Una piattaforma web per la quantificazione automatizzata basata su immagini di isolotti pancreatici isolati da uomini e roditori

Sommario

Questo protocollo descrive campionamento standardizzato, colorazione, acquisizione di immagini e quantificazione automatizzata tramite il web di isolotti pancreati umani e roditori isolati utilizzando analisi delle immagini assistite da deep learning e controllo qualità visiva.

Abstract

Lo scopo di questa pubblicazione è fornire un protocollo video scritto e live-action passo dopo passo per l'uso standardizzato di IsletNet, una piattaforma web per la quantificazione automatica degli isolotti pancreatici isolati nelle immagini, a partire dal campionamento e acquisizione delle immagini fino al caricamento delle immagini, alla validazione visiva e alla generazione automatica di rapporti. La piattaforma è stata sviluppata per la valutazione standardizzata e automatizzata di immagini microscopiche bidimensionali di isolotti pancreatici isolati al fine di supportare flussi di lavoro clinici e sperimentali di isolamento degli isoletti. La segmentazione delle immagini basata sul deep learning viene utilizzata per identificare isolotti ed essustati esocrini da cui vengono estratti i contorni per l'analisi delle immagini. Gli algoritmi computazionali successivamente quantificano il conteggio, il volume e la purezza degli isolotti. Lo strumento di Controllo Qualità visivo supporta la validazione esperta delle analisi automatiche delle immagini consentendo agli utenti di accettare, correggere manualmente o escludere immagini non valide. Il modulo Clinical Islet Isolation supporta l'analisi batch a frazioni di purezza e genera report PDF automatici insieme a file di immagini e dati tabellari scaricabili per la registrazione e l'analisi. Il modulo Confronto Semplice confronta le stime automatizzate con i risultati di riferimento ottenuti localmente inviati insieme alle corrispondenti immagini campionarie per valutare l'idoneità delle immagini localmente standardizzate all'analisi automatizzata. Il protocollo delinea anche raccomandazioni per il riaddestramento utilizzando immagini standardizzate generate localmente quando necessario. I dati rappresentativi provenienti da isolati di roditori e isolotti umani, inclusi esempi impegnativi, dimostrano un miglioramento delle prestazioni di analisi automatica dopo un addestramento adeguato.

Introduzione

Il trapianto di isolotti pancreatici isolati in riceventi diabetici riduce o elimina la necessità di somministrazione esterna di insulina¹. Il processo di isolamento degli isolotti da donatori cadaverici o viventi è soggetto a eterogeneità biologica e procedurale, riflessa nelle variazioni di resa e qualità. Il volume totale degli isolotti rappresenta l'input principale per la determinazione della dose e il processo decisionale clinico riguardo all'idoneità al^{trapianto 2}. L'istogramma della dimensione dell'isolotto e il numero dell'indice dell'isolotta spiegano le differenze nell'efficacia correlata alla^{dimensione 3}. Pertanto, si presta attenzione ai singoli isolotti oltre al volume totale, che attualmente funge da indicatore surrogato per il contenuto delle cellule beta. Gli isolotti umani isolati sono meno densi degli isolotti di roditori e spesso non sono ben separati dal tessuto esocrino. Di conseguenza, sono più difficili da distinguere a meno che non siano tinti. È stato adottato un metodo rapido e semplice di colorazione con zinco utilizzando ditizone, in cui luce rossa intensa viene riflessa dai granuli di insulina arricchiti^{con zinco 4}. Data l'opacità del tessuto, viene raccolta solo la luce riflessa dalla superficie, permettendo l'uso di semplici strumenti stereo- o di microscopia invertita dotati di una sorgente luminosa e di una fotocamera.

Numerosi tentativi sono stati fatti per ridurre la variazione interlaboratorio utilizzando strumenti di analisi digitale^{delle immagini} 5,6,7,8,9,10,11,12, tuttavia questi approcci presentano diverse limitazioni. In questi metodi, la segmentazione degli isolotti e dei tessuti esocrini si basa o sulla soglia manuale, soggetta a^{errori soggettivi} 5,6,7,8,9,10, oppure utilizza approcci di segmentazione completamente ^{automatizzati 11,12}. Inoltre, l'installazione locale di software è spesso richiesta 5,6,7,8,9,10,11 e può essere limitata a hardware ^{specifico 10,11}, limitando l'accessibilità generale e la standardizzazione.

L'obiettivo generale della presente pubblicazione è fornire un flusso di lavoro standardizzato per la quantificazione automatica degli isolotti pancreatici isolati nelle immagini utilizzando una piattaforma di deep learning basata sul web con supervisione umana di esperti. IsletNet affronta le limitazioni associate sia alla disponibilità che all'affidabilità dell'analisi delle immagini degli isolini. In questo articolo presentiamo linee guida raccomandate per il campionamento degli innesti delle isole, la generazione di immagini microscopiche adeguate e l'uso corretto degli strumenti IsletNet . Il protocollo introduce il concetto di supervisione umana dei risultati generati automaticamente e presenta flussi di lavoro per utenti potenziali e affermati (Figura 1). Lo strumento Simple Comparison consente agli utenti potenziali di confrontare direttamente i risultati di IsletNet con i metodi di riferimento ottenuti localmente (Figura 1A). Poiché le immagini standardizzate generate localmente possono differire sostanzialmente tra i centri, IsletNet potrebbe richiedere una riqualificazione prima che si possa ottenere un'analisi affidabile (Figura 1B). Per facilitare questo processo, vengono fornite raccomandazioni per la colorazione standardizzata e l'acquisizione delle immagini. Per gli utenti affermati, lo strumento Clinical Islet Isolation è progettato per supportare il flusso di lavoro di isolamento umano degli isoli (Figura 1C). I report scaricabili insieme a tabelle aggiuntive e visualizzazioni generate da IsletNet sono descritti nella Tabella 1, mentre i parametri chiave calcolati sono riassunti nella Tabella 2.

