Questo protocollo descrive un metodo per registrare dati video e audio sincronizzati durante interazioni sociali multi-mouse. Il metodo utilizza un array di microfoni e la localizzazione della sorgente sonora per assegnare vocalizzazioni ultrasoniche (USV) a singoli topi, permettendo un'analisi quantitativa del comportamento vocale tra animali e contesti sociali.
Articolo metodologico
Rilevamento e assegnazione di vocalizzazioni ultrasoniche a singoli topi durante interazioni sociali
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I topi (Mus musculus) comunicano tramite vocalizzazioni ultrasoniche (USV) durante le interazioni sociali. Tuttavia, poiché gli USV dei topi non sono associati a indicatori visivi chiari e si verificano a frequenze al di fuori dell'estensione uditiva umana, rimane difficile identificare i singoli topi vocalizzanti all'interno di un gruppo. Questo protocollo descrive un metodo per registrare dati audio video sincronizzati e ultrasonici durante interazioni sociali tra più animali, consentendo la cattura simultanea del comportamento e dell'attività vocale. Viene delineata una pipeline computazionale che integra il tracciamento multi-animale, il rilevamento vocalizzazione, la localizzazione della sorgente sonora e l'assegnazione delle vocalizzazioni a singoli animali. Le procedure di validazione utilizzate per valutare l'accuratezza del tracciamento, l'estrazione vocalizzata, la precisione di localizzazione e la fiducia nell'assegnazione in ogni fase della pipeline sono descritte ulteriormente. L'applicazione di questo protocollo a un dataset dimostrativo di quattro animali produce tracciamento vocale risolto individualmente, stime spazialmente precise delle sorgenti sonore e misure quantitative dell'output vocale e delle caratteristiche acustiche. Insieme, questi approcci forniscono un quadro solido per collegare la comunicazione vocale al comportamento individuale e consentono analisi a valle delle differenze di sesso, della variabilità individuale e della comunicazione sociale nei topi che interagiscono liberamente.
Introduzione
La comunicazione sociale attraverso il regno animale è una componente essenziale delle dinamiche comportamentali, favorendo processi come la sopravvivenza e la riproduzione 1,2. Tra i mammiferi, i topi comunicano acusticamente tramite USV, che coprono frequenze da 35 a 110kHz 3. Gli USV presentano caratteristiche complesse, trasmettendo informazioni a seconda del contestocomportamentale 4. Le femmine di topo mostrano una preferenza per i maschi USV 5,6, mentre maschi e femmine interagiscono vocalmente durante i comportamenti dicorteggiamento 7, indicando che gli USV funzionano come segnali sociali chiave. Poiché specifiche caratteristiche dell'USV sono collegate a distinti stati comportamentalidel topo 8, assegnare con precisione vocalizzazioni agli individui è essenziale per comprendere le interazioni sociali.
Nonostante gli sforzi estesi per chiarire le funzioni degli USV e la loro relazione con il comportamentosociale 8, una sfida continua sul campo è stata l'assegnazione degli USV ai singoli topi durante le interazioni di gruppo. Le difficoltà sorgono sia dalla mancanza di movimenti vissibili della bocca durantela produzione 4 dell'USV sia dall'incomprensibile intervallo di frequenza degli USV all'orecchioumano 3. Di conseguenza, studi precedenti sulla relazione tra USV e comportamento sociale sono stati limitati a saghi semplificati o ambienti vincolati che limitano la gamma di comportamenti di gruppoosservabili 9, fornendo solo una comprensione parziale di come si sviluppa il comportamento vocale negli animali che interagiscono liberamente.
Per affinare la comprensione della relazione tra comunicazione uditiva e comportamento sociale, è necessario catturare una gamma completa di comportamenti dei topi e assegnare vocalizzazioni agli individui all'interno di un gruppo. Risolvere le identità dei vocalizzatori è essenziale per determinare le estensioni vocali dipendenti dal sesso e dal contesto tra gliindividui 8, testando ipotesi causali su come specifiche caratteristiche vocali guidino il comportamentoconspecifico 10,11,12 e, dove applicabile, correlando l'output vocale con segnali cerebrali misurati simultaneamente (ad esempio, elettrofisiologia)13. Storicamente, si credeva che i topi maschi fossero gli unici vocalizzatori; tuttavia, la localizzazione della sorgente sonora ha rivelato che anche le femmine producono USV in contestidi gruppo 7 o quando abbinate a unmaschio 14. Senza determinare quale animale abbia emesso un USV, collegare le caratteristiche vocali al comportamento individuale e agli esiti sociali nei gruppi che interagissero liberamente rimane limitato. Pertanto, è essenziale utilizzare un sistema di localizzazione che consenta l'assegnazione delle vocalizzazioni ai singoli animali mantenendo la dinamica naturale delle interazioni.
