Strategie specifiche per l'inserimento di lenti regionali per l'imaging calcio in vivo nei topi attraverso circuiti corticali e ippocampali

Sommario

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l'inserimento e la stabilizzazione specifiche della lente per regione, al fine di consentire un'imaging affidabile in vivo del calcio nei topi, migliorando la riproducibilità ed esaurendo tentativi ed errori nell'imaging del calcio.

Abstract

L'imaging in vivo del calcio delle popolazioni neuronali utilizzando lenti ottiche impiantate chirurgicamente è ampiamente utilizzato per monitorare l'attività delle popolazioni neuronali durante il comportamento. Tuttavia, il successo chirurgico e la qualità dell'imaging dipendono in modo critico da vincoli anatomici che variano tra le regioni cerebrali. Questo protocollo fornisce indicazioni chirurgiche specifiche per regione per la selezione e l'impianto di lenti di imaging in aree corticali e ippocampali comunemente mirate. In particolare, descrive un flusso di lavoro chirurgico che comprende la localizzazione del bersaglio e il livellamento cranico, craniotomia specifica per regione e, quando necessario, la rimozione o aspirazione di dura madre, nonché la selezione, l'inserimento e la fissazione di lenti e supporti appropriati. In particolare, descriviamo tre strategie di impianto: impianto convenzionale di lenti per l'ippocampo ventrale, impianto di lente con aspirazione tissutale per l'ippocampo dorsale e impianto di lenti prismatiche per l'imaging corticale. Forniamo inoltre indicazioni pratiche su come differenze nella profondità del tessuto, nell'architettura vascolare e nell'organizzazione dei circuiti influenzino i parametri chirurgici chiave, tra cui il diametro della lente, la dimensione della craniotomia, l'entità della rimozione del tessuto, la velocità di inserimento, le procedure emostatiche e i metodi di fissazione. Documentando esplicitamente considerazioni chirurgiche spesso poco riportate nei metodi scritti, questo protocollo mira a ridurre il tentativi ed errori durante l'impianto del cristallino e a migliorare la riproducibilità sperimentale. Nel complesso, questo protocollo fornisce una guida pratica per selezionare e implementare in modo affidabile strategie di impianto di lenti appropriate per la regione attraverso circuiti corticali e ippocampici.

Introduzione

L'imaging in vivo del calcio utilizzando lenti ottiche impiantate è diventata una tecnica centrale per monitorare l'attività neuronale a livello di popolazione negli animali in comportamento ^1,2,3,4,5,6. Consentendo registrazioni longitudinali da ensemble neuronali definiti geneticamente, questo approccio ha fornito approfondimenti fondamentali sulle dinamiche dei circuiti alla base della percezione, dell'apprendimento e^{del processo decisionale} 2,6,7,8. Tuttavia, il successo dell'imaging basato su lenti dipende non solo dall'accesso ottico, ma anche da un'attenta considerazione dei vincoli anatomici specifici per regione. Le regioni corticali come la corteccia prefrontale (PFC), le strutture a media profondità come l'ippocampo dorsale e i bersagli profondi come l'ippocampo ventrale differiscono notevolmente nell'orientamento dei circuiti e nella tolleranza allo spostamento dei tessuti, tra gli altri fattori. Queste differenze anatomiche rendono necessarie strategie chirurgiche specifiche per la regione per la selezione e l'impianto del cristallo. Studi precedenti hanno stabilito metodi affidabili per l'imaging dei neuroni CA1 dorsali in topi fissati con la testa utilizzando lenti impiantate ^{verticalmente} 6,9,10,11, e lenti basate su prismi sono ampiamente utilizzate per l'imaging ^{corticale 7,8}, dove l'accesso ottico laterale consente registrazioni specifiche per tutto o laminare a seconda dell'orientamento del circuito bersaglio. Sebbene questi approcci condividano il principio comune dell'accesso ottico tramite lenti impiantate, impongono vincoli chirurgici distinti che devono essere affrontati in modo specifico per regione.

Nonostante l'adozione crescente di questa tecnica, una fonte comune di fallimento sperimentale non risiede nell'incomprensione concettuale, ma nella mancanza di indicazioni chirurgiche sufficientemente dettagliate e specifiche per regione. In pratica, le registrazioni fallite spesso derivano da craniotomia imprecisa, rimozione di tessuto subottimale o insufficiente considerazione dei vincoli vascolari e strutturali specifici per regione. Sebbene le procedure generali di impianto di lenti siano state descritte nei protocolli^precedenti 9,10,11,12, le sfumature chirurgiche pratiche che determinano il successo dell'imaging, in particolare quelle che variano tra le regioni bersaglio, rimangono incompletamente documentate.

