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Articolo di ricerca
* These authors contributed equally
Utilizzando un modello murino indotto da una dieta ad alto contenuto di grassi per la malattia steatotica associata a disfunzioni metaboliche, questo studio valuta gli effetti dell'integrazione di olio di microalghe ricco di acido docosaesaenoico (DHA) e mostra che l'intervento migliora i profili lipidici epatici ed è associato a cambiamenti nella composizione del microbiota intestinale.
Dal punto di vista metabolico, la malattia steatotica disfunzionale del fegato è un disturbo metabolico diffuso associato a disbiosi del microbiota intestinale e a uno squilibrio lipidico epatico. In questo studio, è stato stabilito un modello murino indotto da una dieta ricca di grassi per valutare gli effetti dell'integrazione con olio di microalghe ricco di DHA. I topi (n = 4 per gruppo) sono stati nutriti con una dieta ricca di grassi per 8 settimane e hanno ricevuto la somministrazione orale quotidiana di olio di microalghe, probiotici o la combinazione di olio di microalghe ricco di DHA e probiotici. Sono stati valutati parametri metabolici, composizione del microbiota intestinale (sequenziamento del rRNA 16S), vie funzionali microbiche e profili metabolomici epatici. I risultati hanno mostrato che l'olio di microalghe ricco di DHA ha migliorato l'omeostasi lipidica, come indicato dalla riduzione dei livelli sierici di LDL-c e trigliceridi epatici, e un aumento delle lipoproteine ad alta densità (HDL-c), ed è stato associato all'alleviamento di lesioni epatiche e stress ossidativo. L'analisi del microbioma ha rivelato cambiamenti selettivi nella composizione microbica intestinale, inclusi l'arricchimento di Lactobacillus e Bifidobacterium e la riduzione di taxa associati alla dieta ad alto contenuto di grassi come Clostridium e Ruminococcus. Il profiling funzionale ha indicato alterazioni nelle vie metaboliche microbiche, inclusi il ciclo di recupero della L-metionina e la degradazione della feniletilamina. L'analisi integrata microbioma–metaboloma ha ulteriormente identificato associazioni tra taxa microbici ed epatici metaboliti coinvolti nel metabolismo degli acidi grassi, nel ricambio degli acidi biliari e nelle vie degli amminoacidi. Questi risultati indicano che l'integrazione di olio di microalghe ricca di DHA è associata a miglioramenti nel metabolismo lipidico epatico e nella composizione del microbiota intestinale in questo modello, senza implicare un meccanismo causale diretto.
La steatotica hepatica associata a disfunzioni metaboliche (MASLD) è una condizione globale altamente diffusa, che colpisce circa il 32,4% della popolazionemondiale 1. La MASLD si definisce come un eccesso di grasso nel fegato, che contribuisce a vari problemi di salute associati. Il tratto digestivo umano contiene una comunità microbica sofisticata ed equilibrata, che include batteri, virus, funghi eparassiti 2. A causa dell'interazione tra questa comunità microbica e il fegato, i probiotici sono considerati un metodo promettente per prevenire e trattare la MASLD modulando questa connessionecritica 3. Ricerche emergenti indicano che i probiotici possono avere un impatto positivo sulla MASLD modulando il microbioma intestinale e riducendo l'infiammazione. In particolare, la somministrazione di probiotici ha dimostrato di ristabilire l'equilibrio del microbiota intestinale e ridurre l'infiammazioneepatica 4. Inoltre, alcuni probiotici, in particolare quelli che potrebbero migliorare il metabolismo degli acidi biliari, hanno dimostrato di alleviare la steatosi epatica (fegato grasso) e supportare la salute metabolica complessiva negli individui affetti da MASLD 5,6. Inoltre, forti evidenze indicano che i pazienti con MASLD presentano cambiamenti significativi nell'ambiente intestinale, una condizione nota come disbiosi 7,8. Un risultato cruciale è stata la riduzione della diversità alfa, il che significa che il numero totale e la varietà di specie microbiche sono diminuiti. Inoltre, il microbiota intestinale dei pazienti con MASLD è spesso caratterizzato da una predominanza del phylum batterico Firmicutes 9,10,11. Le persone con MASLD spesso adottano diete povere, tipicamente caratterizzate da un elevato apporto di grassi saturi e un basso consumo di micronutrientiessenziali 12,13. Questi modelli alimentari poco salutari, frequentemente osservati nelle popolazioni urbane, sono correlati a un rapporto elevato di Firmicutes rispetto a Bacteroidetes rispetto alle persone che vivono in contestirurali 14. Inoltre, le diete ricche di grassi sono state direttamente implicate nella causa di uno squilibrio intestinale più profondo. In particolare, sia la ricerca su modelli animali sia gli studi su pazienti con fegato avanzato (MASLD) hanno mostrato che l'elevata assunzione di grassi era collegata a alterazioni intestinali del viromo. Queste alterazioni includevano un aumento dell'attività dei fagi litici, che alla fine peggiorò la disbiosi intestinaleesistente 15,16.
