Modelli tumorali trapiantabili clinicamente rilevanti per lo studio del cancro ovarico metastatico e della risposta terapeutica nel topo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo passo dopo passo per stabilire i modelli tumorali intraperitoneali e intrabursali per studiare la progressione, la metasati e la risposta terapeutica del cancro ovarico. Inoltre, descriviamo come utilizzare l'imaging non invasivo a base di luciferasi in vivo in questi modelli per monitorare la progressione tumorale nel topo.

Abstract

Il cancro ovarico metastatico è una malignità ginecologica estremamente letale che manca di opzioni di trattamento efficaci. Lo sviluppo di approcci terapeutici clinicamente traducibili per i pazienti con cancro ovarico dipende dalla comprensione dei fattori che guidano la metastasi del cancro ovarico. Sebbene la maggior parte dei tumori solidi presenti metastasi ematogene, le cellule tumorali ovariche si diffondono principalmente attraverso la via intraperitoneale. Questo processo comporta il distacco e la dispersione delle cellule tumorali dal tumore primario nella cavità peritoneale, che acquisiscono proprietà che permettono loro di resistere all'anoikis e formare aggregati multicellulari. Questi aggregati cellulari si attaccano e invadono il rivestimento mesoteliale del peritoneo, formando lesioni metastatiche. I modelli in vivo clinicamente rilevanti sono essenziali per comprendere come i fattori cellulari e il microambiente tumorale influenzino i diversi passaggi del processo metastatico e per testare nuove strategie terapeutiche. Due modelli di tumori topini trapiantabili ampiamente utilizzati per studiare la metastasi e la risposta terapeutica del cancro ovarico sono i modelli intraperitoneale e intrabursale. In questo rapporto, descriviamo la metodologia passo dopo passo per stabilire questi modelli e ne evidenziiamo vantaggi e limiti. Inoltre, descriviamo come utilizzare l'imaging bioluminescente per monitorare in modo non invasivo la progressione tumorale utilizzando questi modelli.

Introduzione

Nonostante i notevoli progressi nella comprensione dei fattori che guidano la progressione del cancro ovarico, il cancro ovarico rimane la seconda malignità ginecologica più letale negli Stati^Uniti. A causa della mancanza di sintomi evidenti e dell'assenza di marcatori diagnostici precoci affidabili, oltre il 70 percento dei pazienti con cancro ovarico presenta una malattia metastatica avanzata alla^{diagnosi 2,3}. Le terapie attuali non sono efficaci nel trattamento del cancro ovarico metastatico e, di conseguenza, i tassi di sopravvivenza a 5 anni per i pazienti con malattia in stadio avanzato rimangono inferiori al^{30 percento 4}. Una delle principali cause della mancanza di successo terapeutico è l'emergere della chemioresistenza⁵. Pertanto, è urgente identificare i fattori che guidano la metastasi e la chemioresistenza al cancro ovarico. Affrontare questa lacuna di conoscenza sarà fondamentale per sviluppare strategie terapeutiche più efficaci per colpire questa malattia. Per raggiungere questi obiettivi, abbiamo bisogno di modelli in vivo che imitino accuratamente le fasi chiave della progressione del cancro ovarico.

Sebbene le linee cellulari del cancro ovarico e i modelli in vitro tridimensionali abbiano contribuito enormemente alla comprensione dei fattori che influenzano la metastasi e la risposta terapeutica, questi modelli presentano diverse ^{limitazioni 6,7,8}. Ad esempio, questi modelli non tengono conto delle diverse cellule non cancerose che fanno parte del microambiente tumorale, né catturano le complesse interazioni che avvengono all'interno del microambiente ^{tumorale 6,7,8}. Inoltre, è estremamente difficile studiare i fattori sistemici e il loro impatto sulla progressione tumorale e sulla risposta farmacologica utilizzando i modelli in^{vitro 6,7,8}. Queste limitazioni dei modelli in vitro evidenziano la necessità di modelli in vivo che imitino accuratamente i vari passaggi della metastasi del cancro ovarico, incluse interazioni complesse con altri tipi cellulari e fattori all'interno del suo microambiente.

I modelli murini geneticamente modificati (GEMM) offrono una piattaforma in vivo in cui i tumori sorgono spontaneamente in un microambiente naturale con un sistema immunitario^{intatto 9}. Tuttavia, sono dispendiosi in termini di tempo, impegnativi e costosi da generare e mantenere¹⁰. La maggior parte dei GEMM del tumore ovarico ha anche un lungo periodo di latenza per lo sviluppo del tumore, il che rende il lavoro con essi lungo e costoso, anche dopo che sono stati^{generati 10}. I modelli trapiantabili, come quelli xenoinnesti e alloinnesti, offrono un buon equilibrio tra rilevanza biologica e facilità sperimentale, e spesso sono molto meno costosi da generare rispetto ai^{GEMMs 11}. Oltre ad avere una latenza inferiore rispetto ai GEMM, la facilità con cui le cellule tumorali possono essere modificate geneticamente in vitro rende questi modelli comodi e adatti per studiare come diversi fattori genetici influenzino la progressione^{tumorale 10}. Grazie a questi benefici, i modelli di tumori trapiantabili sono emersi come strumenti preziosi sia per la ricerca di base che per quella traslazionale nel cancro ovarico.

