Metodo colorimetrico Anthrone per la quantificazione del glicogeno nel fegato e nel muscolo scheletrico del ratto

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo colorimetrico anthrone per quantificare il glicogeno nel fegato e nel muscolo scheletrico del ratto attraverso diversi stati metabolici.

Abstract

Il glicogeno è una delle principali riserve intracellulari di glucosio nel fegato e nei muscoli scheletrici e svolge un ruolo fondamentale nel metabolismo dei carboidrati. Il glicogeno epatico è essenziale per preservare l'omeostasi glicemica sistemica, mentre il glicogeno muscolare scheletrico supporta l'attività fisica e la prestazione fisica. La quantificazione accurata del glicogeno tissutale è quindi fondamentale per studi in cui il metabolismo del glicogeno è regolato dinamicamente o patologicamente modificato. Qui descriviamo un metodo colorimetrico anthro affidabile e sensibile per quantificare il contenuto di glicogeno nel fegato e nel muscolo scheletrico del ratto. Il protocollo consiste in passaggi sequenziali, tra cui la digestione alcalina, la deproteinizzazione, la precipitazione del glicogeno, il lavaggio con alcol e lo sviluppo del colore utilizzando il reagente anthrone. L'applicabilità di questo metodo è dimostrata nei ratti sottoposti a tre condizioni fisiologicamente rilevanti: alimentazione ad libitum , digiuno notturno e rinutrizione a breve termine. Questi paradigmi sperimentali catturano stati metabolici chiave associati all'immagazzinamento, all'esaurimento e alla risintesi del glicogeno. L'analisi a western blot ortogonale degli enzimi chiave, glicogeno-sintasi e glicogeno fosforilasi, fornisce supporto meccanicistico ai cambiamenti metabolici osservati. L'applicabilità di questo metodo è ulteriormente dimostrata negli animali trattati con epinefrina per modellare la degradazione acuta del glicogeno indotta dallo stress. Nel complesso, questo metodo fornisce un ampio intervallo dinamico e una sensibilità sufficiente per quantificare il glicogeno tissutale attraverso stati fisiologici marcatamente diversi. Offre uno strumento affidabile per indagare il metabolismo del glicogeno in vivo e può essere applicato anche a modelli di coltura cellulare in vitro.

Introduzione

Il glicogeno è un polisaccaride altamente ramificato che funge da importante riserva energetica nel muscolo scheletrico e nel fegato dei mammiferi, e in misura minore in altri organi come il cervello, i reni, il cuore e il tessuto^{adiposo 1}. Durante l'alimentazione, il glucosio in eccesso subisce polimerizzazione o lipogenesi de novo , e viene immagazzinato sotto forma di glicogeno o lipidi. Tuttavia, durante il digiuno o lo sforzo fisico, il glicogeno subisce degradazione enzimatica, garantendo un apporto costante e rapido di glucosio per soddisfare il fabbisogno energetico. Questa capacità tampone del glicogeno è essenziale per mantenere l'omeostasi glicemica durante i cicli fisiologici di digiuno e rialimentazione².

La sintesi del glicogeno è catalizzata dalla glicogeno-sintasi (GYS), che esiste in due isoforme mammiferiche: GYS1 e GYS2. GYS1 è espressa prevalentemente nel muscolo scheletrico, mentre GYS2 è l'isoforma epatica. L'attività catalitica di GYS viene soppressa dalla fosforilazione in più siti, incluso Ser641, in condizioni di digiuno, mentre la sua attività viene stimolata durante la defosforilazione in condizioni di alimentazione. La degradazione del glicogeno è catalizzata dalla glicogeno fosforilasi. L'isoforma epatica è PYGL, mentre quella muscolare è PYGM. A differenza del GYS, la loro attività catalitica viene stimolata alla fosforilazione a Ser15 durante il digiuno e viene soppressa alla defosforilazione dopo^{l'alimentazione 3}.

La corretta regolazione del metabolismo del glicogeno è fondamentale per numerosi processi biologici, e il metabolismo del glicogeno disregolato è stato identificato come un fattore causale in molte malattie. In particolare, il metabolismo alterato del glicogeno epatico è associato a vari disturbi metabolici, tra cui le malattie da accumulo di^{glicogeno 4}, il diabete^{di tipo 2 5}, la malattia steatotica epatica ^6,7 associata a disfunzioni metaboliche e una risposta controregolatora compromessa all'ipoglicemia⁸. Inoltre, il glicogeno cerebrale è essenziale per la formazione della memoria^{a lungo termine 9}, mentre il glicogeno muscolare scheletrico è un regolatore chiave della capacità di resistenza¹⁰. Pertanto, una quantificazione accurata del glicogeno tissutale è fondamentale per studi in cui il metabolismo del glicogeno è regolato dinamicamente o patologicamente modificato, consentendo l'indagine dei meccanismi della malattia e la valutazione degli interventi modulatori del glicogeno.

Sono stati segnalati diversi metodi di quantificazione del glicogeno, tra cui il metodo Anthrone^11,12, il metodo dell'amiloglucosidasi¹³, il metodo dell'acido fenolsulfurico¹⁴ e il metodo non invasivo della spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (MRS^{) 15}, ciascuno dei quali presenta alcuni vantaggi e limitazioni. Qui descriviamo un protocollo dettagliato per il metodo colorimetrico dell'anthrone per quantificare il glicogeno nel fegato e nel muscolo scheletrico del ratto (Figura 1). Questo protocollo include passaggi sequenziali di digestione alcalina, deproteinizzazione, precipitazione del glicogeno, lavaggio con alcol e sviluppo del colore tramite reagente anthrone. Questo metodo è semplice, economico e richiede una minima strumentazione specializzata. Per dimostrarne la sensibilità e la riproducibilità, abbiamo calcolato il limite di rilevamento (LOD), il limite di quantificazione (LOQ), nonché il coefficiente di variazione intra-saggio e inter-saggio (CV%), utilizzando una serie di standard di glicogeno. Per dimostrarne l'applicabilità, i livelli di glicogeno nel fegato e nel muscolo scheletrico sono stati valutati in tre condizioni fisiologicamente rilevanti: alimentazione ad libitum, digiuno notturno di 16 ore e rinutrizione a breve termine. Inoltre, il metodo è stato dimostrato utilizzando animali trattati con epinefrina per modellare la degradazione del glicogeno indotta da stress acuto. È stata eseguita un'analisi ortogonale western blot degli enzimi chiave coinvolti nel metabolismo del glicogeno per corroborare i cambiamenti metabolici osservati.

Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro per la quantificazione del glicogeno. Rappresentazione schematica del flusso di lavoro sperimentale per la quantificazione del glicogeno nel fegato e nel muscolo scheletrico. La procedura include la raccolta dei tessuti, la digestione alcalina, la precipitazione proteica, l'isolamento di glicogeno e la rilevazione colorimetrica basata su trono. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

Tutti i protocolli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC; #1905019) presso l'Università Medica di Nanchino.

1. Preparazione dei reagenti

1. Consulta la Tabella dei Materiali per tutti i reagenti utilizzati in questo studio.
2. Prepara tutte le soluzioni prima dell'inizio degli esperimenti.
3. Scala i volumi delle soluzioni secondo necessità.
4. Prepara una soluzione di idrossido di sodio (NaOH) di 1 M
   1. Peso 40 g di pellet NaOH.
   2. Aggiungi i pellet di NaOH a 800 mL di acqua distillata.
   3. Mescolare la soluzione con una barra di vetro finché non rimangono particelle non disciolte alla base del recipiente.
   4. Trasferire la soluzione in una fiaschetta volumetrica da 1 L.
   5. Porta il volume esattamente a 1 L con acqua distillata.
   6. Conservare la soluzione in una bottiglia ben chiusa a temperatura ambiente (RT; 18°C–23°C).
      ATTENZIONE: NaOH è corrosivo. Indossa occhiali protettivi, guanti e camice da laboratorio. I pellet NaOH commerciali non sono puri al 100% e assorbono acqua. Evita l'esposizione prolungata dei pellet all'aria.
5. Prepara una soluzione stock al 20% cloruro di litio (LiCl)
   1. Peso 20 g di polvere LiCl anidro.
   2. Aggiungi la polvere di LiCl a 80 mL di acqua distillata.
   3. Mescolare la soluzione finché non rimangono particelle non disciolte alla base del recipiente.
   4. Trasferire la soluzione in una fiaschetta volumetrica da 100 mL.
   5. Porta il volume esattamente a 100 mL con acqua distillata.
   6. Conserva la soluzione in una bottiglia ben chiusa da RT.
      NOTA: LiCl può irritare la pelle, gli occhi e le vie respiratorie. Indossa occhiali protettivi, guanti e camice da laboratorio. Il LiCl è altamente igroscopico. Minimizza l'esposizione all'aria per prevenire l'assorbimento dell'acqua.
6. Prepara la soluzione di reazione dell'anthrone
   1. Metti 28 mL di acqua distillata in un becher da 1 L.
   2. Aggiungere 72 mL di acido solforico concentrato ad alta purezza (98%) (H₂SO₄) all'acqua.
   3. Lascia raffreddare la miscela fino a diventare RT.
   4. Aggiungi 50 mg di anthrone alla soluzione.
   5. Mescolate finché l'anthrone non si dissolve.
   6. Aggiungi 3 g di tiourea alla soluzione.
   7. Mescolare finché la tiourea non si dissolve.
   8. Trasferisci la soluzione in una bottiglia di vetro ambrata o avvolta in alluminio.
   9. Conserva la soluzione in frigorifero (2°C–8°C) per un massimo di una settimana.
      ATTENZIONE: L'acido solforico è altamente corrosivo, causa gravi ustioni chimiche e reagisce violentemente con l'acqua. Indossa un camice da laboratorio, guanti resistenti ai prodotti chimici e una visiera. Esegui tutti i passaggi in una cappa chimica certificata. La diluizione genera calore intenso. Aggiungi sempre acido all'acqua.
7. Prepara etanolo al 95% contenente 0,1% di LiCl
   1. Aggiungi 95 mL di etanolo assoluto in una bottiglia di vetro.
   2. Aggiungi 4,5 mL di acqua distillata.
   3. Aggiungi 0,5 mL di soluzione stock LiCl al 20%.
   4. Mescola bene.
8. Prepara metanolo all'80% contenente 0,1% di LiCl
   1. Aggiungi 80 mL di metanolo assoluto in una bottiglia di vetro.
   2. Aggiungi 19,5 mL di acqua distillata.
   3. Aggiungi 0,5 mL di soluzione stock LiCl al 20%.
   4. Mescola bene.
9. Prepara una soluzione di acido tricloroacetico (TCA) al 100% (w/v)
   1. Peso 100 g di polvere TCA.
   2. Aggiungi la polvere di TCA a 80 mL di acqua distillata.
   3. Mescola finché non si scioglie.
   4. Trasferire la soluzione in una fiaschetta volumetrica da 100 mL.
   5. Porta il volume esattamente a 100 mL con acqua distillata.
   6. Conserva la soluzione in una bottiglia di vetro ben chiusa al RT.
10. Prepara una soluzione satura di acido benzoico
    1. Aggiungi 0,5 g di cristalli di acido benzoico a 100 mL di acqua distillata in un bicchiere di vetro da 250 mL.
    2. Riscaldare la miscela a 90°C su una piastra calda con mescolamento magnetico continuo.
    3. Continuare a riscaldare finché non rimangono particelle non disciolte alla base del recipiente.
    4. Lascia che la soluzione si raffreddi in RT.
    5. Aspira il supernadante trasparente che è privo di particelle visibili.
    6. Conserva la soluzione in una bottiglia di vetro ben sigillata a RT.
11. Prepara standard di glucosio
    1. Sciogliere 50 mg di glucosio in polvere in una soluzione satura di acido benzoico da 50 mL per preparare una soluzione di 1 mg/mL di brodo.
    2. Preparare standard di glucosio (0, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 e 1 mg/mL) in tubi microcentrifughe da 1,5 mL tramite diluizione seriale con acido benzoico saturo come segue.
       1. Aggiungi 500 μL di soluzione di stock da 1 mg/mL al Tubo 1 per preparare lo standard di 1 mg/mL.
       2. Aggiungere 250 μL di soluzione di soglia e 250 μL di acido benzoico saturo al Tubo 2 per preparare lo standard di 0,5 mg/mL.
       3. Aggiungere 200 μL di soluzione per il tubo 2 e 300 μL di acido benzoico saturo nel tubo 3 per preparare lo standard di 0,2 mg/mL.
       4. Aggiungere 250 μL di soluzione per il tubo 3 e 250 μL di acido benzoico saturo al tubo 4 per preparare lo standard di 0,1 mg/mL.
       5. Aggiungere 250 μL di soluzione per il tubo 4 e 250 μL di acido benzoico saturo nel tubo 5 per preparare lo standard di 0,05 mg/mL.
       6. Aggiungere 200 μL di soluzione per il tubo 5 e 300 μL di acido benzoico saturo al tubo 6 per preparare lo standard di 0,02 mg/mL.
       7. Aggiungere 250 μL di soluzione del tubo 6 e 250 μL di acido benzoico saturo al tubo 7 per preparare lo standard di 0,01 mg/mL.
       8. Aggiungi 500 μL di acido benzoico saturo in un tubo separato per preparare il bianco (0 mg/mL).
    3. Tappa ogni tubo e fai un vortice brevemente per 10 secondi per mescolare a fondo.