Gli acidi grassi polinsaturi omega-3 (PUFA), comunemente presenti nell'olio di pesce, potrebbero migliorare il metabolismo dei lipidi e regolare il microbiota intestinale. L'olio di microalghe si è affermato come una fonte promettente e sostenibile di PUFA omega-3. In particolare, l'olio di microalghe di Schizochytrium è una fonte commerciale promettente perché contiene un'alta concentrazione di acido docosaesaenoico puro (DHA). Studi precedenti di questo gruppo hanno riportato che, in un modello topino con dieta ad alto contenuto di grassi (HFD) per obesità, l'efficacia dell'olio di microalghe nel promuovere la perdita di peso era paragonabile a quella dell'olio di pesce e del farmaco dimagrante Orlistat. È fondamentale che l'olio di microalghe abbia mostrato questi effetti sulla perdita di peso prima dell'olio di pesce o dell'Orlistat17. Risultati precedenti hanno anche mostrato che l'olio di microalghe esercitava effetti distinti e benefici sul microbiota intestinale rispetto all'olio di pesce commerciale e all'Orlistat. Sebbene l'olio di microalghe non abbia modificato in modo significativo la diversità batterica complessiva, era associato a una maggiore abbondanza di batteri benefici produttori di acidi grassi a catena corta (SCFA) e a una riduzione dei taxa patogeni, incluso il genere Desulfovibrio, associato all'obesità. Inoltre, l'olio di microalghe ha ripristinato notevolmente la capacità metabolica della microbiota intestinale, migliorando le vie relative ad amminoacidi, SCFA e metabolismo degli acidi biliari, riducendo in modo cruciale la biosintesi dei lipopolisaccaridi (LPS). Queste modulazioni sono probabilmente state responsabili del miglioramento del metabolismo lipidico e del miglioramento della barriera mucosa del colon, suggerendo che l'olio di microalghe fosse un integratore alimentare superiore per alleviare l'obesità17.
Nonostante i progressi nel collegare la disbiosi microbiota intestinale allo sviluppo della MASLD, le relazioni specifiche tra composizione microbica, funzioni metaboliche microbiche e metabolismo lipidico epatico rimangono incompletamente comprese. In particolare, i legami causali tra alterazioni del microbiota e la progressione della malattia restano poco chiari, e se interventi alimentari, come l'olio di microalghe ricco di DHA, siano associati a cambiamenti coordinati nelle comunità microbiche intestinali e nei profili metabolici dell'ospite, non è stato sistematicamente indagato. L'olio di microalghe ricco di DHA è una fonte sostenibile ed efficiente di acidi grassi omega-3, con un contenuto di olio di microalghe ricco di DHA paragonabile a quello degli integratori derivati dal pesce. Studi precedenti hanno suggerito che l'integrazione di olio di microalghe ricca di DHA potrebbe migliorare la steatosi epatica e i parametrimetabolici 18,19. Tuttavia, le sue associazioni con la composizione del microbiota intestinale e la funzione metabolica microbica nel contesto della MASLD rimangono poco chiare.
Pertanto, in questo studio, il presente studio ha utilizzato un modello murino indotto da diete ad alto contenuto di grassi per valutare gli effetti dell'integrazione di olio di microalghe ricco di DHA sui parametri metabolici, sulla composizione del microbiota intestinale e sui profili metabolomici epatici. Si ipotizzava che l'integrazione di olio di microalghe ricca di DHA fosse associata a miglioramenti nel metabolismo lipidico epatico e a alterazioni concomitanti nella composizione del microbiota intestinale e nelle vie metaboliche microbiche.