Il sistema di localizzazione della sorgente sonora a microfono descritto qui, precedentementepubblicato il 7,15, stima l'origine spaziale degli USV all'interno di un'arena e traccia le posizioni di tutti gli animali presenti al momento della vocalizzazione, consentendo di assegnare vocalizzazioni all'emettitore. Le stime delle fonti sonore e le posizioni degli animali tracciate vengono poi integrate utilizzando una metrica basata sulla probabilità per supportare l'assegnazione degli USV ai singoli animali. L'assegnazione di vocalizzazione converte registrazioni vocali di gruppo precedentemente ambigue in dati vocali animalietichettati 7,15, consentendo analisi quantitative che collegano il tipo e il tempismo della vocalizzazione al comportamento e alle successive azioni conspecifiche. Lo scopo del presente lavoro è fornire un protocollo dettagliato per l'implementazione di questo metodo, che era stato precedentemente quantificato econvalidato 15. Il seguente protocollo delinea l'installazione, la calibrazione e l'implementazione di questo sistema, inclusa la geometria dell'array microfono, la sincronizzazione audio-video, il rilevamento automatico del suono e la stima probabilistica della sorgente, il tracciamento della posizione multi-animale e la procedura di assegnazione utilizzata per attribuire gli USV all'animale emette 7,15.
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Protocollo
Tutti i protocolli che coinvolgono gli animali sono stati approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università del Delaware (numero di protocollo: 1275) e condotti in conformità con le linee guida dei National Institutes of Health. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Costruzione del rig di localizzazione della sorgente sonora
- Prepara la camera di registrazione.
- Assemblare un telaio cuboide (76,2 cm × 76. 2 cm × 61 cm; larghezza × lunghezza × altezza), che funge da arena di registrazione, e posizionarlo in un involucro attenuante del suono.
- Usa una rete di nylon per creare le pareti e foderai l'esterno del recinto con schiuma acustica per ridurre le riflessioni acustiche.
- Posiziona un termometro all'esterno, ma vicino alla camera di registrazione, all'involucro per monitorare la temperatura ambiente durante le registrazioni.
- Esegui tutte le registrazioni in condizioni buie.
NOTA: Mantenere condizioni ambientali stabili durante le sessioni di registrazione e registrare i parametri ambientali.
- Configura i sistemi di registrazione video e audio.
- Installare un'illuminazione a infrarossi sopra l'arena per consentire la registrazione video al buio.
- Posiziona una videocamera sopra l'arena e configurala per registrare continuamente a 30 Hz.
- Configura il sistema di acquisizione audio per registrare segnali a ultrasuoni da un array di microfoni a otto canali a una frequenza di campionamento di 250 kHz.
NOTA: In questo sistema sono stati utilizzati otto microfoni, ma il numero di microfoni può essere regolato in base alle esigenze sperimentali. - Sincronizza le registrazioni video e audio utilizzando un trigger esterno condiviso per garantire l'allineamento temporale.
- Conferma che i dati video e audio vengano registrati contemporaneamente e memorizzati per ogni sessione.
NOTA: L'hardware e il software di acquisizione sono elencati rispettivamente nella Tabella dei Materiali e nella Tabella 1.
- Sistemate i microfoni e l'arena.
- Distribuire uniformemente i microfoni lungo le pareti dell'arena (due per parete).
- Posiziona i centri del microfono a 38,1 cm di distanza, 19,05 cm da ogni angolo e 10,8 cm sopra il pavimento dell'arena.
- Segna visivamente la posizione dei microfoni per facilitare la successiva calibrazione e validazione.
NOTA: I LED possono essere utilizzati per segnare le posizioni dei microfoni.
2. Preparazioni per la registrazione del comportamento sociale
- Prepara gli animali sperimentali.
- Seleziona i topi da registrare. Qui sono stati utilizzati gruppi di 2 maschi e 2 femmine di topi C57BL/6J tra le 8 e le 12 settimane al momento della registrazione.
NOTA: La ceppa, il rapporto di sesso, la fascia d'età dei topi e il numero di giorni di registrazione nell'attuale paradigma sperimentale sono regolabili in base a diversi obiettivi sperimentali. Per la dimostrazione di questo metodo, un sottoinsieme di topi sperimentali è stato riutilizzato in due giorni di registrazione. I topi C57BL/6J di età superiore a 12 settimane possono mostrare una sensibilità ridotta ai suoni ad altafrequenza 16.
