Un flusso di lavoro economico per l'immunofluorescenza mono e multiplex in colture cellulari bidimensionali aderenti su vetrini coprioggetti

Sommario

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro economico per l'immunofluorescenza (IF) monocanale e multicanale di colture cellulari aderenti in due dimensioni, riducendo i costi sperimentali grazie all'uso di coprioggetti in vetro economici, piastre standard da 24 pozzetti e condizioni di marcatura a basso volume che minimizzano il consumo di anticorpi, fornendo al contempo un approccio rappresentativo per la localizzazione proteica mediante microscopia a fluorescenza standard.

Abstract

La microscopia a immunofluorescenza (IF) è una tecnica ampiamente utilizzata per visualizzare il posizionamento proteico e la distribuzione concomitante a risoluzione monocellulare, mantenendo al contempo la morfologia cellulare e l'organizzazione subcellulare. L'obiettivo di questo protocollo è presentare un flusso di lavoro pratico ed economico per la colorazione a immunofluorescenza mono- e multicanale di colture cellulari aderenti in 2D, utilizzando materiali di laboratorio standard. Il metodo si basa sulla coltivazione delle cellule su coprislip di vetro economici posizionati in piastre convenzionali a 24 pozzetti ed implementa il multicanale attraverso la separazione per specie ospite degli anticorpi primari, fluorofori spettralmente distinti e condizioni di controllo solide, inclusi controlli senza anticorpo primario, senza anticorpi, con singola colorazione e per il crosstalk, al fine di garantire l'interpretabilità della IF multicanale. Vengono utilizzati passaggi di colorazione a basso volume per ridurre il consumo di reagenti e anticorpi senza compromettere la qualità del segnale. Questo flusso di lavoro evita la necessità di piastre o camere di imaging specializzate ed è compatibile con microscopi a fluorescenza widefield o confocali di routine. Nel complesso, questo protocollo fornisce un flusso di lavoro a immunofluorescenza accessibile e pratico per la valutazione rappresentativa del posizionamento e della distribuzione concomitante delle proteine nelle colture cellulari aderenti. L'adattamento ad altri tipi cellulari o pannelli anticorpali richiede un'ottimizzazione specifica per il bersaglio, inclusa la validazione degli anticorpi, le condizioni di fissazione e permeabilizzazione, la scelta dei fluorofori e la compatibilità con microscopi e set di filtri.

Introduzione

La microscopia a immunofluorescenza (IF) è ampiamente utilizzata per visualizzare la localizzazione subcellulare, l'abbondanza relativa e la codistribuzione delle proteine in cellule fissate, collegando così marcatori molecolari alla morfologia cellulare e al contesto subcellulare^1,2. A differenza dei metodi di rilevamento complessivi (ad esempio, immunoblotting) o dei saggi su singole cellule dissociative (ad esempio, citometria a flusso), l'IF preserva l'organizzazione spaziale cellulare ed è particolarmente utile per valutare l'eterogeneità fenotipica tra cellula e cellula e i cambiamenti nella distribuzione subcellulare delle proteine a risoluzione singola^3,4,5. Poiché le domande sperimentali richiedono sempre più spesso la valutazione simultanea di più marcatori, l'IF multiplex consente il rilevamento contemporaneo di due o più bersagli all'interno dello stesso campione, combinando comunemente anticorpi primari prodotti in specie ospiti diverse con fluorocromi spettralmente distinti⁶ (Figura 1), mediante strategie di rilevamento diretto e/o indiretto (Figura 2). Tuttavia, il multiplexing introduce sfide tecniche fondamentali, in particolare la reattività crociata tra anticorpi e il crosstalk spettrale, che possono compromettere l'interpretazione se non affrontati attraverso una progettazione accurata del pannello e condizioni di controllo rigorose^7,8.

L'obiettivo generale di questo metodo è fornire un flusso di lavoro pratico ed economico, ampiamente applicabile ad anticorpi validati mediante immunofluorescenza e ottimizzato per l'imaging di routine di colture aderenti in 2D. La moltiplicazione è attuata mediante separazione per specie dell'ospite, fluorocromi spettralmente distinti e gruppi di controllo che verificano i livelli di fondo e le prestazioni della colorazione^9,10. Utilizzando coprislip di vetro da 12 mm in piastre standard da 24 pozzetti anziché slide con camere specializzate, questo flusso di lavoro evita l'uso di materiali monouso dedicati e più costosi, preferendo invece materiali comunemente disponibili nella maggior parte dei laboratori di coltura cellulare. Il flusso di lavoro utilizza inoltre una quantità notevolmente inferiore di soluzione di colorazione per unità di superficie di crescita (150 µL per ≈1,13 cm², ovvero ≈133 µL/cm²) rispetto ai formati equivalenti con coprislip a camera^11,12, che richiedono tipicamente 300–500 µL/cm², corrispondente a una riduzione di circa 2-4 volte nel consumo di anticorpi e reagenti per superficie. Di conseguenza, il protocollo consente la valutazione qualitativa della localizzazione e della co-distribuzione di più bersagli mediante microscopi standard a campo chiaro o confocali, insieme a controcolorazioni per il citoscheletro e il nucleo. Questo flusso di lavoro è destinato all'IF multiplex convenzionale su cellule fissate, basato sulla separazione per specie dell'ospite e sulla distinzione spettrale, e non è progettato per approcci iterativi o multiplex ad alta dimensione.

Protocollo

Questo studio non ha coinvolto partecipanti umani né soggetti animali. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando la linea cellulare D17 di osteosarcoma canino, una linea cellulare stabilita ottenuta da una banca pubblica di cellule (Banco de Células do Rio de Janeiro, Cat. No. 0276). Non è stata pertanto richiesta alcuna approvazione etica.

1. Mantenimento delle linee cellulari

1. Mantenere le cellule aderenti in condizioni di coltura standard (37 °C, 5% CO₂, incubatore umidificato) utilizzando il mezzo completo appropriato per la linea cellulare impiegata.
   NOTA: A titolo esemplificativo, le cellule di osteosarcoma canino D17 (Banco de Células do Rio de Janeiro [BCRJ], Cat. No. 0276) vengono mantenute in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di antibiotico-antimicotico, sottocoltivate al raggiungimento di una confluenza del 70–80% utilizzando tripsina-EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) e impiegate entro un intervallo di passaggi validato (ad esempio, passaggi 5–20).
2. Verificare lo stato negativo per micoplasmi prima degli esperimenti, utilizzando un saggio di rilevamento micoplasmi validato.

2. Preparazione della piastra a 24 pozzetti e dei coprivetri in vetro

NOTA: Le superfici dei coprioggetti devono essere pulite immergendole nell'etanolo al 70% (5 min, ripetuto 3 volte)×) prima della sterilizzazione con uno dei metodi descritti di seguito; dopo la sterilizzazione, le lamelle devono essere conservate in un contenitore chiuso a temperatura ambiente fino all'uso.

