Saggio basato sull'immunofluorescenza per la rilevazione dei focus nucleari RAD51 come marcatore della riparazione omologa della ricombinazione nelle cellule tumorali ovariche

Sommario

I foci nucleari di RAD51 sono un indicatore dell'attività di ricombinazione omologa (HR). Questo manoscritto descrive un semplice metodo di immunofluorescenza per rilevare questi fochi nelle cellule tumorali, consentendo la valutazione della funzione HR e supportando l'indagine preclinica delle risposte ad agenti danneggianti dal DNA.

Abstract

RAD51 è una proteina centrale nella via di ricombinazione omologa (HR) ed è essenziale per la riparazione accurata delle rotture a doppio filamento del DNA (DSB). Dopo la formazione del DSB, la resezione estrema del DNA genera substrati di DNA monofilamento che facilitano il reclutamento e l'assemblaggio dei filamenti di nucleoproteine RAD51 nei siti di danno. Questo processo porta alla formazione di focali nucleari RAD51 discreti, che fungono da lettura funzionale ampiamente accettata dell'attività HR e come indicatore surrogato della competenza HR. Poiché i difetti nella HR sono comuni in diverse malignità, in particolare nei tumori ovaricos e al seno, la valutazione della formazione dei fochi RAD51 è emersa come un approccio importante per valutare la capacità di riparazione del DNA e prevedere la risposta alle terapie che danneggiano il DNA, inclusi composti di platino e inibitori della poli(ADP-ribosio) polimerasi (PARP), la cui efficacia è fortemente influenzata dallo stato di riparazione della HR. Questo manoscritto descrive un protocollo basato su immunofluorescenza semplice, affidabile e riproducibile per la rilevazione e quantificazione dei foci nucleari RAD51 nelle cellule tumorali ovariche coltivate. Il metodo prevede l'induzione del danno al DNA tramite radiazioni ionizzanti (IR), seguita da fissazione, immunocolorazione con anticorpi contro RAD51 e γH2AX, microscopia confocale e analisi quantitativa manuale dei fochi co-localizzati RAD51/γH2AX. Il protocollo può essere applicato in condizioni basali o dopo perturbazioni genetiche e farmacologiche per determinarne gli effetti sulla funzione HR. I risultati rappresentativi dimostrano un'induzione robusta dei focus RAD51 nelle cellule tumorali ovariche competenti in HR dopo danni al DNA, mentre la deplezione RAD51 riduce notevolmente la formazione dei focus nonostante livelli comparabili di DSB, confermando la specificità del saggio. Nel complesso, questo protocollo fornisce un test funzionale robusto e riproducibile per valutare la competenza delle risorse umane, con ampie applicazioni nella ricerca sul cancro preclinica e potenzialmente traslazionale.

Introduzione

Le rotture a doppio filamento del DNA (DSB) sono tra le forme più gravi di danno al DNA perché una riparazione imprecisa può compromettere la stabilità del genoma e contribuire allo sviluppo tumorale o alla morte^{cellulare 1,2,3}. Per contrastare queste minacce, le cellule impiegano diverse vie di riparazione del DNA, tra cui la ricombinazione omologa (HR), considerata il meccanismo più accurato per riparare i DSB ^2,4,5. A differenza delle vie di riparazione soggette a errori, HR utilizza una sequenza di DNA omologa come modello per ripristinare informazioni genetiche nel sito danneggiato. Di conseguenza, la frequenza cardiaca funziona prevalentemente durante le fasi S e G2 del ciclo cellulare, quando sono disponibili cromatidi sorelle per fungere da modelli di^{riparazione 2,5}. In particolare, la HR è essenziale per la riparazione accurata dei DSB derivanti da fonti endogene come lo stress di replicazione, così come da insulti esogeni tra cui le radiazioni ionizzanti (IR) e gli agenti chemioterapici dannosi^{al DNA 2,5.}