- Seleziona i topi da registrare. Qui sono stati utilizzati gruppi di 2 maschi e 2 femmine di topi C57BL/6J tra le 8 e le 12 settimane al momento della registrazione.
- Ospita gli animali.
- Ospita ogni topo individualmente per 14 giorni prima della registrazione.
NOTA: L'alloggio individuale minimizza l'influenza delle esperienze sociali precedenti sulle interazioni di gruppo. - Fornire a ogni gabbia biancheria da letto, arricchimento e accesso ad libitum a cibo e acqua.
- Ospita ogni topo individualmente per 14 giorni prima della registrazione.
- Segna gli animali per l'identificazione visiva.
- Due giorni prima della registrazione, anestesiare ogni topo utilizzando il 2,5% di isoflurano in ossigeno a una portata di 1 L/min tramite un vaporizzatore di precisione in una camera sigillata. Una volta che ogni topo è stato anestetizzato, si trasferisce fuori dalla camera, sdraiandolo con la schiena accessibile, ricevendo l'anestesia da un cono nasale per tutta la durata della procedura di marcatura.
NOTA: Il protocollo anestesitico descritto nell'attuale paradigma sperimentale è approvato nel nostro protocollo sugli animali ed è stato applicato a ciascun topo in serie di scena, ma è regolabile per animali diversi o obiettivi sperimentali. - Mentre ogni topo è sotto anestesia, applica un motivo unico sulla schiena usando una tintura per capelli non tossica per consentire l'identificazione visiva durante il tracciamento.
- Monitorare continuamente ogni animale mentre il colorante si indossa, mantenendo l'anestesia per circa 15 minuti, e annota la durata dell'anestesia.
- Sciacquare e mettere ogni topo in una gabbia riscaldata per il recupero finché non si muove completamente.
- Riporta ogni topo in una gabbia pulita individuale con lettiera, arricchimento e accesso a cibo e acqua.
NOTA: Applicare segni sulle femmine di topo prima dei maschi per minimizzare il trasferimento di segnali olfattici maschili che potrebbero influenzare il comportamento successivo.
- Due giorni prima della registrazione, anestesiare ogni topo utilizzando il 2,5% di isoflurano in ossigeno a una portata di 1 L/min tramite un vaporizzatore di precisione in una camera sigillata. Una volta che ogni topo è stato anestetizzato, si trasferisce fuori dalla camera, sdraiandolo con la schiena accessibile, ricevendo l'anestesia da un cono nasale per tutta la durata della procedura di marcatura.
- Esposizione a sesso opposto.
- Un giorno prima della registrazione, prepara gabbie pulite senza lettieri.
- Per ogni topo sperimentale, metti l'animale in una gabbia seguito da un topo nuovo del sesso opposto.
- Permette agli animali di interagire per 10 minuti.
- Osserva le interazioni e registra manualmente gli eventi comportamentali.
- Dopo l'esposizione, restituire gli animali sperimentali nelle singole abitazioni dopo l'esposizione.
NOTA: L'esposizione al sesso opposto è specifica del paradigma sperimentale attuale, poiché aumenta la probabilità di comportamento vocale durante le successive registrazioni di gruppo17; tuttavia, non è una componente obbligatoria dei metodi descritti. Separare gli animali se si osserva un comportamento copulatorio.
- Determina gli stati estrali delle femmine di topo.
- Circa 2 ore prima della registrazione, valutare lo stato estroso di ogni femmina di topo (se utilizzate femmine).
- Eseguire lavaggio vaginale utilizzando 30 μL di soluzione salina tamponata con fosfato.
- Trasferire il campione di lavaggio su un vetrino pulito del microscopio e distribuire uniformemente.
- Lascia asciugare completamente i vetrini.
- Applica una tinta viola cristallina su ogni vetrata e usa una pipetta per risciacquare delicatamente con acqua.
- Esamina le vetrine al microscopio ottico.
- Classificare lo stato estroso in base alle proporzioni relative delle cellule epiteliali nucleate, delle cellule epiteliali cornificate e deileucociti 18.
- Registra lo stato estrale di ogni femmina.
NOTA: Poiché gli USV possono influenzare la ricetività femminile durantel'estros 19,20, determinare lo stato estrale è specifico del paradigma sperimentale attuale. tuttavia, non è una componente obbligatoria dei metodi descritti.