1. Posizionare coprioggetti puliti in vetro rotondi da 12 mm in una capsula di Petri in vetro (o in un portacoprioggetti) e sterilizzare in autoclave. Sterilizzare in autoclave anche una coppia di pinzette metalliche con punte fini.
2. Alternativa: pulire i coprioggetti e le pinzette con etanolo al 70%, lasciarli asciugare all'aria e decontaminare la superficie mediante esposizione a raggi ultravioletti (UV) (30 min) all'interno di una cappa a sicurezza biologica prima dell'uso. Conservare i coprioggetti sterilizzati in un contenitore chiuso a temperatura ambiente fino all'uso.
3. All'interno di una cappa a sicurezza biologica, utilizzare le pinzette sterili per trasferire un coprioggetto sterile in ciascuna pozzetta designata per i gruppi sperimentali di una piastra per colture cellulari a 24 pozzette.
4. Opzionale: ricoprire i coprioggetti con rivestimenti promotori dell'adesione seguendo le istruzioni del produttore o le linee guida consolidate del laboratorio, se necessario per il tipo cellulare utilizzato.
   NOTA: Le opzioni di rivestimento (poli-L-lisina, collagene I o fibronectina) e le relative concentrazioni di lavoro sono elencate nella Tabella dei Materiali. Per la maggior parte delle linee cellulari aderenti coltivate su vetro, coprioggetti sterilizzati non rivestiti sono sufficienti; i componenti del rivestimento possono essere antigenici, pertanto il rivestimento scelto non deve dare reazioni incrociate con gli anticorpi presenti nel pannello.
5. Se i coprioggetti sono stati rivestiti, aspirare la soluzione in eccesso, risciacquare una volta con soluzione salina tamponata al fosfato sterile (PBS), quindi lasciare asciugare all'aria all'interno della cappa a sicurezza biologica prima della semina cellulare.

3. Gruppi sperimentali

1. Includere un pannello di controlli appropriato alla progettazione del multiplex.
   NOTA: Un controllo senza anticorpi (né anticorpo primario né secondario) rivela l'autofluorescenza intrinseca, mentre un controllo senza primario (cocktail di anticorpi secondari senza alcun anticorpo primario) valuta il legame non specifico dell'anticorpo secondario e il rumore di fondo su tutti i canali contemporaneamente; poiché questo protocollo utilizza esclusivamente anticorpi secondari spettralmente distinti, questo singolo controllo permette di valutare ogni anticorpo secondario in modo indipendente all'interno del rispettivo canale, assolvendo allo stesso scopo di un controllo con singolo anticorpo secondario per ogni fluorocromo. I controlli con singola colorazione, in cui ogni coppia primario–secondario viene applicata singolarmente, convalidano le prestazioni di ciascun anticorpo prima della combinazione multiplex e, attraverso il confronto con la condizione multiplex, permettono di valutare il crosstalk spettrale per ogni coppia di fluorocromi. Ogni volta che possibile, si utilizza un controllo positivo che esprime l'antigene bersaglio per confermare le prestazioni del saggio.

4. Seeding cellulare (piantagione) su coverslip

1. Nella cappa a sicurezza biologica, staccare le cellule utilizzando tripsina (o un altro metodo di dissociazione appropriato), neutralizzare e risospendere nel mezzo di coltura completo.
2. Contare le cellule utilizzando un contatore cellulare automatico o un emocitometro.
3. Diluire le cellule a una concentrazione di 6 × 10⁴–1 × 10⁵ cellule/mL.
4. Aggiungere 0,5 mL di sospensione cellulare per pozzetto (finale: 3 × 10⁴–5 × 10⁴ cellule/pozzetto).
   NOTA: Se necessario, è possibile utilizzare una punta pipetta sterile per assicurarsi delicatamente che il vetrino coprioggetto sia ben appiattito sul fondo del pozzetto, evitando graffi.
5. Incubare le cellule in condizioni standard (37 °C, 5% CO₂) fino a quando le cellule si saranno attaccate e avranno raggiunto la confluenza desiderata o il tempo sperimentale prestabilito.

5. Trattamento delle cellule (Opzionale)

1. Selezionare il momento del trattamento in base al disegno sperimentale. Il trattamento può includere terapia farmacologica, stimolazione con citochine, manipolazione genetica per indurre o silenziare l'espressione del gene bersaglio, o altre interventi sperimentali, a seconda dei casi.
2. Etichettare le pozzette per identificare i gruppi di controllo e quelli trattati.
3. Incubare per i tempi richiesti; evitare la sovraconfluenza, poiché la crescita eccessiva aumenta il rumore di fondo e compromette la morfologia.
   NOTA: Le cellule dovrebbero essere aderite al coprislip prima della fissazione, a meno che il disegno sperimentale richieda la fissazione immediatamente dopo la semina.
4. Per bersagli secreti rapidamente (ad esempio citochine), aggiungere la brefeldina A (BFA) al mezzo di coltura a una concentrazione finale di 1–10 µg/mL (comunemente 5 µg/mL) e incubare per 4–6 h a 37 °C, 5% CO₂ prima della fissazione.
5. Rimuovere il mezzo contenente BFA e procedere immediatamente alla Fissazione.

6. Colorazione immunofluorescente

NOTA: a partire dalla fissazione, non è richiesta una tecnica sterile; la colorazione può proseguire sul banco di lavoro, utilizzando una cappa a flusso laminare ogni volta che si maneggiano reagenti con CAUTELA. I campioni non devono mai seccare; durante l'aspirazione, si lascia un sottile strato di tampone e si aggiunge immediatamente la soluzione successiva.

