Screening parallelo in vivo del knockout e attivazione genica nella ghiandola mammaria del topo

Sommario

Questo protocollo descrive un approccio scalabile di screening intraductale CRISPR che consente studi paralleli in vivo di knockout e attivazione genica nella ghiandola mammaria del topo.

Abstract

Gli screening genetici anticipati sono regolarmente impiegati per disturbare migliaia di elementi genetici in modo aggregato con l'obiettivo di produrre mappe su larga scala da genotipo a fenotipo. Sebbene spesso eseguita in sistemi di coltura cellulare, l'accumulo di prove supporta che gli screening in vivo hanno il potere di rivelare nuove biologie che non possono essere ripresentate in vitro. Tuttavia, l'applicazione diffusa di questo approccio è stata limitata da due grandi sfide: un focus predominante sulle perturbazioni della perdita di funzione piuttosto che sull'attivazione genica e i significativi ostacoli tecnici nel fornire biblioteche genetiche complesse a tessuti specifici in vivo. Per superare queste sfide, descriviamo una strategia di iniezione intraductale semplice e versatile che consente uno screening genomico funzionale efficiente e rapido nella ghiandola mammaria del topo, generando decine di migliaia di cloni epiteliali discreti. Inoltre, forniamo tutti i dettagli necessari per la generazione delle librerie, l'iniezione intraductale, la deconvoluzione dello schermo e l'analisi delle librerie CRISPR-Knockout e Activation per schermi in vivo completi. Utilizzando questi strumenti, che abbiamo chiamato CRISPR-KOALA (Knockout and Activation Linked Assay), abbiamo identificato nuovi soppressori tumorali e oncogeni all'interno del genoma codificante e non codificante in librerie aggregate che vanno da 46 loci a un quinto del genoma. È importante sottolineare che questo approccio e analisi possono essere applicati ad altri organi per studiare la funzione biologica di qualsiasi gene durante l'omeostasi o la malattia.

Introduzione

Gli screening genomici funzionali forniscono un potente quadro per esaminare la funzione genica su^{scala 1}. Lo sviluppo delle tecnologie di editing genico CRISPR-Cas ha permesso la perturbazione sistematica di centinaia o migliaia di geni in parallelo, e gli screening aggregati basati su CRISPR nelle linee cellulari di mammiferi sono diventati una pietra angolare della ricerca moderna in biologia^{del cancro 2}. Questi approcci in vitro hanno identificato geni^{essenziali 3}, soppressori^{tumorali 4} e interazioni letali^{sintetiche 5} in diversi contesti oncologici. Tuttavia, una limitazione centrale è l'incapacità di catturare le complesse caratteristiche biologiche dei tumori in vivo, incluse le interazioni con il sistema immunitario e lo stroma, i gradienti di nutrienti e l'architettura tissutale all'interno del^{microambiente 2}. In linea con questa limitazione, studi recenti hanno dimostrato che molti veri geni motori del cancro non esercitano effetti misurabili in vitro, soprattutto quando la loro funzione dipende da segnali microambientali assenti nelle colture^cellulari 6,7,8,9,10.

La ghiandola mammaria del topo fornisce un contesto tissutale particolarmente vantaggioso per lo screening genomico funzionale in vivo. Le cellule epiteliali mammarie sono altamente rigenerative, subiscono cicli di espansione clonale durante i cicli estrali e sono organizzate in una rete dettale ramificata facilmente accessibile e manipolata^{geneticamente} 11,12,13. Queste caratteristiche hanno supportato decenni di analisi genetiche a mosaico ed esperimenti di tracciamento della linea e hanno stabilito la ghiandola mammaria come un sistema trattabile per esaminare la funzione genica intrinseca cellulare e dipendente dal microambiente durante l'omeostasi e la malattia^tissutale 14,15,16,17,18,19,20,21,22^, 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33^. È importante sottolineare che le perturbazioni genetiche possono essere limitate al compartimento epiteliale, consentendo lo studio diretto dei fattori specifici epiteliali di trasformazione, competizione cellulare, fedeltà della linea e progressione tumorale in un contesto di tessuto intatto.

Sebbene siano state sviluppate diverse strategie per trasmettere le perturbazioni genetiche direttamente alla ghiandola mammaria adulta in situ, restano importanti ostacoli tecnici per applicazioni ad alto rendimento. La somministrazione mediata da adenovirus della Cre recombinasi è stata ampiamente utilizzata per indurre la ricombinazione somatica degli alleli condizionati nella ghiandola mammaria^adulta 34,35,36,37, offrendo un mezzo efficiente per manipolare la funzione genica senza la complessa selezione germinale richiesta dai tradizionali modelli murini geneticamente modificati (GEMM). Sebbene l'adenovirus ad alto titolo possa anche fornire componenti CRISPR-Cas9 alle cellule residenti nei tessuti, questi vettori non si integrano nel genoma^ospite 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49 . Questo limita severamente la scala degli screening a ~10–55 geni, poiché ogni sito target del gRNA deve essere sequenziato individualmente utilizzando sonde di inversione^molecolare 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47 . Inoltre, i metodi attuali di somministrazione intraductale consentono un accesso diretto al sistema mammario dottale ma richiedono o un'esposizione chirurgica invasiva della ghiandola mammaria⁵⁰ oppure l'uso di siringhe Hamilton relativamente grandi che sono^{ingombranti 51}. Sebbene efficaci per la consegna localizzata del virus, questi approcci sono relativamente invasivi, tecnicamente impegnativi e non ottimizzati per la consegna scalabile di librerie lentivirali aggregate. Collettivamente, questi studi dimostrano che le perturbazioni virali in situ sono possibili, ma gli strumenti attuali non supportano le perturbazioni stabili, aggregate e recuperabili per la sequenza, necessarie per lo screening CRISPR ad alto rendimento in vivo.

Per affrontare queste limitazioni, noi e altri ci siamo rivolti all'integrazione di vettori lentivirali, che permettono modifiche genetiche stabili ed ereditabili. A differenza dei sistemi di coltura cellulare, i tessuti in vivo impongono rigidi vincoli sul numero di cellule perturbate che possono essere generate all'interno di un singolo organo, rendendo impraticabile lo screening a livello genomico. Di conseguenza, gli schermi CRISPR in vivo richiedono la progettazione di librerie mirate e biologicamente informate che bilancino copertura e fattibilità. Inoltre, la maggior parte degli screening CRISPR in vivo, esaminati qui², si è concentrata quasi esclusivamente sulle perturbazioni della perdita di funzione lentivirale, nonostante le crescenti evidenze che l'attivazione genica possa rivelare intuizioni biologiche complementari e non sovrapposte 52,53,54,55^. Noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato che integrare le perturbazioni lentivirali CRISPR nell'epitelio mammario adulto consente una modifica genetica stabile ed ereditaria in situ e che possono essere recuperate e quantificate dal DNA^{genomico 36,55,56,57,58}. Utilizzando questo approccio, abbiamo effettuato screening CRISPR in vivo aggregati che hanno identificato nuovi fattori della trasformazione^{oncogenica 36,55}, stabilendo sia la fattibilità sia la rilevanza biologica della somministrazione lentivirale e dello screening CRISPR. Tuttavia, questi studi hanno anche evidenziato la necessità di un protocollo semplice, standardizzato e scalabile, che potesse essere ampiamente adottato ed esteso per includere sia modelli di screening di perdita che di guadagno di funzione all'interno della stessa ghiandola.

Qui descriviamo una strategia di iniezione intraductale semplice e versatile che consente lo screening parallelo in vivo delle librerie di knockout e attivazione di CRISPR, denominate CRISPR-KOALA, all'interno della ghiandola mammaria^{adulta del topo 55}. CRISPR-KOALA impiega o un RNA convenzionale 'single-guide' (sg)RNA (sg)RNA da 20-21 bp per le capacità CRISPR-KO, oppure un 'dead-guide' (dg)RNA da 14 bp per CRISPR-A. Il dgRNA guida efficacemente Cas9 verso il sito target ma impedisce l'attività endonucleasi^{di Cas9} 59,60,61, permettendo così l'uso di un singolo topo che esprime Cas9 attivo sia per le modalità knockout che per l'attivazione. L'introduzione di due forcine PP7 nel trcr del dgRNA consente il reclutamento di un transattivatore PP7 Coat Protein:P65:^{HSF1 transattivatore 62} e porta a un'efficace sovraespressione dei geni in vivo⁵⁵ (Figura 1). Combinando la progettazione di librerie di gRNA mirati con la produzione di lentivirali ad alto titolo e la consegna intraductale non chirurgica tramite microcapillari di vetro, questo approccio genera decine di migliaia di cloni epiteliali spazialmente discreti preservando l'architettura tissutale e le interazioni microambientali. È importante sottolineare che l'integrazione lentivirale nel genoma ospite consente il recupero e la quantificazione dei gRNA tramite sequenziamento ad alta produttività, consentendo schermi genomici funzionali in vivo aggregati. Insieme, questo permette perturbazioni parallele o simultanee (nella stessa cellula) CRISPR-KO e CRISPR-A all'interno della stessa ghiandola mammaria di un topo che esprime Cas9.