3. Registrazioni di interazioni sociali
- Prepara l'arena di registrazione.
- Aggiungi la biancheria bianca a base di carta sul pavimento dell'arena fino a una profondità uniforme di circa 1,25 cm.
- Assicurati che la biancheria copra tutti gli angoli in modo uniforme.
- Verifica che tutti i microfoni siano allineati, non ostruiti e orientati verso l'arena.
- Prima delle registrazioni sperimentali, posizionare un righello e un oggetto ad alto contrasto al centro dell'arena per verificare la messa a fuoco della telecamera e stabilire la scalatura spaziale.
- Rimuovi gli oggetti di calibrazione prima che inizino le registrazioni comportamentali.
NOTA: La biancheria bianca a base di carta offre contrasto per animali dal pelo più scuro, facilitando il tracciamento. Se si usano animali dal pelo più chiaro, allora una lettiera nera a base di carta aiuterebbe a seguire il tracciamento. Se le durate delle registrazioni sono allungate, aggiungi cibo e acqua all'arena. L'aggiunta di marcatori direzionali Nord/Sud ed Est/Ovest al righello facilita l'identificazione degli otto microfoni.
- Esegui registrazioni pre-comportamentali del sistema.
- Immediatamente prima delle registrazioni comportamentali, registra 15 secondi di rumore di fondo con luci a infrarossi accese.
- Registra 15 secondi di un test di localizzazione del microfono con le luci a infrarossi spente e le luci indicative del microfono accese.
- Salva tutte le registrazioni pre-comportamenti per una successiva verifica delle prestazioni del sistema.
NOTA: Queste registrazioni sono utilizzate per verificare la funzione del microfono e i livelli di rumore di base. Gli script utilizzati per la registrazione sono disponibili nel relativo repository di codice.
- Registra il comportamento sociale del gruppo.
- Prepara in anticipo tutte le impostazioni di registrazione per minimizzare l'interazione degli animali prima della raccolta dei dati.
- Mettete i topi femmine nell'arena.
- Metti i topi maschi nell'arena.
NOTA: Se registri più animali dello stesso sesso, posiziona entrambi contemporaneamente. - Chiudi il contenitore e inizia a registrare.
- Registra continuamente il comportamento sociale del gruppo per 10 minuti.
NOTA: La durata della registrazione è regolabile. - Verifica che i file video e audio siano leggibili e privi di corruzioni prima della pre-elaborazione.
- Al termine della registrazione, rimuovere tutti gli animali tranne uno.
- Registra i singoli animali.
- Registra il mouse rimasto da solo nell'arena per 10 minuti.
- Ripeti le singole registrazioni per ciascuno dei topi rimasti.
- Pesa ogni topo immediatamente dopo le singole registrazioni.
NOTA: Le singole registrazioni vengono utilizzate per addestrare e convalidare il tracciamento multi-animale. Documenta la temperatura all'interno del rig prima di ogni sessione di registrazione, poiché la temperatura influisce sulla propagazione del suono. Ripeti la sessione di registrazione se i file video o audio sono corrotti o incompleti.
4. Preprocessing video
- Prepara i file video.
- Verifica che tutte le registrazioni video siano memorizzate in una singola directory associata all'esperimento.
- Regola l'intensità video per il tracking.
- Se necessario, applicare una regolazione uniforme della luminosità a tutti i fotogrammi video aggiungendo un valore costante (brightness_adjustment x 255) a ogni pixel, dove brightness_adjustment è uno scalare tipicamente variabile da 0,1 a 0,6 a seconda delle condizioni di illuminazione.
- Se necessario, applica una regolazione globale del contrasto utilizzando la rimappatura dell'intensità (ad esempio, la funzione di imadjust di MATLAB) con un intervallo di input definito (ad esempio, [0.2, 0.8]), che mappa le intensità dei pixel al 20% del massimo al nero e dell'80% del massimo al bianco, e scala linearmente valori intermedi. Questo passaggio viene effettuato per aumentare la separazione tra i segni di identificazione di colore chiaro e lo sfondo.
- Taglia le intensità dei pixel nell'intervallo valido per la profondità di bit video (cioè da 0 a 255 per video a 8 bit).
NOTA: Parametri di preelaborazione identici devono essere applicati a tutti i fotogrammi all'interno di una registrazione e tra le registrazioni per garantire la coerenza. Queste regolazioni sono opzionali e dipendono dalle condizioni di registrazione. Per i dati rappresentativi presentati qui, non sono state applicate regolazioni di luminosità o contrasto. Quando sono necessarie modifiche, gli utenti dovrebbero visualizzare in anteprima il primo fotogramma elaborato per confermare un adeguato contrasto tra gli animali e l'arena prima di elaborare l'intero video.