1. Fissazione (sceglierne una):
   NOTA: Il fissativo viene scelto in base alla localizzazione dell'antigene e alla sensibilità dell'epitopo (vedere la Discussione): la paraformaldeide (PFA) (formaldeide ottenuta da paraformaldeide) è adatta alla maggior parte degli antigeni ed è compatibile con la marcatura della falloidina; il metanolo può favorire la rilevazione di alcuni epitopi nucleari/fosfo-epitopi, ma compromette la colorazione dell'F-actina.
   1. Fissazione con PFA (consigliata per la maggior parte delle proteine bersaglio):
      1. Aspirare il mezzo e risciacquare delicatamente una volta con soluzione salina tamponata al Tris (TBS) (0,5 mL/pozzetto).
      2. Aggiungere PFA al 4% in PBS (soluzione salina tamponata al fosfato) (0,5 mL/pozzetto) e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (≈25 °C).
      3. Aspirare la PFA e lavare 3 volte× con TBS (aspirare prontamente; non far asciugare le pozzette).
         NOTA: ATTENZIONE: il PFA è tossico e un potenziale agente cancerogeno. Manipolare le soluzioni di PFA all'interno di una cappa chimica certificata indossando idonei dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, guanti e protezione oculare). Evitare l'inalazione e il contatto con la pelle, e smaltire i rifiuti in conformità alle linee guida istituzionali per la sicurezza chimica.
2. In alternativa, fissazione con metanolo (utile per alcuni antigeni nucleari e determinati epitopi fosforilati):
   1. Raffreddare preventivamente il metanolo al 100% a −20 °C.
   2. Aggiungere metanolo ghiacciato direttamente sulle cellule (0,5 mL/pozzetto) e incubare per 5 min a −20 °C.
   3. Lavare 3 volte× con TBS (aspirare prontamente; non far asciugare le pozzette).
      NOTA: Dopo la fissazione con metanolo, un'ulteriore permeabilizzazione potrebbe non essere necessaria e va ottimizzata in base all'anticorpo/epitopo. La fissazione con metanolo può danneggiare gli epitopi di membrana e compromettere la colorazione con falloidina marcata con fluorocromo/F-actina. AVVERTENZA: Il metanolo è tossico, volatile e altamente infiammabile. Manipolarlo in un'area ben ventilata o in una cappa chimica; indossare idonei dispositivi di protezione individuale; mantenerlo lontano da fiamme libere e fonti di calore. PUNTO FACOLTATIVO DI SOSPENSIONE: Dopo la fissazione, conservare i campioni a 4 °C in PBS contenente una bassa concentrazione di fissativo (ad esempio, PBS + 0,1% PFA) per un periodo massimo di una settimana; validare i tempi di conservazione per ciascun antigene.
3. Spegnimento dell'aldeide (facoltativo)
   1. Incubare con glicina 50 mM in TBS (0,5 mL/pozzetto) per 5 min a temperatura ambiente (≈25 °C).
   2. Lavare 3 volte× con TBS + 0,05% polisorbato 20.
      NOTA: La glicina neutralizza i gruppi aldeidici liberi residui dopo la fissazione con PFA, riducendo l'autofluorescenza legata alla fissazione e migliorando la specificità della colorazione con anticorpi.
4. Permeabilizzazione
   1. Se si mirano proteine di membrana, saltare la permeabilizzazione e procedere al passaggio 6.5.1.
   2. Se si mirano proteine intracellulari o nucleari, permeabilizzare con detergente non ionico allo 0,1–0,3% in TBS (0,5 mL/pozzetto) per 5–10 minuti a temperatura ambiente≈25 °C).
   3. Lavare 3 volte× con TBS + 0,05% polysorbato 20 (TBST).
      NOTA: La concentrazione e il tempo di incubazione del detergente non ionico octilfenolo etossilato sono ottimizzati in base al bersaglio; l'adeguatezza viene valutata in base al segnale nei compartimenti corretti, al mantenimento della morfologia, all'F-actina ben definita e a un fondo basso (vedere la Discussione). Se viene utilizzato il saponina, esso deve essere mantenuto in tutti i successivi tamponi di lavaggio e di incubazione con gli anticorpi. AVVERTENZA: Il detergente non ionico octilfenolo etossilato è nocivo se inalato o a contatto con la pelle e può causare irritazione oculare. Manipolare con guanti e evitare la formazione di aerosol.
5. Bloccaggio
   1. Aggiungere 0,5 mL/pozzetto di soluzione bloccante (albumina sierica bovina (BSA) al 5%) in TBS) e incubare per 30 min a temperatura ambiente (≈25 °C).
   2. Aspirare il tampone di blocco.
   3. Procedere direttamente all'incubazione con l'anticorpo primario (non lavare).
6. Incubazione con anticorpo primario
   NOTA: Le diluizioni degli anticorpi primari e secondari sono stabilite empiricamente mediante titolazione (vedere la Discussione).
   1. Preparare singoli o multiplex di anticorpi primari in soluzione tampone al Tris contenente polisorbato 20 0,05% e BSA 1% (TBST-BSA) 1%), utilizzando concentrazioni di anticorpi pre-ottimizzate per ogni bersaglio.
   2. Per l'immunofluorescenza multiplex, combinare tutti gli anticorpi primari non coniugati diretti contro antigeni distinti provenienti da diverse specie ospiti (ad esempio, anti-interferone murino)β (IFN-β) + coniglio anti-p14ARF + capra anti-actina) in un unico cocktail di anticorpi.
   3. Aggiungere 150 µL per pozzetto, assicurandosi che l'intero coprioggetto sia completamente ricoperto dalla soluzione di anticorpo.
      NOTA: Per prevenire l'evaporazione a basso volume, la piastra viene incubata in una camera umidificata (ad esempio, una scatola sigillata con tessuto umido).
   4. Incubare per 1,5 h a temperatura ambiente (≈25 °C) oppure 12–16 h a 4 °C.
   5. Lavare 3 volte× con TBST per 3 min ciascuno a temperatura ambiente (≈25 °C), aspirare immediatamente dopo ogni lavaggio.
7. Incubazione con l'anticorpo secondario (e con anticorpi primari direttamente coniugati, quando applicabile)
   NOTA: A partire da questo passaggio, i campioni vengono mantenuti protetti dalla luce per prevenire il fotoblecamento. Vengono utilizzati fluorocromi spettralmente distinti nei diversi anticorpi secondari e in qualsiasi anticorpo primario direttamente coniugato, al fine di minimizzare l'interferenza incrociata; inoltre, si impiegano anticorpi secondari altamente cross-adsorbiti e specifici per specie, per ridurre al minimo il legame a anticorpi primari non specifici. La progettazione del pannello di fluorocromi, inclusi marcatori nucleari e del citoscheletro, nonché la compatibilità con le sorgenti di eccitazione e i filtri di emissione del microscopio, sono trattate nella Discussione.
   1. Diluire gli anticorpi secondari nella soluzione TBST-BSA al 1% utilizzando concentrazioni pre-ottimizzate. Per la rilevazione multiplex, combinare tutti gli anticorpi secondari corrispondenti alle specie ospiti degli anticorpi primari utilizzati (un anticorpo secondario per ogni specie ospite) in un'unica miscela.
   2. Aggiungere 150 µL per pozzetto, assicurando che l'intero coperchio sia completamente ricoperto.
   3. Incubare per 1 h a temperatura ambiente (≈25 °C).
      NOTA: Se il pannello include uno o più anticorpi primari direttamente coniugati, aggiungerli insieme al cocktail di anticorpi secondari e prolungare l'incubazione a 1,5 h a temperatura ambiente (circa 25 °C).
   4. Lavare 3 volte× con TBST per 3 min ciascuno a temperatura ambiente (≈25 °C), aspirando prontamente dopo ogni lavaggio.

7. Colorazione del nucleo e dell'actina F

1. Aggiungere il colorante nucleare Hoechst 33342 (1:5000) diluito in TBS e incubare per 15 min a temperatura ambiente (≈25 °C), protetto dalla luce. Se l'F-actina deve essere marcata con falloidina anziché con un anticorpo anti-actina, includere la falloidina (1:400) nella stessa soluzione.
2. Lavare 3 volte× con TBST, aspirando rapidamente dopo ogni lavaggio (non lasciare asciugare i pozzetti).
3. Aggiungere 0,5 mL di TBS in ogni pozzetto per mantenere le lamelle immerse fino al recupero/montaggio.

8. Recupero del coprioggetto e montaggio del vetrino

1. Mentre i coprioggetti rimangono immersi in TBS, inserire la punta di un ago sottile o di un bisturi sotto il bordo del coprioggetto e sollevarlo delicatamente fino a quando un lato è parzialmente sollevato. Utilizzando pinzette fini, afferrare il coprioggetto ed estrarlo dalla pozzetta.
   NOTA: La rimozione di un coperchio non immerso può causare l'adesione del vetrino al fondo della pozzetta a causa della tensione superficiale, aumentando il rischio di rottura.
2. Tenendo il coverslip con una pinzetta, rimuovere con attenzione l'eccesso di TBS dai bordi utilizzando un aspiratore a vuoto o carta assorbente. Evitare di toccare la superficie coperta da cellule.
   NOTA: È necessario evitare il residuo eccessivo di liquido, poiché potrebbe diluire il mezzo di montaggio e compromettere la chiarezza e il contrasto dell'immagine.
3. Posizionare il coverslip con il lato delle cellule rivolto verso il basso su un vetrino pulito contenente una piccola goccia (≈3 µLdi mezzo di montaggio.
   NOTA: può essere utilizzato un mezzo antifade autopolimerizzante commerciale o un mezzo casalingo a base di glicerolo al 80% in soluzione salina tamponata al fosfato (PBS); i preparati a base di glicerolo vengono sigillati con smalto incolore, e i mezzi privi di colorante nucleare vengono selezionati dopo la controcolorazione. I limiti di conservazione e le indicazioni sulla stabilità dei fluorocromi sono riportati nella Discussione.
4. Lasciare asciugare i vetrini orizzontalmente per ≈24 h, al riparo dalla luce, prima dell'acquisizione delle immagini.