Presentiamo un protocollo dettagliato passo dopo passo che comprende la progettazione delle librerie gRNA, la produzione e concentrazione lentivirale, la somministrazione intraductale, la deconvoluzione delle librerie e l'analisi dei dati (Figura 1). Insieme, questo metodo fornisce un quadro pratico e scalabile per lo screening in vivo di knockout e/o attivazione CRISPR nella ghiandola mammaria del topo e può essere adattato per studiare la funzione genica durante l'omeostasi tissutale, diversi contesti di malattia, altri tessuti e altre specie come il ratto.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida del Canadian Council on Animal Care e sono state approvate dal Comitato per la Cura degli Animali del Centre for Phenogenomics (protocollo 26-0272H).

1. Clonazione della libreria CRISPR

NOTA: Questa sezione descrive il clonaggio aggregato delle librerie di knockout e attivazione CRISPR da oligonucleotidi sintetizzati in array nelle spine dorsali lentivirali. Generiamo regolarmente librerie contenenti fino a 4.000 gRNA, che possono essere schermate a una copertura 400X-1.000X su 8-20 topi. Il numero di gRNA e la copertura possono essere regolati secondo necessità, il che influenzerà il numero di topi necessari per mantenere la potenza statistica. Raccomandiamo di mantenere una copertura minima di 400X, sufficiente per fenotipi di guadagno di funzione forti.

1. Progettazione delle librerie di RNA guida
   1. Compilare una lista di tutti i geni del topo da esaminare all'interno di un singolo esperimento per la progettazione di librerie CRISPR a valle, mantenendo liste di obiettivi separate per le librerie CRISPR knockout (CRISPR-KO) e attivazione CRISPR (CRISPR-A).
      NOTA: le librerie CRISPR-KO e CRISPR-A sono generate separatamente e possono essere combinate nella fase di trasduzione lentivirale per uno screening simultaneo.
   2. Per le librerie CRISPR-KO, seleziona da quattro a cinque RNA guida singoli (sgRNA) per gene utilizzando algoritmi di previsione ad alto punteggio come CRISPick^62,63, CHOPCHOP⁶⁴ o VBC Score⁶⁵.
      NOTA: Il punteggio VBC garantisce un'efficacia molto elevata e un'attività nel bersaglio⁶⁶. Indipendentemente dallo strumento, dare priorità alle guide con alta attività prevista sul bersaglio, potenziale off-target minimo e esoni codificati per il targeting.
   3. Per le librerie CRISPR-A, seleziona otto-dieci guide per gene usando CRISPick^62,63 o CHOPCHOP⁶⁴. Per gli strumenti che permettono lunghezze di guida specifiche dall'utente (come CHOPCHOP), imposta la lunghezza della guida a 14 bp prima della generazione. Se si utilizza uno strumento che genera solo guide da 20 bp, si convertono queste sequenze in RNA dead-guide (dgRNA) mantenendo la sequenza a 14 bp immediatamente a 5' del motivo adiacente al protospaziale, che colpisce le regioni promotrici dei geni.
      NOTA: i dgRNA sono sequenze guida troncate progettate per consentire l'attivazione trascrizionale basata su CRISPR a circa il 50-85% dell'efficacia degli sgRNA di lunghezza^{intera 55} senza indurre la scissione del DNA 59,60,61.
   4. Mettere in comune tutti gli sgRNA o dgRNA corrispondenti a un singolo esperimento in liste separate per consentire clonaggio uniforme, produzione virale e screening in vivo .
      NOTA: sgRNA e dgRNA da screening insieme saranno aggregati dopo la produzione virale.
   5. Generare librerie di controllo negativi aggregate per gli screening CRISPR-KO e CRISPR-A, inclusi sequenze di gRNA non targeting^55,67 e non geniche⁶⁸, come descritto in precedenza, per controllare gli effetti di fondo indipendenti da disturbo o attivazione genica.
      NOTA: Se desiderato, si possono creare librerie separate di gRNA non target e non genici per creare due librerie indipendenti di controllo negativo.
2. Progettazione e amplificazione della piscina di oligonucleotidi
   1. Progettare oligonucleotidi aggregati in modo che ogni gRNA contenga la sequenza di targeting, sporgenze enzimatiche di restrizione compatibili con la spina dorsale lentivirale di destinazione e sequenze di primer specifiche per la libreria per consentire un'amplificazione selettiva da un complesso pool oligonucleotidico (Figura 1, Tabella 1).
   2. Assegnare una coppia di primer unica a ogni libreria di gRNA per consentire l'amplificazione indipendente delle singole librerie da un pool condiviso di oligonucleotidi. Le coppie di primer uniche sono elencate nella Tabella 1.
   3. Ordinare librerie di oligonucleotidi aggregate da una piattaforma commerciale di sintesi di array, garantendo una rappresentazione equimolare di tutti i gRNA all'interno di ogni pool.
   4. Amplificare le singole librerie di gRNA dal modello aggregato di oligonucleotidi utilizzando primer specifici per la libreria nella miscela di reazione successiva. La reazione può essere modificata per aderire alla composizione raccomandata dalla polimerasi specifica. Preparare tre reazioni con un modello di oligonucleotidi aggregati e una reazione di controllo negativa senza modello.
      Modello di oligonucleotidi pooled da 4 ng
      2,5 μL 10 μM Primer specifico per la libreria in avanti
      2,5 μL 10 μM Primer inverso specifico per libreria
      10 μL 5x Buffer di reazione
      0,5 μL DNA polimerasi ad alta fedeltà
      X μL Acqua priva di nucleasi
      50 μL Volume totale
   5. Eseguire l'amplificazione PCR utilizzando le seguenti condizioni di ciclaggio, regolando la temperatura di ricottura in base alla temperatura di fusione del primer specifica della libreria:
      1 ciclo a 98 °C per 30 secondi
      18 cicli a 98 °C per 10 secondi, 62–65 °C per 20 secondi e 72 °C per 3 secondi
      1 ciclo a 72 °C per 5 minuti
      NOTA: Non superare i 18–19 cicli di amplificazione per preservare una rappresentazione uguale del gRNA all'interno della libreria.
   6. Risolvere i prodotti PCR su un gel di agarosio al 2,5% a 120 V per circa 45 minuti e eliminare la banda corrispondente alla dimensione attesa dell'inserto gRNA (circa 100 bp, a seconda del design del primer; Figura 2A).
   7. Purificare i prodotti PCR utilizzando un kit di estrazione gel e eluire 20 μL di acqua ultrapura durante la fase finale di eluzione.
      NOTA: (punto di pausa) Gli inserti di gRNA purificati possono essere conservati a -20 °C prima della clonazione.
3. Preparazione e digestione delle spine dorsale lentivirali
   1. Prepara plasmidi lentivirali contenenti una sequenza di stuffer rimovibile per clonare gli inserti di gRNA. Per le librerie in vivo CRISPR-KO e CRISPR-A si usano rispettivamente pLKO-Cre (Plasmide Addgene #158032 o 256774) e pXPR502-PPH-Cre (Plasmide Addgene #256776).
   2. Digerire 5–10 μg di DNA lentivirale della spina dorsale in un volume totale di reazione di 200 μL utilizzando l'enzima di restrizione e il tampone appropriati. Usa Esp3I per la dorsale pLKO-Cre CRISPR-KO e SapI per la dorsale pXPR502-PPH-Cre CRISPR-A.
      Plasmide della spina dorsale da 5–10 μg
      Tampone enzimatico 20 μL 10x
      Enzima di restrizione a 5 μL
      X μL Acqua priva di nucleasi
      200 μL Volume totale
   3. Incubare le reazioni digerenti per 2–3 ore a 37 °C.
   4. Aggiungere 2 μL di fosfatasi alcalina ricombinante ad ogni reazione digestionale e incubare per 1 ora a 37 °C per defosforilare la spina dorsale digerita.
   5. Risolvere i prodotti digeriti su un gel di agarosio all'1% e eliminare la banda corrispondente alla spina dorsale linearizzata (Figura 2B,C)
      NOTA: Per entrambe le spine dorsale, il frammento di imboccatura è visibile come una banda distinta a circa 2000-2500 bp, a seconda del vettore.
   6. Purificare il DNA della colonna vertebrale espulso utilizzando un kit di estrazione gel ed eluire in un volume minimo di acqua ultrapura per mantenere un'alta concentrazione di DNA (tipicamente 20 μL).
      NOTA: (PUNTO DI PAUSA) Le spine dorsale digerite purificate possono essere conservate a -20 °C prima della ligatura.
4. Digestione e legatura delle librerie di gRNA
   1. Impostare reazioni digestionali-legatura all-in-one utilizzando 750 ng di DNA dorsale lentivirale purificato, 43 ng di DNA inserito nella libreria gRNA, 3 μL di enzima di restrizione, 7,5 μL di legasi di DNA T4, 15 μL di 10 mM ATP e la quantità appropriata di tampone di reazione e acqua distillata sterile per raggiungere un volume totale di reazione di 150 μL.
      NOTA: Utilizzare lo stesso enzima di restrizione che è stato inizialmente usato nella fase di digestione della colonna dorsale plasmide. Un rapporto di 750 ng di dorsale lentivirale purificata per 43 ng di DNA inserito della libreria fornisce un rapporto molare vettore-inserto approssimativo di 1:7 quando si utilizzano le spine dorsale raccomandate.
   2. Dividere ogni miscela di ligatura in tre aliquote uguali per aumentare l'efficienza della trasformazione e la complessità della libreria.
   3. Preparare una singola reazione di controllo negativa contenente DNA dorsale ma senza inserti di gRNA per valutare la legatura di fondo.
   4. Incubare le reazioni di digestione-legatura durante la notte a 30 °C.
   5. La mattina seguente, aggiungere 1 μL dell'enzima di restrizione appropriato a ciascuna aliquota di reazione e incubare per 1 ora a 37 °C per completare la digestione della colonna dorsale.
   6. Aggiungere 2 μL di 10 mM di ATP e 2 μL di legasi di DNA T4 a ogni reazione e incubare a 25 °C per 2–3 ore per completare la legatura.
   7. Raccogliere le tre singole reazioni di legazione digestionale per ogni libreria, purificare le reazioni utilizzando un metodo di pulizia degli oligonucleotidi a colonna ed eludere ciascuna in 21 μL di acqua distillata ultrapura sterile. Elute la singola reazione di controllo negativo purificata in 7 μL di acqua distillata sterile ultrapura.
      NOTA: Non eluire prodotti di legatura in tamponi contenenti sale o EDTA, poiché questi riducono significativamente l'efficienza dell'elettroporazione batterica. (PUNTO DI PAUSA) I prodotti a legatura purificati possono essere conservati a -20 °C prima dell'elettroporazione.
5. Elettroporazione e espansione della libreria
   1. Pre-raffreddare cuvette di elettroporazione da 0,1 cm, tubi microcentrifughe contenenti 2 μL aliquote di prodotti di legatura purificati e tubi di coltura di polipropilene a fondo arrotondato da 14 mL su ghiaccio per almeno 20 minuti prima dell'elettroporazione.
   2. Scongelare le cellule batteriche elettrocompetenti sul ghiaccio e mescolare delicatamente 25 μL di cellule con 2 μL di prodotto di legatura purificato nel tubo della microcentrifuga pre-raffreddato tramite pipetta.
   3. Trasferire la miscela cellula-DNA in una cuvetta di elettroporazione pre-raffreddata da 0,1 cm ed elettroporare a 1,8 kV, 25 μF e 200–600 Ω.
      NOTA: Un'elettroporazione di successo produce tipicamente una costante di tempo compresa tra 4,6 ms e 4,9 ms.
   4. Aggiungere immediatamente 1 mL di mezzo di recupero preriscaldato a 37 °C fornito con le celle elettrocompetenti alla cuvetta, risospendere delicatamente le celle e trasferire la sospensione su un tubo di polipropilene a fondo rotondo da 14 mL.
   5. Incubare le cellule recuperate a 30 °C mentre si agita a 180 giri/min per 90 minuti.
   6. La lastra 10 μL delle cellule recuperate diluita in 90 μL di brodo LB su piastre LB-agar contenenti ampicillina e incubata durante la notte a 30 °C per valutare l'efficienza della trasformazione e la legatura di fondo.
      NOTA: Un clonaggio riuscito dovrebbe portare a centinaia di colonie sulla piastra con inserto e poche (> 30) colonie sulla piastra di controllo negativa solo sulla spina dorsale (Figura 3).
   7. Valida ulteriormente la libreria scegliendo ~10 colonie per miniprep e sequenziamento Sanger in avanti dal promotore U6. Le librerie clonate con successo avranno < 90% dei miniprep che contengono un sequenziamento chiaro di un gRNA, senza guide ripetute nei 10 miniprep. Inoltre, l'enzima di restrizione digerisce i miniprep e la libreria di plasmidi aggregati (passo 1.5.10) e viene eseguito su un gel di agarosio per controllare le dimensioni delle bande e assicurarsi che i costrutti lentivirali non abbiano subito ricombinazioni aberranti.
      NOTA: La rappresentazione della libreria può essere valutata confrontando il conteggio delle colonie dalle piastre di diluizione con il numero totale di gRNA nella libreria, puntando a una copertura di 1.000 volte. Possono essere utilizzate più diluizioni seriali per facilitare questo calcolo.
   8. Se l'efficienza della trasformazione è sufficiente, si placca le cellule rimanenti su piastre LB-agar da 15 cm contenenti l'antibiotico appropriato e si incuba durante la notte a 30 °C per generare un prato denso di colonie.
      NOTA: Placcare 100 μL di cellule recuperate su ciascuna delle dieci piastre agar da 15 cm LB per recuperare abbastanza colonie.
   9. Il giorno seguente, si utilizza un raschiatore cellulare per raschiare le colonie batteriche in 500 mL di brodo LB con ampicillina per generare una singola coltura batterica che rappresenta la libreria di gRNA clonata.
   10. Espandi la coltura batterica raccolta a 30 °C con agitazione per circa 3 ore e isola il DNA plasmidico usando un kit maxiprep.