Figura 1: Flusso di lavoro per utenti potenziali e consolidati della piattaforma. (A) Flusso di lavoro di validazione locale utilizzando il modulo Confronto Semplice. (B) Il ritraining richiede un insieme che rappresenti immagini localmente standardizzate. (C) Flusso di lavoro di uso di routine utilizzando il modulo Clinical Islet Isolation. I passaggi chiave del flusso di lavoro sono riassunti per il caricamento delle immagini, l'analisi, il controllo qualità visivo (vQC) e la generazione di report. Le barre a bilancia non sono applicabili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: File di risultati scaricabili generati dalla piattaforma. Elenco dei file di output scaricabili generati dagli strumenti Clinical Islet Isolation e Simple Comparison, raggruppati per formato di file e categoria di output. La tabella include file di report, output di immagini segmentate, file di visualizzazione e esportazioni di fogli di calcolo per il conteggio degli isoletti, il volume, la purezza e le analisi degli istogrammi. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Parametri chiave inclusi nei report scaricabili e nei risultati dei fogli di calcolo. Elenco dettagliato di metadati, impostazioni definite dall'utente e parametri di analisi quantitativa inclusi nei file XLSX e CSV scaricabili generati dagli strumenti Clinical Islet Isolation e Simple Comparison. I parametri includono i metadati delle sessioni, le impostazioni di acquisizione delle immagini e le metriche di quantificazione degli isolotti per immagini e isolotti individuali. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Protocollo

Le procedure sugli animali sono state approvate dal Ministero della Salute della Repubblica Ceca (Approvazione n. 49/2023) in conformità con la Direttiva 86/609/CEE del Consiglio delle Comunità Europee. Le procedure di isolamento e utilizzo degli isolotti umani sono state approvate dall'Istituto Statale per il Controllo delle Droghe (Numero di approvazione sukls111286/2023). Sono state analizzate immagini microscopiche standardizzate di preparati di isolotti su ratti e umani utilizzando gli strumenti Simple Comparison e Clinical Islet Isolation per confrontare l'analisi automatizzata con il conteggio manuale. La tabella di conversione standard (breve)¹³ veniva utilizzata sia per calcoli manuali che automatici equivalenti degli isolotti.

1. Supervisione umana

1. Vista iniziale dei risultati primari (Figura 2)
   1. Aspetta che i valori generati automaticamente per il conteggio, il volume e la purezza degli isolotti, insieme alla visualizzazione grafica delle corrispondenti annotazioni automatiche (ad esempio, contorni o segmentazioni), appaiono nella finestra dei Risultati del Batch.
   2. Visualizza i risultati riassunti dell'immagine campione attuale nel pannello informativo a sinistra (Figura 2A).
   3. Visualizza i valori replicati (Figura 2B) e le medie dei lotti (Figura 2C) nella tabella a destra.
   4. Sfoglia l'anteprima dell'immagine (Figura 2D, E) usando i link (Figura 2F). Clicca con il tasto destro sull'anteprima dell'immagine e segui il menu a comparsa per scaricare una singola immagine se necessario.
   5. Sfoglia immagini di esempio usando le frecce di navigazione (Figura 2G) oppure seleziona direttamente dalla tabella.
   6. Apri la finestra di Ispezione cliccando all'interno dell'anteprima dell'immagine corrente (Figura 2D) per valutare la qualità dei contorni generati automaticamente e validare i risultati.
2. Controllo qualità visiva
   1. Sposta l'immagine e zooma (Figura 3A) dentro o fuori per ispezionare i contorni alla ricerca di eventuali errori.
   2. Alterna tra le viste Contour (solo le isolotte contate), l'immagine originale e altre visualizzazioni.
      NOTA: Le viste disponibili sono elencate nella Legenda sul lato destro della finestra (Figura 3B) e possono essere accessibili tramite le scorciatoie da tastiera o i collegamenti nella barra di navigazione superiore (Figura 3C; Tabella 3).
   3. Procedi all'immagine successiva premendo il tasto freccia verso il basso se i contorni sono accettabili (Tabella 3).
   4. Correggi manualmente gli errori di contouring quando possibile. Se restano presenti isolotti non rilevati, parzialmente rilevati o spurii, classificare l'immagine come invalida ed escluderla dall'analisi.
      NOTA: Le immagini escluse sono contrassegnate nella finestra dei Risultati del Lotto (Figura 2J) e in tutti i file scaricati.
3. Errori correggibili: Isolotti adiacenti non separati
   1. Separare manualmente gli isolotti adiacenti quando necessario.
   2. Clicca con il tasto sinistro all'esterno degli isolotti per avviare una linea di separazione (Figura 3D).
   3. Aggiungi clic sinistro intermedi per guidare la linea di separazione tra isolotti adiacenti (Figura 3E).
   4. Clicca con il tasto destro all'esterno degli isolotti per completare la linea di separazione (Figura 3F).
   5. Invia la linea di separazione per aggiornare il risultato (Figura 3G).
      NOTA: Attiva o disattiva la visualizzazione delle linee di separazione aggiuntive secondo necessità (Figura 3H).
4. Errori correggibili: Isolotti Spurii
   1. Usa lo strumento di separazione per dividere un isolotto spurio in più oggetti inferiori alla soglia di dimensione dell'isolot.
   2. Evitare di contare i frammenti di isolotti piccoli impostando la soglia minima predefinita di dimensione dell'isolotta (convenzionalmente 50 μm). Regolare la soglia in base alle pratiche locali di laboratorio, se necessario.
   3. Clicca con il tasto destro su qualsiasi punto della linea e seleziona l'opzione appropriata nel menu a comparsa per rimuovere una o tutte le linee di separazione aggiunte manualmente (Figura 3I).
5. Errori irregolabili: isolotti mancanti, parzialmente segmentati o spuri
   1. Attiva la vista Segmentazione per verificare se gli isolotti sono stati rilevati.
   2. Escludere dal calcolo della media dei lotti qualsiasi immagine non valida contenente isolotti non rilevati, parzialmente rilevati o multipli (Figura 3J).
6. Errori irregolabili: oggetti classificati erroneamente
   1. Escludere l'immagine dalla valutazione se tessuti esocrini, reperti di fondo o bolle sono erroneamente classificati come isolotti (Figura 3J).