Risultati

Questo protocollo consente la colorazione immunofluorescente mono- e multiplex di cellule tumorali canine aderenti coltivate su coprislip di vetro, permettendo la visualizzazione simultanea di marcatori nucleari, citoplasmatici e del citoscheletro, preservando al contempo la morfologia cellulare. I risultati rappresentativi sono illustrati nella Figura 3.

Negli esperimenti di successo, le cellule di osteosarcoma canino D17 modificate geneticamente per esprimere p14ARF canino e IFN-β canino (Sezione 5.1) hanno mostrato segnali fluorescenti intensi, spazialmente appropriati, con fondo ridotto e una colorazione aspecifica minima. Per le cellule esprimenti p14ARF (Figura 3A), l'immunofluorescenza ha rivelato una localizzazione prevalentemente nucleare, coerente con la nota distribuzione subcellulare di p14ARF. L'utilizzo di detergente non ionico etossilato di ottile fenolo allo 0,3% per la permeabilizzazione ha permesso un efficiente accesso degli anticorpi agli epitopi nucleari preservando al contempo la morfologia nucleare e l'integrità del citoscheletro, come confermato dalla chiara colorazione di controcolorazione nucleare e dalle strutture di actina visualizzate mediante un anticorpo anti-actina (fluoroforo con emissione arancione).

Per le cellule esprimenti IFN-β (Figura 3A), è stato osservato un segnale citoplasmatico dopo l'incubazione con BFA per bloccare la secrezione proteica, consentendo l'accumulo intracellulare e il rilevamento di questa citochina solubile. In queste condizioni, una permeabilizzazione più lieve è risultata sufficiente per permettere la penetrazione degli anticorpi senza un'eccessiva estrazione del contenuto citoplasmatico. Una colorazione riuscita si è caratterizzata per una fluorescenza citoplasmatica da puntiforme a diffusa, un minimo crosstalk nucleare e un'architettura dell'actina preservata.

Sono stati osservati risultati subottimali quando i parametri chiave non sono stati adeguatamente ottimizzati. Una permeabilizzazione insufficiente ha determinato un segnale nucleare debole o assente per p14ARF, come mostrato nella condizione non permeabilizzata (0% di detergente non ionico etossilato di ottilefenolo; Figura 3B e Figura Supplementare 1). Al contrario, una permeabilizzazione eccessiva (≥0,5% di detergente non ionico etossilato di ottilefenolo o tempi di incubazione prolungati) può portare a una parziale perdita della colorazione del citoscheletro, a un aumento della fluorescenza di fondo e a una compromissione della morfologia cellulare. Negli esperimenti con proteine secretate rapidamente (ad esempio IFN-β), l'omissione della BFA ha spesso prodotto un segnale intracellulare più debole, indicativo di una rapida secrezione piuttosto che di un fallimento del protocollo.

I controlli con colorazione singola (Supplementary Figure 2) hanno mostrato segnale solo nel canale corrispondente a ciascun bersaglio, confermando la specificità della colorazione immunofluorescente osservata. Le condizioni di controllo negative, incluse quelle senza anticorpo primario e senza alcun anticorpo (Supplementary Figure 2), hanno mostrato la colorazione nucleare prevista, con segnale trascurabile nei canali dipendenti dagli anticorpi, indicando una bassa autofluorescenza e un legame non specifico minimo dell'anticorpo secondario.

Nel complesso, questi risultati rappresentativi dimostrano che il protocollo consente il rilevamento di proteine con localizzazioni subcellulari distinte quando la fissazione, l'intensità della permeabilizzazione e le strategie specifiche dipendenti dal bersaglio (ad esempio, il blocco della secrezione) vengono adattate alla biologia del bersaglio. Un'ottimizzazione adeguata produce una fluorescenza intensa e specifica con fondo ridotto e morfologia cellulare preservata, mentre condizioni non ottimali portano a segnali più deboli o più rumorosi e a una struttura cellulare alterata.

Figura 1: Diagramma di flusso riassuntivo del protocollo di immunofluorescenza mono- e multiplex. Passaggi principali che vanno dalla manutenzione delle colture cellulari fino all'acquisizione delle immagini, inclusi i due punti decisionali che richiedono una selezione dipendente dall'antigene: il metodo di fissazione (PFA rispetto a metanolo) e la permeabilizzazione (in base alla localizzazione subcellulare dell'antigene). Il trattamento sperimentale facoltativo, incluso il pretrattamento con brefeldina A (BFA) per antigeni rapidamente secreti, è indicato come diramazione precedente alla fissazione. Passaggi opzionali non mostrati per chiarezza (ad esempio, la bloccaggio degli aldeidi) sono descritti nel Protocollo completo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Rappresentazione schematica delle strategie di rilevamento fluorescente basate su anticorpi. Il rilevamento diretto utilizza anticorpi primari coniugati con fluorocromi, mentre il rilevamento indiretto impiega anticorpi primari non coniugati abbinati ad anticorpi secondari coniugati con fluorocromi, strategia adottata in tutto il presente protocollo. Per applicazioni multiplex, il rilevamento indiretto richiede anticorpi primari non coniugati prodotti in diverse specie ospiti, consentendo a ciascun anticorpo secondario di riconoscere in modo selettivo il proprio anticorpo primario corrispondente senza cross-reattività. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Immunofluorescenza multiplex di cellule D17 di osteosarcoma canino. Le cellule D17 (5 × 10⁴) sono state seminate su coprislip di vetro in piastre a 24 pozzetti e fissate con paraformaldeide al 4% (PFA) per 10 min a 25 °C. Le cellule sono state sottoposte a immunofluorescenza multiplex utilizzando gli anticorpi primari anti-p14ARF (1:200; fluorofori emettitori verdi), anti-actina (1:200; fluorofori emettitori arancioni) e anti-interferone-β (IFN-β) (1:200; fluorofori emettitori nel vicino infrarosso), con gli anticorpi secondari corrispondenti in diluizione 1:500. I nuclei sono stati contrastati. Prima del rilevamento di IFN-β, le cellule sono state trattate con BFA (5 µg/mL, 4 h) per bloccare la secrezione proteica. (A) Le cellule sono state permeabilizzate con detergente non ionico allo 0,3% per 10 min a 25 °C. (B) Le cellule sono state processate senza permeabilizzazione (0% detergente non ionico). Immagini rappresentative di 2 replicati biologici indipendenti, ciascuno eseguito con 2 replicati tecnici. In questa figura sono mostrati solo i canali sovrapposti; i canali singoli sono riportati nella Figura Supplementare 1. Sono osservabili differenze di marcatura tra le condizioni, in particolare per p14ARF (A; frecce), un bersaglio intranucleare, il cui segnale era assente nel gruppo non permeabilizzato (B). I pannelli A e B sono stati acquisiti ed elaborati utilizzando impostazioni identiche (Tabella Supplementare 1). I controlli negativi e con singola colorazione corrispondenti a questo pannello sono mostrati nella Figura Supplementare 2. Barra delle scale: 100 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura supplementare 1: Canali di fluorescenza individuali corrispondenti alla Figura 3, organizzati per marcatore con condizioni di permeabilizzazione (colonna sinistra) e senza permeabilizzazione (colonna destra). Condizioni mostrate a confronto: Hoechst 33342 (A, B), p14ARF (C, D; fluorofori a emissione verde), actina (E, F; fluoroforo a emissione arancione) e IFN-β (G, H; fluorofori a emissione nel vicino infrarosso), insieme ai corrispondenti pannelli fusi (I, J), che corrispondono rispettivamente alla Figura 3A e 3B. Le frecce indicano la colorazione nucleare rappresentativa di p14ARF; le ellissi indicano rispettivamente la colorazione rappresentativa di actina (E) e IFN-β (G). Si osserva una perdita del segnale nucleare di p14ARF, insieme a un'etichettatura subottimale di IFN-β e actina, nelle condizioni senza permeabilizzazione. Il segnale residuo osservato in (D; asterisco) riflette un crosstalk spettrale da fluorofori presenti contemporaneamente, confermato dalla sua assenza nei controlli con singola colorazione e con solo anticorpo secondario (Figura supplementare 2). Barra della scala: 100 µm. Cliccare qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Controlli di immunofluorescenza combinata corrispondenti al pannello multiplex della Figura 3. Per ogni gruppo di controllo, i singoli canali (Hoechst 33342, fluorofori a emissione verde, fluoroforo a emissione arancione e fluorofori a emissione nel vicino infrarosso) sono mostrati insieme all'immagine sovrapposta (quinta colonna).A–EControllo senza anticorpi: cellule trattate senza anticorpi primari o secondari.F–JControllo con sola secondaria: cellule incubate con il cocktail di anticorpi secondari in assenza di anticorpi primari.K–O) controllo con colorazione singola per p14ARF (fluorofori a emissione verde). (P–T) Controllo con colorazione singola per l'actina (fluorocromo con emissione arancione). (U–Y) IFN-β controllo con singola colorazione (fluorofori che emettono in luce infrarossa). Le impostazioni di acquisizione ed elaborazione erano identiche a quelle utilizzate nella Figura 3 (Tabella Supplementare 1). Barra della scala: 100 µm. Cliccare qui per scaricare questo file.

