Protocollo per la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti in cellule primordiali simili alle cellule germinali

Summary

Una guida passo dopo passo per generare cellule primitive simili a cellule germinali a partire da cellule staminali pluripotenti indotte umane in modo robusto, utilizzando un metodo 2D basato su monostrato con sovrapposizione di estratto di membrana basale.

Abstract

L'uso della differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane in vitro ha ampito significativamente la comprensione degli eventi di specificazione della linea che avvengono durante lo sviluppo precoce in vivo, un periodo estremamente difficile da indagare. Una delle prime linee embrionali specificate nell'embrione umano è la linea delle cellule germinali, caratterizzata dall'induzione delle cellule germinali primordiali (PGC). I PGC sono l'unica popolazione fondatrice dei gameti in età avanzata, e la loro specifica è un primo passo fondamentale verso la fertilità dell'organismo. Qui viene descritto un protocollo robusto per generare cellule simili al PGC (PGCLC) da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC), iniziando con la valutazione iniziale dello stato pluripotente e delle caratteristiche cellulari delle hiPSC per garantire un'efficace differenziazione PGCLC. Per questo si discutono gli effetti delle diverse densità cellulari, rivestimenti a piastre e hiPSC utilizzati per la differenziazione PGCLC. Infine, viene fornito un flusso di lavoro per la caratterizzazione e quantificazione degli hPGCLC, utilizzando immunofluorescenza e citometria di flusso. Il protocollo di differenziazione si concentra su condizioni facili da stabilire e testare nella maggior parte dei laboratori e che possono essere regolate secondo necessità. Inoltre, questo protocollo è rapido, permettendo di determinare se gli hiPSC siano adatti alla differenziazione PGCLC. Il protocollo mira a promuovere la coerenza e la compatibilità negli esiti hPGCLC tra diverse linee e piattaforme di coltura hiPSC, garantendo rese robuste che supportino una caratterizzazione affidabile e un'ulteriore ottimizzazione dei passaggi di differenziazione a valle verso una gametogenesi in vitro di successo nell'uomo.

Introduction

Lo sviluppo della linea germinale umana è un processo altamente coordinato che inizia precocemente nello sviluppo embrionale e inizia con la specificazione delle cellule germinali primordiali (PGC), la popolazione che alla fine dà origine a ovociti e cellule^{spermatozoi 1}. In vivo, la specificazione PGC avviene poco dopo l'impianto ^2,3 in risposta a segnali induttivi provenienti da cellule^{vicine 4,5}. Lo sviluppo dei PGC è stato ampiamente studiato nei roditori, in particolare attraverso studi genetici che hanno dimostrato il coinvolgimento di vie di segnalazione, come BMP, WNT e^TGFβ 6,7,8,9. A seguito della specifica, i PGC subiscono una riprogrammazione epigenetica, caratterizzata da demetilazione del DNA a livello genomico e rimodellamento della cromatina, per stabilire successivamente l'identità germinale (specifica per sesso⁾ 10,11,12,13,14.

Nei mammiferi, la specificazione PGC è guidata da un crosstalk coordinato tra vie di segnalazione, e alcuni aspetti sono evolutivamente conservati tra esseri umani, primati non umani, maiali e topi, incluso il coinvolgimento di fattori di pluripotenza come POU5F1 e NANOG ^{9,15,16,17,18}. Nonostante le caratteristiche condivise, le differenze specifiche per specie nei meccanismi di differenziazione PGC e nelle reti regolatorie geniche limitano la traduzione diretta dai modelli animali all'uomo 9,19,20,21.

Per comprendere la gametogenesi negli esseri umani, sono necessari studi che utilizzano materiale umano, ma rimangono impegnativi a causa dell'accesso limitato agli embrioni umani precoci. I continui progressi nei protocolli che consentono la differenziazione in vitro delle cellule germologiche primordiali umane (hPGCLC) da cellule staminali pluripotenti umane, come le cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSC), hanno ridotto la dipendenza dal tessuto gonadale umano, consentendo al contempo l'upscaling e gli studi^{genetici 18,22}. La maggior parte delle strategie consolidate per la differenziazione hPGCLC si basa su aggregati tridimensionali (3D) o corpi^{embrionali 18}. Utilizzando queste piattaforme, numerosi studi hanno dimostrato che gli hPGCLC riproducono caratteristiche epigenetiche chiave dei primi PGC umani, inclusi i programmi di trascrizione germinale^23,24 e la riprogrammazione della metilazione del DNA a livello^{genomico 25}. Insieme, queste piattaforme in vitro hanno avanzato notevolmente la conoscenza della biologia PGC umana, inclusi l'impegno della linea di discendenza e il reset epigenetico. Tuttavia, i protocolli di differenziazione hPGCLC basati su aggregazione rimangono impegnativi in quanto richiedono molto tempo, e la resa totale delle hPGCLC per caratterizzazione epigenetica robusta, ulteriori saggi di differenziazione o uso in applicazioni sperimentali ad alto rendimento rimane bassa.