Figura 2. Finestra dei risultati del lotto. (A) Riepilogo attuale dei risultati campioni. (B) Risultati per immagini campioni replicate. (C) Valori medi da lotti solo dalle immagini accettate. (D, E, F) Anteprime grafiche dei risultati con link. (G) Campione di frecce di navigazione. (H, I, J) Immagini modificate, accettate ed escluse. (K) Barra di navigazione superiore di IsletNet . (L, M) Intestazione e piè di pagina dei risultati del batch. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Finestra di ispezione per vQC e correzione manuale dei contorni. (A) Visualizzazione zoom dell'immagine. (B) Leggenda e suggerimenti di navigazione. (C) Barra di navigazione superiore della finestra di ispezione. (D–G) Costruzione e presentazione di una linea di separazione manuale per isolotti adiacenti. (H) Toggle per visualizzare o nascondere linee di separazione manuali. (I) Rimozione delle linee di separazione manuali. (J) Toggle per escludere un'immagine dalle statistiche. Le barre di scala non sono mostrate in questa vista dell'interfaccia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 3: Modalità di visualizzazione, scorciatoie da tastiera e controlli di navigazione disponibili nella finestra di Ispezione. Riepilogo delle modalità di visualizzazione dell'immagine, scorciatoie da tastiera e funzioni di navigazione disponibili durante il vQC e la revisione manuale dei risultati della segmentazione nella finestra di Ispezione. La tabella include sovrapposizioni di contorno, display di segmentazione, visualizzazione degli istogrammi e controlli di navigazione delle immagini utilizzati negli strumenti Clinical Islet Isolation e Simple Comparison. Clicca qui per scaricare questa tabella.

2. Navigare sulla piattaforma

1. Versione di visione e informazioni tecniche
   1. Rivedi la versione attuale del software e la data di addestramento più recente mostrata nella barra di navigazione in alto (Figura 2K).
   2. Apri la sezione Home per accedere alla descrizione tecnica e alle relative informazioni di riferimento.
2. Valutazione preliminare delle immagini locali
   1. Determinare se le immagini standardizzate generate localmente possono già essere analizzate correttamente dalla piattaforma, basandosi sui criteri di errore descritti nei Passaggi 1.2.4 e 1.5.2, oppure se è necessario un ritraining per le immagini standardizzate locali (Figure 1A e 1B).

3. Confronto semplice e formazione esterna con immagini locali

1. Confronto semplice
   NOTA: Utilizzare lo strumento Simple Comparison per confrontare i risultati dell'analisi automatica con un metodo di riferimento localmente stabilito, tipicamente il conteggio manuale^{standard 13}, tabelle alternative ^7,11,18 o modelli ^5,6. Carica immagini standardizzate generate localmente insieme ai corrispondenti valori di riferimento e al tipo di metodo di riferimento. Il risultato include tabelle scaricabili, immagini e report PDF (Tabella 1).
   1. Apri il cruscotto Simple Comparison dalla barra di navigazione in alto (Figura 4A e 4B).
   2. Consulta la sezione Suggerimenti per le proprietà dell'immagine richieste (Figura 4C).
   3. Scarica il modello form.xlsx (Figura 4D).
   4. Contare isolotti in più campioni utilizzando un metodo di riferimento localmente stabilito.
   5. Acquisire immagini microscopiche standardizzate corrispondenti ai campioni contatti.
   6. Assicurati che tutti gli isolotti conteggiati siano completamente inclusi nella cornice dell'immagine.
   7. Inserisci i nomi esatti dei file immagine e i corrispondenti valori dei parametri nel modello form.xlsx usando i punti decimali in inglese (Figura 4E).
   8. Carica il foglio di calcolo completato e i relativi file immagine trascinandolo e rilasciando o utilizzando i pulsanti di caricamento (Figura 4F).
   9. Seleziona la tabella di conversione o il modello utilizzato per la stima del volume degli isolotti (Figura 4G).
   10. Clicca su Invia batch per generare il confronto affiancato.
   11. Aspetta che appaiono i risultati dell'analisi.
   12. Apri la finestra di Ispezione per effettuare una validazione visiva dei contorni.
   13. Escludere le immagini dall'analisi se i contorni sono errati (Figura 3J).
       NOTA: La modifica manuale dei contorni non è disponibile nello strumento Confronto Semplice.
   14. Scarica i risultati sotto forma di tabelle, immagini e rapporti PDF (Tabella 1).
2. Addestramento IsletNet per immagini localmente standardizzate
   1. Contatta il team di sviluppo dell'Institute for Experimental Medicine (IKEM) al info@isletnet.com.
   2. Condividi immagini rappresentative che coprono l'ampia gamma di qualità d'immagine attualmente ottenuta localmente.
   3. Discutete i requisiti di qualità dell'immagine con il team di sviluppo.
      NOTA: I parametri chiave della qualità dell'immagine includono un contrasto sufficiente, la completa inclusione degli isolotti all'interno del fotogramma e una minima sovrapposizione tra isolotti adiacenti. La colorazione delle isolotte può variare dal rosso al rosa o viola, a condizione che la distinzione dal tessuto esocrino rimanga chiara.
   4. Crea un set di immagini di addestramento che copra la gamma attesa di purezza degli isolotti, ingrandimenti e variazioni cromatiche.

Figura 4. Strumento semplice di confronto, dashboard e flusso di lavoro. (A) Barra di navigazione superiore. (B) Semplice dashboard di confronto. (C) Carica suggerimenti e istruzioni. (D, E) form.xlsx download del modello e visualizzazione dei parametri caricati. (F) Area di caricamento drag-and-drop per immagini e fogli di calcolo. (G) Selezione della conversione dimensione-volume dell'isolotto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Campionamento

NOTA: Gli isolotti sedimentano rapidamente e in modo differenziale in base alla dimensione e alla forma, il che può influenzare i risultati del campionamento.

ATTENZIONE: Esegui tutte le procedure di gestione degli isolotti all'interno di un cappuccio a flusso laminare indossando l'attrezzatura di protezione individuale appropriata.