RAD51 è un effettore centrale del percorso HR e svolge un ruolo critico nella ricerca di omologia e nell'invasione dei filamenti durante la riparazione mediata dalla HR dei DSB ^2,5. Dopo la formazione del DSB, le estremità del DNA subiscono una resezione, un processo avviato dal complesso MRE11–RAD50–NBS1 (MRN) e dai fattori associati che generano sporgenze di DNA a singolo filamento 3′. Queste regioni a singolo filamento sono inizialmente rivestite dalla proteina di replicazione A (RPA), che impedisce la formazione di strutture secondarie e stabilizza l'intermedio^{di riparazione 4,5,6}. La HR viene poi avviata attraverso le azioni coordinate di BRCA1, PALB2 e BRCA2, che facilitano il reclutamento e il carico di RAD51 sul DNA resezionato, sostituendo la RPA e promuovendo la formazione di filamenti nucleoproteici contenenti ^{RAD51 4,5,6}. Una volta assemblati, questi filamenti cercano sequenze di DNA omologhe all'interno della cromatide gemella e catalizzano lo scambio di fili, facilitando così il fedele ripristino del DNA^{danneggiato 4,5,6}. L'accumulo di RAD51 nei siti DSB appare microscopicamente come focali nucleari puntati che possono essere rilevati dall'immunofluorescenza 7,8,9,10. Poiché la formazione di questi focus riflette un coinvolgimento efficace della macchina HR, l'analisi dei focus RAD51 è diventata un approccio funzionale ampiamente utilizzato per valutare la capacità HR e la competenza nella riparazione del DNA nelle^cellule 7,8,9,10. È importante sottolineare che questo saggio misura la capacità delle cellule di eseguire una risposta HR dopo un danno al DNA, invece di affidarsi esclusivamente ai livelli di espressione di geni o proteine associate alla HR.

I difetti nella HR sono frequentemente osservati nel cancro, in particolare nei tumori che presentano alterazioni nei paralog BRCA1, BRCA2, RAD51 o in altri geni coinvolti nella HR, e sono particolarmente diffusi nei tumori ovaricos e^{al seno} 4,11,12,13,14. La carenza di HR ha importanti implicazioni terapeutiche, poiché conferisce una sensibilità aumentata agli agenti dannosi del DNA come la terapia al platino e agli inibitori della poli(ADP-ribosio) polimerasi (PARP) attraverso il principio della letalità^sintetica 4,11,12,13,14,15 . Di conseguenza, saghi funzionali affidabili per valutare l'attività delle risorse umane sono fondamentali sia per gli studi meccanicistici che per la ricerca traslazionale.

Questo protocollo descrive un saggio basato sull'immunofluorescenza per la rilevazione e quantificazione dei focus nucleari di RAD51 a seguito di danni al DNA nelle cellule tumorali ovarica. Il flusso di lavoro prevede l'induzione di DSB di DNA utilizzando IR, seguita dalla rilevazione immunofluorescente di RAD51 e γH2AX e la quantificazione dei foci nucleari co-localizzati tramite microscopia confocale. Il protocollo è dimostrato utilizzando cellule OVCAR-8 competenti in HR e cellule ABT^R2 acquisite resistenti agli inibitori PARP e fornisce un approccio funzionale riproducibile per valutare l'attività HR dopo la formazione del DSB. Sebbene l'analisi dei focus RAD51 sia ampiamente utilizzata come misura funzionale dell'attività HR, i metodi disponibili spesso si concentrano su contesti sperimentali specifici e spesso mancano di linee guida dettagliate sull'integrazione dell'induzione controllata del danno al DNA, la conferma della formazione del DNA DBS, i controlli di validazione dei sami e la quantificazione standardizzata basata su immagini. Inoltre, approcci alternativi per valutare la funzione della HR, inclusi saghi genomici sulle cicatrici, firme mutazionali e analisi di espressione genica o proteica, forniscono misure indirette dello stato HR e non valutano direttamente la capacità cellulare di reclutare RAD51 nei siti di danno al DNA. Saghi basati su reporter come DR-GFP offrono misurazioni dirette dell'attività HR ma richiedono un'ingegneria genetica stabile e non sono facilmente applicabili a molti modelli sperimentali. Pertanto, il flusso di lavoro descritto qui combina danni al DNA indotti da infrarossi con la doppia colorazione immunofluorescenza RAD51/γH2AX per verificare contemporaneamente la formazione di DSB e quantificare il reclutamento di RAD51 nella cromatina danneggiata. Questo approccio fornisce un metodo pratico, biologicamente rilevante e ampiamente applicabile per la valutazione funzionale diretta della competenza HR nelle cellule tumorali coltivate, incorporando al contempo controlli del saggio, passaggi di validazione e procedure standardizzate di quantificazione dei focoli.