Recentemente, un metodo 2D basato su monostrato e senza alimentatori, utilizzando estratto di membrana basale diluito (BMEx) in combinazione con bassi livelli di BMP4 per differenziare gli hiPSC in hPGCLC, si è dimostrato relativamente facile da scalare nelle piastre di coltura tissutale e ha raggiunto alte efficienze (~55%) in una breve finestra di differenziazione (5 giorni⁾²⁶. Rispetto ad altri sistemi 2D che richiedevano una fase intermedia di innesco dell'Activin A prima dell'induzione e utilizzavano concentrazioni BMP4 più elevate (40–50 ng/mL)^27,28, questo approccio BMEx non richiedeva una fase di pre-induzione e utilizzava livelli BMP4 più bassi (10 ng/mL), mantenendo però un'efficienza comparabile e una scalabilità migliorata.

Qui viene fornita una guida dettagliata passo dopo passo al protocollo 2D di differenziazione BMEx per hPGCLC, iniziando con la valutazione iniziale della manutenzione dell'hiPSC, inclusa pluripotenza e caratteristiche cellulari, seguita dal test degli effetti dei diversi rivestimenti a piastra e densità cellulari di hiPSC sulla differenziazione dell'hPGCLC. Viene inoltre descritta la caratterizzazione a valle tramite analisi della citometria di flusso e immunofluorescenza. Sono forniti punti critici di gestione e linee guida per la risoluzione dei problemi per ridurre le deviazioni di laboratorio, permettendo ai ricercatori di riprodurre costantemente la differenziazione hPGCLC in questo formato 2D.

Protocol

Questo protocollo segue le linee guida e i regolamenti del Leiden University Medical Center (LUMC), del LUMC Biobank & Biomaterials (TCBio) e del LUMC Leiden hiPSC Center (ai sensi del BB24.037). Tutti i materiali e le linee maschio di controllo (XY) hiPSC (M54 e M199) utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali. Tutte le procedure di coltura dei tessuti sono state eseguite in una sala dedicata alla coltura di biosicurezza di livello 2, dotata di un incubatore normossico umidificato (37 °C, 5% CO₂), una centrifuga polifunzionale da banco (rotore a secchio oscillante) e un armadio di biosicurezza di Classe II con stereomicroscopio.

ATTENZIONE: Non tutte le linee hiPSC possono differenziarsi in hPGCLC^26,29. Tuttavia, se venissero utilizzati altri hiPSC per la differenziazione PGCLC e si osservassero PGCLC, il metodo descritto qui (Figura 1A) permetterà di aumentare la produzione di hPGCLC.

1. Rivestimento delle piastre di coltura tissutale per coltura hiPSC

Questo protocollo descrive il rivestimento delle placche di coltura tissutale sia con BMEx che vitronectin diluiti.

1. Rivestimento con estratto di membrana basale (BMEx)
   1. Scongela un'aliquota di BMEx sul ghiaccio. Possono essere Geltrex, Cultrex o Matrigel.
   2. Diluire l'aliquota dell'estratto della membrana basale in DMEM/F12 freddo fino a una concentrazione finale dell'1% (v/v) e risospendere delicatamente.
   3. Rivestire il numero desiderato di pozzi di una piastra a 6 pozzi con 1 mL di BMEx diluito per pozzo.
   4. Incubare la piastra rivestita per almeno 30 minuti a 37 °C.
      NOTA: Le piastre rivestite possono essere conservate a 2–8 °C per un massimo di 1 settimana. Quando si utilizzano piastre rivestite conservate a 2–8 °C, si incuba la piastra per almeno 10 minuti a 37 °C prima di un ulteriore utilizzo.
2. Rivestimento con vitronectina
   1. Scongelare un'aliquota di vitronectina a temperatura ambiente (RT) per 10–15 minuti.
   2. Diluire la vitronectina a una concentrazione finale di 5 μg/mL in DPBS senza calcio e magnesio (DPBS -/-) e risospendere delicatamente.
   3. Ricoprire il numero di pozzi desiderati di una piastra a 6 pozzi con 1 mL di vitronectina diluita per pozzo.
   4. Incubare la piastra rivestita a 6 pozzi per 1 ora a RT.