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I dettagli di tutti gli animali, diete, reagenti, kit, strumenti, software e fornitori di servizi utilizzati in questo protocollo sono forniti nella Tabella dei Materiali. Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti seguendo le Linee Guida del National Institutes of Health (NIH) per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio e hanno ricevuto l'approvazione dal Comitato per gli Animali Sperimentali dello Shandong Provincial Hospital (approvazione etica n. 2022–007, approvata il 24 gennaio 2022).
ATTENZIONE: Il sangue animale, i campioni fecali e i tessuti devono essere manipolati come materiali potenzialmente biopericolosi. Tutte le procedure che coinvolgono animali vivi, campioni biologici, oggetti taglienti, solventi organici e reagenti per analisi chimiche devono essere eseguite in conformità con le normative istituzionali sulla biosicurezza, la cura degli animali e la sicurezza chimica. Le carcasse animali, i tessuti, i materiali contaminati dal sangue e i campioni fecali devono essere raccolti in contenitori designati per rifiuti biologici e smaltiti tramite la struttura istituzionale per animali o l'ufficio biosicurezza. Aghi, aghi da gallina, tubi capillari e altri oggetti taglienti devono essere scartati immediatamente dopo l'uso nei contenitori approvati per taglienti. I rifiuti organici a base di solventi, inclusi metanolo, acetonitrile e soluzioni contenenti acido formico, dovrebbero essere raccolti in contenitori di rifiuti chimici etichettati e smaltiti tramite il programma istituzionale di rifiuti chimici pericolosi. I rifiuti provenienti da sagaggi biochimici e di stress ossidativo devono essere raccolti e smaltiti in conformità con le schede dati di sicurezza del produttore e le regole istituzionali sulla sicurezza chimica.
Animali sperimentali
I maschi di topi C57BL/6J di sei settimane (n = 4 per gruppo) sono stati mantenuti in condizioni specifiche prive di patogeni (SPF) con un ciclo chiaro/scuro di 12 ore a 22 ± 2 °C e umidità relativa del 50–60%. Gli animali avevano accesso ad libitum a cibo e acqua, con un massimo di cinque topi per gabbia. I topi di controllo sono stati nutriti con una dieta standard di chow composta dal 70% di carboidrati, 20% di proteine e 10% di grassi (kcal). Per stabilire il modello murino MASLD, i topi sono stati nutriti con una dieta ricca di grassi per 8 settimane contenente il 20% di carboidrati, il 20% di proteine e il 60% di grassi (kcal). Tutte le diete venivano conservate a 4 °C e rifornite due volte a settimana. I topi sono stati assegnati casualmente a gruppi sperimentali utilizzando un generatore di numeri casuali, e la dimensione del campione (n = 4 per gruppo) è stata determinata sulla base di studi precedenti con modelli murini simili indotti da diete ricche di grassi e su esperimenti preliminari. Tutti i trattamenti sono stati somministrati alla stessa ora ogni giorno per minimizzare la variazione circadiana.
L'olio di microalghe veniva estratto e purificato dall'Accademia di Scienze Agrarie dello Shandong, con una purezza di circa il 99%. L'olio di microalghe veniva conservato a −30 °C protetto dalla luce. Prima dell'amministrazione, l'olio veniva preparato con un emulsionante e miscelato accuratamente per garantire l'omogeneità. In particolare, l'olio di microalghe ricco di DHA è stato emulsionato in sterile carbossimetilcellulosa sodica contenente lo 0,5% di Tween-80 nella soluzione salina normale. L'olio di microalghe e il veicolo emulsionante sono stati miscelati in un rapporto di 1:9 (v/v) e sottoposti a vortici per 2 minuti immediatamente prima della gara per ottenere una sospensione uniforme. I topi del gruppo trattato con olio di microalghe ricevevano la preparazione una volta al giorno tramite gavage orale usando un ago sterile per l'alimentazione a una dose di 10 μL/g di peso corporeo. Il volume del gavage veniva regolato quotidianamente in base al peso corporeo per garantire la coerenza della dose. I topi del gruppo di controllo hanno ricevuto un volume equivalente di soluzione salina normale sterile nelle stesse condizioni. La soluzione salina utilizzata era iniezione di cloruro di sodio allo 0,9%.
