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Articolo metodologico

Protocollo integrato per la valutazione dei linfatici meningei: iniezione di cisterna magna, imaging dei linfonodi, dissezione meningea e colorazione dell'intero montaggio

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DOI:

10.3791/71140

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29 maggio 2026

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1School of Medicine, School of Life Sciences, Shanghai University, 2Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University, 3Children's Hospital of Fudan University, National Children's Medical Center, 4First Clinical College, Fujian Medical University; Department of Laboratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fujian Key Laboratory of Laboratory Medicine

In questo articolo

Sommario

Qui viene presentato un protocollo per valutare i vasi linfatici meningei (MLV) dei muri, che svolgono un ruolo importante in molteplici malattie neurologiche. L'obiettivo di questo protocollo è fornire un metodo integrato che consenta sia la valutazione funzionale del drenaggio dei tracce sia la caratterizzazione morfologica dettagliata della rete di MLV dorsali.

Abstract

I vasi linfatici meningei (MLV) sono emersi come regolatori critici dell'omeostasi del sistema nervoso centrale (SNC), e la disfunzione delle MLV è stata implicata in vari disturbi neurologici. Una valutazione completa della morfologia e della funzione degli MLV è quindi essenziale per comprenderne il ruolo nella fisiologia e nelle malattie del SNC. Questo protocollo descrive un metodo integrato per valutare i MLV nei topi utilizzando quattro tecniche chiave: iniezione intra-cisterna-magna (i.c.m.) di traccianti fluorescenti, imaging in tempo reale dei linfonodi cervicali (CLN), dissezione meningea e colorazione a montaggio completo. Per prima cosa, l'ago da 30 G è collegato alla siringa e alla pompa d'infusione tramite un tubo di polietilene (PE). Dopo l'anestetizzazione del topo, la dura madre viene esposta tramite dissezione smussata dei muscoli del collo e l'ago di iniezione viene inserito nella cisterna magna (CM) per far entrare il tracciante nel liquido cerebrospinale (LCR) con un controllo preciso. Il drenaggio tracciante verso i CLN può essere visualizzato in tempo reale, mentre la successiva dissezione meningea e la colorazione dell'intera montatura permettono un'analisi morfologica dettagliata dei MLV dorsali. L'intera procedura può essere completata entro 3 ore, comprendendo iniezione i.c.m., perfusione tissutale, isolamento cranio e inserimento in soluzione fissativa. Questo protocollo può anche essere adattato per la somministrazione intracranica di farmaci o combinato con analisi molecolari, poiché la procedura di dissezione meningea è compatibile con tessuti freschi e non fissati adatti all'estrazione di RNA e proteine.

Introduzione

I MLV si trovano all'interno dei seni durali e sono in grado di trasportare componenti del LCR e cellule immunitarie dal SNC aiCLNs 1,2. La scoperta degli MLV ha messo in discussione il concetto tradizionale di "privilegio immunitario" del sistema nervoso centrale ed è emersa negli ultimi anni come un punto caldodi ricerca. Studi hanno dimostrato che la funzione compromessa delle MLV è strettamente associata a varie malattie, tra cui la malattia di Alzheimer, il declino cognitivo legato all'età, tumori cerebrali e infezioni del SNC 4,5,6,7. Con l'avanzamento della ricerca in questo campo, cresce la necessità di metodi sperimentali integrati, riproducibili e ben standardizzati.

La maggior parte dei protocolli esistenti per la ricerca sui vasi linfatici si concentra sui vasi linfaticiperiferici 8,9,10. In studi relativi alle MLV, uno studio ha descritto una semplice procedura di canulazione del CM che consente l'accesso diretto al LCR senza danneggiare il parenchima cranioo cerebrale 11. Se combinato con tecniche di imaging, questo metodo può valutare efficacemente la funzione del sistema glymphatico e la dinamica del LCR. Tuttavia, protocolli sperimentali dettagliati per studiare la funzione e la morfologia delle MLV non sono stati ben documentati.