2. Passaggio per la manutenzione degli hiPSC

1. Preparare il mezzo di coltura: mezzo di coltura cellulare senza siero mTeSR Plus integrato con soluzione per la prevenzione della contaminazione da micoplasmi (MycoZap (1:1000)).
2. Aspirare il mezzo di coltura dalle cellule pronte per essere passate.
3. Aggiungi 0,5 mL di agente di selezione e passaggio di PSC umano (ReLeSR) a ciascun pozzo e aspira questo entro 1 minuto. Assicurati che rimanga uno strato molto sottile sulle cellule.
4. Incubare le cellule per 6 minuti a 37 °C.
5. Batti un paio di volte sui lati della piastra a 6 pozzi.
6. Distacca con cura le cellule con un mezzo di coltura da 1 mL pipettando su e giù con una pipetta p1000, e assicurati di controllare regolarmente la dimensione dei frammenti della colonia per mantenerne la dimensione tra 50 e 200 μm.
7. Prendi le piastre a 6 pozzi pre-rivestite e rimuovi la soluzione di rivestimento (Passo 1).
8. Aggiungi 2 mL di mezzo di coltura in ogni pozzo.
9. Trasferire il mezzo di coltura contenente i frammenti della colonia hiPSC staccati nel nuovo pozzo nel rapporto desiderato.
   NOTA: Il rapporto ideale per la divisione dei frammenti di colonia di hiPSC è 1:6-1:50, permettendo il passaggio ogni 4–7 giorni.
10. Posizionare la piastra di coltura cellulare con i frammenti della colonia di hiPSC passati in un incubatore normossico umidificato (37 °C, 5% CO₂).
11. Rinfresca il mezzo di coltura a giorni alterni con un substrato di coltura da 2 mL finché i hiPSC non sono pronti per essere rimossi.
    NOTA: Aggiungi 4 mL di substrato colturale invece di 2 mL a ogni 6-pozzo per evitare la necessità di rinfrescare durante il fine settimana.
    ATTENZIONE: Non passare hiPSC quando la confluenza è troppo bassa e abbandonare la cultura quando la confluenza è troppo alta per mantenere una cultura hiPSC sana ed evitare differenziazioni spontanee.

