Preparazione standardizzata del muscolo liscio duodenale isolato del coniglio per la valutazione farmacologica in vitro dell'attività contrattile

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per standardizzare la preparazione del muscolo liscio duodenale isolato del coniglio per la valutazione farmacologica in vitro , utilizzando un Sistema di Sperimentazione di Muscolo Liscio Orizzontale a Temperatura Costante per la registrazione in tempo reale dell'attività contrattile.

Abstract

L'attività contrattile coordinata del muscolo liscio gastrointestinale costituisce la base fisiologica per mantenere normali funzioni di digestione, assorbimento e trasporto, con una disfunzione strettamente associata ai disturbi della motilità. La tecnica di perfusione degli organi isolati elimina interferenze in vivo complesse—come fattori neurali, endocrini ed emodinamici—fungendo da modello classico per gli studi farmacologici. A tal fine, questo studio dettaglia un protocollo a passo per la preparazione standardizzata del muscolo duodenale liscio isolato del coniglio. Il flusso di lavoro procedurale evidenzia i passaggi critici della preparazione delle soluzioni, l'eutanasia del coniglio, l'esecuzione di una laparotomia asettica precisa del centro addominale per una rapida escissione dei tessuti, la sospensione delle strisce muscolari lisce e la calibrazione dei trasduttori per la registrazione in tempo reale della tensione. Sulla base di questa piattaforma tecnica, abbiamo ulteriormente validato il metodo valutando gli effetti del Liquido Orale Huoxiang Zhengqi (HXZQ-OL) sulle contrazioni spontanee e sulle contrazioni tetaniche indotte da acetilcolina/cloruro di bario. In conclusione, questo protocollo fornisce un quadro metodologico robusto e altamente riproducibile, fornendo una piattaforma di screening in vitro ampiamente applicabile per la valutazione farmacologica degli agenti terapeutici che mirano alla motilità gastrointestinale.

Introduzione

L'attività contrattile coordinata del muscolo liscio gastrointestinale funge da base fisiologica per mantenere normali funzioni digestive, assorbenti e di^trasporto. La sua disfunzione è strettamente associata a vari disturbi clinici comuni, tra cui la sindrome dell'intestino^{irritabile 2}, la dispepsia^{funzionale 3} e i disturbi della motilità^{gastrointestinale postoperatoria 4}. Chiarire i meccanismi molecolari e farmacologici che regolano l'attività dei muscoli lisci è fondamentale per sviluppare nuove terapie procinetiche o antispasmodiche. In questo campo di ricerca, la tecnica della perfusione degli organi isolati funge da modello classico. Offre un valore pratico eliminando interferenze in vivo complesse come fattori neurali, endocrini ed emodinamici, consentendo così una valutazione diretta e precisa degli effetti di farmaci o sostanze attive sul tono muscolare^{liscio 5,6}.

Stabilire protocolli stabili e affidabili per la preparazione e la registrazione dei dati in vitro è essenziale per ottenere risultati riproducibili e di alta qualità. I metodi sperimentali in vitro dei muscoli intestinali esistenti richiedono ulteriori ottimizzazioni e standardizzazioni in diversi ambiti: gestione standardizzata degli animali sperimentali, tecniche chirurgiche meticolose per il prelievo dei tessuti, controllo ambientale coerente dei sistemi di perfusione e acquisizione automatica di dati accompagnata da analisi standardizzata. Ad esempio, la temperatura e i livelli di pH del fluido di perfusione, i danni meccanici durante il prelievo dei tessuti e le impostazioni del precarico del tessuto possono tutti influire significativamente sulla vitalità del tessuto e introdurre errori sperimentali. Questi fattori compromettono l'affidabilità dei risultati e ostacolano la comparabilità tra diversi studi ^7,8.