Il trattamento probiotico consisteva in una formulazione composita contenente Lactobacillus plantarum (DY-1), Lactobacillus acidophilus (KDB-03), Lactobacillus casei (KDB-LC) e Bacillus coagulans (GIM 1.645). I quattro ceppi sono stati miscelati con un rapporto cellulare vitali uguale di 1:1:1:1. Ogni ceppo ha contribuito con 2,5 × 107 CFU/mL alla formulazione finale, ottenendo una concentrazione batterica totale di 1 × 108 CFU/mL. La miscela probiotica è stata sintetizzata dall'Accademia di Scienze Agrarie dello Shandong e non è disponibile commercialmente. Il trattamento probiotico consisteva in un brodo composito di fermentazione probiotico contenente Lactobacillus plantarum DY-1, Lactobacillus acidophilus KDB-03, Lactobacillus casei KDB-LC e Bacillus coagulans GIM 1.645. La concentrazione batterica della formulazione era di 1 × 108 CFU/mL. Il brodo probiotico di fermentazione veniva conservato a 4 °C prima dell'uso. I topi del gruppo trattato con probiotici ricevevano la formulazione probiotica una volta al giorno tramite gavage orale a una dose di 0,01 mL/g di peso corporeo durante tutto il periodo sperimentale.
I singoli ceppi sono stati coltivati in condizioni appropriate e raccolti nella fase di crescita a metà troncaggio (OD₆₀₀ ≈ 0,6), quindi combinati al rapporto indicato. Le colture batteriche sono state centrifugate per rimuovere il surnatante e i pellet sono stati risospesi in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS). La sospensione batterica appena preparata veniva conservata in ghiaccio prima della somministrazione per preservare la vitalità. La concentrazione batterica finale è stata regolata a 1 × 108 CFU/mL prima della somministrazione. I topi del gruppo probiotico hanno ricevuto la formulazione tramite gavage orale a una dose di 0,01 mL/g di peso corporeo una volta al giorno durante il periodo sperimentale. Non è stato applicato alcun pretrattamento antibiotico prima della somministrazione dei probiotici. Per ridurre il bias sperimentale, la valutazione degli esiti è stata effettuata da ricercatori ciechi dove applicabile. La MASLD è stata confermata tramite analisi biochimiche del sangue.
Analisi del sangue
Al termine del periodo sperimentale, i topi sono stati digiunati durante la notte (12 ore) con libero accesso all'acqua prima della misurazione della glicemia e della raccolta terminale del sangue. I topi sono stati profondamente anestetizzati con isoflurano utilizzando un vaporizzatore anestesitico fino a quando non è stata confermata la perdita del riflesso pedalale. Campioni di sangue terminale sono stati raccolti tramite sanguinamento retro-orbitale. Dopo il prelievo di sangue, i topi venivano soppressi per lussazione cervicale sotto anestesia profonda, e la morte veniva confermata con la cessazione della respirazione e del battito cardiaco. Il sangue veniva lasciato coagulare a temperatura ambiente e poi centrifugato a 3.000 × g per 10 minuti per ottenere il siero. I campioni di siero sono stati aliquotati e conservati a −80 °C fino all'analisi. Il glucosio sierico, il colesterolo totale (TC), i trigliceridi (TG), il colesterolo lipoproteico a bassa densità (LDL-c), il colesterolo lipoproteico ad alta densità (HDL-c), l'aspartato aminotransferasi (AST) e l'alanina aminotransferasi (ALT) sono stati misurati utilizzando un analizzatore biochimico automatico, seguendo le istruzioni del produttore. Questi parametri sono stati quantificati utilizzando saggi colorimetrici enzimatici con kit di reagenti standard integrati nel sistema analizzatrice. Tutti i parametri biochimici sono stati normalizzati al volume siero ed espressi nelle unità specificate dal produttore.
Saghi di stress ossidativo
I biomarcatori dello stress ossidativo sono stati misurati utilizzando kit, inclusi quelli per malondialdeide, superossido dismutasi e catalasi. I test venivano condotti seguendo le istruzioni del produttore. Per un breve tratto, i tessuti epatici furono omogeneizzati in tampone gelato e centrifugati per ottenere soprannatanti da analisi. I livelli di malondialdeide (MDA) sono stati determinati utilizzando un test di sostanze reattive all'acido tiobarbiturico (TBARS); l'attività della dismutasi del superossido (SOD) è stata misurata dalla sua capacità di inibire reazioni mediate dal superossido; e l'attività della catalasi (CAT) è stata quantificata monitorando il tasso di decomposizione del perossido di idrogeno. Le misurazioni venivano effettuate utilizzando un lettore di microplacche e i valori calcolati utilizzando curve standard o le formule fornite nei kit. I marcatori di stress ossidativo sono stati normalizzati al peso del tessuto epatico ed espressi secondo le specifiche del produttore.