3. differenziazione hPGCLC

1. Preparazione prima della differenziazione hPGCLC (Giorno 0).
   1. Aggiorna il mezzo di coltura degli hiPSC 1 ora prima di iniziare la differenziazione degli hPGCLC.
   2. Prepara la soluzione di rivestimento: soluzione BMEx all'1% diluita v/v in DMEM/F12 freddo.
   3. Rivestire il numero desiderato di pozzi di una piastra a 12 pozzi con una soluzione di rivestimento di 0,5 mL.
   4. Incubare la piastra rivestita per almeno 30 minuti a 37 °C prima di iniziare la differenziazione.
   5. Prepara il mezzo di impiccatura: soluzione BMEx al 2% (v/v) in un mezzo di coltura fredda e integra con un mezzo di recupero post-disgelo (RevitaCell) (1:100).
      ATTENZIONE: Tieni il mezzo di impiccatura sul ghiaccio durante la preparazione e la confezione degli hiPSC.
2. Placcatura hiPSC per differenziazione hPGCLC (Giorno 0).
   1. Rimuovere il mezzo di coltura dal 6-pozzo contenente gli hiPSC per usarlo nella differenziazione hPGCLC. Inizia con hiPSC di alta qualità con confluenza al 50–80%, senza segni di differenziazione spontanea.
   2. Aggiungi 1 mL di soluzione di tripsina (TrypLE) per pozzo.
   3. Incubare gli hiPSC per 5 minuti a 37 °C.
   4. Realizzare una sospensione a singola risospendendo con cura le colonie dell'hiPSC 2–3 volte con una pipetta p1000.
   5. Controlla con un microscopio rovesciato se è stata ottenuta una sospensione a singola cellula. Se no, risospezione delle colonie di hiPSC altre 1–2 volte con una pipetta p1000.
   6. Trasferire la sospensione della cella hiPSC su un tubo da 15 mL.
   7. Aggiungi 4 mL di DMEM-F12 medium al tubo da 15 mL.
   8. Centrifuga la sospensione a celle hiPSC a 200 x g per 5 minuti.
   9. Aspirare il sovrantantante e risospendere con cura le celle hiPSC in un mezzo di placcatura da 0,5 a 1,0 mL.
   10. Contare il numero di hiPSC utilizzando un contatore cellulare o un emocitometro e calcola il numero di hiPSC necessari per ogni pozzo per la differenziazione hPGCLC.
       NOTA: Come punto di partenza, si può utilizzare una densità di placcatura di 40–80K celle/^cm2 . Tuttavia, per ogni linea cellulare e a ogni numero di passaggio, si raccomanda l'ottimizzazione della densità di placcatura per ottenere la resa ottimale. Qui, gli hiPSC sono stati placcati con una densità di placcatura di 10K a 100K celle/^cm2.
   11. Sospendere attentamente il numero richiesto di hiPSC nel volume appropriato di mezzo di placcatura (1 mL per pozzetto di una piastra a 12 pozzi) e assicurarsi che si ottenga una sospensione omogenea a celle utilizzando una pipetta p1000.
   12. Prendi la piastra a 12 pozzi rivestita dall'incubatrice e rimuovi la soluzione di rivestimento.
   13. Aggiungi 1 mL della sospensione a celle a ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzi.
   14. Scuoti con attenzione la piastra per assicurarti che le cellule siano distribuite uniformemente nel pozzo.
   15. Posizionare la piastra a 12 pozzi in un incubatore normossico umidificato (37 °C, 5% CO₂₎ per 16–24 ore.
3. Differenziazione hPGCLC (Giorno 1–2)
   1. Preparare il mezzo basale RB27: RPMI160 avanzata con B-27 (1:100), 1X sostituto amminoacidico (Glutamax), 1X amminoacidi non essenziali MEM e soluzione per la prevenzione della contaminazione da micoplasmi (1:1000).
   2. Prepara il mezzo di differenziazione: soluzione BMEx al 2% (v/v) in mezzo basale freddo RB27 e aggiungi BMP4 a una concentrazione finale di 10 ng/mL. L'estratto della membrana basale è necessario per indurre la lumenogenesi e attivare la specifica PGCLC in vivo.
      ATTENZIONE: Tieni il mezzo di differenziazione sul ghiaccio o a 4 °C. I mezzi di differenziazione possono essere preparati per i giorni 1 e 2 del protocollo di differenziazione.
   3. Nel Giorno 1 (entro 16–24 ore dopo la piastratura degli hiPSC), togli la piastra dall'incubatrice e rimuovi il mezzo di impigatura.
   4. Lavare i pozzi aggiungendo 0,5 mL di mezzo basale RB27 per pozzo.
   5. Aspirare il mezzo basale RB27 e aggiungere 1 mL di mezzo di differenziazione per pozzo.
   6. Rimettere la piastra con le cellule nell'incubatrice normoxica umidificata (37 °C, 5% CO₂).
   7. Al secondo giorno della differenziazione, si rinfrescano le cellule con 1 mL di mezzo di differenziazione per pozzo.
4. Differenziazione hPGCLC (Giorno 3–5)
   1. Prepara il mezzo di commutazione: medio basale RB27 integrato con BMP4 (10 ng/mL), LIF (10 ng/mL), SCF (50 ng/mL) e EGF (50 ng/mL). Il mezzo di commutazione rispecchia il passaggio in vivo dalla specifica hPGC alla sopravvivenza e proliferazione. BMEx viene omesso perché la lumenogenesi non è più necessaria.
   2. Nel giorno 3 e giorno 4, aggiorna ogni pozzo con un mezzo interruttore da 1 mL.
   3. Al quinto giorno di differenziazione, gli hPGCLC possono essere caratterizzati utilizzando immunofluorescenza o citometria a flusso.