Tabella Supplementare 1: Specifiche dei cubetti filtro per fluorescenza e ordine di acquisizione. Le immagini sono state acquisite in modo sequenziale mediante un microscopio a fluorescenza invertito ad ampio campo (obiettivo 40×/0,80) utilizzando i cubetti filtro elencati di seguito, nell'ordine indicato, per ogni campo ripreso nelle Figure 3, Figura Supplementare 1 e Figura Supplementare 2. Le immagini sono state acquisite come singoli piani ottici (senza z-stacking).L'intensità di eccitazione è stata regolata mediante il controllo dell'intensità della fluorescenza ai livelli indicati, mantenendo il diaframma del campo della luce incidente nella posizione 6 per tutti i canali. Le impostazioni della fotocamera (digitalizzazione a 8 bit, formato 3072×2048, gamma 1,0) e un'impostazione fissa di nitidezza digitale sono state mantenute identiche per tutti i canali e i pannelli, inclusi i controlli presenti nella Figura Supplementare 2. È stata applicata una singola regolazione lineare di luminosità/contrasto, applicata in modo identico a tutti i canali e i pannelli per la visualizzazione. Le immagini sono state esportate in formato TIFF. Cliccare qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 2: Guida alla risoluzione dei problemi comuni relativi a questioni tecniche nel protocollo di immunofluorescenza. Problemi frequenti, cause probabili e azioni correttive lungo il protocollo.Cliccare qui per scaricare il file.

Discussione

Diversi passaggi sono fondamentali per ottenere risultati costanti in questo protocollo di immunofluorescenza basato su coprioggetti. Tutte le procedure vengono eseguite all'interno dell'ambiente confinato di una pozzetta di una piastra da 24 pozzetti, il che semplifica la manipolazione, riduce l'intervento sui campioni e permette una completa copertura del coprioggetto utilizzando volumi ridotti di reagenti, riducendo così il consumo di anticorpi per ogni esperimento. Poiché soluzioni a basso volume sono soggette ad evaporazione, le incubazioni devono essere eseguite in una camera umidificata, e i campioni non devono mai asciugarsi: anche un breve asciugamento aumenta la fluorescenza di fondo e degrada la morfologia cellulare. Durante l'aspirazione, si lascia un sottile strato di tampone sul coprioggetto, aggiungendo immediatamente la soluzione successiva.

Una densità di semina cellulare appropriata e una confluenza controllata al momento della fissazione sono essenziali per limitare il rumore di fondo e preservare la morfologia, poiché la sovraproliferazione aumenta il segnale di fondo e compromette l'architettura cellulare. È parimenti necessario un controllo preciso del tempo e della temperatura di incubazione durante tutte le fasi, poiché entrambi influenzano l'efficienza della fissazione, il legame degli anticorpi e il segnale di fondo^5,13. Quando le condizioni ambientali variano, l'uso di un incubatore termoregolato o di un fornetto asciutto impostato a 25 °C, unito a tempi di incubazione costanti tra i replicati, migliora la riproducibilità.

La fissazione è il primo passaggio decisivo, poiché determina la conservazione dell'antigene e l'architettura cellulare⁵, e il fissativo viene scelto in base alla localizzazione dell'obiettivo e alla sensibilità dell'epitopo. Il PFA è raccomandato per la maggior parte degli antigeni associati alla membrana, citoplasmatici, nucleari e del citoscheletro, poiché preserva l'architettura, mantiene la distribuzione dell'antigene ed è compatibile con la colorazione dell'F-actina basata su falloidina. Il metanolo può essere preferito per alcuni antigeni nucleari scarsamente rilevati dopo fissazione con cross-linking, in particolare epitopi fosfo- o epitopi sensibili agli aldeidi, ma compromette l'integrità della membrana, estrae le proteine solubili e altera la colorazione con falloidina/F-actina; la compatibilità deve essere validata per ciascun antigene ^13,14,15,16. Per citochine solubili e altre proteine rapidamente secrete, la fissazione con PFA combinata con un pretrattamento con BFA mantiene il segnale intracellulare prima della fissazione: la BFA blocca il trasporto proteico dal reticolo endoplasmatico all'apparato di Golgi, favorendo l'accumulo intracellulare delle proteine secrete e consentendone la rilevazione mediante immunofluorescenza. Quando è necessario rilevare contemporaneamente antigeni con requisiti di fissazione contrastanti, è richiesta un'ottimizzazione empirica. Il glicossale, un dialdeide di piccole dimensioni, è stato descritto come alternativa al PFA, con cross-linking più rapido, migliore conservazione dell'antigene e compatibilità con immunofluorescenza e microscopia a super risoluzione; non abbiamo esperienza diretta con la fissazione mediante glicossale e la proponiamo come opzione supportata dalla letteratura^17,18.