In questo rapporto, descriviamo il protocollo per stabilire due diversi modelli di tumori di topo trapiantabili ampiamente utilizzati per studiare il cancro ovarico metastatico: (1) il modello intraperitoneale e (2) il modello ortotopico o intrabursale. Entrambi i modelli possono essere stabiliti come xenoinnesti o alloinnesti. Nel modello intraperitoneale, le cellule tumorali vengono iniettate nella cavità peritoneale dei topi. L'introduzione delle cellule del cancro ovarico nello spazio intraperitoneale rispecchia la fase della metastasi del cancro ovarico, in cui le cellule metastatiche vengono rilasciate dal tumore primario nella cavità peritoneale. Similmente al processo metastatico negli esseri umani, queste cellule tumorali ovariche trapiantate dovranno adattarsi al microambiente peritoneale ostile, attaccarsi e invadere lo strato mesoteliale che riveste la cavità peritoneale e formare lesioni metastatiche su organi e tessuti intraperitoneali come omento, mesenterio, fegato e diaframma. A seconda della linea cellulare tumorale utilizzata per generare il modello intraperitoneale, i tumori metastatici possono essere accompagnati da ascite, come osservato nelle malattie in stadio avanzato negli esseri umani. Pertanto, il modello intraperitoneale è stato ampiamente utilizzato per comprendere i fattori che guidano la metastasi del cancro ovarico e la loro progressione verso la malattia in stadio^{avanzato 12}. Questi modelli sono inoltre utili per determinare l'efficacia di nuove strategie terapeutiche per il cancro ovarico^{metastatico 12}. Nel modello intrabursale o ortotopico, le cellule tumorali vengono impiantate nella bursa, una struttura membranosa che circonda l'ovaio del topo. Questo modello imita le fasi iniziali della tumorigenesi e della metastasi ovarica. A questo stadio le cellule tumorali sono ancora confinate nella tuba di Falloppio e nell'ovaio. È da questi siti che le cellule tumorali vengono rilasciate nella cavità peritoneale, metastatizzando infine ad altri organi. Pertanto, il modello intrabursale è utile per studiare sia le fasi iniziali della tumorigenesi ovarica sia gli eventi che portano alla loro successiva metastasi transcoelomica attraverso la cavità^{peritoneale 12}.

Pertanto, sebbene sia i modelli intraperitoneali che quelli intrabursali siano strumenti eccellenti per studiare la metastasi e la risposta terapeutica del cancro ovarico, differiscono nello stadio specifico lungo il processo metastatico che imitano. Sebbene i modelli intrabursali possano imitare la progressione del cancro ovarico dalle fasi iniziali a quelle successive del processo metastastico, a causa della latenza associata a questo processo, sono solitamente utilizzati per studiare gli eventi precoci nelle metastasi del cancro ovarico. Per studi focalizzati sulle fasi avanzate della metastasi del cancro ovarico, il modello intraperitoneale è più adatto. Inoltre, il modello intrabursale è tecnicamente più difficile da stabilire rispetto al modello^{intraperitoneale 12}. L'istituzione del modello intrabursal richiede l'accesso a una sala operatoria dotata di apparecchiature microchirurgiche che permetta l'iniezione precisa di cellule tumorali nella borsa ovarica. La capacità delle cellule tumorali di stabilire tumori ("tasso di assorbimento" o "tasso di ingerto") è anche solitamente inferiore nei modelli intrabursali rispetto a quelli intraperitoneali. Inoltre, poiché i tumori non possono essere facilmente osservati dopo iniezioni ortotopiche o intraperitoneali, viene tipicamente impiegata una tecnica di imaging bioluminescente non invasiva per monitorare la progressione tumorale. Pertanto, sia i modelli intraperitoneali che quelli intrabursali richiedono apparecchiature aggiuntive che permettano l'imaging non invasivo dei^{tumori 12}. In definitiva, gli obiettivi sperimentali, la disponibilità di risorse e le competenze tecniche determineranno la scelta del modello per ogni studio.

Questo rapporto descrive il protocollo passo dopo passo per stabilire modelli di xenoinnesti intraperitoneali e intrabursali di topo utilizzando linee cellulari di cancro ovarico umano. Questi modelli possono essere stabiliti trapiantando le cellule in ceppi di topo immunocompromessi, come NSG (NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ) o il nudo di Foxn1 (B6. Cg-Foxn1 nu/J). Lo stesso metodo può essere adattato per generare modelli alloinnesti (singeneici). Durante l'elaborazione dei modelli allotrapi, le cellule tumorali ovariche del topo vengono impiantate in topi immunocompetenti dello stesso background genetico. Poiché i modelli allotrapiati vengono sviluppati utilizzando topi immunocompetenti, sono utili per studiare come diversi fattori regolano il microambiente tumorale ovarico, il ruolo del sistema immunitario nella progressione del cancro ovarico e l'efficacia dell'immunoterapia. Oltre a stabilire i modelli topini xenoinnesti intraperitoneali e intrabursali, questo rapporto descrive anche come utilizzare l'imaging bioluminescente per monitorare in modo non invasivo la progressione tumorale in questi modelli.