Questo protocollo video colma questa lacuna fornendo indicazioni esplicite e specifiche per regione per la selezione e l'impianto del cristallino su bersagli corticali e ippocampali, utilizzando il PFC e le regioni CA1 dorsale e ventrale dell'ippocampo come esempi rappresentativi. In particolare, descriviamo tre strategie di impianto, ciascuna adattata ai vincoli anatomici e chirurgici della regione bersaglio, evidenziando i punti decisionali chiave e le insidie tecniche associate a ciascun approccio.

Nell'imaging CA1 dell'ippocampo dorsale, il diametro relativamente grande delle lenti convenzionali spesso richiede l'aspirazione tissutale per creare spazio sufficiente per l'impianto. Se la rimozione del tessuto è incompleta o eseguita in modo improprio, il tessuto circostante può essere compresso piuttosto che spostato, portando all'accumulo di neuroni vicino alla superficie del cristallino e alla formazione di strati cellulari densamente compatti che oscurano il piano di imaging previsto. Per l'ippocampo ventrale, che si trova in profondità nel cervello, un targeting accurato richiede un controllo preciso dell'angolo di inserimento, della traiettoria e della velocità di penetrazione per minimizzare i danni ai tessuti e garantire una corretta posizione. Al contrario, l'impianto di lenti prismatiche per l'imaging PFC pone maggiore enfasi sulla minimizzazione del sanguinamento e sulla preservazione dell'integrità corticale tramite una craniotomia precisa e un inserimento attento del cristallino per evitare danni vascolari.

Questo protocollo è pensato per i ricercatori che intendono implementare l'imaging calcio basato su lenti GRIN su bersagli corticali o ippocampali nei roditori, in particolare coloro che hanno incontrato difficoltà nella riproducibilità chirurgica o nella qualità dell'imaging. È particolarmente applicabile quando si mira al CA1 dorsale, al CA1 ventrale o alla corteccia prefrontale, e quando si utilizzano lenti GRIN o prismatiche standard in combinazione con un miniscopio o un sistema di imaging equivalente montato sulla testa. I ricercatori che mirano ad altre regioni cerebrali o utilizzano configurazioni hardware diverse dovrebbero considerare i principi specifici per regione descritti qui come linee guida adattabili piuttosto che come procedure fisse. Documentando esplicitamente queste considerazioni pratiche, questo video mira a ridurre il tentativi ed errori, migliorare la riproducibilità tra laboratori e fornire un quadro di principio per la selezione delle strategie di impiantamento appropriate.

Protocollo

Tutte le procedure di cura degli animali e sperimentali sono state approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali del Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) con il numero di approvazione KA2025-060-V3. Tutti gli esperimenti sono stati conformi alla Guida degli Istituti Nazionali di Salute per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio. Furono fatti tutti gli sforzi per minimizzare la sofferenza animale e ridurre il numero di animali utilizzati.

1. Passaggi preparatorii per l'intervento chirurgico

NOTA: Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando topi adulti C57BL/6J e VIP-Cre knock-in di 8 settimane (RRID: IMSR_JAX:000664, IMSR_JAX:031628). Lo stesso approccio generale può essere applicato ad altre varianti; tuttavia, potrebbero essere necessarie alcune modifiche a dettagli specifici, come le coordinate del bersaglio.