Dopo la fissazione, una permeabilizzazione adeguata consente l'accesso degli anticorpi agli epitopi intracellulari e nucleari mantenendo l'integrità strutturale⁵. Una permeabilizzazione insufficiente produce tipicamente un segnale debole o assente nonostante una morfologia intatta, indicando un accesso limitato degli anticorpi, mentre una permeabilizzazione eccessiva estrae le proteine solubili, altera le membrane, provoca la perdita della colorazione del citoscheletro e aumenta il fondo. Il tipo di detergente, la concentrazione e il tempo di incubazione devono quindi essere ottimizzati in base all'antigene bersaglio. Una permeabilizzazione adeguata può essere valutata secondo quattro criteri: (i) segnale specifico nel compartimento subcellulare previsto; (ii) morfologia preservata, con contorni nucleari e citoplasmatici ben definiti evidenziati rispettivamente da Hoechst 33342 e da falloidina; (iii) colorazione ben definita dell'F-actina, poiché un segnale citoscheletrico diffuso o assente indica una permeabilizzazione eccessiva; e (iv) fondo basso nei controlli negativi. Se tali criteri non vengono soddisfatti, la concentrazione del detergente non ionico octylphenol ethoxylate e/o il tempo di incubazione vengono regolati empiricamente. Quando antigeni associati alla membrana e antigeni intracellulari vengono analizzati insieme in un singolo pannello, condizioni più lievi (bassa concentrazione di detergente, tempo di incubazione breve) preservano gli epitopi di membrana pur consentendo l'accesso intracellulare, ed è utile effettuare una serie temporale che parta da 5 minuti e aumenti progressivamente. Se si utilizza saponina, questa deve essere mantenuta in tutti i successivi tamponi di lavaggio e di incubazione con gli anticorpi, poiché il suo effetto permeabilizzante è reversibile.

Le concentrazioni degli anticorpi vengono stabilite empiricamente mediante titolazione, piuttosto che adottate da raccomandazioni generiche. Un approccio pratico prevede una serie di diluizioni seriali che comprenda almeno 3–4 concentrazioni al di sopra e al di sotto della diluizione suggerita dal produttore (ad esempio, 1:50, 1:100, 1:200 e 1:400 per una diluizione consigliata di 1:200), applicate a replicati di coverslip in condizioni identiche. Ogni diluizione viene valutata in base all'intensità del segnale specifico nel compartimento previsto; al rapporto segnale-rumore, confrontando i campioni colorati con il corrispondente controllo senza anticorpo primario e il rumore di fondo del secondario con il controllo senza anticorpi; e al mantenimento della morfologia. Viene selezionata la concentrazione più bassa in grado di produrre un segnale forte e specifico con un fondo minimo. Un fondo elevato persistente può essere generalmente ridotto mediante ulteriore titolazione, prolungamento del blocco o aumento della stringenza dei lavaggi, mentre un segnale debole potrebbe dipendere da una fissazione eccessiva, da una concentrazione subottimale di anticorpo, dal mancato riconoscimento dell'epitopo target da parte dell'anticorpo primario, da un'incompatibilità tra l'anticorpo secondario e la specie ospite del primario (ad esempio, un secondario anti-coniglio utilizzato su un primario di origine murina), o dalla perdita del segnale fluoroforo dovuta al degrado dell'anticorpo secondario causato dalla scadenza o da un'errata conservazione, in particolare esposizioni ripetute alla luce. Se il segnale è assente in tutte le diluizioni, vale la pena prolungare l'incubazione con l'anticorpo primario o passare a un'incubazione notturna a 4 °C, confermare l'espressione dell'antigene nella linea cellulare, verificare la compatibilità dell'anticorpo con le condizioni di fissazione e permeabilizzazione, controllare il lotto, la conservazione e la data di scadenza degli anticorpi primario e secondario, assicurarsi che il microscopio disponga dei filtri di eccitazione ed emissione appropriati per il fluoroforo, e, se il problema persiste, testare una diversa linea cellulare. Quando si preparano le soluzioni di lavoro, il volume totale del cocktail richiesto corrisponde al numero di pozzetti moltiplicato per 150 µL, più circa il 10% in eccesso per compensare le perdite durante la pipettaggio; il volume del stock di ciascun anticorpo equivale a questo totale diviso per il suo fattore di diluizione (ad esempio, 825 µL ÷ 200 = 4,13 µL per una diluizione 1:200), con il volume residuo completato in TBST–BSA 1%. Lo stesso calcolo si applica al cocktail secondario, sostituendo il corrispondente fattore di diluizione.

Le prestazioni della moltiplicazione dipendono infine dalla progettazione del pannello di fluorocromi. I fluorocromi assegnati ai target principali, alla colorazione nucleare di contrasto e al marcatore del citoscheletro devono essere coordinati per evitare sovrapposizioni spettrali o duplicazioni del segnale, e il sistema di imaging deve supportare l'eccitazione e la rilevazione di ogni fluorocromo selezionato^9,10; gli intervalli di eccitazione e di emissione per ogni cubetto filtro sono riportati nella Tabella Supplementare 1, consentendo un confronto diretto della compatibilità spettrale tra i vari fluorocromi del pannello. Gli utenti che adattano questo pannello ad altri fluorocromi sono invitati a scegliere combinazioni con sovrapposizione minima tra canali adiacenti, ove possibile, e a verificare l'assenza di crosstalk nei controlli con singola colorazione prima di combinare i target, come effettuato in questo caso. Un segnale residuo attribuibile ai fluorocromi co-presenti è stato osservato in tutti i canali acquisiti nel pannello multiplex (Figura Supplementare 1), ma era assente nei corrispondenti controlli con singola colorazione e nei soli secondari (Figura Supplementare 2), indicando un crosstalk spettrale derivante dai set di filtri a banda larga utilizzati nell'acquisizione in campo chiaro (potenzialmente riducibile mediante eccitazione confocale basata su laser). Data la separazione spaziale tra la localizzazione nucleolare di p14ARF e la distribuzione filamentosa/citoplasmatica dell'actina e dell'IFN-β, questo crosstalk non compromette l'interpretazione della localizzazione di p14ARF nel pannello multiplex. Questo flusso di lavoro si basa sulla moltiplicazione convenzionale mediante fluorocromi, in cui il numero di target risolvibili simultaneamente è limitato dalle specie ospiti degli anticorpi disponibili e dai fluorocromi spettralmente distinti. Una moltiplicazione di ordine superiore può essere ottenuta mediante immunofluorescenza ciclica o imaging spettrale, che consentono rispettivamente colorazioni/bleaching iterativi o l'unmixing lineare di fluorocromi sovrapposti, ma richiedono attrezzature e software specializzati non trattati qui^19,20.