Protocollo

Tutti i materiali e i reagenti utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali, inclusi informazioni sui produttori, numeri di catalogo e diluizioni degli anticorpi. Una panoramica del protocollo è mostrata nella Figura 1.

NOTA: Le linee cellulari del cancro ovarico OVCAR-8 e ABT^R2 sono utilizzate in questo protocollo e sono state precedentemente descritte 15,16,17,18,19,20. Le cellule OVCAR-8 sono state gentilmente fornite dal dottor Larry Karnitz (Mayo Clinic), che le aveva originariamente ricevute dal dottor Dominic Scudiero (National Cancer Institute, NIH). Le cellule^{ABT R2}sono state gentilmente fornite dal Dr. Scott Kaufmann (Mayo Clinic⁾²⁰. ABT^R2 è un derivato resistente al PARPi del BRCA2.- linea cellulare mutata del cancro ovarico PEO1 che ha acquisito resistenza attraverso il ripristino dell'espressione di BRCA2. Poiché il ripristino BRCA2 ha ristabilito l'attività di carico e HR di RAD51, le celle^{ABT R}2 fungono da modello rappresentativo di HR-proficient. L'identità delle linee cellulari è stata verificata sulla base della provenienza della fonte e delle caratteristiche stabilite riportate in^letteratura 15,16,17,18,19,20. Gli esperimenti sono stati condotti utilizzando cellule a basso passaggio (passaggi 3–12) mantenute in coltura per non più di 1 mese dopo lo scongelamento. Le linee cellulari venivano testate di routine per la contaminazione da micoplasmi ogni 6 mesi utilizzando un kit di rilevamento di micoplasmi, e tutte le colture utilizzate in questo studio sono state confermate prive di micoplasma.

ATTENZIONE: Il paraformaldeide è tossico e dovrebbe essere preparato e maneggiato in una cappa chimica certificata indossando l'attrezzatura di protezione individuale appropriata. Le linee cellulari di origine umana devono essere maneggiate secondo le procedure di biosicurezza istituzionale utilizzando pratiche di contenimento appropriate. Triton X-100, supporto di montaggio e smalto per unghie devono essere maneggiati secondo le raccomandazioni di sicurezza del produttore. La IR dovrebbe essere somministrata solo da personale formato e in conformità con le politiche istituzionali di sicurezza radiologica. Smaltire rifiuti chimici, biologici e associati alle radiazioni secondo i requisiti istituzionali e normativi locali.