2. Trattamento degli animali

1. Allevamento generale
   1. Maschi di ratti Sprague–Dawley domestici (230–270 g) in una struttura animale in condizioni specifiche prive di patogeni (stato di salute VAF/Plus, Charles River Laboratories), certificati liberi da patogeni comuni dei roditori tra cui il virus Sendai, Mycoplasma pulmonis e i parvovirus dei ratti.
   2. Fornisci una dieta standard per il cibo e permetti libero accesso all'acqua.
   3. Mantieni gli animali in un ciclo di 12 ore luce e scure (luci accese alle 08:00 e luci spente alle 20:00).
   4. Mantieni la temperatura di apertura tra 22°C–23°C.
   5. Mantieni l'umidità relativa tra il 30% e il 70%.
2. Digiuno notturno
   1. Trasferire i ratti in normali gabbie abitative.
   2. Rimuovi il cibo e offri libero accesso all'acqua.
   3. Mantieni il digiuno per 16 ore dalle 16:30 alle 08:30 del mattino successivo.
3. Rialimentazione
   1. Fornisci cibo per cibo regolare (200 g) ai ratti a digiuno notturno.
   2. Permette agli animali di nutrirsi ad libitum per 2 ore.
4. Sfida dell'epinefrina
   1. Prepara la soluzione di cloridrato di epinefrina.
      1. Pesa 5 mg di polvere di epinefrina cloridrato utilizzando una bilancia analitica calibrata.
      2. Trasferisci la polvere in un tubo centrifugo da 15 mL e aggiungi 10 mL di soluzione salina.
      3. Tappa il tubo e inverti 10 volte per preparare una soluzione di base da 0,5 mg/mL.
   2. Iniettare intraperitonealmente ai ratti non a digiuno soluzione di cloridrato di epinefrina a un volume di 1 mL/kg di peso corporeo (0,5 mg/kg di peso corporeo⁾³.
      1. Tieni l'animale in posizione di testa bassa per permettere al contenuto addominale di spostarsi cranicalmente.
      2. Inserire un ago calibro 25 nel quadrante inferiore destro dell'addome con un angolo di 45°.
      3. Aspirare per confermare l'assenza di sangue o contenuto enterico prima dell'iniezione.
   3. Iniettare gli animali di controllo intraperitonealmente con soluzione salina a un volume di 1 mL/kg.
   4. Raccogli campioni di sangue delle vene caudali.
      1. Tieni il topo per esporre la coda.
      2. Comprimi e riscalda la coda per 10 secondi per facilitare il flusso sanguigno.
      3. Pungi la vena caudale laterale a 3 cm dalla punta con un ago sterile calibro 25.
      4. Scarta la prima goccia di sangue usando garze pulite per evitare la contaminazione del liquido tissutale.
      5. Raccogli la seconda goccia di sangue per la misurazione della glicemia.
   5. Misura la glicemia usando un glucometro ogni 15 minuti per 60 minuti.
      1. Calibra il glucometro secondo le istruzioni del produttore.
      2. Verifica la precisione del glucometro mensilmente utilizzando soluzioni di controllo.
      3. Conserva le strisce reattive nel contenitore originale per prevenire l'esposizione all'umidità.
      4. Usa le strisce reattive subito dopo la rimozione dal contenitore.
      5. Inserisci una striscia reattiva nel glucometro per attivare automaticamente il misuratore.
      6. Lascia che il campione di sangue entri nella striscia per azione capillare.
      7. Annota il valore di glucosio nel sangue mostrato.