1. Usa tubi da 50 mL o 250 mL per la sospensione dell'isolot.
2. Determinare la frazione di campionamento richiesta in base al volume e alla purezza osservati della pallina utilizzando le procedure operative standard locali.
3. Mescola accuratamente la sospensione dell'isolotta invertendo delicatamente il tubo cinque volte immediatamente prima della raccolta del campione.
4. Preleva immediatamente il campione utilizzando una punta di pipetta di grande calibro per prevenire l'ostruzione da parte del tessuto esocrino e minimizzare i danni agli isolini.

5. Ottimizzazione dell'acquisizione delle immagini degli isolotti

1. Preparazione al ditizone
   NOTA: È necessaria una colorazione costante con il ditizone per garantire un contrasto sufficiente tra isolotti e tessuto esocrino. Di seguito sono descritti due metodi di preparazione comunemente utilizzati.
   ATTENZIONE: Il ditizone è una sospetta tossina riproduttiva. Il dimetilsolfosido (DMSO) è tossico e penetrante nella pelle. L'idrossido di sodio è altamente corrosivo e può causare gravi ustioni chimiche. Maneggiare tutte le sostanze chimiche indossando le attrezzature di protezione individuale appropriate, evitare il contatto con la pelle e smaltire i rifiuti secondo le procedure istituzionali per i rifiuti pericolosi.
   1. Ristampa in DMSO¹³
      1. Peso 50 mg di polvere di ditizone.
      2. Sciogli il ditizone in 5 mL di DMSO.
      3. Incubare la soluzione a 37°C e far vortice vigorosamente per 1 minuto ogni 5 minuti fino al completamento della dissoluzione.
      4. Diluire 1 mL della soluzione di stocco con 20 mL di Hank's Balanced Salt Solution contenente 2% di siero bovino fetale per preparare la soluzione lavorativa.
      5. Filtra la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm.
      6. Avvolgi il tubo in carta stagnola per proteggere la soluzione dalla luce.
         NOTA: Utilizzare la soluzione funzionante entro circa 12 ore.
   2. Risospensione in soluzione alcolica alcalina (alternativa alla Ref. 8)
      1. Peso 50 mg di polvere di ditizone.
         NOTA: Preparate le aliquote in anticipo, se desiderato.
      2. Aggiungi 800 μL di etanolo al 70% al ditizone.
      3. Aggiungi 400 μL di soluzione di idrossido di sodio da 1 M e vortice accuratamente fino al completamento della dissoluzione.
      4. Diluire la soluzione con soluzione salina tamponata con fosfato contenente 0,2 mg/mL di albumina umana fino a un volume finale di 20 mL.
      5. Filtra la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm.
      6. Avvolgi il tubo in carta stagnola per proteggere la soluzione dalla luce.
         NOTA: Utilizzare la soluzione funzionante entro circa 12 ore.
2. Colorazione degli isolotti
   1. Aggiungere 25 μL di soluzione lavorativa di ditizone al centro di un piatto da 35 mm.
   2. Aggiungi 50 μL di isolotti sospesi nella soluzione salina bilanciata di Hank contenente albumina, mezzo di coltura completo o mezzo di trapianto.
      NOTA: Il volume effettivo del campione varia tra 20 e 50 μL a seconda del pellet di purezza-frazione, con una concentrazione finale di ditizona da 0,85 mg/mL a 1,37 mg/mL.
   3. Pipetta la sospensione dentro e fuori tre volte usando lentamente il primo stop per mescolare delicatamente le soluzioni evitando la formazione di bolle.
   4. Incubare il campione a 20°C–25°C per 1–2 minuti monitorando visivamente la colorazione al microscopio finché gli isolotti non appaiono di un rosso brillante. Alcune preparazioni possono contenere isolotti poco colorati, per i quali IsletNet è anche addestrato.
   5. Usa una siringa da 10 mL per iniettare rapidamente 4 mL di soluzione salina tamponata con fosfato, integrata con 0,2 mg/mL di albumina, direttamente nel campione macchiato, evitando sia bolle che schizzi.
   6. Fai immediatamente roteare vigorosamente il piatto in un movimento circolare per mescolare le soluzioni, spostando gli isolotti verso il centro prima di posarsi.
      OPZIONE 1: Aggiungere con cura 4 mL di PBS/albumina, lasciando gli isolotti in dithizone indisturbati. Poi, fai ruotare delicatamente il piatto in un movimento circolare per mescolare le soluzioni che mantengono gli isolotti al centro. Aspetta che il ditizone si disperda nel piatto.
      OPZIONE 2 (adatta per lo stereomicroscopio): Invece di diluire gli isolini, distribuire la goccia di ditizone-isolotta in uno strato sottile usando una punta o un ago di pipetta invece della diluizione per ridurre le riflessioni.
   7. Ispezionare il campione al microscopio e immediatamente riportare eventuali isolotti spostati nel campo della camera con delicatezza, facendo roteare la soluzione circostante con la punta di una pipetta.
   8. Inizia subito l'acquisizione dell'immagine per minimizzare la citotossicità e i cambiamenti nel volume degli isoli.
3. Acquisizione di immagini
   NOTA: Utilizzare un microscopio stereo o rovesciato dotato di un obiettivo a basso ingrandimento e di una sorgente luminosa stabile. Proteggi l'antenna da ulteriori fonti di luce, come l'illuminazione della stanza.
   1. Accendi la fonte di luce e lascia che la lampadina alogena si scaldi per 5 minuti.
   2. Imposta un'intensità luminosa standardizzata per evitare abbagliamenti e sottoesposizione. L'esatto intervallo dipende dall'hardware di imaging utilizzato.
      NOTA: L'intensità luminosa ottimale può variare in base all'ingrandimento e alla purezza del campione.
   3. Seleziona l'obiettivo e l'impostazione zoom che permetta a tutti gli isolotti di rimanere nel campo visivo della telecamera.
   4. Mantieni lo stesso ingrandimento per tutti i campioni all'interno di un lotto e preferibilmente per tutti i lotti di purezza.
   5. Calibrare il bilanciamento del bianco usando una carrella bianca normalizzata se necessario. Se la qualità dell'immagine rimane insoddisfacente a causa di caratteristiche uniche della preparazione dell'isolotto, regolare i valori RGB e/o le impostazioni gamma.
   6. Regolare il tempo di esposizione e, se necessario, l'intensità o il guadagno di illuminazione utilizzando l'istogramma a colori evitando la sovraesposizione.
      NOTA: I campioni contenenti abbondante tessuto esocrino possono richiedere impostazioni di illuminazione diverse della telecamera o dell'illuminazione a causa della luce riflessa proveniente dal tessuto non isolano. Per garantire la riproducibilità, salva questi parametri come file di configurazione separato per riferimento futuro.
   7. Cattura l'immagine e salva il file in un formato supportato, inclusi JPG, PNG, TIFF o BMP.
      NOTA: Includere data, frazione di purezza, ingrandimento o dimensione dei pixel, e diluizione nel nome del file per facilitare future rianalisi (ad esempio, iz260105_H1_obj1.25x_1000x.jpg).
   8. Acquisisci un'immagine del micrometro di stadio utilizzando le stesse impostazioni di ingrandimento e zoom utilizzate per l'imaging del campione.