1. Anestezionare il topo con isoflurano al 3% somministrato per inalazione a una portata di 1 L·^min-1 in una camera di induzione.
2. Fissa il mouse in una cornice stereotassica usando barre per le orecchie e posiziona la maschera anestesica sopra il muso.
   NOTA: Mantieni la stessa concentrazione anestetica durante tutta la procedura.
3. Imposta il sistema omeothermo a 33,5 °C per mantenere la temperatura corporea durante l'intervento.
4. Radere l'area chirurgica e rimuovere i residui di peli con un cotton fioc immerso in una soluzione di gluconato di clorexidina.
5. Applica lubrificante oculare sugli occhi del topo e coprili con piccoli pezzi di alluminio per proteggerli durante l'intervento.
6. Prima dell'incisione, eseguire un pizzicotto al dito del piede per confermare che il topo sia completamente anestetizzato.
7. Iniettare localmente la soluzione di lidocaina all'1% (miscelata con bupivacaina allo 0,5%) nel sito dell'incisione e somministrare la soluzione di chetoprofene all'1% tramite iniezione intramuscolare.
8. Incidere la pelle in forma ellittica, dimensionata per fornire spazio sufficiente per la successiva impiantamento della testa. Fai attenzione a evitare di tagliare i muscoli intorno al cranio.
   NOTA: Un'incisione eccessiva può indurre un'infiammazione estesa, che può interferire con le registrazioni a lungo termine dalla stessa regione.
9. Utilizzando cotton pong sterili, ritrae delicatamente l'incisione lateralmente. Pulisci la superficie esposta del cranio con cotton fiampi sterili e poi raschia leggermente con un raschietto.
   NOTA: Questo passaggio rimuove i detriti e rende leggermente irrigido la superficie per facilitare la successiva fissazione della lente e della piastra della testa.
10. Per l'allineamento lungo l'asse anteroposteriore (AP), si usano bregma e lambda come punti di riferimento per il bregma. Misura le differenze di altezza tra i punti di riferimento usando un ago calibro 26.
11. Se l'asse AP non è in livello, allentare la maschera anestetica e regolare l'altezza dell'adattatore della mascella sul telaio stereotassico finché la differenza di altezza tra bregma e lambda non sarà entro 0,02 mm.
12. Per l'allineamento lungo l'asse mediolaterale (ML), si usano punti ± 3 mm dalla linea media come punti di riferimento.
13. Se l'asse ML non è in livello, si riposizionano correttamente le barre auricolari finché la differenza di altezza sinistra-destra non è entro 0,02 mm.

2. Craniotomia

1. Segna le posizioni dei bersagli (ad esempio, PFC, ippocampo) sul cranio usando un ago immerso nell'inchiostro. Quando si segna la posizione del bersaglio, segna anche i confini per la perforazione nelle direzioni anteriore, posteriore, mediale e laterale.
   NOTA: Per il PFC, dove l'impianto è guidato da punti di riferimento vascolari, una lente da 1 mm richiede un'apertura da 1,5 mm (Figura 1A). Per l'ippocampo ventrale, un bersaglio profondo, un obiettivo da 0,6 mm richiede un'apertura da 0,8 mm (Figura 1B). Per l'ippocampo dorsale, dove è necessaria l'aspirazione tissutale, una lente da 1 mm richiede un'apertura da 1,2 mm (Figura 1C) per minimizzare lo spazio non supportato attorno alla lente e ridurre lo spostamento laterale durante il posizionamento prima della fissazione dell'adesivo.
2. Crea un'apertura a quadrato arrotondato usando un trapano manuale guidato da marcature.
3. Durante il primo passaggio, la perforazione deve essere eseguita il più verticalmente possibile per evitare i bordi inclinati di formaggio.
4. Esegui la perforazione in più brevi passaggi per minimizzare il rischio di danni cerebrali.
   NOTA: Evita di strappare la dura dur durante questo processo.
5. Quando il cranio rimanente diventa molto sottile (come confermato applicando una pressione delicata con la pinza), solleva il lembo osseo usando la pinza, facendo attenzione a non danneggiare la superficie cerebrale.
6. Levigare i bordi a una velocità di trapano ridotta (Figura 2A). Se frammenti ossei appuntiti rimangono lungo il bordo del cranio (Figura2B), possono danneggiare il cristallino o la superficie cerebrale.
7. Rimuovere con attenzione tutti i detriti ossei generati durante il processo di perforazione. Irrigare il sito con soluzione salina per rimuovere eventuali frammenti ossei residui.

Figura 1. Esempi rappresentativi di perforazione cranica per ciascuna regione bersaglio Fotografie rappresentative di teschi di topo dopo craniotomia. (A) Craniotomia presa di mira alla corteccia prefrontale. (B) Craniotomia che prende di mira l'ippocampo ventrale. (C) Craniotomia colpita all'ippocampo dorsale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Foratura del teschio e finitura dei bordi Illustrazione schematica della perforatura e finitura dei bordi del cranio. (A) Schema a sezione trasversale di una craniotomia ben finita con un bordo inferiore lucidato in modo uniforme. (B) Esempio che mostra residui ossei affilati causati da una lucidatura insufficiente del bordo inferiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Preparazione del tessuto pre-impianto

Prima di inserire la lente, prepara il tessuto per permettere un'inserzione stabile della lente. A seconda del bersaglio, usa il metodo 3.1 o 3.2.