2. Produzione di lentivirali per lo screening in vivo

NOTA: Per la nascita intraduttale e lo screening aggregato in vivo , le preparazioni lentivirali devono essere concentrate per ottenere titoli elevati (idealmente tra 1 x 10^{da 8} pfu/mL e 1 x 10^{da 9} pfu/mL) per garantire una trasduzione efficiente delle cellule epiteliali mammarie. Il seguente protocollo descrive la produzione di lentivirali ad alto titolo ottimizzata per l'uso in vivo .

1. Preparazione delle cellule produttrici di lentivirali
   1. Mantenere HEK293TN cellule nel mezzo Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco, integrate con siero bovino fetale al 10%, 1% Penicillina-Strepmicicina, e coltivare cellule a 37 °C con 5% di_CO2.
   2. Le cellule del passaggio ogni 2–3 giorni per mantenere la crescita logaritmica e garantire che le cellule non superino il 90% di confluenza. Usa cellule nei passaggi <20 per una produzione virale ottimale.
   3. Un giorno prima della trasfezione, ricoprire le piastre di coltura tissutale da 15 cm con poli-L-lisina (0,02 mg/mL) per 1 ora a temperatura ambiente. Prepara nove piatti per un lotto di preparazione virale.
   4. Rimuovere la soluzione di poli-L-lisina e lavare due piastre con soluzione salina tamponata con fosfato.
   5. Seminare 1,1 x 10⁷ HEK293TN cellule su ciascuna delle nove piastre di coltura tissutale da 15 cm rivestite di poli-L-lisina, assicurando che le cellule raggiungano una confluenza di ~90% al momento della trasfezione.
      NOTA: Per applicazioni che non richiedono titoli virali massimi, la produzione lentivirale può essere ridotta a meno placche (ad esempio, tre o sei) con rese proporzionalmente ridotte. Ridimensiona i reagenti (DNA plasmidico, PEI e DMEM) per la trasfezione di conseguenza.
2. Trasfezione lentivirale a base PEI
   1. Preparare DNA plasmidico per la produzione lentivirale utilizzando un sistema a tre plasmidi composto da 95 μg del plasmide della libreria gRNA, 95 μg del plasmide di imballaggio psPAX2 (Addgene Plasmid #12260) e 65 μg del plasmide dell'involucro VSV-G pMD2.G (Addgene Plasmid #12259).
   2. Combina i tre plasmidi per la produzione lentivirale in 10,8 mL di DMEM senza siero e mescola accuratamente vorticando per circa 10 secondi.
   3. Aggiungere 366 μL di 1 mg/mL di polietilenimina (PEI) goccia a goccia alla soluzione diluita di DNA, mescolare accuratamente vorticando per circa 10 secondi e incubare i complessi DNA-PEI a temperatura ambiente per 10–30 minuti.
   4. Durante la formazione del complesso, aspirare il mezzo di coltura dalle piastre HEK293TN e aggiungere 14 mL di DMEM senza siero.
      NOTA: Il siero bovino fetale può inibire l'assorbimento dei plasmidi da parte delle cellule.
   5. Distribuire 1,2 mL del complesso DNA-PEI a goccia in tutta la placca e rocciare per garantire una distribuzione uniforme.
   6. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di_CO2 per 6–8 ore.
   7. Sostituire il mezzo su ciascuna piastra con 20 mL di DMEM preriscaldato integrato con siero bovino fetale al 10% (senza 1% di Penicillina-Streptomicina) e continuare a coltivare le cellule a 37 °C con il 5% di_CO2.
      NOTA: La trasfezione notturna non è raccomandata, poiché l'esposizione prolungata al PEI e la mancanza di siero riducono la resa virale.
3. Raccolta virale e ultracentrifugazione
   1. Preparare 200 mL di soluzione a cuscinetto di saccarosio combinando 40 g di saccarosio, 11,7 g di cloruro di sodio, 4 mL di 1 M HEPES (pH 7,4) e 1 mL di 0,5 M EDTA (pH 7,9) in un volume appropriato di acqua distillata sterile e filtrare tramite un'unità di filtrazione polieterosolfonica a bassa legame proteica di 0,45 μm. Questa soluzione può essere conservata a 4 °C per diversi mesi.
   2. Raccogliere il supernatato lentivirale 48–72 ore dopo la trasfezione.
   3. Passare 10 mL di DMEM integrati con siero bovino fetale al 10% tramite l'unità di filtrazione polieterosulfone a bassa lezione proteica da 0,45 μm. Scartare il flusso attraverso. Carica il soprandanante sul filtro e applica il vuoto.
      NOTA: Se la concentrazione non può essere effettuata immediatamente, conservare il soprandanante virale chiarificato a 4 °C durante la notte.
   4. Aggiungi 30 mL di soprantantante virale chiarificato a un tubo ultracentrifuga.
   5. Sottopoggia lentamente il soprandanante virale chiarificato con 4 mL di soluzione di cuscino di saccarosio.
   6. Posiziona il tubo dell'ultracentrifuga in un adattatore compatibile per un rotore oscillante del secchio e bilancia con precisione i tubi.
   7. Centrifugare i tubi a 104.000 × g per almeno 2 ore a 4 °C.
      NOTA: Un rotore oscillante del secchio, come il rotore Beckman JS24.38, è necessario per far penetrare correttamente il virus attraverso il cuscino di saccarosio.
   8. Esalta con cura il soprantantante senza disturbare la pallina virale, che potrebbe apparire come un tenue film bianco o traslucido sul fondo del tubo.
   9. Lascia asciugare i tubi all'aria per almeno 10 minuti e usa una salvietta da laboratorio per rimuovere quanta più liquidità residua possibile dall'interno del tubo senza disturbare il pellet.
      NOTA: L'essiccazione corretta del tubo è fondamentale per raggiungere alte concentrazioni virali, poiché riduce il volume finale di recupero.
   10. Risospensi i pellet virali in 20 μL di soluzione salina tamponata a freddo fosfato e pipetta con cura su e giù, assicurandoti di evitare bolle d'aria.
   11. Incubare i tubi sul ghiaccio per 2 ore con una delicata agitazione per risospendere completamente i pellet virali.
   12. Trasferire il virus concentrato in un tubo pulito di microfuge e chiarire la soluzione centrifugando a 2.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
       NOTA: Questa centrifuga rimuove detriti e particelle residue che ostruiscono l'ago dell'iniezione durante l'intervento.
   13. Aliquota il virus concentrato in volumi monouso per evitare ripetuti congelamenti e conservazione a -80 °C.
4. Titolazione lentivvirale utilizzando LSL-tdTomato mouse embryonic fibroblasts (MEF)
   1. Impallina 100.000 MEF LSL-tdTomato (derivati da Rosa-LSL-tdTomato [JAX# 007909]) in una piastra a 6 pozzetti un giorno prima dell'infezione in DMEM, integrati con siero bovino fetale al 10%, 1% Penicillina-Streptomycin, e coltura le cellule a 37 °C con il 5% di CO₂. Impietta un pozzo extra per il conteggio delle cellule.
      NOTA: LSL-tdTomato MEFs fungono da segnalatori per Cre all'interno del lentivirus. Può essere utilizzato qualsiasi sistema di segnalazione adatto per la titolazione virale di altre spine dorsale.
   2. Il giorno seguente, contare il numero di MEF LSL-tdTomato da un pozzo aggiuntivo per quantificare il numero di cellule presenti al momento dell'infezione.
   3. Preparare diluizioni seriali di lentivirus concentrato che codifica Cre recombinasi in un totale di 2 mL del mezzo Eagle modificato di Dulbecco, integrato con siero bovino fetale al 10%. Generalmente, 0,4 μL, 0,1 μL e 0,025 μL di virus concentrato forniscono un intervallo lineare dinamico pulito (Figura 4A–D).
   4. Aggiungi 2 mL di diluizioni virali a ogni pozzo di LSL-tdTomato MEF e aggiungi 2 μL di polibrene da 10 mg/mL a ciascuno.
   5. Infettare i MEF girando a 400 × g per 90 minuti a 37 °C.