6. Strumento di isolamento clinico delle isole

NOTA: I passaggi chiave del flusso di lavoro sono riassunti nella Figura 1C. Analizza le immagini in lotti di purezza-frazione man mano che i campioni diventano disponibili.

1. Impostazione della dimensione del pixel
   NOTA: La dimensione calcolata del pixel rimane valida solo quando l'immagine del micrometro di stadio viene acquisita utilizzando le stesse impostazioni di ingrandimento e zoom dei campioni analizzati.
   1. Apri il cruscotto Clinical Islet Isolation .
   2. Clicca su Carica Micrometro Stadio e seleziona l'immagine del Micrometro Stadio.
   3. Disegna i punti finali della linea di misura rossa lungo una distanza nota sul righello digitale.
      NOTA: Utilizzare una distanza di calibrazione più lunga quando possibile per migliorare la precisione delle misurazioni.
   4. Inserisci la distanza nota in micrometri (μm).
   5. Invia la dimensione calcolata del pixel.
      NOTA: La piattaforma mantiene la dimensione del pixel calcolata fino a modifica manuale.
2. Caricamento in lotto di immagini a frazione di purezza
   NOTA: Utilizzare 3–4 campioni replicati per garantire un calcolo affidabile della media del lotto e dei valori di deviazione standard. Usa la stessa diluizione per tutti i campioni all'interno di un lotto.
   1. Immagini trascina e rilascia che rappresentano campioni replicati della stessa frazione di purezza nell'area di caricamento.
      NOTA: La piattaforma impedisce l'uso ripetuto della stessa immagine basandosi sul riconoscimento dei nomi file.
   2. Modifica la dimensione dei pixel se necessario.
   3. Inserisci la soglia minima di dimensione dell'isolotto.
   4. Inserisci il valore di diluizione del campione (ad esempio, 1000).
   5. Inserisci il volume del pellet in millilitri registrati dalla fiaschetta originale.
   6. Inserite le iniziali dell'operatore.
      NOTA: Le iniziali dell'operatore compaiono nel report generato.
   7. Inserisci l'ID della sessione che rappresenta la procedura di isolamento corrente.
   8. Inserisci l'ID del lotto (ad esempio, 1 Alta Purezza).
      NOTA: La piattaforma ordina le frazioni alfanumericamente in base all'ID del lotto.
   9. Clicca su Invia Lotto per iniziare l'analisi.
3. Revisiona e Finalizza i Risultati dei Lotti
   NOTA: Chiudi la finestra precedente dei Risultati del Lotto cliccando sull'intestazione se necessario (Figura 2L).
   1. Aspetta che i risultati numerici e grafici appaian nella finestra dei Risultati del Batch.
   2. Apri la finestra di Ispezione facendo doppio clic sull'anteprima dell'immagine nella finestra dei Risultati del Batch.
   3. Rivedere e, se necessario, correggere i contorni come descritto nel Passaggio 1.
   4. Procedi all'immagine successiva usando il tasto freccia verso il basso se i contorni sono accettabili.
   5. Aggiungi un altro lotto o procedi al riassunto della sessione usando i pulsanti situati in basso nella finestra (Figura 2M).
4. Batch Editing
   NOTA: La piattaforma memorizza i nomi dei file immagine durante tutta la sessione per evitare l'uso ripetuto e involontario della stessa immagine. Questo include le immagini rimosse. Rinomina le immagini prima di riutilizzarle se necessario.
   1. Clicca su Modifica Batch per aggiungere o rimuovere immagini, correggere le specifiche dei campioni o rinominare il batch (Figura 2L).
      NOTA: Registra i nomi dei file immagine prima di modificare il lotto se si prevede il riutilizzo dell'immagine.
   2. Clicca su Rimuovi il batch per eliminare completamente il batch (Figura 2L).
5. Visualizzazione del Riepilogo e Generazione dei Rapporti
   1. Clicca su Mostra Riepilogo per visualizzare la panoramica della sessione (Figura 2M).
      NOTA: Torna ai lotti precedenti e modificali se necessario.
   2. Visualizza il numero totale di isolotti, il volume e i valori del volume dei pellet per la sessione insieme ai corrispondenti valori medi dei lotti.
6. Scarica il rapporto.
   NOTA: Il breve rapporto include il conteggio totale degli isolini, volume, purezza, valori dei pellet, istogrammi e riassunti purezza-frazione. Il rapporto completo include inoltre informazioni grafiche per ogni immagine campione, con i valori accettati visualizzati in rosso e quelli esclusi in nero.

Risultati

Isolotti di Topi Puri

Nel primo esperimento, sono state acquisite 36 immagini che rappresentano 12 campioni contenenti un totale di 249 isolotti purificati di ratti durante quattro sessioni di imaging indipendenti. Le immagini venivano generate utilizzando uno stereomicroscopio in tre condizioni di illuminazione standardizzate ma distinte, impiegando sorgenti di luce alogene e a diodi a emissione luminosa (LED) insieme a diverse impostazioni della telecamera. Le segmentazioni di verità sul campo (GT) sono state generate manualmente per tre immagini rappresentative da un esperto di formazione di IsletNet .