L'attuale protocollo integra l'imaging funzionale con l'analisi morfologica, consentendo l'acquisizione simultanea di dati sulla funzione di drenaggio e sulla morfologia strutturale dallo stesso animale, riducendo così il numero di animali utilizzati e migliorando la comparabilità e la coerenza dei dati. Nel complesso, questo protocollo può essere utilizzato per studiare i cambiamenti strutturali e funzionali nelle MLV in vari modelli di malattia, nonché per valutare gli effetti degli interventi farmacologici o genetici sulle MLV. Il protocollo fornisce descrizioni dettagliate dei passaggi operativi, delle precauzioni chiave e delle indicazioni per la risoluzione dei problemi. Inoltre, la tecnica di iniezione i.c.m. descritta in questo protocollo può essere applicata indipendentemente per la somministrazione intracranica di farmaci, e la procedura di dissezione meningea è compatibile con tessuto fresco per l'estrazione successiva di RNA o proteine, offrendo notevole flessibilità e scalabilità.

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Protocollo

Le procedure topo descritte in questo protocollo sono state eseguite in conformità con il protocollo approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) dell'Università di Shanghai (Approvazione n. ECSHU 2023-099).

1. Preparazione di strumenti chirurgici e tamponi

ATTENZIONE: Utilizzare una cappa chimica e indossare guanti per minimizzare i potenziali rischi quando si utilizza PFA, una sostanza moderatamente tossica e cancerogena. Tutte le operazioni che coinvolgono l'alcol isoamilico devono essere condotte in una cappa chimica lontana dalle fonti di accensione, indossando guanti e mascherina, per ridurre i rischi di esposizione.

  1. Prepara strumenti chirurgici, come un paio di forbici dritte, due paia di pinze curve a punta fine, due paia di pinze a punta smussata, un paio di microforbici e un paio di micropinze dritte con punte lisce (non seghettate).
    NOTA: Asciuga gli strumenti chirurgici con etanolo al 75% e mantienili asciutti sia prima che dopo l'esperimento.
  2. Prepara i cuscinetti.
    1. 1x PBS.
    2. 4% di soluzione fissiva al paraformaldeide (4% PFA).
    3. Soluzione bloccante (1x PBS contenente albumina sierica bovina al 3% (BSA), 0,5% Triton X-100 e 2% siero bovino fetale).
    4. Tampone di diluizione anticorpale (1x PBS contenente 3% di BSA e 0,5% di Triton X-100).
    5. Mezzo da montaggio antifade.
      NOTA: Il reagente preparato può essere conservato a 4 °C per un mese.
  3. Preparare soluzione anestetica 2,2,2-Tribromoetanolo (Avertin, 1,25%, 50 mL)
    1. Pesare 0,625 g di Tribromoetanolo in un tubo da 2 mL, aggiungere 1,25 mL di alcol isoamil e sciogliere accuratamente (shaker da 37 °C).
    2. Trasferire la soluzione completamente disciolta di Tribromoetanolo-isoamilico in un tubo conico da 50 mL, aggiungere 1x PBS per portare il volume totale a 50 mL e mescolare accuratamente.
    3. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm in un armadietto di sicurezza biologica.
  4. Prepara Ovalbumina, soluzione coniugata Alexa Fluor 647 (OVA-647) (2 mg/mL). Sciogliere 2 mg di OVA-647 in 1 mL di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF).

2. Assemblaggio dell'ago di iniezione e collegamento alla pompa di microiniezione

  1. Usa una pinza smussata per staccare l'ago da 30 G e mantenere la punta11 (diametro esterno 0,30 mm, diametro interno 0,15 mm, lunghezza 8 mm).
  2. Utilizzare un tubo di PE-10 di 30 cm (diametro esterno 0,64 mm, diametro interno 0,28 mm) per collegare l'ago rotto da 30 G all'ago di microiniezione contenente un ago da 30 G (Figura 1).
  3. Monta l'ago per microiniezione, con il tubo e l'ago da 30 G attaccati, sulla pompa per microiniezione.

3. Iniezione ICM e imaging dal vivo

ATTENZIONE: Se l'ago viene inserito troppo in profondità e penetra nel parenchima cerebrale, l'iniezione verrà trasmessa nel tessuto cerebrale invece che nel compartimento del liquido cerebrospinale, compromettendo l'accuratezza del risultato e potenzialmente portando alla mortalità dei topi. Durante la procedura chirurgica, è necessario un monitoraggio fisiologico continuo del topo. La profondità dell'anestesia deve essere valutata ogni 15 minuti utilizzando il riflesso del pizzicotto delle dita per garantire che l'animale rimanga indolore. La temperatura corporea dovrebbe essere mantenuta a 37 °C ± 0,5 °C utilizzando una borsa riscaldante per prevenire l'ipotermia e i suoi effetti associati sulla funzione fisiologica. Inoltre, la respirazione e la frequenza cardiaca dovrebbero essere registrate ogni 30 minuti, valutate osservando i movimenti toracici e palpando l'apice cardiaco. Durante l'iniezione di i.c.m., se l'ago viene inserito troppo in profondità e provoca sanguinamento, ciò indica un'iniezione fallita. Termina l'esperimento e sopprimi l'animale.