3. Prelievo dei tessuti

1. Eutanasia e preparazione
   1. Eutanasiare gli animali tramite overdose di isoflurano. Metti gli animali in una camera di induzione ed esponili al 5% di isoflurano somministrato al 100% di ossigeno a 2 L/min per almeno 3 minuti.
   2. Verifica la morte confermando la cessazione della respirazione.
   3. Confermare la perdita del riflesso corneale e del riflesso del pizzicamento delle dita dei piedi.
      1. Tocca delicatamente la cornea con un applicatore sterile con punta di cotone per confermare l'assenza di una risposta di battito di ciglia.
      2. Applica una stretta decisa sulla membrana tra le dita della zampa posteriore usando le pinze smussate per confermare l'assenza di una risposta motoria.
   4. Metti il lato ventrale del ratto su un vassoio di dissezione.
   5. Bagna la pelle addominale con etanolo al 75% usando uno spruzzino.
      NOTA: Minimizzare il tempo tra l'eutanasia e la conservazione dei tessuti per ridurre la degradazione del glicogeno causata dall'ischemia post-mortem.
2. Dissezione epatica
   1. Effettuare una piccola incisione nella pelle di circa 1 cm caudale rispetto al processo xifoide.
   2. Estendi l'incisione verso lo sterno.
   3. Separare la pelle dal muscolo sottostante.
   4. Eseguire una laparotomia trasversale bilaterale effettuando un'incisione orizzontale di 4 cm circa 1 cm caudale al processo xifoide e estendendosi lateralmente verso i margini sottocostali sinistro e destro per esporre completamente la cavità addominale.
   5. Identifica il fegato.
   6. Eliminare il lobo mediano destro (Figura 2A).
   7. Pesa il tessuto entro 1 minuto.
   8. Metti il fazzoletto in un contenitore di plastica in polipropilene.
   9. Congela bruscamente il tessuto con ghiaccio secco.
3. Dissezione del muscolo scheletrico
   1. Utilizzare il muscolo gastrocnemio come esemplare rappresentativo perché contiene una popolazione mista di fibre a contrazione rapida e lenta che riflettono le caratteristiche metaboliche e contrattili dell'arto^{posteriore 16}.
   2. Posiziona il topo a pancia in giù.
   3. Eseguire un'incisione longitudinale della pelle lungo la parte posteriore dell'arto posteriore dalla fossa poplitea fino alla tuberosità calcanea.
   4. Separare la pelle.
   5. Identificare e riflettere i muscoli bicipiti femorale e semitendinoso.
      1. Identificare il bicipite femorale come il grande muscolo posizionato lateralmente che copre la metà superiore della coscia posteriore.
      2. Identificare il semitendino come il muscolo stretto simile a una cinghia che corre medialmente lungo la parte posteriore della coscia e si inserisce vicino al ginocchio.
   6. Esponi il muscolo gastrocnemico.
   7. Trasetta il tendine d'Achille al punto di inserimento distale sul calcaneo utilizzando forbici chirurgiche fine.
   8. Separare il muscolo soleo.
   9. Liberare l'attacco prossimale del muscolo gastrocnemio agli epicondili mediali e laterali del femore.
   10. Rimuovere l'intero muscolo gastrocnemio (Figura 2B).
   11. Pesa il tessuto entro 1 minuto.
   12. Metti il fazzoletto in un contenitore di plastica in polipropilene.
   13. Congela bruscamente il tessuto con ghiaccio secco.

Figura 2: Procedure di dissezione del fegato e del muscolo scheletrico. (A) Passaggi sequenziali per esporre la cavità addominale e prelevare tessuto epatico, inclusa incisione cutanea, estensione dell'incisione, separazione della pelle dal muscolo sottostante e laparotomia trasversale. (B) Passaggi sequenziali per isolare il muscolo gastrocnemico, inclusa incisione longitudinale, riflessione dei muscoli sovrastanti, identificazione delle strutture anatomiche ed escissione del muscolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Analisi Colorimetrica del Glicogeno

1. Giorno 1: Digestione alcalina
   1. Aggiungi 0,4 g di tessuto in un tubo centrifuga da 50 mL. È consentita una tolleranza di ± 0,1 g per garantire un rapido processo e minimizzare la degradazione del tessuto.
   2. Aggiungi 10 mL di soluzione NaOH da 1 M al tubo.
   3. Tritate il tessuto con lame o forbici sterili finché i frammenti di tessuto sono di circa 1–2 mm di dimensione.
   4. Metti il tubo in un bagno d'acqua a 95°C ± 5°C.
   5. Incubare per 30 minuti.
   6. Vortice il campione a 2.500 giri/min per 10 secondi ogni 10 minuti durante l'incubazione.
   7. Rimuovi il tubo dal bagno d'acqua.
   8. Lascia raffreddare il campione in RT.
2. Preparazione del lisato per il saggio proteico
   1. Trasferire 1 mL di lisato alcalino a un tubo microcentrifuga utilizzando un pipettore calibrato P1000.
   2. Centrifuga a 8.000 × g per 10 minuti.
   3. Raccogli il soprandante.
   4. Riserva il surnadante per il saggio proteico BCA.
3. Deproteinizzazione mediata dalla TCA
   1. Trasferire 3 mL di lisato alcalino in un tubo centrifuga da 15 mL.
   2. Aggiungi 1 mL di soluzione TCA al 100% (v/v).
   3. Aggiungi 6 mL di acqua distillata per portare il volume totale a 10 mL.
   4. Vortice la miscela a 2.500 giri/min per 10 secondi.
   5. Posiziona il tubo sul ghiaccio (0°C–4°C).
   6. Incubare per 1 ora per precipitare le proteine.
4. Raccolta di soprandanzanti deproteinizzati
   1. Trasferire 1 mL della miscela in un tubo microcentrifuga.
   2. Centrifugare a 8.000 × g per 10 minuti a RT.
   3. Riserva il soprantantante.
5. Precipitazione del glicogeno
   1. Trasferire 0,4 mL del sovrantato in un nuovo tubo microcentrifuga.
   2. Aggiungi 0,8 mL di etanolo al 95% contenente 0,1% di LiCl.
   3. Vortice la miscela a fondo.
   4. Incubare a RT per 16 ore.
6. Giorno 2: Pelleting con glicogeno
   1. Centrifugare il campione a 1.000 × g per 15 minuti a RT per ottenere un pellet bianco di glicogeno bianco compatto e semi-traslucido (Figura 3A e Figura 3B).
   2. Scartate il soprannatante.
7. Primo lavaggio al glicogeno
   1. Aggiungi 1,5 mL di metanolo all'80% contenente lo 0,1% di LiCl al pellet.
   2. Vortice il campione a 2.500 giri/min per 10 secondi.
8. Centrifugazione dopo il lavaggio
   1. Centrifugare a 1.000 × g per 5 minuti a RT.
   2. Scartate il soprannatante.
9. Secondo lavaggio al glicogeno
   1. Ripeti il passaggio del lavaggio una volta.
   2. Rimuovere eventuali residui di liquido aspirando con attenzione utilizzando un pipettor P200 con punta fine per assicurarsi che il pellet di glicogeno rimanga indisturbato.
10. Dissolzione del glicogeno
    1. Aggiungi 0,8 mL di acqua distillata al pellet.
    2. Vortice a 2.500 giri/min fino a ottenere una soluzione chiara e omogenea senza particelle visibili.
11. Preparazione di standard e campioni
    1. Preparare tubi microcentrifughe da 1,5 mL per standard di glucosio, campioni vuoti e sconosciuti in triplice.
       NOTA: Aggiungere reagenti a ciascun tubo secondo la Tabella 1.
    2. Aggiungere 50 μL di ogni standard di glucosio ai tubi designati.
    3. Aggiungi 50 μL di acqua distillata al tubo bianco.
    4. Aggiungi un campione di glicogeno da 50 μL a ogni provetta sconosciuta.
    5. Aggiungi 200 μL di soluzione per la reazione anthrone a ogni tubo.
12. Sviluppo del colore Anthrone e misurazione dell'assorbizione
    1. Vortice tutti i tubi a fondo.
    2. Metti i tubi in un bagno d'acqua a 95°C ± 5°C.
    3. Incubare per 15 minuti.
    4. Rimuovi i tubi e lasciali raffreddare in RT.
    5. Trasferire 200 μL da ogni tubo a una piastra da 96 pozzi.
    6. Misurare l'assorbenza a 620 nm utilizzando un lettore di micropiastre (modalità endpoint, 25°C) con correzione automatica della lunghezza del percorso fino a 1 cm.
    7. La curva standard dovrebbe avere un coefficiente di determinazione (R²) pari a ≥0,995, come determinato dalla regressione lineare, per essere considerata accettabile.
    8. Qualsiasi singolo standard o campione replicato con un CV% di >20% tra le misurazioni triplicate dovrebbe essere considerato inaffidabile e rieseguito.