Quando le immagini sono state analizzate utilizzando la versione pubblica dello strumento Simple Comparison, nessuno dei contorni generati automaticamente ha superato il controllo qualità visivo (vQC, Figura 5F). La piattaforma è stata successivamente riaddestrata utilizzando immagini locali rappresentative, e tutti i contorni generati dalla versione sperimentale riaddestrata hanno superato vQC (Figura 5C).

Il rapporto tra stime automatiche e manuali del volume degli isolotti ha dimostrato prestazioni costanti nelle tre condizioni di imaging dopo il riaddestramento, con valori mediani di 1,03, 0,98 e 0,94 per le condizioni di illuminazione A, B e C rispettivamente (Figura 5A). Questi risultati rappresentarono un miglioramento sostanziale rispetto al modello di addestramento originale (Figura 5B).

Il confronto pixel per pixel con le segmentazioni GT ha dimostrato una stretta concordanza tra contorni automatizzati e generati manualmente dopo il ritraining (Figura 5D), corrispondente a una corretta posizione dei contorni nelle immagini rappresentative (Figura 5C). Al contrario, il modello di addestramento originale mostrava una proporzione aumentata di pixel falsi negativi (Figura 5G) e spostamenti sbagliati dei contorni (Figura 5F), portando a uno spostamento verso categorie di isolotti più piccole negli istogrammi corrispondenti di dimensione degli isolotti (Figura 5E vs 5H).

Figura 5. Valutazione del riaddestramento delle piattaforme utilizzando tre sistemi di imaging e preparazione delle isole ratti. (A) Confronto tra le stime di IsletNet e dell'equivalente manuale degli isoli (IEQ) dopo il riaddestramento utilizzando tre sistemi di imaging. (B) Confronto tra le stime IEQ di IsletNet e manuali utilizzando il modello originale di addestramento pubblico. (C, F) Posizionamento rappresentativo dei contorni utilizzando lo strumento vQC dopo e prima del riaddestramento del modello, rispettivamente. Le frecce bianche indicano una corretta posizione dei contorni e quelle magenta indicano una posizione scorretta dei contorni. (Re, Sol) Confronto pixel a pixel con la verità sul terreno dopo il riaddestramento e con il modello di addestramento originale, rispettivamente. Nella legenda sono indicate regioni di vero positivo, falso positivo, falso negativo e vero negativo. (E, H) Istogrammi rappresentativi delle dimensioni degli isolotti dopo il riaddestramento e con il modello di addestramento originale, rispettivamente, rispetto al conteggio manuale. Configurazione di imaging 1 = illuminazione LED; Imaging Setup 2 = illuminazione alogene; configurazione di imaging 3 = illuminazione LED in campo scuro. Barre della scala = 100 μm. I boxplot sono mostrati secondo la convenzione di Tukey; i baffi si estendono fino a punti dati entro 1,5 ×intervallo interquartile tra il primo e il terzo quartile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Preparazioni cliniche per isolotti umani

Nel secondo esperimento, sono state analizzate 17 immagini che rappresentano una singola procedura di isolamento di isolotti umani con tre coppie purezza-frazione utilizzando la versione pubblicamente disponibile della piattaforma. Un campione è andato perso. Dopo la vQC, tutte le immagini che rappresentano frazioni di purezza media e bassa sono state escluse a causa del rilevamento di isolotti spuri (dati non mostrati). La piattaforma è stata successivamente riaddestrata utilizzando immagini locali rappresentative.

Dopo il riaddestramento, tutte le immagini superavano la vQC dopo l'aggiunta di tre linee di separazione manuali. Il confronto a lotto con il conteggio manuale ha mostrato una sottostima complessiva del ≤5% per il conteggio totale degli isolotti e le stime del volume. I campioni diluiti tra 2.000 e 4.000 volte contenevano tra 80 e 4 isolotti a seconda della frazione di purezza. Il contributo relativo delle singole frazioni di purezza alla preparazione finale è mostrato nella Figura 6A. La frazione ad alta purezza 1VC2 ha contribuito prevalentemente a isolotti più piccoli rispetto alla frazione di purezza media 2SC1. L'istogramma della dimensione complessiva dell'isolotto generato automaticamente dalla piattaforma è mostrato nella Figura 6B.

Figura 6. Quantificazione e analisi di campioni di isolamento umano degli isolotti. (A) Stime del conteggio degli isolotti e delle stime di volume equivalente utilizzando IsletNet e metodi manuali di conteggio su frazioni di purezza dell'intero innesto. (B) Istogramma della dimensione finale dell'isolotto generato da IsletNet utilizzando valori medi batch. (C) Confronto tra IsletNet e stime manuali per conteggio e volume su 17 immagini individuali. (D) Dettaglio rappresentativo dell'immagine dal campione 3NC1 che mostra l'immagine originale e la posizione dei contorni generata da IsletNet riaddestrato. (E) Confronto pixel per pixel della segmentazione IsletNet con la verità sul campo generata dall'esperto che conta manualmente rispetto all'esperto che allena IsletNet (GT1 vs. GT2). Nella legenda sono indicate regioni di vero positivo, falso positivo, falso negativo e vero negativo. (F) Istogramma rappresentativo delle dimensioni dell'isolotto per la stessa immagine confrontando i risultati di IsletNet e manuali. Le frecce magenta indicano uno spostamento di contorno e di dimensione degli isolotti. Barre della scala = 100 μm. I boxplot sono mostrati secondo la convenzione di Tukey; i baffi si estendono fino a punti dati entro 1,5 ×intervallo interquartile tra il primo e il terzo quartile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Successivamente sono state confrontate stime automatiche e manuali per tutte le singole immagini (Figura 6C). I rapporti mediani tra stime automatiche e manuali erano di 1,00 per il conteggio degli isolotti e 0,93 per il volume degli isolini, con diversi valori anomali osservati. In un campione rappresentativo a bassa purezza (3NC1), la piattaforma ha identificato lo stesso numero di isolotti del conteggio manuale (cinque isolotti) ma ha stimato un volume degli isolotti inferiore del 29%. Questi dati sono indicati da punte di freccia nella Figura 6C.