- Esporta i video preprocessati.
- Salva i file video preprocessati utilizzando la stessa frequenza di fotogrammi e allineamento temporale delle registrazioni originali.
- Conserva i file video originali per riferimento e verifica.
NOTA: Gli script utilizzati per la pre-elaborazione video e i valori specifici dei parametri applicati sono disponibili nel relativo repository di codice.
5. Tracciamento multi-animale
- Prepara il software di tracciamento e i dati.
- Installa un software di tracciamento multi-animali e tutte le dipendenze necessarie. Questo studio ha utilizzato MOuse TRacker (MoTR; Tabella 1) poiché il formato dell'output è compatibile con Muse (Tabella 1), un altro software nella nostra pipeline utilizzato per i calcoli di localizzazione della sorgentesonora 21.
NOTA: Altri software di tracciamento automatizzato, come Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP)22 oDeepLabCut 23, potrebbero essere utilizzati per tracciare gli animali, purché vengano generate la posizione dell'animale, la direzione della rotta e la posizione del naso. - Organizza i file video preprocessati in modo che le registrazioni con singolo animale e quelle su più animali siano chiaramente separate.
- Verifica che tutti i file video abbiano frame rate e risoluzioni spaziali coerenti.
NOTA: Le istruzioni per l'installazione del software e i requisiti di dipendenza sono forniti nel relativo repository di codice.
- Installa un software di tracciamento multi-animali e tutte le dipendenze necessarie. Questo studio ha utilizzato MOuse TRacker (MoTR; Tabella 1) poiché il formato dell'output è compatibile con Muse (Tabella 1), un altro software nella nostra pipeline utilizzato per i calcoli di localizzazione della sorgentesonora 21.
- Addestrare i modelli con un singolo animale.
- Seleziona registrazioni su un singolo animale corrispondente a ciascun soggetto sperimentale.
- Addestra un classificatore di identità separato per ogni animale utilizzando caratteristiche estratte dalla registrazione di un singolo animale di quell'animale. Durante le registrazioni di gruppo, questi output per classificatore per animale vengono combinati con informazioni di traiettoria tra i frame per mantenere l'identità animale.
- Verifica che la formazione sia completata con successo prima di procedere.
NOTA: Le registrazioni su un singolo animale vengono utilizzate per iniziare il tracciamento specifico dell'identità nelle sessioni multi-animale.
- Registra registrazioni multi-animali.
- Applicare il modello di tracciamento addestrato alle registrazioni di interazione sociale con più animali.
- Genera stime fotogramma per fotogramma della posizione, dell'orientamento e della forma corporea degli animali per ogni soggetto.
- Conserva i risultati di tracciamento per le analisi a valle.
6. Segmentazione acustica
- Prepara i dati audio.
- Verifica che tutte le registrazioni audio provenienti dai singoli canali microfonici siano presenti e accessibili.
- Rileva vocalizzazioni.
- Esegui il software di segmentazione acustica, Ax (Tabella 1), su ogni registrazione per rilevare gli USV.
- Configurare i parametri tempo-frequenza definiti in un file di input considerato da Ax. La frequenza di campionamento del microfono era impostata a 250 kHz.
NOTA: Sono state considerate tre dimensioni di finestra per la Trasformata di Fourier Veloce Non uniforme, inclusi 64, 128 e 256 campioni. È stato applicato un prodotto tempo-banda multi-taper di 3 con 5 taper, insieme a una soglia di significatività di 0,05. È stata utilizzata una durata minima di 0 campioni, con un cutoff di bassa frequenza di 30 kHz e un cutoff di alta frequenza di 110 kHz. La dimensione della convoluzione era impostata per coprire 1001 Hz per 0,001 s. Fu incluso un bandiero per unire segnali armonicamente correlati. Per dettagli specifici, vedi Neunuebel et al.7. - Estrarre i candidati USV basandosi su queste caratteristiche tempo-frequenza.
- Salva gli output di segmentazione come foglio di calcolo per ogni registrazione.
NOTA: Le istruzioni di installazione software, gli script e le impostazioni dei parametri sono fornite nel relativo repositorydi codice 7.
- Compila gli output di segmentazione.
- Generare un elenco consolidato degli eventi di vocalizzazione rilevati contenente i tempi di inizio, i tempi di offset e i limiti di frequenza.