Pertanto, questo studio mira a stabilire e sviluppare un protocollo standardizzato per preparare campioni isolati di muscolo liscio duodenale provenienti da conigli e per la registrazione in tempo reale della tensione. Questo protocollo descrive sistematicamente l'intero processo, dall'etica e il benessere animale sperimentale, la laparotomia asettica e l'isolamento preciso dei segmenti intestinali, fino al raggiungimento del controllo ambientale, impostazioni standardizzate del precarico a tensione e acquisizione di dati ad alta fedeltà tramite un sistema integrato di perfusione orizzontale a temperatura costante e un sistema di acquisizione fisiologica multicanale. Basandoci su questa piattaforma tecnica standardizzata, abbiamo ulteriormente applicato metodi di dosaggio cumulativo per valutare quantitativamente gli effetti del Liquido Orale Huoxiang Zhengqi (HXZQ-OL), rispettando gli standard di qualità della Farmacopea Cinese (edizione 2025^)9, su contrazioni spontanee e contrazioni tetaniche indotte da cloruro di acetilcolina e bario in muscoli lisci duodenali isolati. Il Liquido Orale Huoxiang Zhengqi (HXZQ-OL), una forma orale della classica formula di medicina tradizionale cinese Huoxiang Zhengqi, è comunemente utilizzato in Cina per disturbi gastrointestinali, fornendo la giustificazione per valutare i suoi effetti diretti su muscoli lisci intestinali isolati. Questo studio non solo fornisce prove farmacologiche sperimentali dirette che chiariscono gli effetti regolatori del muscolo liscio gastrointestinale dell'HXZQ-OL, ma il protocollo sperimentale funge anche da modello metodologico standardizzato e riproducibile per lo screening farmacologico e gli studi in vitro dei tessuti del muscolo liscio gastrointestinale.

Protocollo

In questo lavoro sono stati utilizzati conigli bianchi sani della Nuova Zelanda adulti di entrambi i sessi (dal peso 2,0–2,5 kg). Tutte le procedure sperimentali sugli animali sono state condotte secondo le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono state approvate dal Comitato Etico degli Animali da Laboratorio dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (Approvazione n.: [2026070]). Furono fatti tutti gli sforzi per minimizzare la sofferenza animale e ridurre il numero di animali utilizzati. Il diagramma del flusso di lavoro è illustrato nella Figura 1.

1. Preparazione della soluzione

NOTA: Tutte le soluzioni operative, inclusa la soluzione di tirodo, acetilcolina (ACh), cloruro di bario, atropina e verapamilo, devono essere preparate fresche immediatamente prima dell'esperimento.

1. Prepara 1 L di soluzione di tirodo dissolvendo 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 0,4 mM NaH₂PO₄, 1,0 mM MgCl₂, 12 mM NaHCO₃ e 5,6 mM D-glucosio. Prima dell'utilizzo, saturare con una miscela al 95% di O₂ / 5% CO₂ per 15–30 minuti, regolando il pH a 7,3–7,4 (vedi la Tabella dei Materiali).
2. Prepara una soluzione di stock da 1 mM ACh. Prendi 20 μL e aggiungi 20 mL della soluzione di Tyrode. Mescola accuratamente per ottenere una soluzione ACh da 1 μM.
3. Prepara una soluzione di 1 M di cloruro di bario (BaCl₂). Prendi 20 μL e aggiungi 20 mL di soluzione di Tyrode. Mescola accuratamente per ottenere una soluzione da 1 mM di BaCl₂.
   NOTA: BaCl₂ è altamente tossico e irritante. Durante la maneggiazione, indossa dispositivi di protezione individuale in una cappa e smalti i liquidi di scarto secondo le normative.
4. Prepara una soluzione di stock di solfato di atropina da 10 mM. Prendi 20 μL e aggiungi 20 mL di soluzione di Tyrode. Mescola accuratamente per ottenere una soluzione di solfato di atropina da 10 μM.
5. Prepara una soluzione di 1 mM di cloridrato di verapamil. Prendi 2 μL e aggiungi 20 mL di soluzione di Tyrode. Mescola accuratamente per ottenere una soluzione di cloridrato di verapamillo a 0,1 μM.
   NOTA: Le concentrazioni delle soluzioni preparate sono state determinate facendo riferimento agli studi^{precedenti 6,10,11} e sono state ulteriormente ottimizzate attraverso i nostri esperimenti preliminari per garantire condizioni sperimentali ottimali.