Figura 3: Isolamento e quantificazione del glicogeno in diversi stati nutrizionali. (A) Immagine rappresentativa di pellet di glicogeno precipitati da campioni di fegato in condizioni di alimentazione, digiuno e refed. (B) Immagine rappresentativa di pellet di glicogeno precipitato da campioni di muscoli scheletrici in condizioni di alimentazione, digiuno e refed. (C) Curva standard generata da standard di glucosio che mostra la relazione lineare tra assorbenza a 620 nm e concentrazione di glucosio. (D) Livelli di glucosio nel sangue in condizioni di alimentazione, digiuno e refed. (E) Contenuto di glicogeno epatico in condizioni di alimentazione, digiuno e refed. (F) Contenuto di glicogeno muscolare scheletrico in condizioni di alimentazione, digiuno e rifezione. I dati sono presentati come media ± SEM (n = 6 per gruppo). L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando l'analisi ordinaria unidirezionale della varianza (ANOVA) con confronti multipli corretti dal metodo di Benjamini–Hochberg. **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001, NS: non significativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Reagenti	0 mg/mL	0,01 mg/mL	0,02 mg/mL	0,05 mg/mL	0,1 mg/mL	0,2 mg/mL	0,5 mg/mL	1 mg/mL	Blank	Campione sconosciuto
Soluzione standard del glucosio	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	–	–
Acqua distillata (H₂O)	–	–	–	–	–	–	–	–	50 μL	–
Campione di glicogeno	–	–	–	–	–	–	–	–	–	50 μL
Soluzione di reazione di Anthrone	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL

Tabella 1: Impostazione della reazione per il saggio colorimetrico sul glicogeno. Impostazione della reazione per standard di glucosio, campioni di glicogeno vuoti e sconosciuti utilizzati nell'analisi colorimetrica di Anthrone. Volumi definiti di standard di glucosio, acqua distillata o campioni di glicogeno sono stati combinati con la soluzione di reazione anthrone prima dell'incubazione e della misurazione dell'assorbimento.

5. Calcolo del contenuto di glicogeno tissutale

NOTA: Normalizzare il glicogeno misurato sia al peso umido del tessuto sia alla massa proteica totale.

1. Determinazione standard della curva e concentrazione
   1. Usa le letture di assorbanza degli otto tubetti standard di glucosio.
   2. Sottrai valori vuoti dalle letture di assorbanza prima di graficarli con le concentrazioni di glucosio.
   3. Adatta una curva di regressione lineare usando la regressione ordinaria dei minimi quadrati in Excel (Figura 3C).
   4. Calcola la concentrazione di glucosio in ciascun campione di glicogeno sconosciuto (C_sconosciuta) interpolando la sua assorbanza sottratta in bianco sulla curva standard lineare usando l'equazione di regressione ottenuta nel Passo 5.1.3.
2. Normalizzazione al peso umido del tessuto
   1. Calcola il contenuto di glicogeno utilizzando la seguente equazione:
      
   2. Definire C_sconosciuto come la concentrazione di glucosio (mg/mL) nel campione di glicogeno sconosciuto determinata nello Passo 5.1.4.
   3. Definisci 0,8 come il volume del campione di glicogeno disciolto (mL) nel Passo 4.10.1.
   4. Definisci 0,9 come fattore utilizzato per convertire il valore del glucosio in valore di glicogeno.
   5. Definisci 2.5 come fattore di diluizione introdotto durante la precipitazione del glicogeno nello Passo 4.5.
   6. Definisci 10 come il fattore di diluizione che tiene conto dell'aliquota di 1 mL analizzato dal totale di 10 mL preparati nello Passo 4.3.3.
   7. Definisci 10/3 come il fattore di diluizione che tiene conto dei 3 mL di aliquota utilizzati dal totale di 10 mL di digestione alcalina preparata nello Passo 4.1.2.
3. Normalizzazione alla massa proteica totale
   1. Calcola il contenuto di glicogeno utilizzando la seguente equazione:
      
   2. Definire C_sconosciuto come la concentrazione di glucosio (mg/mL) nel campione di glicogeno sconosciuto determinata nello Passo 5.1.4.
   3. Definisci 0,8 come il volume del campione di glicogeno disciolto (mL) nel Passo 4.10.1.
   4. Definisci 0,9 come fattore utilizzato per convertire il valore del glucosio in valore di glicogeno.
   5. Definisci 2.5 come fattore di diluizione introdotto durante la precipitazione del glicogeno nello Passo 4.5.
   6. Definisci 10 come il fattore di diluizione che tiene conto dell'aliquota di 1 mL analizzato dal totale di 10 mL preparati nello Passo 4.3.3.
   7. Definisci 1/3 come fattore di correzione che tiene conto dei 3 mL di aliquota usati dalla digestione alcalina nello Passo 4.3.1.
   8. Definisci la concentrazione proteica come la concentrazione di proteine totali (mg/mL) nella digestione alcalina determinata tramite test BCA nello Passo 4.2.4.