Protocollo

Tutte le procedure animali descritte in questo protocollo sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Maryland, Contea di Baltimora (Investigatore Principale - Achuth Padmanabhan; Numero di protocollo - 1947).  L'elenco completo dei materiali e delle attrezzature utilizzate in questo protocollo e i loro numeri di catalogo sono forniti nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione delle linee cellulari del cancro ovarico per il trapianto nel topo

Nota: Per tutti i modelli in vivo descritti in questo protocollo, le cellule tumorali ovariche devono essere preparate per il trapianto nel topo. Le cellule tumorali ovariche devono essere preparate in un cappuccio per coltura tissutale a flusso laminare come descritto di seguito a temperatura ambiente, salvo indicazione:

1. Coltivare cellule tumorali ovariche a 37 ^°C in un incubatore di_CO2 con camicia d'acqua mantenuto al 5% di CO₂ utilizzando un substrato standard come raccomandato in letteratura. Se si desidera l'imaging in vivo non invasivo del tumore, le cellule tumorali ovariche devono essere modificate per esprimere stabilmente la luciferasi prima del trapianto.
2. Quando le cellule raggiungono circa l'80%–85% di confluenza, si prelevano in condizioni sterili, come descritto di seguito:
   1. Aspira il substrato dalla piastra di coltura tissutale.
   2. Lavare due volte le cellule aderenti con soluzione salina 1X tamponata con fosfato (PBS) sterile senza calcio e magnesio. La presenza di calcio e magnesio nel PBS può interferire con l'attività della tripsina e favorisce l'adesione cellulare. Aspira il PBS dalla piastra di coltura tissutale.
   3. Aggiungi lo 0,05% di tripsina-EDTA sulla piastra di coltura tissutale. La quantità di tripsina da utilizzare dipenderà dalla dimensione della piastra di coltura e dalla linea cellulare su cui si lavora. Per la maggior parte delle linee cellulari che crescono su una piastra da 100 mm, si utilizza 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,05%. Per linee cellulari di cancro ovarico fortemente aderenti come OVCA420, si raccomanda 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,25%.
   4. Trasferire la piastra con le cellule nell'incubatrice di_CO2 con guaina ad acqua da 37 ^°Cutilizzata per la coltura dei tessuti e incubare per 1–5 minuti. Il tempo esatto di incubazione richiesto dipenderà dalla linea cellulare. Alcune linee cellulari, come TYK-Nu e HEYA8, si staccano molto rapidamente (1–2 minuti), mentre altre, come OVCA420, impiegano più tempo (4–5 minuti).
   5. Una volta staccate le cellule, si aggiungono substrati contenenti FBS per fermare l'azione della tripsina. Aggiungi 6 mL di substrato contenente FBS per ogni 1 mL di tripsina. Pipetta delicatamente su e giù per staccare le cellule dalla piastra di coltura e dissociarle in una sospensione monocellulare.
      Nota: Quando osservate al microscopio a campo chiaro invertito, le cellule staccate appariranno arrotondate (invece che piatte/allungate) e fluttueranno liberamente invece di essere attaccate al fondo della placca.
   6. Raccogli le celle in un tubo conico e centrifuga a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   7. Rimuovere il surnante contenente tripsina e risospendere la pellet cellulare in un mezzo di coltura cellulare fresco contenente FBS.
3. Contare le cellule utilizzando un colorante di vitalità cellulare come il blu di tripano e un emocitometro. In alternativa, si può utilizzare un contatore automatico delle celle per contare le celle.
4. Ricostituire le cellule in un volume definito di PBS sterile 1X (pH 7,4) in modo che si raggiunga la concentrazione desiderata di cellule per unità di volume. Il numero raccomandato di cellule da iniettare per le linee cellulari di cancro ovarico umano comunemente utilizzate è indicato nella Tabella^1-13.
   Nota: Il volume massimo che può essere iniettato in sicurezza nei topi dipende dal modello. Per il modello intraperitoneale, il volume massimo raccomandato è di 500 μL (vedi sezione 2.1). Per il modello intrabursale, il volume massimo raccomandato è di 5 μL (vedi sezione 2.2).
5. Tieni la sospensione cellulare sul ghiaccio fino al momento di iniettarla nei topi. Iniettare le cellule nei topi il prima possibile, preferibilmente entro 30–45 minuti dalla preparazione delle cellule.