   6. Sostituire il substrato virale con 2 mL di DMEM integrati con siero bovino fetale al 10%, 1% Penicillina-Streptomicina, e coltivare le cellule a 37 °C con 5% di CO₂ per 48–72 ore.
   7. Quantificare le cellule td-Tomato-positive tramite microscopia a fluorescenza o citometria a flusso per determinare la frazione di cellule infette ad ogni diluizione.
   8. Calcola il titolo funzionale in base alla frazione di cellule infette e al numero di cellule presenti al momento dell'infezione.
      NOTA: i virus CRISPR-KO e CRISPR-A vengono prodotti, concentrati e titolati separatamente. I titoli funzionali determinati utilizzando i MEF LSL-tdTomato vengono utilizzati per mescolare i virus CRISPR-KO e CRISPR-A in un rapporto definito prima dell'iniezione intraductale.
5. Valutazione della qualità delle librerie di plasmidi e lentivirus
   1. Per accertare che le librerie di gRNA siano clonate con sufficiente profondità/copertura e che tutti i gRNA siano mantenuti durante la clonazione e la produzione del virus, è fortemente raccomandato sequenziare sia il pool di plasmidi sia i MEF trasdotti.
   2. Per valutare la copertura lentivirale, si trasfettano i MEF con lentivirus a >1000× copertura basata sul titolo virale calcolato. Non è necessario garantire un'infezione singola delle cellule durante questa fase.
   3. Dopo 48–72 ore, si staccano le cellule usando tripsina o un raschiatore cellulare e si granulano le cellule. Estrai il DNA usando un kit commerciale di estrazione gDNA.
   4. Sequenzia 1 μg di plasmide e 3 μg di DNA MEF estratto utilizzando il protocollo descritto nella Sezione 5. Un sequenziamento profondo di 5 milioni di letture è sufficiente per la maggior parte delle librerie personalizzate con <5000 gRNA.
      NOTA: Una forte correlazione (R²> 0,6) tra le letture del pool di plasmidi e una rappresentazione relativamente equa delle guide (>70% delle guide entro 1 log-decade) senza una guida individuale che domini i conteggi delle librerie indica buona qualità (Figura 4E).

3. Iniezione lentivirale intraductale nella ghiandola mammaria del topo

1. Diluizione di ago e virus
   1. Estrai i microcapillari di vetro utilizzando un estratore di micropipette per generare capillari a punta fine adatti all'iniezione intraductale di volumi da 9–10 μL. Usa un paio di pinze fini per staccare la punta dell'ago.
      NOTA: La posizione ottimale crea una dimensione dell'ago abbastanza grande da essere caricata con liquido ma abbastanza sottile da entrare facilmente nell'apertura del capezzolo.
   2. Diluire le preparazioni lentivirali a una concentrazione finale di 1 × 10⁷ pfu/mL in soluzione salina sterile tamponata con fosfato e integrata con colorante Fast Green FCF allo 0,05% (w/v).
   3. Se si mescolano virus CRISPR-KO e CRISPR-A per schermarli all'interno dello stesso pool complesso, si regolano le due librerie a un titolo virale uguale con soluzione salina sterile tamponata con fosfato e si mescolano in un rapporto che garantisca una rappresentazione uguale dei gRNA tra entrambe le librerie.
2. Preparazione dei topi per l'iniezione intradutale
   1. Anestesiare una femmina adulta di topo (8–20 settimane di età) con un contenuto di isoflurano al 4% con 1 L/min di ossigeno e applicare un lubrificante oftalmico sterile su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza corneale durante la procedura.
      NOTA: L'iniezione intraductale è una procedura non invasiva e non richiede analgesia. Usa topi Rosa26-LSL-Cas9, H11-Cas9 o Rosa-LSL-tdTomato per questi esperimenti.
   2. Fissa il topo in posizione supina su una borsa termica coperta impostata su basso per mantenere la temperatura corporea e mantieni l'anestesia usando isoflurano al 2% con 1 L/min di ossigeno tramite naso durante tutta la procedura.
   3. Rimuovere il pelo intorno al terzo capezzolo toracico e al quarto addominale utilizzando una crema depilatoria applicata con un cotton fioc sterile in un'area circolare di circa 0,5 cm di raggio per 10–15 secondi. Rimuovere immediatamente la crema con garze sterili e acqua sterile per prevenire irritazioni cutanee.
      NOTA: La terza e la quarta ghiandole mammaria sono di solito le più facili da iniettare. In alternativa, la seconda e la quinta ghiandola possono essere preparate per l'iniezione allo stesso modo.
   4. Disinfettare la pelle circostante ogni capezzolo tramite tamponi sequenziali con alcol isopropilico al 70% e iodio utilizzando garze sterili.
   5. Posizionare il topo sotto un microscopio dissezionale all'interno di un armadietto di biosicurezza per permettere una chiara visualizzazione dei capezzoli.
   6. Utilizzando pinze fini pulite con etanolo al 70%, rimuovi delicatamente la pelle morta che ricopre il capezzolo per esporre l'apertura duttale.
      NOTA: Questo strato cheratinizzato morto è attaccato in modo debolmente e può ostacolare l'ingresso dell'ago. La rimozione non dovrebbe danneggiare la pelle vivace o i tessuti sottostanti.
3. Iniezione intraductale
   1. Carica 8 μL del virus diluito in un microcapillare di vetro estratto.
   2. Tieni la zona del capezzolo con un paio di pinze sottili e inserisci delicatamente la punta dell'ago nell'apertura del capezzolo (Figura 5A). Un ago posizionato correttamente entrerà nel condotto con una resistenza minima. Erogare lentamente la sospensione virale nel dotto mammario nell'arco di 5–10 secondi.
      NOTA: 8 μL di un lentivirus da 1 × 10^pfu/mL produrranno circa il 30% di infettività delle cellule epiteliali mammarie luminali e il 5% di infezionalità delle cellule epiteliali mamare basali, con infezione trascurabile (< 0,5%) dello^{stroma 36}. Il titolo virale può essere regolato per ottenere un'infettività più alta o più bassa.
   3. Monitorare la diffusione del colorante Fast Green durante l'iniezione tramite il microscopio dissezionale. Confermare la consegna intraductale di successo osservando la dispersione del colorante in tutta la rete canale sotto la pelle (Figura 5B).
   4. Identificare le iniezioni fallite accumulando il colorante all'interno del cuscinetto adiposo mammario adiacente al capezzolo piuttosto che lungo l'albero ductale (Figura 5C).
   5. Ripetere la procedura di iniezione per la terza ghiandola mammaria toracica e la quarta addominale su entrambi i lati, iniettando un totale di quattro ghiandole per topo.
      NOTA: Con l'esperienza, il rilascio intraductale riuscito si ottiene nel >95% delle iniezioni. Le iniezioni fallite confinate al cuscinetto adiposo non sono associate a effetti avversi e le restanti ghiandole possono comunque essere utilizzate. Ulteriori validazioni delle iniezioni possono essere effettuate tramite immunoistochimica e citometria di flusso (Figura 5D,E).
   6. Interrompi l'anestesia e trasferisci il topo in una gabbia di recupero pulita.
   7. Monitorare il topo finché non è completamente deambulante e riportarlo nell'alloggio di biosicurezza designato una volta osservato il comportamento normale.
   8. Tre giorni dopo l'iniezione, effettua un cambio completo della gabbia, eliminando qualsiasi alloggio e biancheria come rifiuti virali, e trasferisci il topo in una gabbia pulita che può essere riportata alla custodia standard.