L'isolotto più grande, parzialmente intrappolato in tessuto esocrino, da questa immagine rappresentativa è mostrato nella Figura 6D, includendo l'immagine originale e la sovrapposizione di contorno generata automaticamente. Il confronto pixel per pixel con le segmentazioni GT generate indipendentemente da due esperti è mostrato nella Figura 6E. Gli istogrammi corrispondenti della dimensione degli isolotti hanno dimostrato uno spostamento nella distribuzione delle dimensioni tra segmentazioni manuali e automatiche (Figura 6F).

Prestazioni operative dell'analisi automatizzata

Le prestazioni operative degli strumenti Simple Comparison e Clinical Islet Isolation sono state valutate in condizioni standard di internet con velocità medie di download e upload rispettivamente di 50 Mbps e 30 Mbps. Cinque lotti di immagini contenenti 12 immagini ciascuno sono stati analizzati utilizzando dimensioni che andavano da file JPEG da 0,5 MB a file TIFF da 20 MB. La durata del download è stata misurata per i pacchetti completi dei risultati ZIP.

I tempi di visualizzazione dell'analisi e le durate del download aumentarono progressivamente con la dimensione dell'immagine per entrambi gli strumenti (Tabella 4). Lo strumento Clinical Islet Isolation richiedeva tempi di elaborazione più lunghi rispetto allo strumento Simple Comparison per insiemi di immagini equivalenti. Questi risultati dimostrano la relazione pratica tra risoluzione dell'immagine, formato file e throughput di analisi durante il funzionamento di routine.

Tabella 4: Tempi di visualizzazione dell'analisi e durate di download per gli strumenti Clinical Islet Isolation e Simple Comparison. Confronto dei tempi di elaborazione necessari per la visualizzazione dei risultati e il download dei file utilizzando lotti di immagini di dimensioni e formati di file diversi. Le misurazioni sono state ottenute utilizzando lotti contenenti 12 immagini e sono riportate come tempo trascorso dalla sottomissione del batch alla visualizzazione dei risultati o al completamento del download. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Il protocollo presentato qui descrive il flusso di lavoro pratico per gli utenti potenziali e affermati di IsletNet, con enfasi su due caratteristiche fondamentali della piattaforma: la vQC esperta e il ritraining delle reti neurali. I risultati rappresentativi dimostrano che una quantificazione automatica accurata dipende non solo dalle prestazioni di segmentazione delle immagini, ma anche dalla capacità dell'utente di valutare criticamente la posizione dei contorni e l'idoneità dell'immagine prima di accettare i risultati. Due strumenti avanzati aggiuntivi, Confronto Pixel-to-Pixel e My Segmentations, sono stati utilizzati per generare risultati di validazione selezionati; tuttavia, questi strumenti sono destinati principalmente al supporto dell'addestramento delle reti neurali e quindi non sono inclusi nel flusso di lavoro del protocollo.

IsletNet è stato sviluppato come uno strumento di riferimento collaborativo e ampiamente accessibile per l'analisi standardizzata delle immagini degli isolotti in diversi laboratori. La rete neurale è stata addestrata e validata utilizzando segmentazioni GT annotate manualmente di immagini microscopiche bidimensionali originali di isolotti umani e di ratti^isolati 14,15,16. Sono stati generati due modelli separati per preparazioni colorate con ditizone e un ulteriore modello di ricerca per isolotti di ratti non colorati, con accesso disponibile su richiesta. La versione della piattaforma e la data di addestramento sono visualizzate nell'interfaccia utente. IsletNet segmenta automaticamente isolotti e tessuti esocrini e successivamente calcola il numero, il volume e la purezza degli isoli utilizzando la dimensione del pixel definita dall'utente e la soglia minima di dimensione dell'isolot. La scelta della soglia di dimensione degli isolotti dipende dalla qualità dell'immagine e dallo scopo dell'analisi (confronto fianco a fianco con il conteggio manuale rispetto allo studio di piccoli isolotti) piuttosto che dalla specie. Data la risoluzione della microscopia convenzionale, la dimensione minima significativa dell'isolotto è di 50 μm 7,8,9,12, ma può essere ridotta fino a 10 μm per immagini ottenute con uno strumento ^{appropriato 10}. Le stime del volume degli isoli sono generate utilizzando la tabella di conversione standard basata sulla sfera¹³, così come le tabelle di conversione^{alternative 7,18,19}, incluse le approssimazioni adattate dell'ellisse ^5,6 e i modelli di Spinacle e Sphiracle basati sui^{contorni 17}. I valori risultanti sono riportati in equivalenti di isolotti e nanolitri, mentre la purezza viene calcolata sia dall'area tissutale sia dal volume stimato del tessuto. Un passaggio fondamentale nel protocollo è l'acquisizione di immagini microscopiche standardizzate adatte alla segmentazione automatica. IsletNet è stato addestrato utilizzando immagini acquisite con microscopi stereo e rovesciati dotati di una gamma di camere a semiconduttore a ossido metallico complementari e sistemi di illuminazione. Gli obiettivi a basso ingrandimento (1–2×) sono vantaggiosi perché permettono all'intero campione di rimanere nel campo visivo mantenendo una dimensione dei pixel compatibile con una rilevazione affidabile di piccoli isolotti. Un'illuminazione costante, un bilanciamento del bianco stabile e l'evitamento della sovraesposizione dell'immagine sono essenziali per una generazione affidabile dei contorni. I risultati rappresentativi dimostrano che il ritraining utilizzando immagini locali rappresentative può migliorare sostanzialmente le prestazioni di segmentazione in condizioni di imaging eterogenee. Come linea guida pratica, le immagini sono generalmente adatte all'addestramento IsletNet quando i confini di isolotti ed estrechi sono chiaramente distinguibili da un osservatore esperto. Le immagini contenenti isolotti raggruppati o fortemente sovrapposti dovrebbero essere evitate ogni volta che possibile.