4. Caratterizzazione degli hPGCLC tramite immunofluorescenza e citometria di flusso

1. Caratterizzazione tramite immunofluorescenza.
   1. Prepara la soluzione di permeabilizzazione: 0,3% Triton X-100 diluito in PBS.
   2. Prepara la soluzione di lavaggio: 0,05% Tween 20 in PBS (PBST)
   3. Prepara la soluzione bloccante: albumina sierica bovina (BSA) all'1% in PBST.
   4. Rimuovere il mezzo di commutazione dai pozzi utilizzati per la differenziazione hPGCLC.
   5. Lavare le celle con 1 mL per pozzo DPBS (-/-).
   6. Fissare le cellule con 1 mL per pozzo al 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS per 15 minuti a RT.
   7. Lava le cellule 3 volte per 5 minuti con PBS, usando 1 mL per pozzo.
      NOTA: A questo punto, le piastre possono essere conservate a 4 °C prima dell'inizio dell'immunofluorescenza.
   8. Permeabilizza le cellule con la soluzione di permeabilizzazione per 15 minuti a RT, utilizzando 1 mL per pozzo.
   9. Lava le cellule 3 volte per 5 minuti con la soluzione per il lavaggio, usando 1 mL per pozzo.
   10. Bloccare le celle con soluzione bloccante per 1 ora a RT, utilizzando 1 mL per pozzo.
   11. Prepara la soluzione primaria degli anticorpi: diluire gli anticorpi primari di interesse nella soluzione bloccante.
       NOTA: Qui sono state utilizzate le seguenti due combinazioni di anticorpi per i marcatori PGC: anti-SOX17 di capra e anti-TFAP2C di coniglio, e anti-SOX17 di capra e anti-POU5F1 di topo (Tabella dei materiali).
   12. Rimuovere la soluzione bloccante, aggiungere 0,4 mL di soluzione primaria di anticorpi per pozzo e incubare durante la notte a 4 °C.
       NOTA: È importante includere controlli negativi per valutare il legame anticorpale non specifico. Per questo, lasciane uno ben per tutta la notte in una soluzione bloccante, omettendo gli anticorpi primari, ma poi colorare bene con la soluzione secondaria di anticorpi.
   13. Il giorno dopo, rimuovere la soluzione primaria di anticorpi e lavare le cellule 3 volte per 5 minuti con PBST.
   14. Prepara una soluzione secondaria per anticorpi: diluire gli anticorpi secondari di interesse (Tabella dei materiali) e DAPI (1:500) in soluzione bloccante.
       NOTA: La soluzione secondaria di anticorpi è sensibile alla luce e deve essere conservata al buio.
   15. Rimuovere PBST e aggiungere 0,4 mL di soluzione secondaria di anticorpi per pozzo per 1 ora a RT al buio.
   16. Lava le cellule 3 volte per 5 minuti con PBS, usando 1 mL per pozzo.
   17. Fai imaging delle cellule (lente obiettiva 20x).
       NOTA: Le immagini di immunofluorescenza sono state acquisite utilizzando un obiettivo 20x sul microscopio Airyscan, mentre le immagini in campo chiaro sono state catturate con un obiettivo 4x e uno 10x sul microscopio EVOS.
2. Caratterizzazione tramite citometria di flusso
   1. Preparare il buffer FACS: 0,5% BSA in DPBS (-/-)
   2. Rimuovi il mezzo di commutazione dai pozzi con gli hPGCLC.
   3. Lavare le celle con 1 mL DPBS (-/-).
   4. Aggiungi 0,5 mL di Accutase preriscaldata per pozzo e incuba per 15 minuti a 37 °C. Per la dissociazione, l'Accutasi è preferita alla soluzione di tripsina perché gli hPGCLC sono altamente sensibili alla dissociazione.
   5. Realizzare una sospensione a singola risospendendo con cura le celle 2–3 volte con un p1000.
   6. Controlla con un microscopio rovesciato se è stata ottenuta una sospensione a singola cellula. In caso contrario, risospedi le cellule altre 1–2 volte con una pipetta p1000.
   7. Filtrare la sospensione della cella attraverso un filtro da 40 μm in un tubo da 15 mL.
   8. Lava il filtro da 40 μm con un buffer FACS da 5 mL.
   9. Centrifuga la sospensione a celle a 300 x g per 5 minuti.
   10. Rimuovi il soprannatante.
   11. Risospendere il pellet cellulare in un buffer FACS da 0,3 mL in un tubo da 1,5 mL.
       NOTA: È opzionale contare le cellule utilizzando un contatore cellulare o un emocitometro. Se le celle vengono contate, aspettati circa 1 milione di celle per pozzo di una piastra a 12 pozzi.
   12. Prepara campioni di controllo adeguati per la citometria di flusso (controlli non colorati e con colorazione singola). Per questo, trasferire 15–30 μL della sospensione della cella in tubi da 1,5 mL e riempire fino a 100 μL con il buffer FACS.
       NOTA: Per questo studio sono state preparate 3 colorazioni singole: EPCAM-PEcy7 (1:200), ITGA6-BV421 (1:200) e 7AAD (1:200). Le soluzioni contenenti gli anticorpi coniugati e il 7AAD sono sensibili alla luce e devono essere conservate al buio.
   13. Aggiungere direttamente gli anticorpi coniugati di interesse alla sospensione cellulare per ottenere una diluizione adeguata. Qui, insieme sono stati utilizzati insieme i seguenti anticorpi coniugati per i marcatori PGC: EPCAM-PEcy7 (1:200) e ITGA6-BV421 (1:200) (Tabella dei materiali).
   14. Incubare le cellule con gli anticorpi coniugati per 30 minuti su ghiaccio al buio.
   15. Aggiungi 1 mL di tampone FACS ai campioni, controllo non colorato e controlli a singolo anticorpo, e centrifuga a 300 x g per 5 minuti.
   16. Rimuovi il soprannatante.
   17. Risospendere i campioni a 0,5 mL e i campioni di controllo a 0,2 mL, del buffer FACS contenente 1 mM EDTA. Questo impedisce che le cellule si agglutino.
   18. Aggiungi i campioni e i controlli in un tubo FACS da 5 mL con un filtro filtro per filtri cellulari, poi passali attraverso il filtro.
   19. Aggiungi direttamente 7AAD a ogni campione diversi minuti prima di misurare nel citometro di flusso.
   20. Misura i campioni usando un citometro a flusso. Qui, per misurare i campioni è stato utilizzato l'analizzatore cellulare basato su fluorescenza, i dati sono stati raccolti con il software FACSDiva (v9.0) e il software FlowJo (v10.10.0) è stato utilizzato per analizzare i dati.
   21. Utilizzare i campioni di controllo (controlli non colorati e a singolo anticorpo) per impostare la strategia di gating ed eseguire la compensazione se necessario.
   22. Vortice i campioni prima di metterli nella macchina.
   23. Estrarre la popolazione cellulare da tutti gli eventi impostando prima una porta basata sull'area [area di dispersione frontale (FSC-A) e area di dispersione laterale (SSC-A)].
   24. Da questa popolazione cellulare, estraggono singole cellule in base alla dimensione [larghezza FSC (FSC-W) e altezza FSC (FSC-H)] e granularità [SSC-W e SSC-H].
   25. Escludere le cellule morte da ulteriori analisi impostando una porta per le cellule 7AAD-negative.
   26. Usa il campione per verificare se le porte sono posizionate correttamente e regolarle se necessario.
   27. Analizza i marcatori di interesse di questa popolazione di cellule vive. Qui, le cellule gated positive sia per EPCAM che per ITGA6 corrispondevano agli hPGCLC.