- Salva i file di vocalizzazione consolidati per le analisi di localizzazione a valle.
7. Localizzazione della sorgente sonora
- Prepara gli input per la localizzazione.
- Conferma che siano disponibili output di segmentazione acustica e risultati di tracciamento multi-animale per ogni registrazione.
- Organizza gli input di localizzazione in modo che i dati audio, i dati di tracciamento e le informazioni sulla geometria dell'arena siano accessibili al software di localizzazione.
NOTA: Gli script utilizzati per ordinare i file di input, definire le strutture di directory richieste e raccogliere informazioni sulla geometria dell'arena sono forniti nel relativo repository di codice.
- Stima le posizioni delle fonti sonore.
- Applicare l'algoritmo di localizzazione della sorgente sonora, MUSE (Tabella 1), a ogni vocalizzazionerilevata 7.
- Utilizzando registrazioni a microfoni, stima l'origine spaziale di ogni vocalizzazione all'interno dell'arena.
- Per ogni vocalizzazione, stimare la posizione della sorgente sonora usando il ricampionamento jackknife ripetendo la procedura di localizzazione otto volte, omettendo ogni volta un microfono in modo che ogni stima si basi sui restanti sette microfoni. Questo genera otto stime per vocalizzazione.
NOTA: Le differenze nei tempi di arrivo tra i microfoni sono fondamentali per stimare la posizione della sorgente sonora. Il ricampionamento con jackknife viene utilizzato per valutare l'affidabilità della localizzazione e ridurre la sensibilità ai singoli canali del microfono. Gli script utilizzati per stimare la posizione della sorgente sonora sono forniti nel relativo repositorydi codice 7.
- Calcola le distribuzioni di probabilità di localizzazione della sorgente sonora.
- Per ogni vocalizzazione, calcola una matrice dicovarianza 24 e usa questa e le stime medie dei punti jackknife per calcolare la densità di probabilità sul pavimento dell'arena.
- Integra la localizzazione con le posizioni degli animali.
- Estrarre le posizioni tracciate della testa o del naso di tutti gli animali al momento di ogni vocalizzazione.
- Per ogni vocalizzazione, si valuta la densità di probabilità di localizzazione nella posizione del naso di ciascun animale.
- Per ogni vocalizzazione, calcola una metrica di fiducia dell'assegnazione per ogni animale basata sui valori di probabilità. La metrica di fiducia dell'assegnazione viene calcolata per ogni animale come il valore di densità al muso di quell'animale diviso per la somma dei valori di densità di tutti gli animali. Ci riferiamo a questa metrica come indice di probabilità del mouse (MPI)15.
- Assegna vocalizzazioni.
- Se la metrica di fiducia di assegnazione per un singolo mouse supera 0,95, il segnale viene assegnato a quelmouse 7,15.
- Etichetta le vocalizzazioni che non soddisfano i criteri di assegnazione come non assegnate.
- Salva gli output di localizzazione e assegnazione per la validazione e l'analisi a valle.
NOTA: Soglie di assegnazione, criteri di fiducia e codice sono forniti negli script di analisi associati.
8. Validazione dei risultati
- Valida il tracciamento multi-animale.
- Carica le uscite di tracciamento finali per ogni registrazione.
- Sovrapponeva le posizioni degli animali e la forma del corpo sui corrispondenti fotogrammi video.
- Ispezionare visivamente i risultati del tracciamento per confermare la posizione accurata del mouse e l'assegnazione coerente dell'identità tra i frame.
NOTA: I risultati di tracciamento includono ellissi codificate a colori che indicano la direzione della testa sovrapposte a ciascun mouse in ogni fotogramma video. La dimensione dell'ellisse e l'orientamento del corpo dovrebbero corrispondere rispettivamente alla dimensione e all'orientamento del mouse, in ogni fotogramma. Il colore dell'ellisse dovrebbe essere coerente per ogni mouse durante tutta la registrazione. - Identifica e correggi gli errori di tracciamento.
Salva gli output di tracking corretti per le analisi a valle.
NOTA: Gli errori di tracciamento comuni si verificano durante interazioni sociali ravvicinate o vicino ai confini dell'arena. Correggi tutti i casi di ribaltamenti testa-coda, interruttori di identità e salti e drift ellissi.
NOTA: Nel repository di codice sono forniti programmi per visualizzare l'output di tracciamento e correggere errori.
- Valida l'estrazione della vocalizzazione.
- Carica le uscite di segmentazione acustica per ogni registrazione.