  1. Pesare il topo e somministrare 200 mg/kg di Avertin tramite iniezione intraperitoneale per anestetizzare il topo.
    NOTA: Possono essere utilizzati anestetici alternativi (ad esempio ketamina/xilazina).
  2. Applica una crema depilatoria sulla regione cervicale per rimuovere i peli sopra i linfonodi quando il riflesso del pizzicamento del dito del piede cessa e la respirazione diventa lenta e regolare.
  3. Rasi la zona dorsale del collo.
  4. Posizionare il mouse in una cornice stereotassica su una borsa riscaldante con la testa inclinata a un angolo di 120° rispetto al tronco (Figura 2A).
  5. Pulire l'area in sequenza con povidone-iodio e etanolo al 75%.
  6. Applica la pomata oftalmica per eritromicina.
  7. Fai un'incisione mediana nella pelle del collo e separa in modo diretto gli strati muscolari.
    NOTA: Usando due paia di pinze con punta smussata, separare gli strati muscolari per minimizzare il sanguinamento.
  8. Dissezionare il muscolo con una pinza a punta fine finché la dura madre traslucida che sovrasta il CM non diventa visibile  (Figura 2B, C).
    NOTA: Usa una pinza curva a punta fine per ritrarre i muscoli e mantenere un'esposizione costante del cervo cervicale.
  9. Al microscopio stereoscopico, si usano pinze smussate per tenere l'ago e inserirlo a un angolo di 45° rispetto al piano della dura mater a una profondità di circa 1–2 mm. Posizionare la smussatura dell'ago parallela alla dura madre in modo che sia completamente sotto la dura madre (Figura 2D).
    NOTA: Applica una leggera forza con l'ago per perforare la dura madre. La puntura riuscita è indicata da una perdita palpabile di resistenza, insieme alla visualizzazione della punta dell'ago sotto la dura madre e all'uscita del liquido cerebrospinale.
  10. Usa carta assorbente per asciugare eventuali liquidi liquidi che perdono.
  11. Imposta la pompa di microiniezione per erogare a 1 μL/min. Iniettare 5 μL di soluzione di OVA-647 (2 mg/mL) nel CM4 (Figura 2E).
  12. Lascia l'ago in posizione per 2 minuti per evitare il riflusso di riflusso.
  13. Applica una goccia di colla biologica sulle meningi.
  14. Chiudi l'incisione chirurgica.
  15. Esegui immagini in vivo del topo per monitorare l'intensità del colorante nei CLN in vari momenti (30 min, 60 min). Utilizzare i seguenti parametri di imaging: tempo di esposizione: 0,5 s; filtro di eccitazione: 640 nm; Filtro di emissione: 680 nm.

4. Isolare l'aspetto dorsale del cranio del topo

NOTA: Confermare l'assenza del riflesso del pizzichio del dito del piede e la cessazione della respirazione spontanea prima di iniziare la dissezione toracica.

  1. Eutanasiare il topo con un'overdose di Avertin (600 mg/kg) ed eseguire una perfusione cardiaca con 20 mL 1x PBS o soluzione fisiologica normale.
  2. Decapita il topo per isolare la testa.
  3. Fai un'incisione lungo la linea centrale del cranio per aprire il cuoio capelluto.
  4. Utilizzare due emostrati curvi per separare il cuoio capelluto bilateralmente tramite una delicata retrazione. Successivamente, inserire gli emostrati curvi nelle fosse orbitali e rimuovere con cura il cuoio capelluto residuo dalle regioni nasale e orale (Figura 3A–C).
    NOTA: Questo metodo consente una separazione rapida e completa del cuoio capelluto.
  5. Rimuovere la mandibola mantenendo intatto il cranio (Figura 3D).
  6. Rimuovere l'osso dalla base del cranio per esporre l'aspetto ventrale del cervello (Figura 3E).
  7. Estrarre con attenzione il cervello con una pinza smussata, evitando il contatto con la dura madre delle ossa parietali (Figura 3F).
  8. Immergere completamente il cranio dorsale in 5 mL, 4% PFA e fissare per 24 ore a 4 °C (Figura 3G).
    PUNTI DI PAUSA: Conservare teschi fissi a 4 °C per non più di una settimana. Rimuovere il campione da 4 °C e lasciarlo tornare alla temperatura ambiente prima della dissezione meningea.