4. Isolamento del DNA genomico da ghiandole mammarie e tumori

NOTA: Eutanasiare i topi_{tramite esposizione} al CO 2 o overdose di anestetici seguita da una lussazione cervicale, in conformità con le linee guida per la cura degli animali. Prelevare ghiandole mammarie o tumori mammari nei momenti desiderati o al punto finale umano secondo le linee guida normative. Le cellule infette sono state prelevate già 48 ore dopo l'infezione^{lentivirale 36,55} o fino a 5+ mesi dall'iniezione in topi^{wildtype 36}, o >24 mesi in sfondo oncogenico⁵⁵. I seguenti passaggi dovrebbero essere eseguiti in uno spazio pulito con DNA Erase e con apparecchiature prive di plasmidi contenenti cassette sgRNA/dgRNA. Anche tracce di DNA plasmidico sono sufficienti a contaminare campioni di tessuto, e devono essere eseguiti successivamente sequenziamenti profondi e controlli negativi (senza tessuto) per garantire preparazioni pulite.

1. Dissociazione tissutale
   1. Per le ghiandole mammarie, digerire ogni ghiandola mammaria in 2 mL di mezzo completo Epicult-B (Topo) integrato con 0,2 mL di collagenasi/ialuronidasi delicate in un tubo conico da 15 mL e incubare durante la notte a 37 °C.
   2. Il pellet ha dissociato le cellule a 450 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   3. Trasferire con cura lo strato grasso superiore utilizzando una punta di pipetta sieroica rivestita di albumina bovina su un nuovo tubo conico da 15 mL e scartare il soprandanante residuo.
      NOTA: Lo strato grasso superiore in questa fase spesso contiene organoidi epiteliali residui che non sono stati separati e rimangono associati al tessuto adiposo. Elaborare questa frazione in un tubo separato aumenta notevolmente il recupero delle cellule epiteliali.
   4. Lavare sia la frazione grassa che il pellet cellulare una volta con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato, centrifugare a 450 × g per 5 minuti a temperatura ambiente e eliminare i soprantativi.
   5. Combinare la frazione grassa lavata e il pellet cellulare della stessa ghiandola mammaria in un unico tubo conico da 15 mL contenente 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato.
   6. Spargere il materiale combinato a 450 × g per 5 minuti e scartare il soprantantante.
   7. Per i tumori mammari, tritate il tessuto in piccoli pezzi usando forbici sterili o bisturi e trasferitevi direttamente in un tubo microfuge da 2 mL.
2. Isolamento del DNA genomico
   NOTA: L'estrazione del DNA genomico può essere effettuata utilizzando il kit Qiagen DNEasy Blood and Tissue seguendo le istruzioni del produttore o utilizzando il seguente protocollo fenol-cloroformico.
   1. Prepara il tampone di lisi del DNA combinando 5 mL di 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 mL di EDTA (pH 8,0), 25 mL di 5 M NaCl e 50 mL di SDS al 10%, portando il volume finale a 500 mL con acqua distillata sterile.
   2. Aggiungi 1 mL di tampone per la lisi del DNA e 10 μL di proteinasi K (20 mg/mL) a ogni campione e mescola accuratamente per inversione.
   3. Incubare i campioni a 56 °C durante la notte per consentire una lisi completa.
   4. La centrifuga si lisa a 16.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente per pelletare detriti insolubili.
   5. Trasferire il sovrandanzato chiarificato in un nuovo tubo microcentrifuga da 2 mL.
      ATTENZIONE: Fenolo:cloroformio:isoamilico alcol è tossico e corrosivo. Esegui tutti i passaggi che coinvolgono solventi organici in una cappa chimica indossando l'attrezzatura di protezione individuale appropriata.
   6. Aggiungi un volume uguale di fenolo:cloroformio:isoamil alcol e mescola vigorosamente vorticando per circa 15 secondi fino a formare una miscela omogenea.
   7. Centrifugare a 16.000 × g per 10 minuti a 4 °C per separare le fasi organica e inorganica.
   8. Trasferire con attenzione la fase acquosa superiore in un nuovo tubo senza disturbare l'interfase.
      NOTA: Evitare di aspirare materiale dall'interfase bianca per minimizzare la contaminazione da proteine e RNA.
   9. Aggiungere 0,7 volumi di isopropanolo alla fase acquosa recuperata e mescolare vigorosamente vorticando per circa 15 secondi.
   10. Centrifugare a 16.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
   11. Scartare con cura il soprantantante e risciacquare la pellet di DNA con 500 μL di etanolo al 70%.
   12. Centrifugare a 16.000 × g per 10 minuti a 4 °C e rimuovere completamente l'etanolo.
   13. Asciuga la pellet di DNA all'aria a temperatura ambiente per 10 minuti.
   14. Risospendere la pellet di DNA in 50 μL di acqua distillata sterile.
   15. Incubare i campioni a 37 °C per 1 ora o a 4 °C durante la notte per facilitare la completa risospensione del DNA genomico.
   16. Misurare la concentrazione e la purezza del DNA tramite nanodrop o quantificazione fluorometrica.

5. Sequenziamento di nuova generazione delle librerie CRISPR

NOTA: Genera un campione di riferimento per consentire il calcolo delle variazioni del piegamento del gRNA nel tempo. I MEF trasdotti (Sezione 2) o le ghiandole mammarie (Sezione 4) prelevate 3 giorni dopo l'infezione, così come il plasmide originale maxiprep, possono essere utilizzati per determinare la rappresentazione della guida nella libreria iniziale e nello stock virale.