1. Coltura cellulare e manutenzione

1. Cellule di coltura nel mezzo di crescita Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 integrate con 8% di siero bovino fetale in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO₂.
   NOTA: Queste condizioni di coltura sono coerenti con quelle utilizzate nei nostri studi precedenti sulle cellule OVCAR-8 e ABT^R215,16,17,18,19. In queste condizioni, entrambe le linee cellulari mostrano una crescita robusta e fenotipi di risposta al danno al DNA riproducibili.
2. Se desiderato, eseguire perturbazioni (ad esempio, knockdown/knockout genico), seguendo condizioni sperimentali^{ottimizzate 15,17}.
   NOTA: In questo protocollo, il knockdown mediato da siRNA di RAD51 è fornito come esempio rappresentativo di perturbazione genica prima dell'analisi dell'immunofluorescenza.
   1. Preparare 5 × 10⁶ cellule in mezzo RPMI-1640 a 180 μL integrato con siero bovino fetale all'8%.
   2. Aggiungi 20 μL di soluzione siRNA da 20 μM (2 μM siRNA per trasfezione) e mescola delicatamente.
      NOTA: Utilizzare i seguenti siRNA: siRNA di controllo non targeting della luciferasi (siLUC): 5′-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3′; RAD51 siRNA (siRAD51.): 5′-GGGAUUUGUGAAGCCAAA-3′. Tutti i siRNA sono stati acquistati da Horizon Discovery.
   3. Trasferire la sospensione della cella su una cuvetta di elettroporazione da 4 mm.
   4. Elettroporare celle utilizzando un elettroporatore BTX ECM 830 con due impulsi da 10 ms a 280 V.
   5. Trasferire le cellule al mezzo di crescita completo e incubare in condizioni standard di coltura in una piastra da 10 cm per 24 ore.
   6. Ripetere l'elettroporazione del siRNA utilizzando le stesse condizioni descritte nei passaggi 1.2.1–1.2.4.
   7. Incubare le cellule in condizioni di coltura standard in una ciotola da 15 cm per ulteriori 48 ore.
   8. Semina una porzione delle cellule per il saggio di immunofluorescenza come descritto nel Passaggio 2. Riservare le cellule rimanenti per la validazione del knockdown di RAD51 tramite immunoblotting.
   9. Valida il knockdown di RAD51 tramite immunoblotting
      1. Cellule di lisi in tampone di lisi gelida contenente 50 mM di HEPES (pH 7,6), 150 mM di NaCl, 1 mM di EDTA, 1% di Triton X-100, 10 mM di NaF, 30 mM di pirofosfato di sodio, 1 mM di Na₃VO₄, 10 mM di β-glicerofosfato e cocktail di inibitori di proteasi (1 compressa per ogni tampone di lisi da 10 mL).
      2. Chiarire i lisati tramite centrifugazione a 18.800 × g . per 5 minuti a 4 °C. Trasferire il soprantantante in un tubo microcentrifuga fresco e determinare la concentrazione proteica utilizzando un saggio proteico appropriato.
      3. Mescola una quantità appropriata di lisato proteico con 4× tampone di campione di Laemmli per ottenere una concentrazione finale di 1×.
      4. Aggiungi β-mercaptoetanolo a una concentrazione finale del 20% e riscalda i campioni a 95 °C per 12 minuti prima della SDS-PAGE.
      5. Separare quantità uguali di proteine tramite SDS-PAGE e trasferire le proteine a una membrana appropriata per l'analisi immunoblot.
      6. Blocca la membrana nel latte al 5% per 30 minuti a temperatura ambiente con le scuotazioni.
      7. Lava la membrana tre volte (5 min ciascuna) con 1× soluzione salina treptata con tween 20 (TBST) a temperatura ambiente, scuotendola.
      8. Incubare la membrana con anticorpo policlonale anti-RAD51 (diluizione 1:1.000) o anticorpo anti-ACTIN (diluizione 1:1000) a 4 °C per 16–18 ore con scuotere.
      9. Lava la membrana con 1× TBST (5 min ciascuno) a temperatura ambiente, scuotendola.
      10. Incubare la membrana con anticorpo secondario anti-coniglio o anti-topo coniugato con perossidasi di rafano (HRP) (diluizione 1:10.000) per 1 ora a temperatura ambiente con scuotiture.
      11. Lavare la membrana con 1× TBST (5 min ciascuno) a temperatura ambiente con agitazione, rilevare le bande immunoreattive utilizzando un metodo appropriato di rilevamento della chemiluminescenza, confermare la deplezione di RAD51 rispetto alle cellule trasfettate con il siRNA di controllo non targeting.