Il mezzo di montaggio influenza sia la qualità dell'immagine che la durata del segnale. È possibile utilizzare un mezzo antifade commerciale autopolimerizzante oppure, come alternativa casalinga, glicerolo all'80% in PBS (senza antifade, senza autopolimerizzazione); i preparati casalinghi a base di glicerolo devono essere sigillati con smalto trasparente per prevenire l'essiccazione e il movimento del vetrino, e si devono scegliere mezzi privi di coloranti nucleari qualora sia già stata eseguita una controcolorazione nucleare. Le immagini vanno acquisite preferibilmente subito dopo la polimerizzazione. Quando non è possibile procedere immediatamente all'acquisizione, i vetrini polimerizzati possono essere conservati in una scatola buia a 4 °C per 2–4 settimane oppure a −20 °C per un massimo di 6 mesi, tenendo presente che fluorofori altamente fotolabili (ad esempio, fluorofori con emissione verde) perdono segnale nel tempo anche nelle condizioni ottimali di conservazione. I mezzi antifade commerciali aumentano notevolmente la stabilità dei fluorofori rispetto ai mezzi casalinghi a base di glicerolo; quando si utilizzano questi ultimi, si raccomanda fortemente di effettuare l'acquisizione entro 24–48 ore. Lo smalto trasparente è compatibile con la maggior parte dei fluorofori e non altera in modo significativo la conservazione del segnale, purché si permetta almeno un tempo di polimerizzazione al buio di 30 minuti prima della conservazione.

A partire dal passaggio di fissazione, non è più richiesta una tecnica sterile e la colorazione può essere eseguita sul banco di lavoro, riservando una cappa chimica certificata per qualsiasi reagente contrassegnato dall'avvertenza CAUTION. Le linee cellulari di derivazione tumorale, come D17 e altre, vengono gestite in conformità con le linee guida istituzionali di biosicurezza per materiali del gruppo di rischio 1 o 2, secondo i casi. Tutti i materiali che vengono a contatto con cellule in coltura, coprioggetti, puntali, mezzo di coltura e rifiuti liquidi devono essere decontaminati prima dello smaltimento: i rifiuti liquidi vengono inattivati con candeggina fino a una concentrazione finale del 10% per almeno 30 minuti, mentre i rifiuti solidi vengono smaltiti in appositi contenitori per rifiuti biologici. I rifiuti chimici contenenti PFA, metanolo o detergente non ionico etossilato di ottilefenolo vengono separati e smaltiti in conformità con le normative istituzionali sulla sicurezza chimica.

Sebbene progettata per essere ampiamente utilizzabile, questa procedura deve essere considerata più adattabile in base all'antigene piuttosto che un protocollo rigido e universale; l'applicazione riuscita dipende dalla comprensione, da parte del ricercatore, della localizzazione, solubilità, accessibilità dell'epitopo e sensibilità alla fissazione e alla permeabilizzazione di ciascun antigene. Vanno sottolineati due limiti. In primo luogo, la valutazione della colorazione qui descritta è qualitativa, basata sul confronto con controlli negativi e sulla localizzazione subcellulare prevista, piuttosto che su una quantificazione formale del rapporto segnale-rumore; pertanto, la riproducibilità riportata riflette una colorazione qualitativa riproducibile su replicati di coprioggetti e condizioni di controllo, piuttosto che prestazioni validate quantitativamente. Una guida consolidata per la risoluzione dei problemi, che riassume i problemi comuni, le cause probabili e le azioni correttive, è fornita nella Tabella Supplementare 2. I laboratori che richiedono letture quantitative possono utilizzare software open-source per l'analisi delle immagini per misurare l'intensità media, sottrarre il fondo, effettuare quantificazioni basate su Regioni di Interesse (ROI) e profili di intensitಹ. In secondo luogo, i dati rappresentativi derivano da una singola linea tumorale canina aderente (D17), quindi l'estensione ad altri tipi cellulari, specie o combinazioni di antigeni richiederà una riottimizzazione specifica per l'antigene in esame riguardo alle condizioni di fissazione, permeabilizzazione e di impiego degli anticorpi.