1. Rimozione della dura madre (per ippocampo ventrale, corteccia prefrontale): Se viene eseguita l'aspirazione del tessuto cerebrale, non è necessaria la rimozione della duramimadre. Tuttavia, se il cristallino viene impiantato senza aspirazione tissutale, la dura deve essere rimossa.
   1. Per rimuovere la dura, piega leggermente la punta di un ago per siringa per insulina e usalo come strumento da taglio.
   2. Incisci con cura la dura a piccoli incrementi. Se necessario, tieni il tessuto inciso con pinze sottili mentre tagli le parti rimanenti. Fai attenzione a non danneggiare il cervello durante questo processo.
2. Aspirazione del tessuto superiore (per l'ippocampo dorsale): Con questo approccio è necessario un intervallo minimo di due settimane tra l'iniezione del virus e l'impianto del cristallino per prevenire la perdita o la riduzione dell'espressione virale dovuta all'aspirazione.
   NOTA: Non è consigliata l'aspirazione tissutale prima dell'iniezione virale, poiché l'iniezione in tessuto recentemente danneggiato può compromettere l'espressione stabile. Al contrario, consentire un lungo periodo di recupero dopo l'aspirazione è altrettanto subottimale, poiché la ricrescita dei tessuti può ostacolare l'impianto successivo del cristallino.
   1. Collega la pompa a un tubo di 8 mm di diametro, che viene poi collegato all'estremità di una siringa da 1 ml. Tutte le connessioni sono sigillate ermeticamente con nastro adesivo per evitare perdite d'aria.
      NOTA: Utilizzare una pompa a aspirazione in grado di generare una pressione negativa massima di almeno 50 kPa. Poiché la pompa può generare vibrazioni notevoli, posizionala lontano dal tavolo operatorio.
   2. Collega l'ago 24 calibro levigato all'estremità della siringa da 1 mL collegata (Figura 3).
   3. Aumentare la pressione della pompa di aspirazione ad almeno 50 kPa.
   4. Avvicina con attenzione la punta dell'ago al tessuto in modo che il tessuto venga aspirato insieme alla soluzione salina. Durante questo passaggio, usa una mano per manipolare l'ago di aspirazione mentre con l'altra applica continuamente soluzione salina con una siringa. Questo impedisce che il sangue ostruisca la visuale e facilita l'aspirazione fluida.
      NOTA: Sebbene si preveda sanguinamento durante il processo di aspirazione, ciò non richiede cicli ripetuti di aspirazione–emostasi. È importante evitare un'aspirazione eccessiva nei luoghi di sanguinamento attivo, poiché può aggravare l'emorragia a causa di ulteriori disturbi meccanici.
   5. Esegui l'aspirazione tissutale a piccoli incrementi. A intervalli, irrigare il campo chirurgico con soluzione salina per valutare l'entità e la posizione della rimozione del tessuto.
   6. Rimuovere il tessuto cerebrale sopra il bersaglio in un volume a imbuto centrato sul bersaglio, invece di rimuovere tessuto su tutta l'apertura. Un'illustrazione schematica di questa procedura è fornita nella Figura 4.
      NOTA: Per ottenere ciò, non avvicinarti al tessuto solo da un solo angolo; invece, regola l'ago su più angoli durante l'aspirazione.
   7. La rimozione del tessuto dovrebbe fermarsi leggermente sopra la regione bersaglio, lasciando intatto uno strato sottile. Per l'ippocampo dorsale, l'aspirazione è avanzata al livello del corpo calloso; l'aspirazione si interrompe una volta che la sostanza bianca sotto la corteccia diventa visibile (non rimuovere il corpo calloso).
3. Se il sanguinamento avviene dopo la rimozione della dura o l'aspirazione tissutale, applicare una spugna gelatinosa (ad esempio Cutanplast) immersa in soluzione salina fredda (4 °C) per controllare il sanguinamento prima della coagulazione. Fai attenzione a evitare che il sangue rimanga nel campo chirurgico.
   NOTA: Invece di pulire il sangue, applica una pressione delicata usando la spugna.
4. Una volta esposto il cervello, si posiziona la spugna di gelatina imbevuta di soluzione salina sull'area per mantenere il tessuto umido durante tutta la procedura fino all'impianto del cristallo.