1. Amplificazione PCR di cassette gRNA da DNA genomico
   1. Utilizzare coppie di primer elencate nella Tabella 2 per indicizzare in modo unico i campioni, consentendo il multiplexing e la demultiplexing di fino a 306 campioni dopo il sequenziamento.
   2. Prepara le reazioni PCR utilizzando 1 μg di DNA genomico come modello in un volume totale di reazione di 50 μL contenente 25 μL di 2x Master Mix Q5, 2,5 μL di primer frontale da 10 μM e 2,5 μL di primer inverso da 10 μM.
   3. Includere una reazione di controllo senza modello in parallelo per monitorare eventuali contaminazioni.
   4. Eseguire l'amplificazione PCR utilizzando le seguenti condizioni di ciclaggio, regolando la temperatura di ricottura in base alla temperatura di fusione del primer specifica della libreria:
      1 ciclo a 98 °C per 30 secondi
      5 cicli a 98 °C per 10 secondi, 68 °C (-1 °C/ciclo) per 10 secondi e 72 °C per 15 secondi
      20 cicli a 98 °C per 10 secondi, 63 °C per 30 secondi e 72 °C per 15 secondi
      1 ciclo a 72 °C per 2 minuti
   5. Resolve i prodotti PCR su un gel di agarosio al 2,5% per verificare la dimensione corretta dell'amplicon.
   6. Confermare la presenza di bande a circa 306 pb per le librerie sgRNA basate su pLKO e a 430 bp per le librerie dgRNA basate su pXPR502 (Figura 6).
      NOTA: Un chiaro controllo senza modello garantisce la purezza dei reagenti e conferma che il test è privo di contaminazione incrociata.
   7. Purificare i prodotti PCR utilizzando un metodo adeguato di purificazione del DNA e quantificare la concentrazione di DNA tramite la quantificazione fluorometrica.
2. Sequenziamento di nuova generazione
   1. Determinare la profondità di sequenziamento richiesta in base alla complessità attesa della libreria e alla clonalità del campione.
      NOTA: Per i tumori sospettati di essere clonali, circa 1 milione di letture per campione sono sufficienti per quantificare con precisione la rappresentazione delle guide. Per calcolare la profondità di sequenziamento dalle ghiandole mammarie, moltiplica il numero di guide nella biblioteca per la copertura di 1.000 volte, poi moltiplica per 6 pg di DNA/cellula genomica per calcolare la massa totale di DNA genomico per campione che dovrebbe essere amplificato per PCR. Il numero totale di letture richieste per il sequenziamento è uguale al numero di guide nella libreria moltilate per 1.000.
   2. Raccogli librerie purificate da diversi campioni a concentrazioni equimolari.
   3. Librerie di sequence pooled utilizzando una piattaforma di sequenziamento Illumina a lettura breve.
3. Analisi dei dati
   1. Demultiplex file FASTQ raw sequenziando utilizzando indici specifici per campione.
   2. Trim legge la sequenza del protospaziatore gRNA usando Trimmomatic⁶⁹. Per i campioni CRISPR-A, le letture di trim a 14 bp, e per CRISPR-KO, le letture di trim a 20 bp dalla fine dell'innesco anteriore.
   3. Allinea le letture tagliate alla corrispondente libreria di riferimento gRNA usando Bowtie⁷⁰. Usa i parametri di allineamento -v 2 e -m 1 per CRISPR-KO e -v 2 e -m 2 per CRISPR-A e pool misti.
      NOTA: Tipicamente, oltre il 90% delle letture viene allineato con successo. Il basso allineamento deriva tipicamente da errori di taglio, formattazione errata dei file di input o contaminazione del campione durante la PCR.
   4. Quantificare le letture allineate per ogni gRNA utilizzando la funzione di conteggio in MAGeCK⁷² per generare le tabelle finali di conteggio dei gRNA per l'analisi a valle.

Risultati

Qui forniamo un protocollo per lo screening CRISPR in vivo aggregato nella ghiandola mammaria del topo. Questa pipeline può essere utilizzata end-to-end per progettare e amplificare librerie di gRNA aggregate da array di oligonucleotidi, clonare le librerie di gRNA in backbone lentivirali, produrre lentivirus ad alto titolo, eseguire la consegna intraductale di librerie lentivirali aggregate nella ghiandola mammaria adulta e recuperare gRNA per la deconvoluzione basata sul sequenziamento della rappresentazione delle librerie (Figura 1).

L'amplificazione e il clonaggio riusciti delle librerie di gRNA aggregati vengono inizialmente valutati tramite elettroforesi su gel di agarosio. L'amplificazione PCR delle librerie di gRNA produce bande discrete che indicano un'amplificazione uniforme da array di chip oligonucleotidici aggregati (Figura 2A). La digestione restritiva delle dorsale pXPR502 PPH-Cre e pLKO Cre porta a una netta separazione della colonna vertebrale linearizzata dal frammento di stuffer (Figura 2B,C). Una digestione efficiente e un recupero pulito della spina dorsale sono fondamentali per minimizzare la ligatura di fondo e ottenere un'elevata complessità della libreria durante la clonazione.

Un aspetto importante per l'uso di CRISPR-KOALA è l'efficienza dei dgRNA in combinazione con Cas9 vivo rispetto ad altri approcci convenzionali che utilizzano sgRNA a lunghezza intera e Cas9 morti. Abbiamo già dimostrato che i dgRNA con Cas9 vivi sono sufficienti a indurre l'attivazione genica con circa il 50-85% dell'efficienza degli sgRNA a lunghezza^{intera 55}. Per compensare questa riduzione dell'attivazione e per superare il potenziale di dgRNA più inefficienti rispetto agli sgRNA, puntiamo a includere il doppio dei dgRNA per gene nel nostro disegno di libreria. Poiché questa metodologia è limitata all'uso di Cas9 vivo per il knockout genico, abbiamo ritenuto che questo livello di attivazione fosse sufficiente per lo screening CRISPR. Per testare ciò, abbiamo effettuato l'attivazione genica mediata dal dgRNA di diversi geni endogeni, tra cui Erbb2, Esr1 e Plgrkt, ottenendo un'espressione robusta sia^{al livello} 55 dell'mRNA che di proteina. È importante sottolineare che abbiamo regolarmente ottenuto un aumento da 3 a 10 volte nell'espressione genica bersaglio, che è spesso più rilevante dal punto di vista fisiologico rispetto agli aumenti da 100 a 1.000 volte osservati con diversi sistemi CRISPR-A convenzionali.

La complessità della libreria dopo legazione ed elettroporazione viene valutata impiegando diluizioni seriali di batteri trasformati. Il clonaggio di librerie riuscito è indicato da colonie dense e distribuite uniformemente nelle reazioni di legazione rispetto a poche colonie sulle piastre di controllo negative solo della spina dorsale (Figura 3). I numeri delle colonie sulle lastre di diluizione sono utilizzati per stimare la rappresentazione della biblioteca, puntando a una copertura superiore a 1.000 volte (ad esempio, 1.000 colonie batteriche per gRNA nella libreria). Una copertura insufficiente o un alto background sulle piastre di controllo negative indicano una legatura e/o elettroporazione subottimali. In questo caso, questi passaggi dovrebbero essere ripetuti prima dell'espansione su larga scala delle colture batteriche.

Per le iniezioni intradutali della ghiandola mammaria e lo screening in vivo aggregato, le preparazioni lentivirali devono essere concentrate per ottenere titoli funzionali sufficientemente elevati. La produzione virale ad alto titolo può essere validata tramite titolazione funzionale utilizzando fibroblasti embrionali di topo LSL-tdTomato (MEF, JAX# 007909), come sia la dorsale pLKO che quella pXPR502 evidenziate in questo protocollo espressono Cre. Tuttavia, possono essere utilizzati metodi alternativi per altre spine dorsale (ad esempio, utilizzando un diverso reporter fluorescente o selezione di antibiotici all'interno della colonna dorsale lentivirale). Le preparazioni lentivirali efficienti mostrano un'induzione chiara e dipendente dalla dose dell'espressione di tdTomato con un intervallo lineare, permettendo il calcolo dei titoli funzionali (Figura 4A–D). Per gli screening CRISPR-KO e CRISPR-A in pool e multiplex, i lentivirus vengono prodotti, concentrati e titolati separatamente, e i titoli funzionali vengono utilizzati per normalizzare e mescolare le due librerie lentivirali in rapporti definiti prima dell'infezione.

È necessaria una corretta ed efficiente somministrazione di librerie lentivirali aggregate nella ghiandola mammaria adulta per infettare in modo ottimale l'epitelio mammario. La corretta collocazione del microcapillare di vetro con il capezzolo per consentire l'accesso al dotto mammario (Figura 5A) è cruciale per diffondere il lentivirus attraverso l'albero ductale. Una punta di ago di dimensioni adeguate permette di caricare il lentivirus all'interno dell'ago stesso, consentendo al contempo l'ingresso nel dotto mammario con una resistenza minima. Le iniezioni riuscite possono essere osservate dalla diffusione uniforme del colorante Fast Green in tutto l'albero dettale mammario, visibile esternamente all'interno delle ghiandole immediatamente dopo l'iniezione (Figura 5B). Al contrario, le iniezioni fallite sono caratterizzate dall'accumulo di colorante sotto il capezzolo, riflettendo la consegna nel cuscinetto adiposo mammario piuttosto che nel dotto mammario (Figura 5C). La colorazione immunoistochimica delle sezioni del tessuto mammario può essere utilizzata per confermare l'infezione delle cellule epiteliali (Figura 5D), e la citometria a flusso può essere utilizzata per quantificare la proporzione di infezioni da cellule epiteliali luminali e basali (Figura 5E), entrambi validando il targeting efficace delle cellule epiteliali mammarie dopo la consegna intraduttale.