2. Stabilimento di modelli trapiantabili di cancro ovarico nel topo

1. Stabilimento del modello intraperitoneale del cancro ovarico
   Nota: In questo processo, cellule tumorali ovariche che esprimono stabilmente luciferasi vengono iniettate nella cavità peritoneale di una femmina adulta di topo. L'utilizzo di cellule che esprimono la luciferasi in modo stabile permetterà un monitoraggio longitudinale e non invasivo della progressione tumorale con il Sistema di Imaging In Vivo (IVIS).
   1. Preparare le celle come descritto nella sezione 1. Risospendere delicatamente le cellule con una micropipetta da 1000 μL e assicurarsi che le cellule rimangano dissociate.
      Nota: Il mancato spostamento dei grumi causerà l'ostruzione degli aghi.
   2. Preleva 500 μL di sospensione a celle in una siringa da 1 mL e attacca un ago da 21G x 1 pollice. Assicurati che non ci siano bolle d'aria nella siringa.
      Nota: Il volume massimo che può essere iniettato intraperitonealmente in una femmina adulta di topo (25–30 g) è di 500 μL. Pertanto, si risospendono le celle in un volume tale che il numero richiesto di celle sia contenuto in un volume massimo di 500 μL. Il numero raccomandato di cellule da iniettare per le linee cellulari di cancro ovarico umano comunemente utilizzate è indicato nella Tabella^1-13.
      Nota: Se il topo pesa tra 20 e 25 g, si consiglia iniettare un volume minore (meno di 400 μL).
   3. Rimuovi l'animale dalla gabbia e mettilo su una superficie ruvida o con filo per immobilizzarlo.
   4. Trattieni il topo accarezzando delicatamente la pelle flaccida alla base del collo con la mano non dominante come mostrato nella Figura 1A.
   5. Solleva delicatamente il topo e giralo in modo che il suo lato ventrale sia rivolto verso l'alto. Fissare la coda dell'animale con le dita come mostrato nella Figura 1B.
   6. Disegna una linea immaginaria al centro dell'addome. Per localizzare il sito dell'iniezione, immagina un triangolo tra la linea mediana e i due capezzoli nel quadrante inferiore destro. Assicurati che il sito di iniezione sia al centro di questo triangolo immaginario. Consulta la Figura 1B.
   7. Inclina leggermente la testa del topo verso terra, facendola scendere più in basso rispetto al posteriore. Immobilizzare il topo in questa posizione aiuta il contenuto addominale a spostarsi cranialmente. Questo riduce il rischio di perforare gli organi interni durante l'iniezione.
   8. Usa un tampone sterile di alcol per pulire l'area dell'iniezione.
   9. Con la mano dominante, inserire l'ago nel sito di iniezione con un angolo di 45° o meno. Avanza solo di 0,5 pollici e non più della metà della lunghezza dell'ago. Assicurati che l'ago rimanga stabile, poiché il movimento nella cavità addominale può causare lesioni agli organi interni.
   10. Dispensa le cellule a un ritmo lento e costante nella cavità addominale del topo.
   11. Tira fuori l'ago dal topo con lo stesso angolo di inserimento. Posiziona immediatamente un manometro sterilizzato sul sito di iniezione per evitare perdite.
   12. Getta l'ago e la siringa nel contenitore appropriato per oggetti taglienti.
   13. Prima di mettere il topo nella gabbia, taggialo con il metodo preferito. Il tagging auricolare permetterà di identificare successivamente il topo iniettato.
2. Definizione del modello intrabursale del cancro ovarico
   Nota: Nel modello intrabursale, le cellule tumorali ovariche che esprimono stabilmente luciferasi vengono iniettate direttamente nella borsa ovarica di una topo adulta. La bursa è un sacco membranoso che circonda le ovaie murine. L'espressione stabile della luciferasi nelle cellule tumorali ovariche permetterà un monitoraggio longitudinale non invasivo della progressione tumorale tramite IVIS.
   1. Giorno 1 – Preparazione dell'attrezzatura e del topo per l'intervento di trapianto intrabursale
      1. Autoclave: gli strumenti necessari per l'intervento. L'elenco degli strumenti è (Figura 2A):
         Forbici a punta fine, pinze curve a punta fine da 5 pollici, portaago per ago Mayo-Heger, micropinze per gioielliere dissezionatori, punta fine, strumenti per sezionare pinze con punte fini
      2. Somministrare analgesia preoperatoria di carprofene (15 mg/Kg) ogni 24 ore tramite iniezione sottocutanea nel topo.
         Nota: somministrare l'analgesico carprofene sottocutaneamente ogni 24 ore, iniziando 1 giorno prima dell'intervento e proseguendo per 3 giorni dopo l'intervento.
   2. Giorno 2 – Trapianto intrabursale di cellule tumorali ovariche in un topo
      1. Preparare le cellule del tumore ovarico per l'iniezione come descritto nella sezione I. Il volume massimo che può essere iniettato in sicurezza intraborsalimente in un topo è di 5 μL. Pertanto, è preferibile avere cellule a una concentrazione di 10⁴ cellule/μL. Questo permetterà il trapianto di 5 x 10⁴ cellule.
         Nota: Il numero raccomandato di cellule da iniettare per le linee cellulari di cancro ovarico umano comunemente utilizzate è indicato nella Tabella^1-13.
      2. Tieni le celle sul ghiaccio fino all'uso. Una volta prelevata, si raccomanda di iniettare le cellule il prima possibile, preferibilmente entro 30–45 minuti.
      3. Indurre l'anestesia inserendo il topo in una camera di isoflurano con una portata di isoflurano del 4 percento e una portata di ossigeno di 3,5 L/min. Conferma che il topo sia anestetizzato controllando l'immobilizzazione e l'assenza del riflesso del pizzicotto del dito del piede.
      4. Trasferire il topo anestetizzato su una panglia chirurgica sterile che viene posta sopra una borsa riscaldante per roditori mantenuta a 37 °C. Posiziona rapidamente un cono nasale e mantieni l'anestesia con 1,5% di isoflurano e 98,5% di ossigeno. Assicurati che il topo sia anestetizzato confermando l'assenza del riflesso del pizzicotto del dito del piede.
