 1020904 (J.N.) e NIH T32 AI007520 (S.F.).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
75 cm2 Fiala per coltura tissutaleFisher Scientific FB012937
Amicacina disulfato Research Products International A20540-25.0
Antibiotico-antimicotico (100x)Gibco15240062
Anticorpo anti-E.coliAbcamab137967
Piastre micropiastre BioLite - 6 pozzettiFisher Scientific 12-556-004
Albumina sierica bovinaSigma-AldrichA7906
Collageno I, coda di ratto, 100 mgCorning354236
Lamella per conteggio delle cellule CountessInvitrogenC10312
DMEM, alta glucosiGibco11965118
Siero fetale bovinoCorning35-011-CV
Acido acetico glacialeSigma-AldrichA6283
Glicina ultrapuraUSBiologicalG8165
Anticorpo secondario anti-Coniglio IgG (H + L) adsorbito incrociato, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11008
Hoechst 33342, triidrocloruro triidratoInvitrogenH3570
Liofilchem MTS amicacina [AK] 0,016-256 µg/mLFisher Scientific 22-777-704Strisce di test MIC per amicacina
Soluzione di paraformaldeide, 4% in PBSFisher Scientific J19943.K2
PBS, 1xCorning21-040-CV
Coprioggetto in vetro tedesco tedesco sterile rivestito con poli-L-lisina per colture cellulariNeuvitroNC1327375
Montante antifade ProLong Gold InvitrogenP36934
Rhodamina-FalloidinaInvitrogenR415Rosso-arancione 540/565 nm
Piastre per colture tissutali trattate in superficieFisher Scientific FB012929Piastre da 24 pozzetti
Triton X-100 (Elettroforesi)Fisher Scientific BP151-100
Blu di TripanoInvitrogenT10282
Tripsina-EDTA (0,25%), phenol redGibco25200056
Tween-20Fisher Scientific BP337-100

Riferimenti

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