5. Dissezione delle meningi dal cranio del topo

  1. Lava il cranio fisso con 5 mL 1x PBS, ripetendo il lavaggio tre volte (10 min ciascuno).
  2. Posiziona il cranio con il lato dorsale verso il basso in un piatto da 10 cm riempito con 1x PBS  (Figura 4A).
  3. Usa la punta delle pinze a punta fine per afferrare o premere la bolla timpanica e rimuoverla dal cranio (Figura 4B).
    NOTA: La rimozione della bolla timpanica è un passaggio fondamentale per evitare lacerazioni meningee causate dall'adesione durante la separazione dal cranio.
  4. Taglia strettamente lungo la superficie ventrale del cranio per una distanza di circa 2 mm con forbici per lisciarli (Figura 4C).
  5. Utilizzare pinze sottili, eliminando meticolosamente il tessuto bianco residuo della regione della confluenza dei seni paranasali (COS) delle meningi (Figura 4D).
    NOTA: La rimozione incompleta del tessuto residuo è una delle principali cause di colorazione aspecifica nell'immunomarcatura.
  6. Usa una micropinza fine per sollevare delicatamente un bordo delle meningi dal margine del cranio, poi sollevare il bordo opposto (Figura 4E, F).
  7. Afferra il bordo a forma di ciotola delle meningi e tira per separarlo dal cranio nella regione del COS (Figura 4G).
  8. Rimuovere l'osso mascellare con forbici (Figura 4H).
  9. Afferra nuovamente il bordo a forma di ciotola delle meningi e tira per separare le meningi dal cranio nell'area dell'osso frontale (Figura 4I).
  10. Posizionare le meningi intatte in una piastra a 24 pozzi contenente 1 mL PBS 1x, pronta per la tintura.
    NOTA: Se le meningi si rompono durante l'autopsia, specialmente alla giunzione tra i seni sagittale superiore e trasverso, il campione potrebbe non essere adatto a ulteriori analisi. Se si osserva un alto coloramento di fondo non specifico, aggiungere un passaggio di tempra dopo la fissazione del PFA (ad esempio, incubare con una soluzione di 0,1 M glicina per 40 min12) per ridurre ulteriormente il segnale di fondo.

6. Colorazione di blocco, anticorpi primari e anticorpi secondari

  1. Usa una pipetta da 1 mL per aspirare il PBS 1x in modo che le meningi si attacchino al fondo della piastra del pozzo.
  2. Bloccare le meningi dell'intera montatura con una soluzione bloccante da 200 μL in una piastra a 24 pozzi per 1 ora a temperatura ambiente.
    NOTA: Distribuire delicatamente le meningi completamente nella soluzione bloccante usando le pinze per garantire un'esposizione uniforme.
  3. Usa una pipetta per rimuovere la soluzione bloccante.
  4. Incubare le meningi dell'intera montatura con 200 μL di anticorpo anti-LYVE-1 diluito (marcatore specifico del vasolinfatico 13) a una diluizione 1:200 (concentrazione finale 1 μg/mL) durante la notte a 4 °C.
  5. Usa una pipetta per rimuovere la soluzione di anticorpi.
  6. Lava tre volte con 1 spruzzo di soppressione (10 minuti ciascuno).
  7. Incubare meningi a montaggio intero con DAPI (concentrazione finale 1 μg/mL) e Alexa Fluor 488 anti-asino IgG (concentrazione finale 2 μg/mL) per 1 ora a temperatura ambiente in 1x PBS.
    NOTA: Proteggi dalla luce durante l'incubazione degli anticorpi.
  8. Usa una pipetta per rimuovere la soluzione di anticorpi.
  9. Lava tre volte con 1 spruzzo di soppressione (10 minuti ciascuno).