      5. Assicurati che il topo rimanga anestetizzato durante tutta la procedura confermando l'assenza del riflesso del pizzicotto ogni 15 minuti. Monitora la frequenza respiratoria del topo durante l'anestesia per assicurarti che sia lenta e regolare. Se la frequenza respiratoria cambia, regola la dose di isoflurano. Se il topo mostra difficoltà respiratorie o ansima, ridurre la dose. Al contrario, se il topo mostra un aumento della frequenza respiratoria, aumentare leggermente la dose di isoflurano.
         Nota: Evita di tenere il topo sotto anestesia per più di 40 minuti. Per raggiungere questo obiettivo, è importante essere efficienti e rapidi durante l'intervento.
      6. Posizionare il topo con il lato in cui le cellule del cancro ovarico devono essere trapiantate intrabursamente, rivolto verso l'alto come mostrato nella Figura 2B.
      7. Applica la pomata per gli occhi su entrambi gli occhi del topo per proteggerli dall'essiccazione (disidratazione corneale).
      8. Se il topo ha il pelo, rasa i peli sulla metà inferiore del topo, sul lato rivolto verso l'alto. Pulisci bene la zona rasata e posiziona il mouse su un nuovo tappeto sterile. Se lavori con il Foxn1 nudo (B6. Cg-Foxn1 nu/J) stirpe di topoli, saltare questo passaggio.
      9. Usa un panno chirurgico sterile per coprire il topo in modo che venga rivelata solo la metà inferiore del corpo.
      10. Lava bene le mani con il sapone prima dell'inizio dell'intervento e indossa un paio nuovo di guanti chirurgici sterili. Evita di toccare aree o oggetti non sterili dopo aver indossato i guanti chirurgici.
      11. Utilizza un applicatore sterile a punta di cotone per applicare il liquido di betadine sul sito chirurgico in un movimento circolare in senso orario dall'interno verso l'esterno. Successivamente, usa un tampone alcolico sterile per pulire la stessa zona in modo simile. Ripeti questa procedura altre due volte.
          Nota: Non toccare oggetti o aree non sterili durante l'intervento chirurgico. Sostituire immediatamente i guanti se avviene contatto con una superficie non sterile. È fortemente consigliato avere un'altra persona che possa aiutare durante l'iniezione intrabursale. Questa persona può aiutare a maneggiare oggetti non sterili durante l'intervento.
      12. Aspetta 1 minuto che l'alcol si asciughi.
      13. Individuare il sito che si trova a circa 1,5 cm sopra la zampa posteriore e a 5 mm dalla gabbia toracica del topo, come mostrato nella Figura 2B. Sollevare la pelle in questo punto con la pinza curva, poi fare un'incisione verticale di 5 mm con una forbice a punta fine.
          Nota: Prima di effettuare l'incisione, assicurati che il topo sia completamente sotto l'effetto dell'anestesia confermando l'assenza del riflesso del pizzicamento del dito dei piedi.
      14. Tieni la pelle da un lato con una micropinza a punta fine e fai un'incisione nel tessuto sottocutaneo nello stesso punto.
      15. A questo punto, lo strato peritoneale sotto il tessuto sottocutaneo diventerà visibile. Utilizzare una pinza fine, curva e seghettata per tenere lo strato peritoneale, e realizzare un'incisione lunga circa 2,5 mm con forbici a punta fine.
      16. Tieni il lato del lembo dell'incisione peritoneale con le pinze seghettate e localizza il cuscinetto adiposo ovarico usando una pinza fine. L'ovaio si trova sotto il cuscinetto adiposo.
      17. Tira delicatamente fuori un po' del cuscinetto adiposo ovarico insieme all'ovaio attraverso l'incisione.
      18. Usa la pinza disezionante per tenere il cuscinetto adiposo in modo che l'ovaio sia rivolto verso l'alto e immobile.
          Nota: Non tenere l'ovaio con la pinza. Usa sempre le pinze seghettate per tenere il cuscinetto adiposo perché il tessuto è scivoloso.
      19. Chiedi alla persona che assiste di preparare la siringa contenente la sospensione cellulare. Si consiglia l'uso di una siringa di insulina da 0,3 mL.
      20. Inserisci delicatamente l'ago con la smussatura rivolta verso l'alto nella borsa ovarica dalla giunzione tra la tuba di Falloppio e l'ovaio. Assicurati che tutto lo smusso vada all'interno della borsa prima di premere lo sturalavandini.
          Nota: Fai attenzione a non perforare la borsa all'estremità opposta del sito di inserimento.
      21. Spingi delicatamente lo sturalavandini e trasferisci il contenuto della siringa nella borsa ovarica. Rimuovi l'ago rapidamente.
      22. Il gonfiore della borsa che circonda l'ovaio indica un'inoculazione riuscita delle cellule.
      23. Aspetta 5 secondi e poi rimetti delicatamente l'ovaio nella cavità peritoneale.
      24. Chiudi il peritoneo usando una sutura monofilament assorbibile 6-0 con uno o due semplici punti chirurgici interruti.
      25. Chiudi l'incisione cutanea usando la sutura monofilament assorbibile 6-0 con un semplice punto chirurgico in movimento. Assicurati che non ci siano sanguinamenti dal sito dell'incisione.
      26. Applicare una tripla pomata antibiotica (Bacitracina, Neomicina e Polimixina B) sul sito dell'incisione dopo averla chiusa.
      27. Somministrare Carprofen 15 mg/Kg sottocutaneamente al topo per alleviare il dolore.
      28. Ear tag al topo usando il metodo preferito. Il tagging auricolare permetterà di identificare successivamente il topo iniettato.
      29. Trasferisci il topo in una gabbia nuova. Metti questa gabbia con metà su una borsa riscaldante per almeno 60 minuti. Assicurati che l'effetto dell'anestesia sia completamente svanito a questo punto e che il topo sia sveglio e attivo.
          Nota: I topi sono soggetti all'ipotermia sotto anestesia. Perciò, è importante fornire calore esterno per regolare la temperatura corporea.
      30. Controlla i topi dopo 4-5 ore dall'intervento per eventuali segni di sanguinamento dal sito dell'incisione o altro fastidio.
      31. Somministrare al topo carprofene 15 mg/Kg per via sottocutanea ogni 24 ore per i successivi 3 giorni.
      32. Se le cellule inoculate sono geneticamente modificate per esprimere stabilmente la luciferasi, allora il carico tumorale può essere misurato tramite IVIS dal primo giorno dopo l'iniezione, come descritto nella sezione 3.