2. Semina delle celle

1. Quando le cellule raggiungono la fase di crescita logaritmica (circa 70–80% di confluenza), aspirare il mezzo di coltura e lavare delicatamente le cellule una volta con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere il siero residuo.
2. Aggiungere una soluzione sufficiente allo 0,25% di tripsina–EDTA per coprire il monostrato cellulare (ad esempio, 1–2 mL per fiaschetta T175) e incubare a 37 °C per 2–5 minuti, monitorando il distacco cellulare al microscopio.
3. Una volta che le cellule si sono staccate, neutralizza immediatamente la tripsina aggiungendo un volume uguale di mezzo di coltura completo contenente FBS.
4. Raccogli la sospensione della cella in un tubo conico da 15 mL
5. Determinare la vitalità e la concentrazione cellulare utilizzando l'esclusione del blu di tripano e un emocitometro o contatore cellulare automatico prima della semina.
6. Preparare una sospensione monocellulare in mezzo di crescita completo a una concentrazione di 4 × 10⁴ cellule/mL.
7. Semina 200 μL della sospensione della cella in ogni pozzo di una lama a camera di vetro a 8 pozzi per ottenere una densità finale di 8.000 celle per pozzo.
8. Incubare i vetrini della camera per 24 ore a 37 °C con il 5% di CO₂ per consentire l'attacco cellulare.
   NOTA: Il numero di cellule da seminare può variare a seconda del tipo di cellula. Prepara una sospensione a celle sufficienti ad almeno un pozzo aggiuntivo per tenere conto della variabilità del pipetaggio. Semina ogni condizione in duplicato o più per garantire la riproducibilità. Se si desidera la modulazione farmacologica della HR, le cellule devono essere trattate dopo l'attacco notturno (12–16 ore dopo la semina). La densità di semina dovrebbe essere regolata secondo necessità per garantire che le cellule raggiungano la confluenza appropriata al momento del trattamento e dell'analisi a valle, tenendo conto degli effetti attesi dell'agente farmacologico sulla proliferazione o sulla vitalità cellulare. Poiché la HR si verifica prevalentemente durante le fasi S e G2 del ciclo cellulare, mantenere le colture nella crescita logaritmica ed evitare la sovraconfluenza. Per esperimenti che coinvolgono trattamenti che possono alterare la progressione del ciclo cellulare, possono essere eseguite l'incorporazione di EdU, l'analisi del contenuto del DNA o altre misurazioni del ciclo cellulare per facilitare l'interpretazione dei risultati dei focus RAD51. Includere controlli non trattati (–IR) e irradiati (+IR) in ogni esperimento per stabilire rispettivamente la formazione dei focus RAD51 basali e indotti dal danno al DNA. Quando si eseguono perturbazioni mediate dal siRNA, si includono condizioni di siRNA di controllo non targeting (ad esempio, siLUC) e condizioni specifiche del siRNA target (ad esempio, siRAD51). Controlli senza anticorpi primari e senza anticorpi secondari sono raccomandati durante l'ottimizzazione degli anticorpi per valutare la colorazione aspecifica e la fluorescenza di fondo.

3. Induzione del danno al DNA tramite IR

1. Le cellule esposte sulle vetri della camera alla IR a una dose di 6 Gy²¹ per indurre DSB del DNA.
2. Restituire immediatamente i vetri in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO₂.
3. Incubare le cellule per 6 ore dopo la radiazione radioincendiale.
   NOTA: L'IR veniva consegnato utilizzando un irradiatore biologico RS-2000 operato a 160 kV e 25,0 mA (posizione 5 sul scaffale). Le cellule sono state irradiate a temperatura ambiente con una singola dose da 6 Gy (circa 4,8 Gy/min) e immediatamente riportate in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂ per il recupero. L'irradiatore veniva calibrato regolarmente secondo le raccomandazioni del produttore e tutte le procedure venivano eseguite secondo le linee guida istituzionali sulla sicurezza radiologica. L'incubazione post-IR di 6 ore è stata precedentemente^{stabilita 15, 17, 22}. Il tempismo ottimale può variare tra i tipi cellulari e dovrebbe essere ottimizzato per ciascuna linea cellulare.

4. Fissazione e permeabilizzazione

1. Aspirare con cura il mezzo di coltura dai pozzi senza disturbare le cellule.
2. Fissare le cellule usando paraformaldeide al 3% appena preparato in 1× PBS per 12 minuti a temperatura ambiente.
3. Aspirare delicatamente il fissativo e lavare i pozzi tre volte con 500 μL di 1× PBS per pozzo.
4. Permeabilizzare le cellule con 0,2% di Triton X-100 in 1× PBS per 12 minuti a temperatura ambiente.
5. Lava i pozzi tre volte con 1× PBS.
   NOTA: Esegui delicatamente le fasi di fissazione, permeabilizzazione e lavaggio aggiungendo e rimuovendo soluzioni lungo la parete di ogni pozzo per minimizzare il distacco cellulare. Salvo diversa indicazione, usa 500 μL di 1× PBS per lavaggio.