Il protocollo evidenzia anche diverse limitazioni e considerazioni di risoluzione dei problemi associate all'analisi automatica delle immagini. Sebbene IsletNet aumenti notevolmente la capacità di throughput, l'oggettività e la riproducibilità rispetto al conteggio completamente manuale, il metodo rimane sensibile alla qualità dell'immagine. Una posizione errata dei contorni (rilevamento spurio degli isolotti e mancata capacità di sepa-rate degli isolotti adiacenti) può occasionalmente verificarsi e influire sulla quantificazione a valle. Un vQC di routine rimane essenziale prima di accettare i risultati automatici. L'applicazione immediata in loco a IsletNet è vantaggiosa perché immagini inappropriate possono essere riacquisite con parametri di imaging modificati. La correzione manuale dei contorni automatici è possibile entro la finestra di ispezione, tranne che per isolotti mancanti o isolotti spuriosi. Inoltre, l'algoritmo di separazione automatica si basa sulla geometria dei contorni e sulle statistiche di distribuzione delle dimensioni degli isolotti e può quindi differire dall'interpretazione iniziale di un singolo esperto, pur rimanendo analiticamente accettabile.

L'affidabilità di IsletNet è determinata principalmente dalla coerenza tra la qualità locale dell'immagine e il dataset di addestramento, piuttosto che solo dalla specie. Sebbene l'attuale set di addestramento contenga isolotti umani di varie purità e isolotti di ratti ad alta purezza, la piattaforma può essere estesa ad altre specie a condizione che le caratteristiche dell'immagine rimangano coerenti con i dati di addestramento. Ad esempio, gli isolotti suini purificati tramite coltura possono assomigliare a isolotti umani incorporati presenti nel dataset di addestramento. Al contrario, isolotti ampiamente coltivati con debole colorazione di ditizone non erano rappresentati durante l'addestramento e potrebbero richiedere un addestramento aggiuntivo. Lo strumento Simple Comparison, quindi, supporta un importante passaggio di validazione per nuovi utenti o nuove configurazioni di imaging. I risultati qui presentati sottolineano come diverse interpretazioni degli esperti degli isolotti incorporati possano influenzare la generazione di GT e la stima del volume a valle. Per affrontare l'assenza di un ampio consenso degli esperti nei futuri studi multicentrici, è stata sviluppata l'applicazione^{IsletSwipe 20} per facilitare l'annotazione delle immagini basata sul consenso.

Rispetto al conteggio manuale convenzionale al microscopio, IsletNet offre un throughput sostanzialmente superiore, documentazione digitale permanente e output quantitativi standardizzati, riducendo la variabilità dipendente dall'operatore. Il conteggio manuale può comunque fornire maggiore fiducia nell'identificazione dei tessuti nei casi borderline, ma è limitato da stima soggettiva della dimensione, minore scalabilità e ampie esigenze di formazione del personale. Come servizio web, IsletNet consente la comparabilità inter-laboratorio tramite analisi centralizzate ma anonime. La velocità di analisi rimane dipendente dalla larghezza di banda locale di internet, dalla dimensione del file immagine e dalla complessità dell'immagine. I file TIFF più grandi possono migliorare la fedeltà dell'immagine ma richiedono tempi di upload e download più lunghi rispetto alle immagini JPEG compresse.

Nel complesso, i risultati qui presentati dimostrano che è possibile ottenere una quantificazione automatizzata affidabile quando l'acquisizione locale dell'immagine rimane riproducibile e coerente con il set di addestramento. Gli utenti sono incoraggiati a incorporare la vQC nella loro routine e a considerare il ritraining ogni volta che vengono introdotti cambiamenti sostanziali nelle condizioni di imaging locale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
35 mm Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5481	Non sterilizzato
200 µL pipette tips, wide-bore	Sigma-Aldrich	AXYT205WBCRS	Per la somministrazione della sospensione di isole prima della colorazione
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Grado GC o grado per colture cellulari
Ditizone (DTZ)	Sigma-Aldrich	D5130	Polvere
Etanolo, 70%	Fornitore locale	N/A	(v/v) in H2O; per la preparazione di DTZ
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco	10270106	Inattivato per calore, qualificato
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H6648	Con o senza phenol red (specificare in base al saggio)
Albumina umana	Grifols	61953-0001-2	Soluzione ad alta concentrazione (200 g/L)
Infinity 1-3C	Lumenera	3-1URC	CMOS, 3 MP
Infinity Capture	Lumenera	N/A	Software standard per l'acquisizione delle immagini
Microscopio invertito CKX41	Olympus	N/A	Obiettivi 1,25x e 2x
LED-High-Power-Spots (a 2 bracci)	Photonics	10068	Sorgente luminosa LED; guida a doppio collo d'oca
Sorgente luminosa Highlight 2000	Olympus	5-HL2000	Sorgente luminosa alogena (14,5 V, 90 W); controllo manuale dell'intensità; guida a doppio collo d'oca
Attrezzatura di laboratorio essenziale	Vari	N/A	Pipette, tubi, aghi, siringhe, timer da laboratorio, DPI standard
Software MicroCam	Bresser	N/A	Software standard per l'acquisizione delle immagini
MikroCam 3.0M	Bresser	86000180	CMOS, fotocamera 3,1 MP
Unità filtro Millex-MP	MilliporeSigma	SLMP025SS	Dimensione poro 0,22 µm, membrana PES
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010023	pH 7,4
Promicam Pro 3-5 CP	Promicam	E61MPR937	CMOS, fotocamera ad alto intervallo dinamico, 5 MP
QuickPHOTO	Promicra	N/A	Software standard per l'acquisizione delle immagini
Idrossido di sodio (1 M NaOH)	Fornitore locale	N/A	Per la regolazione del pH e la solubilizzazione durante la preparazione di DTZ
Micrometro da palco	Thorlabs	R1L3S1P	Lunghezza 10 mm; divisioni da 50 µm per la calibrazione
Microscopio stereo SZH10	Olympus	N/A	Obiettivo apocromatico 1x