2. Preparazione in vitro di campioni di muscolo liscio duodenale di coniglio

1. Eutanasia del coniglio
   1. Fissare il coniglio nel dispositivo di contenimento per conigli (Figura 2A, B e Figura 3A). Eseguire l'eutanasia somministrando un'overdose di pentobarbital sodio (120 mg/kg) tramite la vena auricolare nei conigli (Figura 2C e Figura 3B).
      NOTA: La morte completa deve essere confermata secondo i seguenti criteri: pupille dilatate, assenza di riflesso luminoso pupillare, cessazione della respirazione e del battito cardiaco, e perdita del riflesso plantare.
2. Preparazione e disinfezione del sito chirurgico
   1. Fissa il coniglio in posizione supina sul tavolo operatorio (Figura 2D e Figura 3C). Utilizzando forbici chirurgiche (Figura 2E) o un rasoio elettrico, rimuovere accuratamente tutti i peli addominali per esporre la pelle nell'area chirurgica designata (Figura 3D).
   2. Usando una pinza a spugna (Figura 2E), afferrare un batuffolo di cotone imbevuto di iodio (Figura 2F,G). Partendo dal centro dell'incisione chirurgica pianificata, applica la soluzione antisettica in un motivo concentrico e circolare dall'interno verso l'esterno (Figura 3E).
      NOTA: L'area di disinfezione dovrebbe estendersi oltre i bordi dell'incisione per garantire una copertura completa dell'intera pelle del campo chirurgico. Dopo la disinfezione, aspetta almeno 3 minuti per permettere all'antisettico di asciugarsi naturalmente sulla superficie della pelle.
   3. Posizionare un drappo sterile (Figura 2H) sull'area addominale disinfettata per esporre il campo chirurgico (Figura 3F).
3. Posizione e incisione dell'incisione addominale
   1. Utilizzando un bisturi (lama #23) (Figura 2E), eseguire un'incisione longitudinale di 8 cm lungo la linea mediana dell'addome da sotto il processo xifoide fino sopra la sinfisi pubica.
   2. Dissezionare la pelle e il tessuto sottocutaneo strato dopo strato. Seguendo la linea alba, si disseziona la guaina anteriore del muscolo retto addominale, le fibre muscolari e il peritoneo strato dopo strato per entrare nella cavità addominale (Figura 3G).
   3. NOTA: Durante la procedura, evitare di danneggiare gli organi addominali assicurandosi l'emostasi per prevenire la contaminazione del sangue del campo chirurgico e degli organi addominali.
4. Separazione duodenale
   1. Apri la cavità addominale lungo l'incisione (Figura 3H). Ritrai delicatamente i lobi epatici cefaladi usando garze saline umide (Figura 2I) per esporre completamente lo stomaco e il duodeno (Figura 3I).
   2. Selezionare il segmento iniziale del duodeno (parte bulbare o parte superiore discendente) situato a 2–3 cm dal piloro come sito di prelievo del tessuto.
   3. NOTA: Evitare la trazione diretta o il clampaggio del segmento intestinale bersaglio ogni volta che è possibile per minimizzare lesioni meccaniche. Invece, usa pinze smussate per afferrare delicatamente il mesenterio adiacente, oppure usi cotton fioc inumiditi con soluzione salina per manipolare e posizionare delicatamente il tessuto.
   4. Utilizzando forbici oftalmiche sterili (Figura 2E), si reseziona rapidamente e con precisione un segmento di 1–2 cm (Figura 2J) del tubo duodenale (Figura 3J,K).
   5. Trasferire immediatamente il segmento intestinale espulso in una ciotola di coltura (Figura 2K) contenente una soluzione di tirodo preraffreddata (4 °C) perfusa continuamente con un gas misto (95% O₂ / 5% CO₂).
5. Ripotazione, pulizia e conservazione temporanea dei segmenti intestinali
   1. Utilizzando le pinze oftalmiche (Figura 2E), sezionare delicatamente il mesentere e il tessuto adiposo circostante aderente alla parete intestinale.
   2. Utilizzando una siringa riempita con soluzione fredda di Tyrode (dotata di un ago a punta smussata) (Figura 2L), iniettare delicatamente la soluzione di clistere nella cavità intestinale. Risciacqua lentamente l'interno della cavità intestinale 2–3 volte per eliminarne completamente il contenuto.
   3. Mettere i segmenti intestinali puliti in una soluzione fresca e fredda di Tyrode per una conservazione temporanea fino a esperimenti successivi.