Results

La qualità e lo stato stabile degli hiPSC sono importanti per un'ulteriore differenziazione
le hiPSC venivano mantenute in piastre a 6 pozzi per almeno 3 passaggi (nei diversi rivestimenti) prima degli esperimenti di differenziazione e delle analisi. Le hiPSC sono state passate quando le colonie cellulari hanno raggiunto una confluenza del 70–80% (Figura 1B), che è anche la confluenza ottimale per iniziare la differenziazione hPGCLC. Le colture sane di hiPSC hanno mostrato una morfologia uniforme della colonia senza aree scure o differenziate, visibile nelle immagini in campo chiaro (Figura 1B). Tuttavia, la qualità degli hiPSC è stata influenzata quando le colonie cellulari non sono state mantenute alla confluenza ottimale o hanno mostrato segni di differenziazione (Figura 1B). A bassa confluenza, l'hiPSC continuava a proliferare e si necessitava di più tempo per la formazione della colonia fino a quando la confluenza non fosse adatta a esperimenti di passaggio o differenziazione. Ad alta confluenza, gli hiPSC crescevano uno sopra l'altro, mentre apparivano regioni differenziate. Lo stato di pluripotenza degli hiPSC è stato confermato dall'espressione di SOX2 o POU5F1, entrambi fattori di trascrizione essenziali per mantenere la pluripotenza e l'auto-rinnovamento negli hiPSC³⁰, e soprattutto, SOX2 non è espresso dagli^{hPGCLC 31}. La colorazione con la flaloidina è stata utilizzata per valutare l'organizzazione del citoscheletro e la morfologia delle colonie, indicativa della qualità degli hiPSC. Si noti che le differenze nella morfologia cellulare sono associate alla riduzione di SOX2 o POU5F1 (Figura 1B).