Figura 3. Configurazione del dispositivo di aspirazione Fotografia dell'insieme completo del dispositivo di aspirazione. L'estremità distale del tubo è collegata a una pompa a aspirazione e tutte le giunzioni sono ben sigillate per garantire una suzione stabile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Aspirazione tissutale durante la preparazione della craniotomia Un'illustrazione schematica che rappresenta la profondità approssimativa e l'estensione dell'aspirazione tissutale necessarie per l'impianto del cristallino mirando a dCA1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Impianto di lenti

Qui verranno descritti due metodi di impianto di lente. Entrambi prevedono l'inserimento della lente facendola avanzare nel tessuto, ma differiscono per come viene applicata la lente. Seleziona il metodo appropriato dalle Sezioni 4.1 e 4.2.

1. Impianto di lente con portalenti in alluminio (per PFC e CA1 ventrale)
   1. Prima della sessione chirurgica, assicurati che la lente GRIN (o prisma) sia fissata permanentemente all'interno del portalenti^{in alluminio 9} usando la supercolla.
   2. Immediatamente prima dell'impianto, sterilizza il cristallino sporgente e il portalente tramite immersione in una soluzione di gluconato di clorexidina allo 0,5%. Prima dell'inserimento della lente, assicurati che la soluzione sia completamente asciutta.
   3. Monta l'unità preassemblata del portalente e dell'asta sul manipolatore stereotassico della cornice, assicurandoti che i dadi siano ben stretti per evitare spostamenti durante l'inserimento.
   4. Poiché la lente potrebbe non essere perfettamente ortogonale al supporto, allinea prima manualmente la barra filettata a occhio per assicurarsi che sia allineata orizzontalmente con la cornice stereotassica o i punti di riferimento circostanti.
   5. Una volta raggiunto l'allineamento visivo, si utilizza un microscopio stereo per impostare il riferimento del punto zero al bregma.
   6. Abbassare l'obiettivo a una velocità costante di 0,5 mm·^min-1 (per la PFC). Per le aree cerebrali profonde come l'ippocampo ventrale, si utilizza un tasso di inserzione più lento per minimizzare i danni ai tessuti e garantire un targeting accurato.
   7. Durante l'impianto del cristallino nell'ippocampo ventrale, avanzare il cristallino di 0,2 mm ogni 2 minuti fino a raggiungere una profondità di 2,0 mm. Continua ad abbassare lentamente l'obiettivo da 2,0 mm a 3,0 mm.
   8. Il passo di avanzamento si riduce a 0,1 mm ogni 2 minuti, oltre i 3,0 mm di profondità.
   9. Abbassare l'obiettivo a passi di 0,05 mm ogni 2 minuti fino a raggiungere la profondità finale del bersaglio.
   10. Poiché questo processo spesso induce sanguinamenti significativi, applica piccoli pezzi di spugna gelatinosa imbevuta in soluzione salina sterile sul sito della craniotomia per mantenere un campo libero e controllare il sanguinamento durante l'avanzamento del cristallino.
   11. Dopo che la lente raggiunge la profondità bersaglio, attendi almeno 10 minuti che il sito chirurgico si asciughi completamente. L'umidità residua può compromettere l'adesione del cemento dentale.
   12. Una volta asciutto, applica l'adesivo finché non copri l'intero insieme, lasciando esposta solo la superficie superiore del portalentes.
   13. Dopo che l'adesivo si è completamente indurito, per minimizzare gli shock meccanici durante il distacco del supporto, allenta parzialmente le cuffie.
   14. Taglia il ponte del portatore con i nipper. Dopo il taglio, stringi nuovamente le cuffie prima di procedere con i passaggi successivi.
2. 4.2. Impianto di lente con pompa a aspirazione (per CA1 dorsale)
   1. Preparazione del portalentes: collega l'estremità stretta di una punta P1000 a un tubo in gomma di diametro 4 mm, e l'estremità opposta del tubo è collegata a una siringa da 1 mL. Tutte le giunzioni sono sigillate con nastro in Teflon per garantire connessioni ermetiche.
   2. Monta orizzontalmente la siringa da 1 mL collegata al tubo sul supporto stereotassico.
   3. Assemblaggio punta: Taglia la punta P1000 a 2 e 27 mm dall'estremità stretta e mantieni il segmento da 2 a 27 mm. Taglia la punta del P200 a 24,5, 27 e 45 mm dall'estremità stretta, mantenendo i segmenti 0–24,5 mm e 27–45 mm (Figura 5A).
   4. Inserire il segmento 0–24,5 mm della punta P200 nel segmento 27–45 mm e fissare con la supercolla (ad esempio Loctite, Figura 5B). Inserisci i segmenti P200 assemblati nel segmento della punta P1000 e fissalo con la supercolla. Allinea gli assi centrali di tutti i segmenti di punta. Imposta la distanza tra l'estremità della punta P1000 e l'estremità stretta della punta interna P200 a 1 mm (Figura 5C).
   5. Rimuovere l'ago di aspirazione attaccato alla siringa e sostituirlo con un portalenti collegato al portalenti stereotastico (descritto sopra).
   6. Sterilizza la lente immergendola in una soluzione di gluconato di clorexidina allo 0,5% prima di caricarla nel porta.
   7. Monta il portalenti sul sistema stereotassico e imposta la pompa del vuoto a ≥ 50 kPa. Fissare l'assemblaggio della punta (descritto sopra) al supporto tramite un press-fit e caricare la lente nell'insieme della punta usando le pinze.
   8. Posizionamento dell'obiettivo: Dopo aver confermato l'attacco stabile dell'obiettivo all'assemblaggio della punta, posizionare il bordo inferiore dell'obiettivo al punto di riferimento come punto di riferimento e poi spostarsi verso la posizione del bersaglio. Avanzare la lente di una distanza aggiuntiva pari al suo raggio (in questo caso 0,5 mm) lungo l'asse anteroposteriore (AP) per allineare il centro della lente con il bersaglio.
   9. Allinea la punta del cristallino con il bordo mediale della craniotomia.
   10. Abbassare l'obiettivo di 1,7 mm lungo l'asse dorsoventrale (DV) (per il CA1 dorsale). Se durante l'avanzamento si verifica sanguinamento, ritrai lentamente il cristallino, ferma il sanguinamento, rimuovi il sangue dal cristallino e ricomincia l'inserimento.
       NOTA: Avanzare i primi 0,7 mm a una velocità di 0,1 mm ogni 10 secondi e avanzare lentamente il restante 1 mm a una velocità di 0,2 mm al minuto.
   11. Una volta che la lente raggiunge il bersaglio, fissare la lente (descritta sotto) usando Superbond e cemento dentale dopo aver lasciato asciugare completamente la superficie del cranio. In questa fase, fai attenzione a evitare che l'adesivo entri in contatto con l'interfaccia tra la lente e il supporto.
   12. Per rimuovere il portavuoto dopo la fissazione, spegni l'aspirapolvere, poi stacca il portafumo e il tubo.
       NOTA: Questa sequenza garantisce che non rimanga alcuna pressione negativa residua nel sistema dopo la disattivazione della pompa.
   13. Solleva con attenzione il portapunta per evitare di far cadere il gruppo della punta.