6. Western Blot degli enzimi chiave che catalizza il metabolismo del glicogeno

1. Considerazioni generali
   1. Fare riferimento ai protocolli precedentemente descritti per le procedure standard del western^{blot 17,18}.
2. Estrazione proteica
   1. Peso 75 mg di tessuto a ghiaccio rapido. È consentita una tolleranza di ± 25 mg per garantire una rapida elaborazione e ridurre al minimo lo scongelamento dei tessuti.
   2. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi RIPA gelida (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 1% Triton X-100; 0,5% desossicolato di sodio; 0,1% SDS; e 1 mM EDTA) integrato con inibitori di proteasi e fosfatasi.
   3. Omogeneizzare il tessuto utilizzando un omogeneizzatore rotore-statore portatile.
3. Preparazione del lisato
   1. Incubare omogeneati sul ghiaccio per 30 minuti.
   2. Vortice i campioni a 2.500 giri/min per 10 secondi ogni 10 minuti durante l'incubazione.
   3. Centrifugare a 10.000 × g usando un rotore ad angolo fisso per 5 minuti a 4°C.
4. Quantificazione delle proteine
   1. Raccogli il soprandanante come lisato proteico totale.
   2. Esegui un test BCA per determinare la concentrazione proteica.
   3. Preparare standard BSA di 0, 0,025, 0,125, 0,25, 0,5, 0,75 e 1 mg/mL diluiti in RIPA lysis buffer.
   4. In una micropiastra a 96 pozzi, caricare 20 μL di ciascun campione standard o sconosciuto in singoli pozzi.
   5. Aggiungi 200 μL di reagente funzionante BCA (preparato mescolando 50 parti di reagente A con 1 parte di reagente B) in ciascun pozzo.
   6. Incubare la piastra di reazione a 37°C per 30 minuti.
   7. Dopo il raffreddamento a RT (18°C–23°C), misurare l'assorbenza a 562 nm utilizzando un lettore di micropiastre (modalità endpoint, 25°C) con correzione automatica della lunghezza del percorso fino a 1 cm.
5. SDS-PAGE
   1. Mescola 15 μg di proteine con il tampone di caricamento SDS-PAGE.
   2. Riscalda i campioni a 95°C per 5 minuti.
   3. Raffreddare i campioni sul ghiaccio.
   4. Carica i campioni su un gel SDS-PAGE al 10%.
   5. Risolvere le proteine tramite elettroforesi nel tampone in movimento (25 mM Tris, 192 mM glicina e 0,1% SDS).
   6. Fai passare il gel a 100 V costanti finché la fronte del colorante blu di bromofenolo non raggiunge il fondo del gel.
6. Trasferimento e blocco delle proteine
   1. Trasferire proteine a una membrana di nitrocellulosa o PVDF.
   2. Per le membrane di nitrocellulosa, bilanciare la membrana in tampone di trasferimento (25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% metanolo, pH 8,3) per 10 minuti.
   3. Per le membrane PVDF, attiva la membrana per immersione nel 100% di metanolo per 30 secondi, poi equilibra nel tampone di trasferimento per 10 minuti.
   4. Assembla il sandwich di trasferimento nel seguente ordine: spugna, carta filtrante, gel, membrana, carta filtrante, spugna.
   5. Esegui il trasferimento proteico a corrente costante di 200 mA per 90 minuti a 4°C.
   6. Prepara il 3% (p/v) di BSA in TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; e 0,1% Tween-20).
   7. Blocca la membrana a RT per 1 ora con oscillazioni costanti.
      NOTA: Usa BSA invece del latte scremato quando rilevi proteine fosforilate.
7. Incubazione primaria degli anticorpi
   1. Prepara una soluzione primaria di anticorpi in tampone bloccante a una diluizione di 1:1.000.
   2. Incubare la membrana con anticorpo primario a 4°C durante la notte con oscillazioni costanti.
8. Lavaggio
   1. Lava la membrana con TBST.
   2. Ripeti il lavaggio tre volte per 10 minuti ciascuno.
9. Incubazione secondaria degli anticorpi
   1. Prepara anticorpi secondari coniugati con HRP in un tampone bloccante con una diluizione di 1:10.000.
   2. Incubare la membrana a RT per 1 ora con oscillazioni costanti.
10. Lavaggio
    1. Lava la membrana con TBST.
    2. Ripeti il lavaggio tre volte per 10 minuti ciascuno.
11. Rilevamento chemiluminescente
    1. Prepara il substrato chemiluminescente mescolando volumi uguali di luminolo/potenziatore e soluzioni di perossido stabili.
    2. Applicare il substrato a un volume di 0,1 mL/cm di superficie della^{membrana 2} e incubare per 2 minuti a RT su uno shaker orbitale (100 rpm).
    3. Cattura i segnali usando un imager chemiluminescente.
    4. Testare i tempi di esposizione che vanno da 10 a 300 s e selezionare un'esposizione all'interno dell'intervallo di rilevamento lineare per ogni blot.
    5. Verifica la linearità del segnale confermando l'assenza di saturazione dei pixel utilizzando il software integrato dello strumento.
12. Analisi delle immagini
    1. Analizzare l'intensità della banda utilizzando il software ImageJ (versione 1.51, NIH).
    2. Converti le immagini in scala di grigi a 8 bit e applica una sottrazione di sfondo a palla rotolante con un raggio di 50 pixel.
    3. Definire ogni banda usando una regione rettangolare di interesse di dimensioni identiche e sottrarre lo sfondo locale da un'area vuota adiacente per ottenere valori grezzi di densità integrati.
13. Colorazione proteica totale
    1. Incubare la membrana in soluzione di inchiostro indiano allo 0,1% in TBST a RT per 1 ora con oscillazione costante.
    2. Lava la membrana tre volte per 10 minuti ciascuna con TBST.
    3. Quantificare più bande colorate come controlli di carico per normalizzare i segnali di immunoblotting.
       NOTA: Utilizzare la colorazione proteica totale invece dei geni di mantenimento (HKG), poiché l'espressione di HKG può variare in condizioni sperimentali^{diverse 19}.