In sintesi, questo protocollo fornisce un flusso di lavoro flessibile ed economico per l'immunofluorescenza mono- e multiplex in colture aderenti in 2D, combinando un basso consumo di reagenti con prestazioni di marcatura costanti su apparecchiature di laboratorio standard, pur consentendo adattamenti mirati e dipendenti dall'antigene.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre per colture cellulari a 24 pozzetti	Corning	3524	Seeding e colorazione di coverslip
Antibiotico-antimicotico	Gibco	15240062	Utilizzato per prevenire la contaminazione batterica e fungina nelle colture cellulari.
Soluzione diluente per anticorpi (TBST-BSA 1%)	Preparato in sede	—	Per 10 mL: 2 mL della soluzione bloccante BSA al 5% + 5 µL di Tween-20 + 7,995 mL di TBS 1x (soluzione lavorativa) fino a un volume finale di 10 mL (finale: BSA 1%, Tween-20 0,05% in TBS; pH 7,6). Preparare al momento; se conservato, mantenere a 4 °C al riparo dalla contaminazione e utilizzare entro 1 settimana.
Soluzione bloccante	Preparato in sede	—	Per 10 mL: 0,5 g di BSA disciolto in 10 mL di TBS 1x (1 mL di soluzione stock TBS 10x + 9 mL di acqua distillata); pH 7,6. Incubazione di 30 min a 25 °C; preparare al momento.
(BSA 5% in TBS)
Brefeldina A	Sigma-Aldrich	B7651	5 µg/mL; pretrattamento di 4 h per bloccare la secrezione proteica prima del rilevamento delle citochine.
BSA (albumina sierica bovina)	Sigma-Aldrich	A7906	5% in TBS per bloccaggio; 1% in TBS + 0,05% Tween-20 per diluente degli anticorpi.
Reagente a base di collagene (rivestimento di coverslip, opzionale)	Corning	354231	Collagene di tipo I derivato da derma bovino; diluito a 50 µg/mL in HCl 0,01 N; applicato a 5–10 µg/cm² (≈100 µL/pozzetto); incubare 1 h a temperatura ambiente (≈25°C); aspirare e risciacquare con PBS prima del seeding cellulare.
Coverslip in vetro, rotondi da 12 mm	Knittel Glass	100013	Supporto per colture cellulari aderenti e colorazione.
Linea cellulare D17 di osteosarcoma canino	Banco de células do Rio de Janeiro	276	Modello cellulare rappresentativo; mantenuta in DMEM integrato con 10% di FBS e antibiotico-antimicotico; mantenere a 37 °C, 5% CO2.
(BCRJ)
Acqua deionizzata/distillata	Preparato in sede	—	Preparazione di tamponi.
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	12100-046	Mezzo completo per colture cellulari.
Etilene	Supelco	1.00983	Decontaminazione di coverslip e pinze.
Siero fetale bovino	Sigma-Aldrich	F7524	Integratore nel mezzo di coltura cellulare.
(FBS)
Fibronectina	Gibco	33016015	Glicoproteina della matrice extracellulare; diluita a 0,0125 mg/mL nel mezzo di coltura cellulare; applicata a 100 µL/pozzetto e incubata per 1 h a temperatura ambiente (≈25°C) prima del seeding cellulare.
Pinze metalliche a punta fine	Varie	—	Manipolazione dei coverslip.
Microscopio a fluorescenza	Leica Microsystems	DMi8	Microscopio a fluorescenza in campo luminoso DMi8 (Leica Microsystems), obiettivo HC PL FLUOTAR 40×/0,80 DRY; compatibile con fluorofori nel pannello (AF488, AF555, AF647, Hoechst).
Vetrini per microscopio in vetro	Bioslide	—	Montaggio di coverslip colorati per l'acquisizione di immagini.
Piattino di Petri in vetro o portacoverslip	Varie	—	Autoclavaggio/conservazione dei coverslip.
Glicina	Sigma-Aldrich	8.16E+09	Per 10 mL di soluzione 50 mM: 37,5 mg di glicina disciolti in 10 mL di TBS 1x; pH 7,6. 5 min a 25 °C; passaggio opzionale di quenching degli aldeidi dopo la fissazione, prima della permeabilizzazione; preparare al momento.
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Per 10 mL di soluzione lavorativa: diluire il stock 1:5000 in TBS. Colorazione di contrasto nucleare; incubare al riparo dalla luce; preparare al momento.
Camera umidificata	Varie/Preparato in sede	—	Per l'incubazione con anticorpi; alternativamente assemblata da una scatola di plastica sigillata con carta assorbente inumidita.
ImageJ	Open source (NIH)	—	Utilizzato per l'analisi delle immagini post-acquisizione.
Software di acquisizione delle immagini	Leica Microsystems	LAS X 3.7.3	Utilizzato per l'acquisizione delle immagini su Leica DMi8.
Metanolo	Merck	1.06009	Fissazione alternativa (antigeni nucleari/epitopi fosforilati); preraffreddato a −20 °C, incubazione di 5 min; può compromettere la colorazione con falloidina/F-actina.
Mezzo di montaggio	Sigma-Aldrich	G2289	Per 10 mL: 8 mL di glicerolo + 2 mL di PBS, pH 7,6, mescolare accuratamente. Non contiene agenti antifading e non indurisce autonomamente. Sigillare i bordi dei coverslip con smalto per unghie per prevenire l'essiccazione/drift, conservare i vetrini a 4 °C al riparo dalla luce e acquisire le immagini rapidamente per minimizzare il fotoblanco.
(a base di glicerolo)
Mezzo di montaggio (ProLongTM Glass)	Invitrogen	P36984	Contiene reagenti antifading e indurisce autonomamente (si solidifica) entro ~24 h a temperatura ambiente, al riparo dalla luce, formando un montaggio permanente (non richiede sigillatura con smalto per unghie). Conservare i vetrini a 2–8 °C, al riparo dalla luce fino all'acquisizione delle immagini.
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Componente ionico del tampone TBS; mantiene l'osmolarità fisiologica per preservare la morfologia cellulare e tissutale durante i passaggi di lavaggio e incubazione con anticorpi.
Ago (a calibro fine, es. 25–27G)	Varie	—	Utilizzato come leva per sollevare delicatamente e staccare il coverslip dal fondo del pozzetto senza danneggiare il monolayer cellulare.
Paraformaldeide (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Per 10 mL: 0,4 g di polvere di paraformaldeide disciolti in 8 mL di PBS, riscaldati a 60–65 °C con alcune gocce di NaOH 1N fino a ottenere una soluzione limpida, raffreddare, aggiustare il pH a 7,4 e portare a 10 mL con PBS; filtrare attraverso un filtro da 0,2 µm prima dell'uso. Preparare al momento o aliquotare e conservare a −20 °C, evitando cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.
Falloidina coniugata con fluoroforo.	Invitrogen	A seconda del colore di fluorescenza scelto	Per 10 mL di soluzione lavorativa: diluire lo stock 1:400 in TBS, pH 7,6, secondo le indicazioni del produttore. Etichetta alternativa per il citoscheletro/F-actina; preparare al momento, al riparo dalla luce.
Soluzione salina tamponata al fosfato	Sigma-Aldrich	P4474-1L	Tampone fosfato isotonico (pH 7,4); mantiene l'osmolarità fisiologica per preservare la morfologia cellulare durante i passaggi di fissazione e lavaggio.
(PBS)
Poli-L-lisina (rivestimento di coverslip, opzionale)	Sigma-Aldrich	P8920	Reagente sintetico di rivestimento policationico che migliora l'adesione cellulare elettrostatica; utilizzato a 0,1 mg/mL in acqua distillata; volume sufficiente per coprire la superficie del coverslip; incubare 30 min a 25 °C prima del seeding cellulare.
Anticorpo primario, anti-actina (ospite capra)	Santa Cruz Biotechnology	SC-1615	Anticorpo anti-actina; policlonale, non coniugato, rivelato con anticorpo secondario anti-capra. Utilizzato a diluizione lavorativa 1:200.
Anticorpo primario, anti-IFN-β (ospite topo)	Aviva Systems Biology	OAPB00536	Anticorpo anti-IFN-β; policlonale, non coniugato, rivelato con anticorpo secondario anti-topo. Utilizzato a diluizione lavorativa 1:200.
Anticorpo primario, anti-p14ARF (ospite coniglio)	Calbiochem	PC409	Anticorpo anti-p14ARF; policlonale, non coniugato, rivelato con anticorpo secondario anti-coniglio. Questo prodotto è stato dismesso; sarà necessario validare un nuovo anticorpo se si prevede di lavorare su questo target. Utilizzato a diluizione lavorativa 1:200.
Anticorpo secondario, anti-coniglio, coniugato con Alexa Fluor 488	Thermo Fischer Scientific	A32731TR	Anticorpo anti-coniglio coniugato con AF488. Utilizzato a diluizione lavorativa 1:500.
Anticorpo secondario, anti-capra, coniugato con Alexa Fluor 555	Thermo Fischer Scientific	A-21432	Anticorpo anti-capra coniugato con AF555. Utilizzato a diluizione lavorativa 1:500.
Anticorpo secondario, anti-topo, coniugato con Alexa Fluor 647	Thermo Fischer Scientific	A-21235	Anticorpo anti-topo coniugato con AF647. Utilizzato a diluizione lavorativa 1:500.
Soluzione stock di TBS (Tris-buffered saline) 10x	Preparato in sede	—	Per 100 mL: sciogliere 6,06 g di Tris base e 8,77 g di NaCl in 80 mL di acqua distillata; aggiustare il pH a 7,6 con HCl concentrato; portare a volume finale di 100 mL; autoclavare. Diluire 1:10 in acqua distillata per ottenere la soluzione lavorativa (TBS 1x) (finale: Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6); conservare a temperatura ambiente o a 4 °C fino a 3 mesi.
TBST (TBS + 0,05% Tween-20)	Preparato in sede	—	Per 10 mL: 1 mL di soluzione stock TBS 10x + 8,995 mL di acqua distillata + 5 µL di Tween-20 (0,05% v/v); pH 7,6. Tampone di lavaggio tra i passaggi di colorazione; preparare al momento, utilizzare entro ~1 settimana a 4 °C.
Tris Base	Sigma-Aldrich	252859	Agente tampone utilizzato per preparare la soluzione stock di TBS; mantiene la stabilità del pH nel range fisiologico (pH 7,6) per i tamponi di lavaggio e diluizione nell'immunofluorescenza.
Triton X-100 (detergente non ionico etossilato di ottilefenolo)	Sigma-Aldrich	X100	Per 10 mL: 10 µL di Triton X-100 in 9,99 mL di TBS 1x per ottenere TX100 0,1%; 30 µL in 9,97 mL di TBS 1x per ottenere TX100 0,3% (dipendente dal target; i target nucleari richiedono concentrazioni più elevate).
Tripsina-EDTA	Gibco	25200056	Utilizzato per il distacco cellulare.
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416	Utilizzato in TBS come tampone di lavaggio (TBST) e diluente per anticorpi (TBST-BSA 1%).