7. Montaggio e imaging

  1. Pipetta 100 μL di 1x PBS al centro di un vetrino.
  2. Galleggiare e allargare le meningi dell'intera montatura all'interno della goccia (Figura 5A).
  3. Aspirare il PBS 1x per permettere al tessuto di aderire piattamente al vetrino (Figura 5B).
  4. Applicare 20 μL di mezzo di montaggio sulle meningi dell'intera montatura.
  5. Posizionare un copertore sopra il tessuto (Figura 5C).
  6. Asciugare le vetrine all'aria a temperatura ambiente e conservarle a 4 °C.
    PUNTI DI PAUSA: Le vetrine possono essere conservate a 4 °C per un massimo di un mese. Rimuovi il vetrino da 4 °C e lascialo tornare alla temperatura ambiente. Rimuovere eventuale condensa dalla superficie del vetrione con carta assorbente.
  7. Usa un obiettivo 20x per acquisire immagini MLV. Imposta il canale su FL Green con una lunghezza d'onda di emissione di 518 nm e un tempo di esposizione di 100 ms.

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Risultati

Dopo l'iniezione i.c.m. di OVA-647, l'imaging in vivo di piccoli animali ha rivelato segnali fluorescenti ovali distinti distribuiti bilateralmente nella regione cervicale (Figura 6A). Nelle iniezioni riuscite, il tracciante era chiaramente visibile nei CLN dopo l'iniezione, con l'intensità della fluorescenza che raggiungeva il picco di circa 60 minuti (Figura 6B). Inoltre, sono stati osservati segnali fluorescenti nei ...

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Discussione

Questo protocollo fornisce un metodo completo per valutare la funzione e la morfologia degli MLV integrando iniezione i.c.m., imaging in vivo dei CLN, dissezione meningea e colorazione a montaggio completo. Un vantaggio chiave di questo approccio integrato rispetto ai metodi convenzionali è che consente una valutazione simultanea della funzione di drenaggio linfatico e della morfologia dei vasi all'interno dello stesso animale, eliminando la necessità di coorti separate e riduce...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dal National Key R&D Program of China (2023YFC2306500), dalla National Natural Science Foundation of China (82502108) e dalla China Postdoctoral Science Foundation (2024M760542).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
ACSF (Artificial Cerebrospinal Fluid)Tocris  Cat# 3525
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (1:1000 dilution)InvitrogenCat# A-21208
Antifade Mounting MediumBeyotimeCat# P0126
Blunt-tipped forcepsRWD Life ScienceCat# F12011-10
BSABeyotimeCat# ST023
CoverslipsCITOTESTCat# 80312-3161
Curved sharp forcepsRWD Life ScienceCat# F11003-11
DAPISigma-AldrichCat# D9542
Depilatory creamVeetN/A
Dish-10 cmThermo Fisher ScientificCat# 150464
Disposable intravenous (IV) infusion needleZhejiang Kindly Medical Devices N/A
Ethanol-75%Sinopharm Chemical Reagent Cat# 80176961
Fetal Bovine SerumExcellCat# FSD500
Filter-0.22 µmMerck Millipore Cat# SLGPR33RB
Glass slidesCITOTESTCat# 80340-3610
Isoamyl alcoholSinopharm Chemical Reagent Cat# 10003218
IVIS SpectrumPerkinElmerN/A
Micro forcepsShinva Medical Instrument Cat# ZD372RB 
Micro scissorsShinva Medical Instrument Cat# ZO13056R
Microinjection needle (25 µL)Shanghai Gaoge Industry & Trade N/A
Microinjection pumpVoyage PowerCat# QHZS-001A
Mouse: C57BL/6 wild-type, 8 weeks old, male CavensN/A
Needle-30GZhejiang Kindly Medical Devices N/A
Normal SalineBeyotimeCat# ST341
Ovalbumin, Alexa Fluor™ 647 ConjugateThermo Fisher ScientificCat# O34784
Paraformaldehyde Fix Solution-4%BeyotimeCat# P0099
PE-10 tubingShanghai Qiujing Biochemical Reagent and InstrumentN/A
Phosphate-buffered saline (1x PBS)BeyotimeCat# ST447
Rat anti-LYVE-1 (1:200 dilution)Santa CruzCat# sc-65647
StereomicroscopeJonecCat# JSZ6
Stereotaxic frameRWD Life ScienceCat# 68030
Straight scissorsRWD Life ScienceCat# S12007-10
Syringe-1-mL Zhejiang Kindly Medical Devices N/A
Tissue Adhesive I3M VetbondCat# 1469SB
TribromoethanolSigma-AldrichCat# T48402
Triton X-100 Sigma-Aldrich Cat# T8787
VS120 High-throughput fluorescence imaging systemOlympusN/A

Riferimenti

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