3. Imaging non invasivo di un tumore del topo utilizzando il Sistema di Imaging In Vivo (IVIS)

Un obiettivo importante in diversi studi che utilizzano i modelli tumorali trapiantabili descritti in questo rapporto è ottenere dati longitudinali sulla progressione tumorale. Sebbene il volume dei tumori sottocutanei possa essere stimato con un calibro vernier, questa non è un'opzione valida per tumori formati utilizzando i modelli intraperitoneale e intrabursali. Per superare questa sfida e determinare il carico tumorale intraperitoneale, la maggior parte dei laboratori utilizza immagini bioluminescente non invasive a base di luciferasi. Per renderlo possibile, le cellule tumorali trapiantate sono ingegnerizzate per esprimere stabilmente la luciferasi, che produce bioluminescenza durante l'amministrazione del substrato, la D-luciferina. La bioluminescenza viene rilevata in modo non invasivo utilizzando un Sistema di Imaging In Vivo (IVIS). Questo segnale viene poi quantificato per monitorare il carico tumorale e rivelare informazioni sulle metastasi e sull'efficacia terapeutica dei farmaci. Di seguito, descriviamo il protocollo per monitorare il carico tumorale tramite imaging bioluminescente non invasivo a base di luciferasi con IVIS nei topi.

1. Preparazione del substrato di D-luciferina
   1. Prepara una soluzione di 15 mg/mL di D-luciferina in 1X PBS (pH 7,4) in condizioni sterili.
   2. Sterilizza la soluzione tramite filtro usando un filtro da 0,22 μm.
   3. Avvolgi la soluzione in carta stagnola per proteggerla dalla luce fino all'uso.
2. Inizializzazione dell'imager IVIS per l'acquisizione dell'immagine
   1. Apri il software "living image" sul computer collegato all'imager IVIS e accedi.
   2. L'imager deve essere inizializzato per l'acquisizione dell'immagine. Questo avviene come segue:
      1. Al momento dell'accesso, si aprirà una finestra del pannello di controllo IVIS come mostrato nella Figura 3A.
      2. Clicca sul pulsante "inizializza" situato sul lato destro in basso della finestra (Figura 3A). Ci vorranno un paio di minuti perché il sistema si iniziali.
         Nota: Inizialmente, la barra della temperatura nella parte inferiore della finestra diventa rossa, indicando che la fotocamera d'imaging sta raggiungendo la temperatura obiettivo di -90 °C (Figura 3B).
      3. Quando la fotocamera raggiunge la temperatura obiettivo (-90 °C), la barra della temperatura diventa verde e lo stato del sistema indica "Pronto all'uso" (Figura 3C). Ora l'imager è pronto per l'imaging del mouse.
         Nota: Il tempo di esposizione, il binning e il f/stop possono essere regolati secondo le esigenze dell'utente.
3. Preparazione del topo per l'imaging IVIS
   Prima di immaginare il topo, la D-luciferina deve essere iniettata intraperitoneale.
   1. Togli il topo dalla gabbia e posizionalo su una superficie ruvida o con filo metallico. Scocca delicatamente i topi con la barba per immobilizzarli correttamente come descritto nella sezione 2.1.
   2. Prendi il mouse e giralo in modo che il lato ventrale sia rivolto verso l'alto.
      Nota: Se il topo è correttamente trattenuto, tutte e quattro le zampe si estenderanno verso l'esterno quando lo raccoglie, come mostrato nella Figura 1B. Tieni la coda tra le dita come misura extra di contenzione durante la procedura.
   3. Utilizzare un tampone alcolico sterile per pulire il sito di iniezione come previsto dal protocollo di iniezione intraperitoneale della sezione 2.1.
   4. Utilizzare una siringa da 1 ml di TB e un ago da 30 g e mezzo pollice per iniettare intraperitonealmente un volume appropriato di D-luciferina dalla soluzione originale e ottenere una dose finale di 150 mg/kg di D-luciferina.
      Nota: Consulta il protocollo di iniezione intraperitoneale nella sezione 2.1 per le istruzioni su come eseguire l'iniezione intraperitoneale. Se si utilizzano topi C57BL/6 (per modelli di alloinnesti singenici), è fortemente raccomandato rimuovere il pelo prima di effettuare immagini bioluminescenze tramite IVIS. Il pelo nero e la pelle pigmentata attenuano significativamente la luce, riducendo l'intensità del segnale.
   5. Rimetti delicatamente il topo nella gabbia. Il tempo esatto di attesa e il tempo di esposizione dovranno essere determinati empiricamente. Questo può essere determinato come segue.
      1. Anestesiare il topo immediatamente dopo l'iniezione di D-luciferina e immanettarlo come descritto nella Sezione 3.4 ogni 2 minuti per 20 minuti.
         Nota: Quando si effettua questo esperimento per la prima volta, si raccomanda di determinare come varia il segnale della luciferasi nel tempo dopo la somministrazione della D-luciferina. Questo aiuterà a determinare il momento più adatto per fotografare il topo dopo aver somministrato D-luciferina negli esperimenti successivi. Il segnale bioluminescente può variare a seconda di diversi fattori, tra cui la linea cellulare, il modello di xenoinnesti topinsi, il livello di espressione della luciferasi, ecc.
      2. Ad ogni intervallo si fanno stime di 5, 10 e 15 s.