- Genera spettrogrammi dai dati audio grezzi per finestre temporali rappresentative.
- Sovrappongono gli eventi di vocalizzazione rilevati, inclusi intervalli di tempo e frequenza individuali, sugli spettrogrammi.
- Confermare visivamente la corrispondenza tra eventi rilevati e vocalizzazioni osservate negli spettrogrammi.
- Se vengono osservati errori sistematici, si modificheranno i parametri di segmentazione prima di rieseguire i passaggi di estrazione e localizzazione, oppure si aggiustare manualmente eventuali errori di segmentazione (ad esempio, errata identificazione del tempo di vocalizzazione o dell'intervallo di frequenza).
- Valida l'assegnazione della vocalizzazione.
- Carica le uscite di localizzazione e assegnazione della sorgente sonora.
- Per ogni vocalizzazione, visualizza stime di localizzazione, distribuzioni di probabilità spaziale e posizioni degli animali sovrapposte ai fotogrammi video.
- Confermare che le densità di probabilità di localizzazione siano centrate vicino alla testa dell'animale assegnato e siano chiaramente separate dagli altri animali.
- Verifica che le vocalizzazioni che non hanno fatto i criteri dell'assegnazione siano etichettate come non assegnate.
NOTA: I controlli per l'output dell'assegnazione includono la verifica che tutte le uscite attese siano state generate e che la mappa di probabilità per ogni vocalizzazione sia situata all'interno dei limiti dell'arena e circostante il mouse assegnato alla vocalizzazione. - Salva i risultati dell'assegnazione validati per le analisi a valle.
NOTA: Le soglie di fiducia dell'assegnazione e i criteri di validazione sono definiti negli script di analisi associati.
9. Analisi dei dati
- Visualizza la localizzazione della sorgente sonora.
- Per sessioni di registrazione con un singolo o più animali, seleziona i fotogrammi video durante i quali sono state rilevate vocalizzazioni.
- Genera rappresentazioni schematizzate dei fotogrammi video selezionati.
- Genera uno schema spaziale dall'uscita MUSE tracciando le posizioni di tutti i microfoni, le stime dei singoli punti della sorgente sonora, la posizione stimata della sorgente sonora, la distribuzione di probabilità spaziale, la posizione del mouse, l'identità del vocalizzatore inferita e una barra di scala.
- Genera spettrogrammi della corrispondente vocalizzazione registrata da ciascun canale microfonico.
NOTA: Queste visualizzazioni sono utili per valutare qualitativamente le prestazioni di localizzazione sia in contesti individuali che di gruppo.
- Quantificare l'errore di localizzazione e la precisione.
- Calcola la distanza tra la posizione stimata della sorgente sonora e la posizione dell'animale registrato per quantificare l'errore di localizzazione. Utilizzare registrazioni con un singolo mouse per questi calcoli, poiché c'è un solo emettitore e la sorgente è nota.
- Per valutare la precisione dell'assegnazione, trasformare le stime della fonte sonora e le corrispondenti posizioni degli animali in un sistema di riferimento centrato sull'animale vocalizzante.
- Visualizza la distribuzione spaziale delle stime della sorgente sonora rispetto alla posizione centrata dell'animale.
- Genera spettrogrammi per visualizzare le vocalizzazioni.
- Identificare i momenti di vocalizzazione di interesse utilizzando le uscite di estrazione vocale contenenti l'identità del vocalizzatore, i tempi di inizio e offset della vocalizzazione, e i limiti di frequenza alta e bassa.
- Seleziona finestre temporali che vanno da prima dell'inizio della prima vocalizzazione fino a dopo lo offset dell'ultima vocalizzazione in ogni incontro.
- Estrarre tracce di tensione dai file dei canali audio per le finestre temporali selezionate.
- Generare spettrogrammi trasformando le tracce di tensione estratte dal dominio temporale a quello della frequenza.
- Segna i punti temporali corrispondenti alle vocalizzazioni assegnate e non assegnate usando colori distinti sullo spettrogramma.
- Per le sessioni di interazione sociale, identifica i crisi di vocalizzazione prodotti da individui diversi e genera spettrogrammi con identità vocalizzanti indicate tramite colori specifici per identità.
- Quantifica l'output vocale per individuo.
- Utilizzare l'output del codice di localizzazione della sorgente sonora per assegnare a ogni vocalizzazione un'etichetta identitaria, in modo che le identità degli animali non localizzate, localizzate ma non assegnate e individuali vengano codificate numericamente.
- Somma il numero di vocalizzazioni prodotte da ogni singolo animale.