Una volta recuperato il DNA genomico, viene amplificato per PCR per il sequenziamento profondo di nuova generazione, al fine di quantificare quali gRNA sono stati arricchiti in un determinato campione. Dopo la PCR, i prodotti vengono separati tramite elettroforesi su gel, che dovrebbe produrre prodotti specifici per lentivirali (Figura 1 e Figura 6). Si può osservare un'amplificazione non specifica occasionale, in particolare nei campioni CRISPR-A (Figura 6B), anche se questo prodotto è solitamente superiore a 1.000 bp ed è ben separato dal prodotto di interesse; tuttavia, la presenza di una banda forte nella dimensione prevista indica un recupero della biblioteca riuscito. Le reazioni di controllo senza modello non dovrebbero produrre alcuna banda rilevabile, e la presenza di amplificazione in questi controlli suggerisce contaminazione, che comprometterà la quantificazione delle librerie a valle (Figura 7A). Se questa contaminazione viene osservata, ogni primo deve essere testato utilizzando acqua come modello per identificare la fonte di contaminazione, sostituendo immediatamente quegli innesco. Gli amplicon purificati vengono aggregati a rapporti equimolari e sequenziati su una piattaforma di sequenziamento Illumina a lettura breve per la quantificazione delle guide a valle.

Il sequenziamento delle librerie fornisce una chiara metrica del successo della clonazione delle librerie e della produzione virale. Le librerie prodotte in modo ottimale e controllate dalla qualità mostrano una rappresentazione uniforme tra i gRNA senza (o pochissime) guide assenti dalle cellule trasdotte (Figura 7B). Per le grandi librerie, l'interruzione di un piccolo numero di gRNA non avrà un forte impatto sulle prestazioni della libreria se i gRNA rimanenti per ogni gene sono ben rappresentati.

Finora, questo approccio di screening è stato utilizzato prevalentemente per valutare la propensione a singole perturbazioni genetiche clonali a guidare la trasformazione delle cellule epiteliali mammarie e la crescita tumorale in background genetici sensibilizzati ai^{tumori 36,55.} La dissezione e il sequenziamento di un singolo tumore clonale spesso rivelano un arricchimento clonale di un singolo gRNA, che può essere classificato come un colpo di schermo (Figura 7C). In alcuni casi, i tumori presentano due o più gRNA in proporzioni approssimativamente uguali. Questi possono essere il risultato di una doppia infezione o di due cloni che crescono insieme in un'unica massa tumorale. A volte è possibile districare queste due possibilità campionando più aree dello stesso tumore, tuttavia questo grado di granularità di solito non è richiesto. I veri colpi si distinguono facilmente da infezioni multiple grazie alla loro prevalenza su molti tumori nello schermo, mentre i passanti casuali non si ripresenteranno su più tumori. Il nostro approccio standard per chiamare i risultati su uno schermo è fissare un cutoff del conteggio delle letture dell'80%, in cui qualsiasi gRNA che possiede almeno l'80% dei conteggi all'interno di un dato campione viene chiamato hit. Quantificare il numero di questi risultati su tutti i tumori sequenziati identificherà quali geni hanno gli effetti fenotipici più forti.

Questo metodo può essere utilizzato anche sulle ghiandole mammarie prima della formazione del tumore, valutando l'abbondanza di gRNA tramite strumenti come^{MAGeCK 71}. In questo contesto, questo approccio funziona bene nel contesto dello screening dell'arricchimento. Sebbene sia possibile testare la deplezione, richiede una copertura molto più elevata e i dati risultanti potrebbero essere meno affidabili, poiché è statisticamente difficile determinare se un gRNA fosse esaurito o semplicemente assente all'inizio dello screening. CRISPR-StAR offre una preziosa tecnologia alternativa in questo^{senso 9,10} ma necessita di essere ottimizzata per lo screening in vivo nei GEMM.

Insieme, questi risultati rappresentativi forniscono parametri di riferimento per il controllo qualità per ogni fase principale del flusso di lavoro di screening CRISPR in vivo aggregato, dalla clonazione delle librerie e produzione virale alla consegna intraductale e alla deconvoluzione basata sul sequenziamento.

Figura 1: Rappresentazione schematica della pipeline di screening in vivo per la ghiandola mammaria del topo. Questo protocollo include la progettazione di chip oligonucleotidici della libreria gRNA, PCR e clonazione della libreria, preparazioni lentivirali, iniezioni intraductali nella ghiandola mammaria e successivamente analisi a valle per deconvoluto i colpi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: amplificazione e clonazione della libreria di gRNA. Immagini rappresentative in gel di agarosio per (A) reazioni PCR della libreria gRNA, (B) spina dorsale di pXPR502 PPH Cre digerita e (C) spina dorsale di pLKO Cre digerita. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagini rappresentative della diluizione seriale della piscina batterica trasdotta con la libreria di gRNA dopo l'elettroporazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Titolazione lentivirale. (A–D) Citometria a flusso rappresentativa per il calcolo dei titoli virali da un esempio (A e B) di basso titolo e (C e D) di alto titolo di preparazione virale. In entrambi i casi, i MEF LSL-tdTomato sono stati trasdotti con virus che esprimono Cre come indicato nella Sezione 2.5. (E) Risultati rappresentativi del confronto del conteggio tra plasmidi sequenziati in profondità e cellule trasfettate che mostrano una libreria poco rappresentata (a sinistra), con una grande variazione nei conteggi e molti gRNA a basso conteggio, rispetto a una libreria ben rappresentata con una distribuzione più stretta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Iniezione intraduttale della ghiandola mammaria. (A) Vista dell'ago di vetro inserito nel capezzolo. (B) Iniezione riuscita indicata dal colorante che permea l'albero visto dall'esterno del topo (a sinistra) o in una ghiandola mammaria sezionata immediatamente dopo l'iniezione (a destra). (C) Iniezione mammaria fallita, indicata dall'accumulo di colorante sotto il capezzolo. (D) Sezioni mammarie colorate con anti-GFP che mostrano cellule infette. (E) Grafici di citometria a flusso rappresentativo che mostrano le cellule luminali e basali infettate con GFP+. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Deconvoluzione basata sul sequenziamento dei campioni. Gel rappresentativi di sequenziamento profondo da campioni (A) MEF e campioni di plasmide e (B) tumori. Nota che la banda da 1 kb per alcuni campioni CRISPR-A è una banda non specifica e dovrebbe essere ignorata. I costrutti che contribuiscono al campione sono indicati sopra i pozzi (KO per pLKO e A per pXPR502). La variazione nell'intensità della banda è normale, ma l'assenza completa di una banda indica una reazione fallita. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Rappresentazione della libreria e risultati rappresentativi del sequenziamento profondo del tumore. (A) Mappatura dei risultati di un tumore sequenziato con successo rispetto a una reazione di sequenziamento profondo contaminato, in cui molte letture non possono essere mappate alla libreria. (B) Risultati rappresentativi che mostrano sequenziamento da un plasmide, un tumore clonale e una regione dalla ghiandola mammaria. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Progettazione della biblioteca e primer.Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella 2: Elenco dei primer per sequenziamento profondo.Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Una considerazione chiave per lo screening CRISPR in vivo in pool è ottenere una copertura bibliotecaria sufficiente mantenendo una trasduzione scarna e a singola cellula per preservare la risoluzione^{clonale 2}. Nella ghiandola mammaria del topo, il compartimento epiteliale è conservativo composto da circa 3,5 × 10⁵ cellule per^{ghiandola 36}. Con un tasso medio di trasduzione lentivirale del 15%, che minimizza la frequenza di infezioni multiple per cellula, la somministrazione intraductale comporta circa 5 × 10 cellule epiteliali^trasdotte per^{ghiandola 36,55}. L'iniezione bilaterale sia della terza ghiandola mammaria toracica che della quarta addominale produce ~2 ×^10,5 cellule epiteliali trasdotte per^{topo 36,55}. Sulla base di questi parametri, una libreria contenente 4.000 gRNA (equivalenti a ~1.000 geni per CRISPR-KO o ~500 geni per CRISPR-A) richiede circa 4 × 10⁶ cellule trasdotte per ottenere una rappresentazione robusta di 1.000 volte per gRNA, corrispondente a una dimensione di coorte di circa 20 topi. Se si prevede un forte fenotipo di guadagno di funzione, una copertura più bassa (ad esempio, 400× o 8 topi) potrebbe essere sufficiente. In alternativa, un tasso di infezione più alto, ad esempio del 30-35%, potrebbe essere possibile, specialmente per le biblioteche più grandi. D'altra parte, gli esperimenti focalizzati sulle cellule epiteliali mamare basali possono richiedere titoli lentivirali più elevati o un numero maggiore di animali per garantire una copertura sufficiente, mentre questo approccio mediato da lentivirali probabilmente non è adatto a perturbazioni stromali a causa dell'infettività estremamente bassa di queste^{cellule 36}. Questo quadro quantitativo fornisce una base pratica per la progettazione sperimentale bilanciando complessità della libreria, uso animale e risoluzione clonale, e può essere adattato ad altri contesti di screening regolando il numero stimato di cellule target e l'efficienza di trasduzione specifica per tessuto.