3. Avvio e infusione di soluzione per sistema di muscolo liscio orizzontale a temperatura costante

1. Aggiungere la soluzione di Tyrode al piatto di preriscaldamento del DSQG-1 Horizontal Cost-Temperature Fixed Muscle Experiment System (Figura 4B; vedi la Tabella dei Materiali).
2. Accendi l'alimentazione del sistema, tocca il pannello operativo per impostare la temperatura del bagno a 37 °C e inizia il preriscaldamento (Figura 4C).
3. Premi il pulsante Infusione e il sistema dispenserà automaticamente 20 mL di soluzione di Tirode nella vasca del bagno.
4. Premi il pulsante Scarico per svuotare completamente il liquido nel contenitore di raccolta rifiuti.
5. Premi il pulsante Risciacquo e il sistema completerà automaticamente il processo di prima drenaggio del contenuto e poi riempire di nuovo con liquido.
6. Premi il pulsante Stop per interrompere immediatamente tutti i processi di infusione, drenaggio e risciacquo in corso.
7. Premi il pulsante Gonfiamento per introdurre continuamente il gas misto (95% O₂ / 5% CO₂) nel bagno. Regolare la portata del gas a scala 5 per garantire una successiva ossigenazione sperimentale dei tessuti.
   NOTA: La scala 5 indica una portata di gas di 100 mL/min. Flussi di gas eccessivamente alti possono causare un aumento della turbolenza della soluzione, compromettendo la stabilità delle registrazioni di tensione.

4. Collegare un sistema di registrazione e elaborazione fisiologica multicanale con il funzionamento software

1. Collega il cavo dati del trasduttore del Sistema Orizzontale di Esperimenti Muscolari Lisci a Temperatura Costante al Canale 1 del Sistema Multi-Canale di Registrazione e Elaborazione Fisiologica (Figura 4D).
2. Accendi l'alimentatore esterno per il Multi-Channel Physiological Recording and Processing System e avvia il computer. Fai doppio clic sull'icona RM6240XC Multi-Channel Physiological Recording and Processing System sul desktop per avviare il sistema software sperimentale (vedi la Tabella dei Materiali).
3. Nella barra del menu, seleziona Esperimento | Digestione | Caratteristiche fisiologiche del muscolo liscio intestinale per caricare il corrispondente modulo sperimentale.
4. Imposta i seguenti parametri: modalità canale a Tensione, frequenza di campionamento a 400 Hz, sensibilità a 1,5 g, costante temporale a DC e frequenza del filtro a 30Hz.
5. Clicca sul pulsante Start nell'angolo in alto a destra dell'interfaccia software per iniziare l'acquisizione e la visualizzazione del segnale in tempo reale. Clicca sul pulsante Registra per visualizzare simultaneamente l'oscilloscopio e salvare il segnale acquisito sull'hard disk in tempo reale.
6. Nella barra del menu, seleziona Esperimento | Zero rapido per adattare il segnale di tensione al livello di base.
   NOTA: Se il segnale si discosta dalla linea di base di più di un'unità di coordinate verticali, regolare manualmente il punto zero del trasduttore di tensione usando un cacciavite.
7. Nella barra del menu, seleziona Esperimento | Metodo di visualizzazione dati in tempo reale | Placco fluttuante. Nella finestra di dialogo che appare, scegli Misurazione Normale in Tempo Reale-Veloce pervisualizzare i dati di tensione in tempo reale del muscolo intestinale nella finestra fluttuante.