Sequenziamento del rRNA 16S e analisi del microbioma
I campioni fecali venivano raccolti al termine del periodo sperimentale direttamente da singoli topi in condizioni sterili, immediatamente congelati in azoto liquido e conservati a −80 °C fino all'estrazione del DNA. Il DNA microbico è stato estratto utilizzando un kit commerciale secondo il protocollo del produttore. La regione V3–V4 del gene batterico 16S rRNA è stata amplificata utilizzando primer 341F/806R. L'amplificazione PCR è stata eseguita in un sistema di reazione da 25 μL contenente DNA modello, 2 mix master PCR e 0,2 μM di ciascun primer. Il programma di amplificazione consisteva in una denaturazione iniziale a 95 °C per 3 minuti, seguita da 25 cicli a 95 °C per 30 secondi, 55 °C per 30 secondi e 72 °C per 45 secondi, con un'estensione finale a 72 °C per 10 minuti. Le librerie Amplicon venivano costruite e sequenziate su una piattaforma Illumina MiSeq utilizzando una strategia a 2 × 250 bp a pari pari da un fornitore commerciale di servizi di sequenziamento. La qualità della libreria veniva valutata prima del sequenziamento e le librerie aggregate venivano caricate alla densità di cluster raccomandata dal produttore. Le letture di bassa qualità con basi ambigue, lunghezza insufficiente o un punteggio medio di qualità inferiore a Q20 sono state rimosse prima dell'analisi a valle.
Le letture di sequenziamento grezzo sono state processate utilizzando QIIME 2 versione 2019.420. In breve, le letture a pari sono state demultiplexate, filtrate per qualità, denoise ridotte, unite e filtrate per chimera usando DADA2 con parametri predefiniti, salvo diversa specificazione. Le varianti di sequenza amplicon non singole (ASV) sono state mantenute per l'analisi a valle. L'assegnazione tassonomica è stata eseguita utilizzando la versione 13_8 del database Greengenes implementata in QIIME221. Date le limitazioni intrinseche della risoluzione del sequenziamento genico del rRNA 16S, in particolare nell'utilizzo del database Greengenes, le annotazioni tassonomiche sono state interpretate esclusivamente a livello di genere. La classificazione a livello di specie non era considerata affidabile e quindi non veniva utilizzata in analisi a valle, confronti statistici o interpretazioni biologiche. Tutte le caratteristiche microbiche sono state compresse a livello di genere prima della visualizzazione e dell'analisi.
Sono state utilizzate metriche di alpha-diversità (Chao1, specie osservate, Shannon, Simpson, PD di Faith e uniforme di Pielou). Confronti statistici della diversità alfa tra i gruppi sono stati effettuati utilizzando test non parametrici appropriati (ad esempio, test di Kruskal–Wallis). La distanza di Jaccard e la dissimilanza di Bray-Curtis sono state utilizzate come metriche di diversità beta. Sono stati utilizzati grafici di Analisi Principale delle Coordinate (PCoA), scalatura multidimensionale non metrica (NMDS) e analisi discriminante lineare della dimensione dell'effetto (LEfSe) per illustrare i cambiamenti nelle comunità microbiome, con una soglia di punteggio LDA di 2,0. L'analisi multivariata permutazionale della varianza (PERMANOVA) è stata utilizzata per valutare la significatività statistica nella diversità beta. La visualizzazione dei dati e le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando la piattaforma GenesCloud (https://www.genescloud.cn).
I profili funzionali microbici sono stati dedotti dai dati del sequenziamento del 16S rRNA piuttosto che misurati direttamente tramite sequenziamento metagenomico o trascrittomico a pompa. Sulla base della tabella di abbondanza dei percorsi normalizzati o dei gruppi funzionali, le unità funzionali previste sono state mappate a database comunemente utilizzati, inclusi KEGG, MetaCyc e COG. L'abbondanza dei percorsi KEGG è stata riassunta secondo le sue categorie gerarchiche funzionali, con le classificazioni di percorso di livello 2 utilizzate per il confronto a valle. L'abbondanza media di ciascuna categoria di percorso è stata calcolata utilizzando il software R.