Figura 5. Gruppo punta (A) Segmenti delle punte delle pipette P1000 e P200 utilizzati per la costruzione dell'assemblaggio della punta. (B) Schema della configurazione assemblata. Inserire il segmento più piccolo della punta P200 nel segmento più grande della punta P200 e poi montare il segmento della punta P1000 all'esterno. (C) Assemblaggio della punta completamente assemblato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Cementazione

1. Applicare cemento resinoso dentali (ad esempio Super-Bond C&B) per coprire la superficie del cranio e la superficie laterale del cristallo.
2. Dopo che l'adesivo è completamente maturato, rimuovere il portalenti come descritto sopra.
3. Usa il cemento dentale per coprire il cranio esposto con uno strato a cupola. Assicurati che la lente non sporga oltre il livello del cemento dentale.
4. Applica cemento nero o smalto nero intorno alla lente per evitare interferenze dalla luce ambientale.
5. Per proteggere l'obiettivo, copri la superficie dell'obiettivo con un sigillante siliconico (ad esempio Kwik-Cast). Dopo che il sigillante in silicone si è indurito, applicare adesivo siliconico (ad esempio Kwik-sil) sul cemento dentale (Figura 6).
   NOTA: Questo protocollo si basa sull'impianto di una lente GRIN standard. È quindi necessario un intervento secondario della placca di base dopo il recupero. Prevedi 4-8 settimane dall'iniezione per un'espressione virale sufficiente, poi identifica il piano focale ottimale prima di fissare permanentemente la piastra di base.