5. Impostazione della sospensione e precarico di tensione della striscia muscolare duodenale

1. Regola la distanza anteriore-posteriore dei ganci di tessuto ruotando la manopola orizzontale della vite in base alla lunghezza della striscia muscolare duodenale, assicurandoti che corrisponda alla lunghezza della striscia.
2. Mantieni il segmento intestinale nella sua configurazione cilindrica naturale e allinea la linea di vista con l'apertura circolare a sezione trasversale del lumen intestinale.
3. Utilizzando le pinze oftalmiche, ritrae delicatamente l'apertura intestinale per mantenere la pernocenza.
4. Inserisci delicatamente la punta del gancio di tessuto nel lumen intestinale.
5. A una distanza di 2–3 mm dal margine intestinale, perforare la parete intestinale superiore a strato singolo dall'interno verso l'esterno usando la punta dell'uncino tessutale.
   NOTA: L'uncino di tessuto deve penetrare lo strato muscolare per garantire un'ancoragga sicura, evitando un attacco superficiale solo allo strato seroso, per evitare tagli meccanici e lacerazioni della parete intestinale da parte dell'amo durante l'applicazione del precarico.
6. L'altro lato della parete intestinale è identico al primo lato. Dopo aver identificato il punto corrispondente parallelo, penetrare solo la parete intestinale a singolo strato in quel punto (Figura 3L).
7. Ruota di nuovo la manopola orizzontale per regolare la distanza tra gli uncini, assicurandoti che la striscia muscolare duodenale rimanga naturalmente rilassata.
8. Applicare gradualmente la tensione regolando il regolatore fine unidimensionale finché la tensione media della striscia muscolare duodenale non si stabilizza a 0,8 ± 0,1 g (Figura 4A).
   NOTA: Ispezionare visivamente tutta la lunghezza dell'intestino per assicurarvi che rimanga dritto e cilindrico, privo di torsioni, rotazioni o pieghe a spirale. Se non è così, riduci immediatamente la tensione e riregola il punto di montaggio a un'estremità.
9. Prima di iniziare l'esperimento, bilanciare la striscia muscolare duodenale nella camera di perfusione per 60 minuti. Durante questo periodo di equilibrio, si sostituisce la soluzione del tirodo con un nuovo tampone ogni 15–20 minuti finché il suo ritmo contrattile spontaneo non si stabilizza.
   NOTA: Il periodo di equilibrio di 60 minuti è stato considerato completo solo quando i segmenti intestinali isolati hanno mostrato attività contrattile spontanea stabile per almeno 15 minuti consecutivi. I criteri oggettivi per la stabilizzazione sono stati definiti quantitativamente come segue: (1) deriva di tensione a riposo di base del < ±5%, (2) varianza dell'ampiezza contrattile media del < ±10% su intervalli consecutivi di 5 minuti e (3) fluttuazione di frequenza di < ± 1 ciclo/minuto.
10. Registrare la curva di attività di contrazione spontanea della striscia muscolare duodenale come dati di riferimento di base per gli esperimenti successivi.