- Confronta il conteggio vocale tra individui e tra sessi.
- Analizza le caratteristiche vocali.
- Estrae i contorni di frequenza per ogni vocalizzazione.
- Quantifica parametri vocali come frequenza massima, frequenza minima, frequenza media, larghezza di banda e durata della vocalizzazione.
- Confronta i parametri vocali tra i sessi.
- Esegui analisi statistiche appropriate basate sulle proprietà distributive dei dati.
NOTA: Seleziona metodi statistici per corrispondere alle proprietà parametriche delle variabili misurate. Qui, il numero di soggetti è troppo basso per confronti statistici.
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Risultati
I risultati presentati in questo articolo provengono da registrazioni condotte in 2 giorni e sono pensati per illustrare l'output del protocollo, originariamente pubblicato su Warren et al.15. Questi dati non sono destinati a supportare inferenze statistiche o conclusioni generalizzate.
Estrazione e assegnazione degli USV
Gli USV venivano registrati sia durante sessioni di interazione sociale individuali che di grupp...
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Discussione
L'attribuzione affidabile degli USV a singoli animali durante le interazioni di gruppo è stata una delle principali limitazioni tecniche nello studio della comunicazione vocale del topo. Sebbene i topi siano ampiamente utilizzati per studiare la comunicazione sociale, l'incapacità di assegnare vocalizzazioni a individui specifici ha limitato l'analisi quantitativa del comportamento vocale in contesti sociali naturalistici. Un metodo che consenta il tracciamento vocale specifico per anima...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il personale della Life and Science Research Facility dell'Università del Delaware per la cura degli animali, Jim Farmer e Jamie Quesenberry per l'assistenza nella costruzione delle attrezzature di laboratorio, e il Gruppo di Calcolo ad Alte Prestazioni dell'Università del Delaware per il supporto nella manutenzione del cluster di calcolo. Ringraziamo Andre Yichong Ma per l'assistenza nella raccolta dei dati. Il lavoro è stato finanziato dal NIH, con i numeri di finanziamento R01MH122752 e T32GM142603.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Alpha-Dri Bedding | Shepherd Specialty Papers | ALPHA-dri | Necessario per il sistema di localizzazione della sorgente sonora |
| Estrusione in alluminio | 8020 | Costruito su misura per corrispondere all'arena di registrazione | Necessario per il sistema di localizzazione della sorgente sonora |
| BNC-2110 | National Instruments | 777643-01 | Necessario per il sistema di localizzazione della sorgente sonora |
| Pannello in acrilico trasparente | Home Depot | MC-24 | Necessario per il sistema di localizzazione della sorgente sonora |
| CM16/CMPA40-5V | Avisoft | 40014 | Necessario per il sistema di localizzazione della sorgente sonora |
| Computer | Hewlett–Packard | Z620 | Necessario per il sistema di localizzazione della sorgente sonora |
| Grasshopper 3 | FLIR | GS3-U3-41C6M-C | Necessario per il sistema di localizzazione della sorgente sonora |
| Luci IR | GANZ | IR-LT30 | Necessario per il sistema di localizzazione della sorgente sonora |
| NI PXIe-1073 | National Instruments | 781161-01 | Necessario per il sistema di localizzazione della sorgente sonora |
| NI PXIe-6356 | National Instruments | 781053-01 | Necessario per il sistema di localizzazione della sorgente sonora |
| Nice ‘N Easy, Born Blonde Maxi | Clairol | 2523721 | Necessario per il sistema di localizzazione della sorgente sonora |
| Rete in nylon per pareti della gabbia | McMaster-Carr | 9318T25 | Necessario per il sistema di localizzazione della sorgente sonora |
| Cavo di alimentazione | National Instruments | 763000-01 | Necessario per il sistema di localizzazione della sorgente sonora |
| SCHC68-68-EPM | National Instruments | 192061-02 | Necessario per il sistema di localizzazione della sorgente sonora |
| Schiuma Sonex | Pinta Acoustic | VLW-35 | Necessario per il sistema di localizzazione della sorgente sonora |
Riferimenti
- Barfield, R. J., Thomas, D. A. The role of ultrasonic vocalizations in the regulation of reproduction in rats. Ann N Y Acad Sci. 474 (1), 33-43 (1986).
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- Waidmann, E. N., Yang, V. H. Y., Luo, E., Doyle, W. C., Jarvis, E. D. Mountable miniature microphones to identify and assign mouse ultrasonic vocalizations. Cell Rep Methods. 5 (6), 101081 (2025).
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