7. Sensibilità e riproducibilità del metodo

1. Preparazione degli standard del glicogeno
   1. Prepara una soluzione di brodo di glicogeno da 20 mg/mL in 1 M di NaOH.
   2. Prepara una serie di standard di glicogeno (0, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 e 1 mg/mL) in tubi centrifughe da 15 mL tramite diluizione graduale con 1 M NaOH come descritto di seguito.
      1. Prepara il Tubo 1 (1 mg/mL) mescolando una soluzione di 500 μL di stock di glicogeno con 9,5 mL di 1 M di NaOH.
      2. Prepara il Tubo 2 (0,5 mg/mL) mescolando una soluzione di stock di glicogeno da 250 μL con 9,75 mL di 1 M NaOH.
      3. Prepara il Tubo 3 (0,2 mg/mL) mescolando una soluzione di 100 μL di glicogeno con 9,9 mL di 1 M NaOH.
      4. Prepara il Tubo 4 (0,1 mg/mL) mescolando una soluzione di 50 μL di glicogeno con 9,95 mL di 1 M NaOH.
      5. Prepara il Tubo 5 (0,05 mg/mL) mescolando una soluzione di glicogeno da 25 μL con 9,975 mL di 1 M NaOH.
      6. Prepara il Tubo 6 (0,02 mg/mL) mescolando una soluzione di 10 μL di glicogeno con 9,99 mL di 1 M NaOH.
      7. Prepara il Tubo 7 (0,01 mg/mL) mescolando 100 μL di soluzione del Tubo 1 con 9,9 mL di NaOH 1 M.
      8. Preparare il tubo 8 (0,005 mg/mL) mescolando 50 μL di soluzione del tubo 1 con 9,95 mL di 1 M NaOH.
      9. Prepara il cieco (0 mg/mL) aggiungendo 10 mL di 1 M NaOH a un tubo centrifuga da 15 mL.
   3. Tappa ogni tubo e vortice a 2.500 giri/min per 10 secondi di miscelazione.
2. Saggio colorimetrico Anthrone
   1. Estrarre il glicogeno ed eseguire il saggio colorimetrico anthro secondo i passaggi 4.1.4–4.12.6.
   2. Registrare letture di assorbenza a 620 nm (A₆₂₀).
3. Calcolo della concentrazione di glicogeno
   1. Generare la curva standard del glucosio e calcolare la concentrazione di glucosio in ogni campione standard standard (_standard C) come specificato nello Passo 5.1.
   2. Calcola la concentrazione di glicogeno in ogni tubo standard usando la seguente equazione:
      
   3. Definisci_{C standard} come la concentrazione di glucosio (mg/mL) determinata in ogni campione standard.
   4. Definisci 0,8 come il volume del campione di glicogeno (mL).
   5. Definisci 0,9 come fattore per convertire il valore del glucosio in valore di glicogeno.
   6. Definisci 2,5 come fattore di diluimento.
   7. Definisci 10 come il fattore di diluizione che tiene conto dell'aliquota di 1 mL analizzato dal totale di 10 mL preparati nello Passo 4.3.3.
   8. Definisci 1/3 come fattore di correzione che tiene conto dei 3 mL di aliquota usati dalla digestione alcalina nello Passo 4.3.1.
   9. Ripeti l'intera procedura altre tre volte in un giorno, per un totale di quattro corse.
   10. Ripeti le quattro corse in quattro giorni, per un totale di 16 riprese.
4. Calcolo di LOD e LOQ
   1. Traccia tutte le 16 letture di assorbanza sull'asse y rispetto a ciascuna concentrazione standard di glicogeno sull'asse x.
   2. Calcola la curva di regressione lineare e^R2. Una regressione lineare con^{R 2} pari a ≥0,995 è considerata accettabile.
   3. Calcola il LOD e il LOQ usando le seguenti equazioni:
      
      
   4. Definisci σ come l'errore standard della risposta (intercetta y).
   5. Definiamo S come la pendenza della curva di regressione lineare.
5. Calcolo del CV% intra-saggio e inter-saggio
   1. Per ogni standard di glicogeno, calcola la percentuale di CV% intra-saggio dei valori calcolati dalle quattro corse del Giorno 1 utilizzando la seguente equazione:
      
   2. Definisci s₁ come la deviazione standard dei valori rispetto alle quattro corse del Giorno 1.
   3. Definisci come il valore medio delle quattro corse del Giorno 1.
   4. Ripeti questo calcolo per il giorno 2, giorno 3 e giorno 4 per ottenere CV₂,_{CV 3} e_{CV 4}.
   5. Calcola il CV% finale intra-saggio usando la seguente equazione:
      
   6. Calcola il percentuale di CV inter-saghi usando la seguente equazione:
      
   7. Definisci s_inter come la deviazione standard di CV₁, CV₂,_{CV 3} e CV₄.
   8. Definisci come il valore medio di CV₁,_{CV 2},_{CV 3} e CV₄.

Risultati

Livelli di glicogeno muscolare epatico e scheletrico sotto diversi stati nutrizionali

Il digiuno notturno ha ridotto significativamente i livelli di glucosio nel sangue (media ± errore standard della media [SEM]) da 7,9 ± 0,4 mM nei ratti nutriti ad libitum a 5,4 ± 0,3 mM. I livelli di glucosio nel sangue sono stati ripristinati a 8,3 ± 0,1 mM dopo 2 ore di rinutrimento (Figura 3D). In linea con questi cambiamenti, i livelli di glicogeno ...