Analisi metabolomica non mirata di campioni di fegato
I tessuti epatici venivano rapidamente estratti immediatamente dopo la conferma della morte, immediatamente congelati in azoto liquido e conservati a −80 °C prima dell'analisi. Circa 50 mg di tessuto epatico congelato sono stati omogeneizzati in metanolo:acqua gelato (4:1, v/v) integrato con standard interni. Il rapporto tessuto-solvente di estrazione era 1:10 (v/p). I campioni sono stati vortizzati per 1 minuto, sonicati sul ghiaccio per 10 minuti, e poi incubati a −20 °C per 30 minuti per migliorare la precipitazione proteica. Gli omogeneati furono accuratamente miscelati, sottoposti a sonicazione sul ghiaccio e centrifugati a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C. I soprannatanti sono stati accuratamente raccolti, evaporati sotto un lieve flusso di azoto e ricostituiti al 50% di metanolo per analisi successive.
I campioni di controllo qualità (QC) sono stati generati raggruppando volumi uguali da ciascun campione e sono stati analizzati a intermittenza durante la prova per valutare la stabilità analitica e la riproducibilità. L'analisi metabolomica non mirata veniva eseguita utilizzando un sistema di cromatografia liquida ad altissime prestazioni abbinato a spettrometria di massa ad alta risoluzione, gestito da un fornitore di servizi commerciale. I metaboliti sono stati separati su una colonna C18 in fase inversa utilizzando un sistema solvente binario composto da acqua con acido formico allo 0,1% e acetonitrile con acido formico allo 0,1%. Il volume di iniezione era di 2 μL, la temperatura della colonna era mantenuta a 40 °C e la portata era impostata a 0,30 mL/min. È stato utilizzato un programma di eluzione a gradiente per ottenere una vasta separazione dei metaboliti. La rilevazione spettrometrica di massa è stata condotta sia in modalità di ionizzazione elettrospray positive che negative su un intervallo m/z di 70–1.000 per ottenere una copertura metabolitica ampia. La tensione di spruzzatura ionica era impostata a 3,5 kV in modalità positiva e a −2,5 kV in modalità negativa. La temperatura capillare è stata mantenuta a 320 °C e i dati sono stati acquisiti in modalità MS a scansione completa con acquisizione MS/MS dipendente dai dati per l'annotazione dei metaboliti. I dati grezzi venivano elaborati utilizzando software dedicato alla metabolomica (MassLynx v4.1) per il rilevamento, l'allineamento e la normalizzazione delle caratteristiche. L'identificazione dei metaboliti è stata effettuata sulla base di massa, tempo di ritenzione e modelli di frammentazione MS/MS accurati, confrontandola con database pubblici, inclusi il Human Metabolome Database (HMDB) e la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (v2023), dove applicabile.
Analisi multivariata e di percorsi
I dati di metabolomica processati sono stati sottoposti ad analisi statistiche multivariate, inclusa l'analisi delle componenti principali (PCA) e l'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali (PLS-DA), per visualizzare le differenze metaboliche tra i gruppi sperimentali. I metaboliti differenziali sono stati identificati in base a una combinazione di punteggi di importanza variabile nella proiezione (VIP) (>1,0) e significatività statistica (p < 0,05). I metaboliti identificati sono stati ulteriormente mappati nelle vie metaboliche utilizzando l'analisi di arricchimento delle vie KEGG per chiarire i processi biologici associati all'integrazione di olio di microalghe ricco di DHA.
Analisi statistica
I dati sono stati presentati come media ± SEM e analizzati utilizzando un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguita dal test di confronto multiplo di Tukey. La significatività statistica è stata definita come p < 0,05. L'analisi di arricchimento dei metaboliti epatici è stata effettuata utilizzando R (versione 4.4.1). Le associazioni a coppie tra generi microbici e metaboliti epatici sono state analizzate utilizzando correlazioni di rango di Spearman. Solo correlazioni significative (tasso di false scoperte, FDR < 0,05) con |ρ| ≥ 0,6 sono stati inclusi nelle analisi integrative della rete. L'elaborazione dei dati per microbioma e metabolomica è stata effettuata come descritto sopra, inclusa l'uso della piattaforma GenesCloud e le procedure di controllo qualità.
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L'olio di microalghe ricco di DHA migliora il metabolismo lipidico, il danno epatico e lo stress ossidativo epatico nei topi MASLD indotti da HFD
Per valutare l'effetto degli integratori alimentari sull'omeostasi di glucosio e lipidi, sono stati valutati parametri biochimici in cinque gruppi: cibo regolare (RC), dieta ricca di grassi (HFD), integrata con olio di microalghe ricca di DHA, integrata con probiotici e topi combinati con olio di mic...