5. Bloccaggio

1. Prepara una soluzione bloccante sciogliendo albumina sirica bovina (BSA) al 5% (w/v) in 1× PBS.
2. Incubare le cellule in una soluzione bloccante per 60 minuti a temperatura ambiente per ridurre il legame degli anticorpi non specifici.

6. Incubazione primaria degli anticorpi

1. Rimuovi la soluzione bloccante e lava le cellule tre volte con 1× PBS.
2. Prepara gli anticorpi primari con diluizioni appropriate nella soluzione bloccante. Si usano anticorpi anti-RAD51 policlonali di coniglio (1:1000) e anti-fosfo-istona monoclonali di topo H2AX (γH2AX) (1:1000), con γH2AX che funge da marcatore per i DSB^23,24.
3. Aggiungere 100 μL di soluzione diluita di anticorpi primari in ciascun pozzo.
4. Incubare le vetrine a temperatura ambiente per 16–18 ore in una camera umidificata per evitare l'evaporazione.
   NOTA: I due anticorpi primari possono essere combinati nella stessa soluzione per una colorazione simultanea.

7. Incubazione secondaria degli anticorpi

1. Prepara anticorpi secondari alle diluizioni appropriate nella soluzione bloccante. Alexa Fluor 488 con IgG anti-coniglio coniugato (1:350) viene utilizzato per rilevare RAD51, mentre Alexa Fluor 594 con IgG anti-topo (1:350) è utilizzato per rilevare γH2AX.
2. Aspirare la soluzione primaria di anticorpi e lavare le cellule tre volte con 1× PBS.
3. Aggiungere 100 μL di soluzione secondaria diluita di anticorpi in ciascun pozzo.
4. Incubare i vetrini per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
   NOTA: I due anticorpi secondari possono essere combinati per una rilevazione simultanea. Da questa sezione in poi, esegui tutti i passaggi in uno spazio protetto dalla luce per minimizzare il fotosbiancamento.

8. Contrasto e montaggio nucleare

1. Prepara la soluzione di Hoechst 33342 a una diluizione 1:1.000 in 1× PBS per colorare i nuclei.
2. Aspirare la soluzione secondaria di anticorpi e lavare le cellule una volta con 1× PBS.
3. Incubare le cellule con soluzione diluita di Hoechst 33342 per 90 secondi a temperatura ambiente.
4. Aspirare la soluzione Hoechst 33342 e lavare le celle tre volte con 1× PBS.
5. Rimuovere il PBS da 1× e staccare la camera superiore dai vetri di vetro, aggiungendo circa 25 μL di antifade in ciascun pozzo.
6. Posizionare delle coperture di vetro sopra le celle montate, assicurando un contatto uniforme con il montante.
7. Rimuovi delicatamente le bolle d'aria e sigilla i bordi con lo smalto.
   NOTA: La controcolorazione nucleare fornisce un riferimento per i nuclei, facilitando una localizzazione accurata e quantificazione dei focoli nucleari RAD51 e γH2AX.