      3. Usa questi dati per tracciare una curva standard. In base alla curva, si sceglie il tempo di attesa e di esposizione in cui il segnale raggiunge un plateau mantenendo l'intensità più alta.
         Nota: Di solito questo tempo è tra i 5 e i 10 minuti, ma può variare a seconda del modello.
4. Imaging non invasivo dei tumori del muro tramite IVIS
   1. Dopo il periodo di attesa, si mette il topo in una camera di isoflurano con tasso di isoflurano del 4% e portata di ossigeno di 3,5%.
   2. Conferma che il topo sia anestetizzato controllando l'assenza del riflesso del pizzicore del dito del piede.
   3. Posiziona il topo sul palco all'interno dell'imager IVIS e infila il naso all'interno del cono nasale per mantenere l'anestesia durante l'imaging. Assicurati che rimangano entro le linee segnate della messa a fuoco della fotocamera e chiudi la porta dell'imager.
      Nota: Ci saranno cinque posizioni sul palco all'interno dell'imager. Ogni posizione avrà anche i rispettivi coni nasali anestesi. Questo permette di fotografare 5 topi contemporaneamente. A seconda del numero di mouse per l'immagine, regola il campo visivo della fotocamera nella scatola del pannello di controllo da "D" (campo più ampio) a "A" (messa a fuoco ristretta). Il topo può essere posizionato ovunque sul palco, a condizione che il naso rimanga all'interno dei coni nasali dell'anestesia per tutta la durata dell'esame. Si raccomanda di fotografare i topi in sequenza, prima sul lato dorsale e poi sul lato ventrale.
   4. Regola il tempo di esposizione e clicca su "Acquisisci" nel pannello di controllo (Figura 3C).
      Nota: Assicurati che luminescenza, fotografia e sovrapposizione siano "ON" nel pannello di controllo.
      Una volta catturata l'immagine, l'immagine del topo con il segnale luciferasi apparirà sullo schermo.
   5. Apri l'imager e gira il mouse in modo che il lato ventrale sia rivolto verso l'alto, clicca su "Acquisi" dopo aver chiuso la porta dell'imager.
      Nota: Assicurati che il naso del topo sia all'interno del cono nasale per garantire il mantenimento dell'anestesia durante l'immagini.
   6. Una volta acquisite sia le immagini dorsali che ventrali, si apri la porta dell'imager e rimetti il topo nella sua gabbia.
   7. Aspetta 5-10 minuti per assicurarti che il topo riprenda conoscenza.
5. Analisi dell'immagine IVIS per determinare il carico tumorale nel topo
   1. Regolazione della scala dei colori delle immagini
      1. Salva le immagini raw nella cartella appropriata cliccando su "file" seguito da "Salva come".
         Nota: L'imager regola automaticamente la scala dei colori in base all'intensità del segnale. È consigliabile mantenere costante la scala dei colori su tutte le immagini scattate durante l'esperimento. La scala dei colori può essere regolata successivamente aprendo l'immagine raw con questo software.
      2. Per la regolazione manuale, un'altra finestra della tavolozza degli strumenti appare nell'angolo in alto a destra dello schermo (Figura 3D), vai su "Regola immagine" e poi scegli "manuale" per la scala. Inserisci il numero minimo e massimo desiderato per il valore della scala e clicca su "Invio" (Figura 3E).
         Nota: Quando si regola la scala colore di un'immagine acquisita in precedenza, apri prima il file raw infoclick.txt immagine salvata dalla cartella corrispondente usando "file" seguito da "open".
         3.5.1.3. Salva questa immagine separatamente dall'immagine raw nella cartella appropriata.
   2. Analisi del carico tumorale nel topo
      Nota: Per la misurazione quantitativa del carico tumorale, puoi misurare l'intensità del segnale di ogni topo attraverso le immagini scattate durante tutto il periodo. Puoi inserire quei valori in Excel o GraphPad Prism per analisi statistiche e per generare grafici lineari della progressione tumorale.
      1. Apri il file grezzo infoclick.txt salvato dalla cartella corrispondente.
      2. Vai alla sezione ROI (Regione di Interesse) della finestra della palette degli strumenti che compare nell'angolo in alto a destra (Figura 3F).
      3. Disegna manualmente o automaticamente l'area del ROI su ogni mouse con l'aiuto della funzione "disegna" usando la forma che funziona meglio per te. Per farlo manualmente, mantieni l'area coerente per tutte le immagini di tutti i mouse che vengono confrontati.
         Nota: Per l'inoculazione intraperitoneale, la selezione manuale del ROI per tutto il torace e l'addome sull'immagine ventrale del topo è la scelta migliore. Per l'inoculazione intrabursale, la selezione manuale del ROI nell'area dell'immagine dorsale con segnale funziona meglio.
         Nota: La selezione automatica del ROI selezionerà solo regioni con maggiore intensità del segnale d'immagine.
      4. Clicca su "Misura ROI" (Figura 3F). Questo aprirà un'altra finestra con dati sui conteggi totali e medi per ciascun ROI selezionato.
      5. Salva questo file nella cartella appropriata in modo da poterlo accedere in seguito. Usa questi dati per tracciare il grafo sia in MS Excel che in GraphPad Prism.