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Negli ultimi anni, diversi studi hanno indagato i cambiamenti nel microbioma legati al MASLD. Tuttavia, la maggior parte di questi studi si è concentrata sul confronto di individui sani con pazienti con MASLD o sull'esame di diversi gradi di steatosi24. Di conseguenza, ci sono ancora poche evidenze che dettaglino i cambiamenti specifici del microbiota intestinale associati alla fibrosi epatica nella MASLD, anche se la fibrosi è il fattore più critico nella previsi...
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questa ricerca è stata finanziata dal Ministero della Scienza e della Tecnologia ("National Key R&D Program of China" n. 2021YFA0702100, 2022YFE0132200) e dal Modern Agricultural Technology Industry System della provincia di Shandong, Cina (Numero di sovvenzione: SDAIT-26).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2x PCR Master Mix | Takara Bio Inc., Giappone | RR902A | Utilizzato per l'amplificazione PCR del 16S rRNA |
| Acetonitrile | Merck, Germania | 100030 | Solvente utilizzato per la fase mobile UHPLC |
| Vaporizzatore per anestesia | Scienze della Vita RWD | R580 | Usato per somministrare anestesia isoflurano ai topi |
| Analizzatore biochimico automatico | Istituto di Ingegneria Biologica Jian Cheng, Nanchino, Cina | A110-1 & A111-1 | Misura i parametri sierici (glucosio, TC, TG, LDL-C, HDL-C, AST, ALT) e i livelli di lipidi epatici |
| Bacillo coagulante (GIM 1.645) | Centro di Raccolta delle Colture Microbiche del Guangdong, Cina | GIM 1.645 | Ceppo componente della formulazione dei probiotici |
| Carbosilmetilcellulosa sodica (CMC-Na) | Sigma-Aldrich, USA | C4888 | Utilizzato come componente emulsionante per la preparazione di olio di microalghe ricco di DHA |
| Kit per il saggio Catalase (CAT) | Nanjing Construction Ltd. | A007-1-1 | Rileva l'attività della CAT (un indicatore della capacità antiossidante) nel tessuto epatico |
| Pacchetto software DADA2 | Team di sviluppo DADA2 | Incluso in QIIME 2 v2019.4 | Utilizzato per la denoising e il filtraggio chimera delle letture di sequenziamento |
| Olio di microalghe ricco di DHA (derivato da Schizochytrium sp.) | - | - | Ricco di acido docosaesaenoico (DHA); somministrato quotidianamente da Gavage a 10 e micro; L/g come intervento sperimentale |
| Animali sperimentali (Maschi C57BL/6J) | Laboratorio Animale Tecnologia del Fiume Vitale di Pechino | - | 6 settimane di vita, n = 4 per gruppo; Utilizzato per stabilire il modello MASLD tramite alimentazione HFD |
| Acido formico | Sigma-Aldrich, USA | F0507 | Additivo di fase mobile per l'analisi metabolomica |
| Database Greengenes | Greengenes | Versione 13_8 | Utilizzato per l'assegnazione tassonomica microbica |
| Dieta ad alto contenuto di grassi (HFD) | Research Diets Inc., USA | D12492 | Composto da 20% carboidrati, 20% proteine, 60% grassi (kcal); nutrito per 8 settimane per indurre la MASLD |
| Spettrometro di massa ad alta risoluzione | Thermo Fisher Scientific, USA | Q Orbitrap Esattivo | Utilizzato per la rilevazione dei metaboliti in modalità ioniche positive e negative |
| Database del Metaboloma Umano (HMDB) | Università di Alberta, Canada | Uscita 2024 | Database pubblico di annotazione dei metaboliti |
| Piattaforma Illumina MiSeq | Illumina, Inc., USA | Sistema MiSeq | Usato per il gioco di fine accoppiata 2 e volte; Sequenziamento a 250 bp |
| Isoflurano | Merck, Germania | PHR2874 | Utilizzato per l'anestesia inalatoria nei topi |
| Enciclopedia di Geni e Genomi di Kyoto (KEGG) | Laboratori Kanehisa, Giappone | Versione 2023 | Database utilizzato per l'arricchimento delle vie e l'annotazione dei metaboliti |
| Lactobacillus acidophilus (KDB-03) | Accademia di Scienze Agrarie dello Shandong, Cina | - | Ceppo componente della formulazione dei probiotici |