Figura 6. Schemi di cementazione e sigillatura per la fissazione della lente Illustrazioni schematiche della fissazione della lente dopo l'impianto. Il superlegame viene applicato sulla superficie laterale del cristallino e sul cranio circostante (grigio). Dopo il completo indurimento del superlegame, il cemento dentale viene costruito a forma di cupola per corrispondere all'altezza della lente (rosa). Una volta che il cemento si è indurito, viene applicato un sigillante siliconico per coprire la superficie della lente (verde). Infine, viene applicato un adesivo siliconico per coprire e circondare la cupola in cemento (azzurro chiaro). (A) Fissazione del cristallo che prende di mira l'ippocampo dorsale. (B) Fissazione dell'obiettivo rivolta al PFC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

L'analisi istologica successiva all'impianto della lente utilizzando il protocollo sopra descritto ha confermato la posizione accurata sia della lente GRIN che di quella GRIN a prisma accoppiata. In entrambi i casi, le lenti erano posizionate correttamente per registrare l'attività neurale della corteccia prefrontale mediale (Figura 7A) e della regione CA1 dell'ippocampo dorsale (Figura 7B).

Discussione

Il successo dell'imaging calcio in vivo basato su lenti dipende da diversi passaggi chirurgici che variano tra le regioni cerebrali e le geometrie del cristallo, ciascuno dei quali determina direttamente la qualità e l'affidabilità dei segnali registrati. La Figura 10 riassume il flusso di lavoro chirurgico complessivo per ciascuna strategia di impianto. Una dimensionamento accurata della craniotomia è un passaggio fondamentale: un'apertura troppo g...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
8  Tubo mm (diametro esterno)	Tygon	E-3603
Pompa a aspirazione	Cliq	VC-701
Cemento nero (Liquido Ortho-Jet contemporaneo)	Lang Dental Mfg. Co.	1506, nero
Cemento nero (Contemporanea Ortho-Jet Powder)	Lang Dental Mfg. Co.	1530, nero
Bupivacaina HCl ingezione pesante	Myungmoon	649801341
Soluzione di gluconato di cloresididina 5%	Sungkwang	657400190
Cutanplast (dentale)	Mascia Brunelli	5610101
Cemento dentale	Vertice	Tipo 2, Classe 2
Punta (diametro della punta: 0,5  mm)	Strumenti scientifici di qualità	19007-05
Lubrificante per gli occhi (Optixcare Pet Eye Lube Plus)	Aventix Animal Health	OPX-4242
Pinza	Strumenti scientifici di qualità	11254-20, 11051-10
Obiettivo GRIN (0.6  ×   7,3  mm)	Inscopix	1050-004597
Obiettivo GRIN (1.0  ×   4.0  mm)	Inscopix	1050-004595
Sistema omeotermico per il controllo della temperatura corporea nei piccoli animali	Apparato di Harvard	Modello: HB101
Isoflurano (Terrell)	Piramal	NDC 66794-011-25
Iniezione di chetoprofene 100  mg/2  mL	Bukwang	642201001
Kwik-Cast	Strumenti di Precisione Mondiale	KWIK-CAST
Kwik-Sil	Strumenti di Precisione Mondiale	KWIK-SIL
Iniezione di idrato di lidocaina HCl 2%	Daihan	645104361
Smalto per unghie (Nero)	Wakemake	11
Obiettivo Prisma GRIN (1.0 x 4.3 mm)	Inscopix	1050-004601
Soluzione salina	JW Pharmaceutical Corporation	201703175
Micruscopio stereo	Olympus	SZ61
Portaelettrodi stereotassico (portaelettrodi standard)	KOPF	Modello 1770
Super bond C & B (Catalizzatore)	Sun Medical	0334-0010
Super bond C & B (radiopaca di tipo L)	Sun Medical	0334-0020
Super bond C & B (monomero)	Sun Medical	0334-0013
Forbici chirurgiche	Strumenti scientifici di qualità	14060-10
Colla UV (Norland Optical Adhesive)	Prodotti Norland	NOA 63