Risultati

Dati rappresentativi da un modello di cancro ovarico intraperitoneale utilizzando cellule OVCAR8 marcate con luciferasi in topi nudi Foxn1 immunodepressi sono mostrati nella Figura 4. L'espressione stabile della luciferasi in queste cellule ha permesso il monitoraggio longitudinale della progressione tumorale tramite imaging bioluminescente non invasivo utilizzando l'imager IVIS come descritto nella sezione III. L'iniezione intraperitoneale di 5 milioni di c...

Discussione

La capacità di imitare interazioni complesse tra cellule tumorali, microambiente e fattori sistemici rende i modelli topini un'ottima risorsa per studiare la progressione del cancro^{ovarico 12}. Oltre ad avanzare la comprensione dei fattori che guidano la progressione e la metastasi del cancro ovarico, i modelli topini in vivo svolgono anche un ruolo importante nella valutazione preclinica di piccole molecole e nelle strategie di trattamento per il cancro ovarico

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Filtro sterile a siringa 0,22 um, 33mm	Fisher Scientific	09-720-004
Siringa da 1 ml TB	BD	309659
21G, ago da 1 pollice	BD	305167
30G, ½ Ago di un pollice	BD	305106
Pinze curbate a punta fine da 5 pollici	Fisher Scientific	1631
Sutura monofilamento assorbibile 6-0	MaxonTM	6532-11
Tampone alcolico (alcol isoprolilico al 70%)	Dukal Corp	80003156
Betadina (soluzione di iodio all'1%)	Prodotti Purdue	367618150085
Carprofen Inj, 50mg/ml	Levafen	RXLEVA50-20INJ
Centrifuga	Eppendorf	5702
D-luciferina	Syd Labs	MB000102-R70170
Micropinze da gioielliere dissezionante, punta fine	Fisher Scientific	08-953E
Pomata per gli occhi	Medvet	11897
Forbici a punta fine	Fisher Scientific	8940
Cuscina termica	Sunbeam	731-500
Strumenti che dissezionano le pinze con punte fini	Fisher Scientific	S08096
Siringa per insulina 3/10ml	BD	328438
Isofurano	Fluriso	Fluriso250
IVIS	Perkin Elmer	IVISLMIII
Maionese - Portaago per ago dritto Heger	Fisher Scientific	08-966
Sterile 1X PBS, senza calcio né magnesio	Corning	21-040-CV
Applicatori sterili con punta di cotone	McKeesson	24-106-1S
Calibro sterile	Kendall	3033
Cuscinetto/asciugamano/drappeggio sterile, non fenestrato	Henry-Schein	100-9687
Triplo unguento antibiotico	Globe	4006-4SL
Tripsina-EDTA (0,25%), fenolo rosso	Gibco	25200-056