| Lactobacillus casei (KDB-LC) | Accademia di Scienze Agrarie dello Shandong, Cina | - | Ceppo componente della formulazione dei probiotici |
| Lactobacillus plantarum (DY-1) | Accademia di Scienze Agrarie dello Shandong, Cina | - | Ceppo componente della formulazione dei probiotici |
| Azoto liquido | Air Liquide | - | Utilizzato per il congelamento rapido e la conservazione di campioni fecali e di fegato |
| Kit per il saggio malondialdeide (MDA) | Nanjing Construction Ltd. | A003-1 | Rileva MDA (un marcatore di perossidazione lipidica/danno ossidativo) nel tessuto epatico |
| Software MassLynx | Waters Corporation, USA | Versione 4.1 | Utilizzato per l'elaborazione dei dati grezzi metabolomica, l'estrazione delle caratteristiche e la normalizzazione |
| Metanolo | Merck, Germania | 106035 | Solvente utilizzato per l'estrazione dei metaboliti |
| Piattaforma di analisi dati del microbioma | Genescloud | V1 | Piattaforma online: https://www.genescloud.cn/home; utilizzato per analisi di visualizzazione del microbioma per PCoA, NMDS, LEfSe e altre analisi di visualizzazione del microbioma |
| Kit OMEGA per il DNA del Suolo | Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA) | (M5635-02) | Isolamento del DNA |
| Le OTU fanno riferimento alle sequenze | Genescloud | Citato da McDonald et al. 2012; Utilizzato per l'assegnazione tassonomica delle varianti di sequenza degli ampliconi (ASV) | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, USA | 10010023 | Utilizzato per la risospensione batterica di pellet |
| Primer 341F/806R | Tsingke Biotechnology Co., Ltd., Cina | - | Utilizzato per l'amplificazione del 16S rRNA V3 e ndash; Regione V4. 341F: 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′; 806R: 5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′ |
| Probiotici | - | - | Ceppi specifici non esplicitamente menzionati; Utilizzato come intervento comparativo (principalmente migliora l'omeostasi del glucosio) |
| Software QIIME 2 | - | 2019.4 | Utilizzato per l'analisi bioinformatica del microbioma (elaborazione ASV, calcolo della diversità alfa/beta) |
| Software R | - | 4.4.1 | Utilizzato per l'analisi dell'arricchimento metabolitico epatico e per l'analisi di correlazione di Spearman delle associazioni microbio-metaboliti |
| Centrifuga refrigerata | Eppendorf, Germania | 5810R | Utilizzato per la centrifugazione di campioni siero e metabolomica |
| Colonna C18 a fase inversa | Waters Corporation, USA | 186002350 | Utilizzato per la separazione cromatografica dei metaboliti |
| Soluzione salina | Shijiazhuang No.4 Pharmaceutical | 2211112304 | Somministrato quotidianamente tramite gavage al gruppo di controllo (rispetto al trattamento con olio di microalghe) |
| Dieta standard del chow | Keao Xieli Feed Ltd., Cina | 1016706714625204224 | Composto dal 70% di carboidrati, 20% di proteine, 10% di grassi (kcal); alimentato al gruppo di controllo (RC) |
| Ago sterile per l'alimentazione | Laboratori Instech, USA | FTP-20-38 | Utilizzato per l'amministrazione orale della gavaga |
| Kit di saggio per il superossido dismutasi (SOD) | Nanjing Construction Ltd. | A001-3 | Rileva l'attività SOD (un indicatore della capacità antiossidante) nel tessuto epatico |
| Preadolescente-80 | Sigma-Aldrich, USA | P4780 | Utilizzato come componente emulsionante per la preparazione di olio di microalghe ricco di DHA |
| Omogeneizzatore a ultrasuoni | Scientz Biotechnology, Cina | JY92-IIN | Utilizzato per la sonicación del tessuto epatico durante l'estrazione dei metaboliti |
| Metabolomica Epatica Non Targetata | Metabo-Profile Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. | Codice del progetto: P035Y23A13_SFMU_MJWang_SH | |
| Miscelatore a vortice | Thermo Fisher Scientific, USA | LP Vortex Mixer | Utilizzato per l'omogeneizzazione e l'emulsificazione del campione |
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