Sebbene questo protocollo consenta uno screening CRISPR in vivo in pool scalabile, alcune limitazioni dovrebbero essere considerate nella progettazione degli esperimenti. Innanzitutto, una copertura efficace delle librerie è intrinsecamente limitata dalla dimensione del tessuto e dall'efficienza di trasduzione raggiungibile, rendendo necessarie librerie mirate piuttosto che genomiche per la maggior parte delle applicazioni in ^{vivo 2}. La variabilità nell'efficienza dell'iniezione intraduttale tra ghiandole e/o animali può ulteriormente ridurre la copertura efficiente e dovrebbe essere mitigata attraverso tecniche di iniezione attente, titolazione virale costante ed esperimenti pilota per stimare i tassi di infezione in una gamma di titoli virali. Nonostante queste potenziali fonti di variabilità, abbiamo recentemente dimostrato che gli screening CRISPR con una libreria di 4.000 gRNA raggiungono quasi la saturazione in 20 topi dopo la deconvoluzione^{della libreria 55}.

Per ridurre il numero effettivo di topi necessari a mantenere coperture così robuste, è in pratica fattibile iniettare la seconda ghiandola mammaria toracica e la quinta inguinale oltre alla terza toracica e alla quarta ghiandola mammaria addominale, come evidenziato in questo protocollo. Sebbene i capezzoli di queste ghiandole aggiuntive siano facilmente osservati durante la procedura tramite lunocchia di dissezione, la prima ghiandola mammaria cervicale è spesso coperta e nascosta dagli arti anteriori fissati al naso. Poiché ogni ghiandola mammaria differisce dalle altri, sia all'interno che tra le^{coppie 72}, il numero di cellule epiteliali mammarie in queste ghiandole aggiuntive dovrebbe essere determinato empiricamente per calcolare la copertura efficace. Una considerazione importante, tuttavia, è che indurre tumori mammari su otto ghiandole mammarie di un singolo topo può portare a un finale cumulativo totale del carico tumorale prima dell'arricchimento palese di tutti i cloni contenenti gRNA. In alternativa, nuovi approcci entusiasmanti per ridurre le coperture richieste per lo screening in vivo CRISPR, come CRISPR-StAR (Stocastic Activation by Recombination)^9,10, possono essere combinati con la nostra tecnologia CRISPR-KOALA. CRISPR-StAR introduce sia una traccia unica di linea per ogni gRNA sia un controllo negativo controllato internamente, che ha dimostrato di ridurre i requisiti di copertura di screening in contesti xenograft di oltre due ordini^{di grandezza 9}. Se questi principi possano essere applicati alla nostra tecnologia CRISPR-KOALA resta da testare, ma offre un'opportunità entusiasmante per continuare a ridurre il numero di animali necessari per ogni screen.

Oltre a abilitare lo screening CRISPR in vivo in pool, questo protocollo semplifica la consegna intraductale rispetto agli approcci esistenti. I metodi precedenti per l'accesso diretto al sistema mammario e dottale si sono basati sull'esposizione chirurgica della ghiandola⁵⁰ o sull'uso di siringhe Hamilton per l'iniezione⁵¹, che può essere invasiva e tecnicamente più ingombrante. Al contrario, la strategia di iniezione intraductale non chirurgica descritta qui utilizza aghi microcapillari di vetro fine, permettendo volumi di somministrazione rapidi e riproducibili di lentivirus concentrato con una minima interruzione^{tissutale 36,55}. Questo approccio semplificato facilita la generazione efficiente di un gran numero di cloni epiteliali perturbati indipendentemente ed è particolarmente adatto per la somministrazione lentivirale aggregata in applicazioni di screening, dove la massima diffusione virale è importante.

Un punto di forza principale di questa pipeline è che il framework è altamente adattabile attraverso linee cellulari e contesti^{tissutali 55}. I principi della progettazione di librerie di gRNA mirati, della trasduzione lentivirale sparsa e della deconvoluzione basata sul sequenziamento sono equivalenti a quelli utilizzati negli screening CRISPR in vitro^{convenzionali 2}. Tuttavia, qui forniamo una piattaforma aggiuntiva per eseguire CRISPR-KO multiplexata e CRISPR-A all'interno dello stesso screening, che può essere sfruttata in vitro su scala genomica, dove numeri cellulari più elevati permettono una maggiore complessità della libreria e coperture più profonde. L'uso degli RNA guida morti per CRISPR-A consente l'uso dello stesso topo Cas9 Cre-inducibile o costitutivo per eseguire CRISPR-A e CRISPR-KO. Inoltre, questi esperimenti possono essere condotti all'interno della stessa ghiandola mammaria o multiplexati all'interno della stessa cellula utilizzando costrutti che esprimono sia uno sgRNA che un^{dgRNA 55}. Poiché il protocollo di screening CRISPR si basa sull'integrazione stabile dei lentivirali e sul recupero del codice a barre, è anche compatibile e può essere adattato per modalità alternative di perturbazione, come CRISPR-Inhibition⁶², Cas12 ^73,74 e screens basati su^{ORF-based 75}. Oltre allo screening, la stessa pipeline può essere utilizzata per perturbare i singoli geni clonando gRNA, siRNA o ORF e consegnandoli come perturbazioni individuali nello stesso ^{modo 36,55,67,76,77,79}.

Inoltre, sarà di grande interesse adattare questa tecnologia ad altre specie, in particolare al rat⁸⁰. La maggiore dimensione della ghiandola mammaria del ratto permetterebbe l'uso di librerie significativamente ampliate, mantenendo al contempo un'elevata copertura e un'efficienza^{dell'infezione 80}. Inoltre, la biologia mammaria dei ratti riproduce più da vicino alcune caratteristiche della ghiandola umana rispetto al^topo 80,81,82,83,84,85; Ad esempio, mentre i tumori mammari dei topi sono prevalentemente indipendenti dagli ormoni⁸³, i tumori mammari dei ratti sono frequentemente dipendenti dagli ormoni 81,82,85.

In sintesi, questo protocollo fornisce un approccio pratico e riproducibile per lo screening aggregato in vivo di eliminazione e attivazione CRISPR nella ghiandola mammaria del topo adulto. Integrando la progettazione mirata delle librerie con la produzione lentivirale ad alto titolo, la somministrazione intradutale non chirurgica semplificata e la deconvoluzione basata sul sequenziamento, si abbassano le barriere tecniche alla genomica funzionale in vivo e si consente l'interrogazione diretta della funzione genica all'interno degli ambienti tissuti nativi. Questo quadro dovrebbe facilitare un'adozione più ampia di approcci di screening in vivo aggregati e supportare l'indagine sistematica dei regolatori genetici dipendenti dal contesto dell'omeostasi tissutale e delle malattie.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0.45 micron filter	Sigma	S2HVU02RE
12k or 92k oligo chip	Customarray Inc. (Genscript)
15 cm cell culture plates	Corning	CLS353004
293FT	Invitrogen	R70007
293NT	Systems Biosciences	LV900A-1
Alkaline phosphatase	NEB	M0290L
Amplicillin	Fisher Scientific	BP1760-25
ATP	NEB	9804S
ATP	NEB	P0756S
Cutsmart buffer	NEB	B6004S
Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq)	Illumina
DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit	Qiagen	69506
Dulbecco’s modified Eagle medium	Wisent	319-015-CL
Endura electrocompetent cells	Lucigen	60242-1
EpiCult-B Mouse Medium Kit	Stemcell Technologies	05610
Esp3I	NEB	R0734L
Fetal Bovine Serum	Wisent	090-150
Gel DNA-cleanup kit	Zymo Research	D4008
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes	BioRad	1652089
Gentle Collagenase/Hyaluronidase	Stemcell Technologies	7919
H11-Cas9	Jackson Labratories	JAX#028239
High-Speed Centrifuge	Beckman Coulter	MLS-50
Kim-wipe	Kimberly-Clark	34155
LB Agar	Wisent Technologies	800-011-LG
Micropipette puller	Sutter Instrument	P97
Mini-prep plasmid Kit	Frogga Bio	PDH300
NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI)	NEB	R0580L
Oligo Clean and Concentrator	Zymo Research	D4061
Oligo cleanup kit	Zymo research	D4060
PAGE purified illumina sequencing primer	IDT DNA
PCR Micropipettes	Drummond	5-000-1001-X10
PEI (polyethyleneimine)	Sigma	408727-100ML
Penicillin and Streptinomycin	Wisent	450-201-EL
pLKO-Cre	Addgene	158032
pMD2.G	Addgene	12259
Poly-L-Lysine	Sigma	P2636-100MG
psPAX2	Addgene	12260
pXPR502-PPH-Cre	Addgene	256776
Q5 Polymerase 2x Master mix	NEB	M0494L
Qubit Fluorometric Quantification	Invitrogen	Q33327
R26-LSL-Cas9-EGFP	Jackson Labratories	JAX#024857
R26-LSL-TdTomato mice	Jackson Labratories	JAX#007909
SapI	NEB	R0569L
T4 DNA ligase	NEB	M0202L
Ultra-centrifuge tubes	Beckman Coulter	344058
Vacuum Filter Units	Fisher Scientific	SCHVU02RE