6. Acquisizione di dati sperimentali

1. Per esperimenti in corso, nella barra del menu, seleziona Strumenti | Split view per eseguire analisi statistiche in tempo reale sui dati di forma d'onda catturati.
2. Per i file di dati memorizzati, clicca sul pulsante Apri nella barra degli strumenti, seleziona un file di dati salvati con l'estensione .lsd e carica i record storici degli esperimenti.
3. Clicca sull'icona Misura nella barra degli strumenti, seleziona modalità Regione . Muovi il cursore del mouse sull'area della forma d'onda, tieni premuto il tasto sinistro del mouse per selezionare due punti qualsiasi e il sistema mostrerà un pannello dati che mostra il valore medio della tensione all'interno di quel segmento.
4. Clicca sull'icona Misura nella barra degli strumenti, seleziona modalità Periodo . Utilizzando il tasto sinistro del mouse, clicca su cinque picchi d'onda distinti consecutivi (punti di picco) lungo la forma d'onda. Clicca con il tasto destro del mouse e il pannello dati calcolerà e visualizzerà la frequenza di contrazione (in bpm) (Figura supplementare S1).

Risultati

Questo protocollo sperimentale descrive il metodo standardizzato di preparazione per strisce muscolari duodenali isolate del coniglio e il processo di registrazione in tempo reale delle variazioni dinamiche di tensione e frequenza utilizzando un sistema di perfusione di organi isolati. Seguendo questo protocollo, HXZQ-OL veniva aggiunto sequenzialmente tramite dosaggio cumulativo in un bagno di soluzione di tirodo da 20 mL, raggiungendo concentrazioni volumiche finali di 10, 20, 30, 40 e 50 μL/mL nel bagno. Facendo rifer...

Discussione

Le tecniche di perfusione e registrazione della tensione degli organi isolati rappresentano metodi classici per studiare la fisiologia dei muscoli lisci e la farmacologia. I loro risultati hanno un'importanza significativa per chiarire i meccanismi fisiopatologici alla base dei disturbi della motilità gastrointestinale, delle malattie vascolari e della disfunzione^uterina 12,13,14,15.<...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,5-10 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101004
10 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-10
10 mL Volumetric flask	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-043804
100 mL Volumetric flask	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-043807
100-1000 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101014
1250 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-1250
20 mL Volumetric flask	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-010105
200 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-200
50 mL Conical centrifuge tube	LABSELECT	CT-002-50A
5-50 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101006
Acetilcolina cloruro	Supelco	PHR1546
All-in-One Lab Computer	Lenovo	R5-3500U
Atropina solfato	Macklin	A822893
Cloruro di bario	Sigma-Aldrich	342920
Cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	499609
D-Glucosio	Sigma-Aldrich	G5767
Osmometro a punto di congelamento	Shanghai Precision Instruments Co., Ltd.	BS100
Sistema orizzontale per esperimenti su muscoli lisci a temperatura costante	Chengdu Instrument Factory	DSQG-1
Huoxiang Zhengqi Oral Liquid	Taiji Group Co., Ltd.	Z50020409
Cloruro di magnesio	Sigma-Aldrich	M8266
Sistema multicanale per registrazione e elaborazione fisiologica	Chengdu Instrument Factory	RM6240XC
Conigli bianchi della Nuova Zelanda	Pizhou Dongfang Breeding Co., Ltd. (License No.: SCXK[Su]2022-0004)	sesso indifferente (pesante 2,0–2,5 kg)
pH-metro	Shanghai Leici	PHS-25
Cloruro di potassio	Sigma-Aldrich	P5405
Povidonio-iodo	H&H Medical Co., Ltd.	3180132
Bilancia di precisione (0,1 mg)	Sartorius	BCE64i
Soluzione salina	H&H Medical Co., Ltd.	100014438029
Bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich	S6014
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S9888
Fosfato di sodio diidrogeno	Supelco	1063700250
Pentobarbital sodico	Sigma-Aldrich	P3761
Cloridrato di verapamil	Macklin	V820460
Vortice	Kylin-Bell	XW-80A