Discussione

In questo articolo descriviamo un metodo colorimetrico anthrone modificato per quantificare il glicogeno nei tessuti animali. Oltre ai passaggi sequenziali convenzionali di prelievo dei tessuti, digestione alcalina, precipitazione del glicogeno, lavaggio con alcol e sviluppo del colore basato su anthrone, abbiamo incorporato una fase di deproteinizzazione per ridurre l'interferenza di fondo (Figura 1). Abbiamo quindi applicato questo metodo per valutare i ca...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1.5 mL microcentrifuge tubes	LABGIC	BS-15-M	Usato per il campionamento e la preparazione della reazione
15 mL microcentrifuge tubes	LABGIC	BS-150-M-S	Usato per la manipolazione del lisati e le fasi di precipitazione
20X TBST	Solarbio Life Sciences	T1082	Buffer per il lavaggio della membrana in Western blot
37 oC Incubator	Shanghai Jinghong Instrument	HWS-150	Incubazione della piastra BCA
50 mL centrifuge tubes	LABGIC	CT-112-50A	Usato per la digestione e l'estrazione dei tessuti
96-well plate	LABGIC	BS-MP-96W-CL	Misura dell'assorbanza basata su piastre
Analytical balance	Changzhou Xingyun	FA2204N	Pesatura di polveri chimiche
Anthrone	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	A108571	Reagente per il rilevamento colorimetrico del glicogeno
Anti-GYS1 antibody	Proteintech	10566-1-AP	Rilevamento della glicogeno sintasi 1
Anti-GYS2 antibody	Proteintech	22371-1-AP	Rilevamento della glicogeno sintasi 2
Anti-phospho-GYS1/2 (Ser641) antibody	Cell Signaling Technology	47043S	Rilevamento del GYS fosforilato
Anti-phospho-PYGL (Ser15) antibody	Abcam	ab227043	Rilevamento della glicogeno fosforilasi fosforilata
Anti-PYGL antibody	Proteintech	15851-1-AP	Rilevamento della glicogeno fosforilasi epatica
Anti-PYGM antibody	Novus Biologicals	NBP2-16689	Rilevamento della glicogeno fosforilasi muscolare
BCA assay kit	Beyotime	P0012	Quantificazione delle proteine
Benzoic acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	B116255	Preparazione di soluzione satura per gli standard
Blunt forcepts	Shanghai Jinzhong	J42010	Pinzatura delle dita; dissezione dei tessuti
BSA Fraction V	Beyotime	ST023	Agente di blocco in Western blot
Chemiluminescent imager	Tanon	Tanon 5200 Multi	Rilevamento dei segnali del Western blot
Chemiluminescent substrate (ECL)	Beyotime	P0018S	Sviluppo del segnale in Western blot
Distilled water	Beyotime	ST872	Solvente per la preparazione dei reagenti
Epinephrine hydrochloride	Sigma-Aldrich	E4642	Induzione della degradazione del glicogeno in vivo
Ethanol	Macklin	E809065	Precipitazione e lavaggio del glicogeno
Fine surgical scissors	Shanghai Jinzhong	JA2601	Dissezione dei tessuti
Fresco 17 centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002402	Centrifugazione dei campioni
Glucometer	i-SENS	CareSens N	Misura del glucosio nel sangue
Glucometer	i-SENS	CareSens N	Misurazione del livello di glucosio nella vena caudale
Glucometer strips	i-SENS	CareSens N Strips	Misurazione del livello di glucosio nella vena caudale
Glucose	Macklin	G6172	Preparazione della curva standard
Glycogen stock	Beyotime	D0812	Preparazione di una serie di standard di glicogeno
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	31462	Rilevamento degli anticorpi primari
Handheld homogenizer	GreenPrima	PB100	Omogenizzazione dei tessuti
India ink	Sigma-Aldrich	198285	Colorazione totale delle proteine per la normalizzazione
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10	Eutasia animale
Laboratory heating block	Changzhou Guowang	GWJ300-1	Riscaldamento del campione durante gli saggi
Lithium chloride	Macklin	767397	Migliora la precipitazione del glicogeno
Methanol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	M116115	Passo di lavaggio del glicogeno
Microplate reader	BioTek	ELx800	Misura dell'assorbanza a 620 nm
Nitrocellulose membrane	Millipore	HATF04700	Membrana di trasferimento delle proteine
Orbital shaker	DLAB SCIENTIFIC CO.,LTD	SK-O180-S	Incubazione del substrato chemiluminescente
P1000 Pipettor	Thermo Fisher Scientific	4641100N	Trasferimento della soluzione
P200 Pipettor	Thermo Fisher Scientific	4641080N	Rimozione del liquido residuo
Phosphatase inhibitors (PhosSTOP)	Roche	4906845001	Preservazione della fosforilazione delle proteine
Plastic containers (for tissue storage)	Thermo Fisher Scientific	6A0008	Conservazione dei tessuti raccolti
Protease inhibitors cocktail	MCE	HY-K0011	Prevenzione della degradazione delle proteine
RIPA lysis buffer	Beyotime	P0013B	Estrazione delle proteine
SDS-PAGE gel kit	Beyotime	P0012A	Separazione delle proteine
SDS-PAGE loading buffer (6X)	Beyotime	P0015F	Miscela con campioni proteici prima del caricamento nei pozzetti del gel SDS-PAGE
SDS-PAGE running buffer (5x)	Beyotime	P0014D	Elettroforesi SDS-PAGE
Small Animal Anesthesia Machine	RWD Life Science	R500	Eutasia animale
Sodium hydroxide	Macklin	S817977	Digestione dei tessuti ed estrazione del glicogeno
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories	Crl: CD(SD)	Modello animale sperimentale
Spray bottle	Beyotime	TB6310	Applicazione del 75% di etanolo sul pelo dell'animale per l'umidificazione e la disinfezione
Standard chow diet	Jiangsu-Xietong, Inc.	XTI01ZJ-009	Dieta di mantenimento per roditori
Surgical scissors	Shanghai Jinzhong	J22010	Dissezione dei tessuti
Syringe (sterile) with 25-gauge needle	Beyotime