9. Imaging e quantificazione dei focus RAD51 presso i DSB

1. Immagini che si vede immediatamente o conservate a 4 °C in una scatola di diapositive al buio fino all'analisi.
   NOTA: Per minimizzare il potenziale degrado del segnale e il fotosbiancamento, acquisire immagini il prima possibile, preferibilmente entro una settimana dal montaggio.
2. Acquisire immagini utilizzando un microscopio confocale con linee laser e set di filtri appropriati: Hoechst 33342 (405 nm) per i nuclei, Alexa Fluor 488 (488 nm) per RAD51 e Alexa Fluor 594 (561/594 nm) per γH2AX.
3. Eseguire immagini confocali utilizzando un obiettivo ad alto ingrandimento adatto per risolvere strutture subcellulari.
4. Quantificare manualmente i fochi RAD51 contando i fochi nucleari discreti che co-localizzano con γH2AX; escludere i focoli non co-localizzati con γH2AX.
   NOTA: Validare le prestazioni degli anticorpi prima dell'analisi quantitativa confermando i fochi nucleari RAD51 e γH2AX indotti da IR nelle cellule di controllo e il segnale ridotto di RAD51 dopo il trattamento con siRNA RAD51. Quantificare solo i focoli nucleari RAD51 discreti che co-localizzano con γH2AX in nuclei con morfologia intatta e chiari schemi di colorazione; escludono colorazioni diffuse o non nucleari, segnali RAD51 non colocalizzati, cellule sovrapposte o multinucleate, cellule mitotiche e cellule apoptotiche. Mantenere le stesse impostazioni di imaging in ogni esperimento e applicare criteri manuali di punteggio coerenti in tutte le condizioni. Analizza ~50 nuclei per condizione da più campi visivi per ogni replica biologica e esegui almeno tre repliche biologiche indipendenti. Riporta il numero di focoli co-localizzati RAD51/γH2AX per nucleo utilizzando un'analisi statistica appropriata.

10. Analisi statistica

1. Quantificare i focoli co-localizzati RAD51/γH2AX da circa 50 nuclei per condizione.
2. Presentare i dati come media ± SD da almeno tre repliche biologiche indipendenti.
3. Effettuare confronti statistici utilizzando un test statistico appropriato (ad esempio, un test Student a due code non accoppiati per confronti tra due gruppi o un ANOVA unidirezionale per confronti tra più gruppi)
4. Consideriamo p. < 0,05 statisticamente significativo.
5. Eseguire analisi statistiche e generazione di grafi utilizzando GraphPad Prism (versione 10.6.1).

Risultati

L'IR induce la formazione di fochi RAD51 nei DSB del DNA nelle cellule OVCAR-8
Per valutare funzionalmente l'attività HR, la formazione dei focus RAD51 è stata esaminata in cellule tumorali ovariche OVCAR-8 con HR dopo l'induzione dei DSB del DNA tramite IR. Per stabilire la specificità del test e confermare che i focus osservati rappresentano veri eventi HR dipendenti da RAD51, le cellule sono state trasfettate con siRNA di controllo luciferasi non targeting...

Discussione

La rilevazione basata sull'immunofluorescenza dei foci nucleari di RAD51 descritta qui fornisce un approccio affidabile e funzionale per valutare l'attività della frequenza cardiaca nelle cellule tumorali ovariche coltivate. A differenza delle analisi genomiche o trascristatiche che inferiscono indirettamente lo stato HR, la formazione dei fochi RAD51 riflette direttamente la capacità della cellula di reclutare e assemblare la macchina HR centrale nei siti dei DSB del DNA. In quanto tale...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10% Polyacilamide gel recipe (Lower gel buffer 20 ml,ddH2O 33.4 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 26.6 mL. 10% APS (fresh) 200 µL  TEMED 70 µL)	Home-made	NA	Resolving gel for SDS-PAGE
10% Polyacylamide gel recipe (Upper gel buffer 10 mL, ddH2O 23.6 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 6.4 mL 10% APS (fresh) 160 µL  TEMED 40 µL)	Home-made	NA	Stacking geL for SDS-PAGE
100 mL Trypsin EDTA 1X, 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA in Sodium Bicarbonate	Corning	25-053-C1	Used to detach adherent cells during routine passaging and prior to cell seeding.
10x Phosphate Buffered Saline (PBS)	Bio-Rad	1610780	Diluted to 1× and used for washing steps, blocking solution, antibody dilutions, fixation, and permeabilization.
10X Running buffer (6 L) Tris 181.8 g +Glycene 864.0 g+SDS 60 g	Home-made	NA	Run to proteins sample in the gel
10X Transfer (6 L) Tris 181.8 g+ Glycene 864 g	Home-made	NA	Transfter the protein from gel to membrane
10x Tris Buffered saline	Bio-Rad	1706435	buffer
30%  (w/v)Acrylamide ;0.8(w/v)/Bis-acrylamide stock solution (37.5:1)	Ultrapure EC-890	EC-890	For SDS-PAGE
ABTR2 cells	Mayo clinic	NA	acquired PARPi-resistant ovarian cancer cell lines
AKT Lysis Buffer Recipe (50 mM HEPES (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 30 mM sodium pyrophosphate, 1 mM Na3VO4, 10 mM 2-glycerophosphate, 10 μg/mL leupeptin, 5 μg/mL aprotinin, 5 μg/mL pepstatin, and 20 mM microcystin-LR.	Home-made	NA	Cell lysis buffer
Ammonium Persulfate	Bio-Rad	16107000	Molecular biology as a polymerization for gels an oxidizing agent used as a free-radical initiator
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301	Sigma-Aldrich	05-636	Primary antibody used to detect γH2AX foci. Used at 1:1000 dilution
Anti-Rad51 (Ab-1) Rabbit pAb	Sigma-Aldrich	PC130	Primary antibody used to detect RAD51 nuclear foci as a marker of homologous recombination activity. Used at 1:1000 dilution
Bovine serum albumin Protease free	GoldBio	A-420-250	Used to prepare blocking solution (5% BSA in PBS) to reduce non-specific antibody binding during immunofluorescence staining.
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	12003154	Imaging system
Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS	Zeiss LSM 780	Immunofluorescence imaging, γH2AX foci analysis, RAD51 foci quantification, protein co-localization, and 3D image acquisition
Countess II FL Automated Cell Counter	Life Technologies	AMQAF1000	Automated Cell Counter
Cover slips	Cardinal Health	M6045-10A	Placed over mounted samples to protect stained cells and enable high-resolution imaging.
ECM 830 Square Wave Electroporation System	Hbio-BTX	45-2052	Electroporation system suitable for applications for gene delivery in mammalian cells
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	Added to RPMI-1640 (as 8%) to support cell growth and viability.
Glycine	Thermo Fisher Scientific	A13816.0C	Buffer
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032	Secondary antibody used to detect γH2AX primary antibody. Used at 1:350 dilution
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488	Thermo Fisher Scientific	A-11034	Secondary antibody used to detect RAD51 primary antibody. Used at 1:350 dilution
GraphPad Prism	GraphPad Software	version 10.6.1	Statistical analysis, graph generation, and data visualization.
HEPES 1M	Corning	25060-C1	PH maiantance buffer in the pH 7.2-7.6 range
Hoechst 33342 solution (20 mM, 5 mL)	Thermo Fisher Scientific	62249	was used for nuclear staining
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse immunoglobulin G	Cell Signaling Technology	7076S	Secondary antibody used for detection of mouse (β-actin) primary antibody in Western blotting.
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbitimmunoglobulin G	Cell Signaling Technology	7074S	Secondary antibody used for detection of rabbit primary antibody (RAD51) in Western blotting.
Instant non-fat dry milk	Hyvee	G461A323	Blocking reagent
Laemmli Sample Buffer (4×)	Bio-Rad	1610747	Sample Buffer
Lonza's MycoAlert Mycoplasma Detection Assays	Lonza Bioscience	LT07-218	Used to routinely confirm that cell cultures are free of mycoplasma contamination.
Lower gel Recipe is (1 L)(Tris 181.7 g+SDS 4.0 g)PH to 8.8 w/cenc HCl	Home-made	NA	Resolving gel for SDS-PAGE
Mouse monoclonal Anti-beta Actin antibody	Abcam	ab8226	Primary antibody used to detect β-actin as a loading control in Western blot analyses.
Non-targeting control luciferase siRNA (siLUC): 5′-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3′	Horizon Discovery	NA	working concentration 20 nmol
Nunc Lab Tek II, 8-chamber slide W/cover RS Glass slide sterile	Thermo Fisher Scientific	154534	Used for seeding and culturing cells for immunofluorescence staining and confocal imaging.
OVCAR-8 cells	National Cancer Institute, (NIH)	NA	Ovarian cancer cell lines
Paraformaldehyde 16% Aqueous Solution EM Grade	Electron microscopy sciences	15710-S	Diluted to 3