Effetto del substrato di mantenimento dell'hiPSC sulla differenziazione dell'hPGCLC
Per valutare se il mantenimento degli hiPSC su diversi substrati di rivestimento influenzasse la differenziazione verso gli hPGCLC, gli hiPSC sono stati coltivati su substrati differenti (Geltrex, Matrigel, Cultrex e vitronectina) (Figura 2). Su tutti i substrati, gli hiPSC hanno mostrato livelli robusti e uniformi di SOX2 nucleare o POU5F1, indicativo del loro stato pluripotente. le colonie hiPSC mantenute su Geltrex, Matrigel e Cultrex avevano una morfologia comparabile, inclusi confini ben definiti e forme complessive irregolari delle colonie, rispetto alle colonie rotonde con la vitronectina (Figura 2). Le hiPSC che hanno raggiunto una confluenza del 70–80% sono state placcate a una densità di 40K cellule/^cm2 e differenziate in hPGCLC su Geltrex²⁶. Al quinto giorno, le immagini del campo chiaro hanno mostrato colonie caratteristiche di hPGCLC in tutte le condizioni (Figura 3). Inoltre, in tutte le condizioni sono stati identificati hPGCLC SOX17/TFAP2C/PDPN triplo positivi o doppiamente positivi SOX17/POUF51 (Figura 3). Questo suggeriva che il protocollo di differenziazione potesse essere utilizzato con hiPSC coltivati in condizioni diverse.

Effetto della densità cellulare hiPSC iniziale sulla differenziazione hPGCLC
È importante verificare la densità ottimale di semina per la differenziazione ottimale degli hPGCLC (su Geltrex), poiché diversi hiPSC hanno tassi di proliferazione differenti. Inoltre, nel caso in cui l'efficienza nella differenziazione hPGCLC diminuisse durante il passaggio continuo degli hiPSC, si consiglia di regolare la densità della cella di semina dell'hiPSC. Per valutare l'impatto della densità delle cellule di semina sull'efficienza della differenziazione hPGCLC, gli hiPSC sono stati seminati a densità diverse, da 10K a 100K cellule/^cm2 (Figura 4A). Al quinto giorno, la percentuale di hPGCLC è stata valutata tramite citometria di flusso utilizzando due diversi anticorpi coniugati per i marcatori PGC umani, EPCAM e integrina α6 (ITGA6)³². L'analisi a citometria a flusso ha seguito una strategia standard di gating sequenziale, mostrata per gli hiPSC M199 seminati a 40K cellule/^cm2 (Figura 4B). In breve, la popolazione cellulare totale (tutti gli eventi) è stata selezionata per escludere detriti (area particellare), poi sono state selezionate singole cellule in base alla dimensione (FSC) e alla granularità (SSC), e infine sono state escluse le cellule morte sulla base della colorazione 7AAD. Successivamente, è stato stabilito il gate per quantificare le cellule che esprimono EPCAM-cy7 e ITGA6-BV421 utilizzando campioni colorati e non colorati (Figura 4B).

Confrontando l'efficienza di differenziazione hPGCLC usando diverse densità cellulari di semina e usando hiPSC coltivati su substrati differenti si è rivelata una tendenza dipendente dalla densità (Figura 4C). Alla densità di semina di 20–40K cellule/^cm2, gli hiPSC M54 e M199 hanno mostrato la più alta proporzione di hPGCLC doppiamente positivi EPCAM+/ITGA6+, ottenuta da hiPSC mantenuti su Geltrex e Cultrex. È interessante notare che densità più elevate portavano a una minore efficienza di differenziazione. I risultati di immunofluorescenza utilizzando i marcatori PGC SOX17/TFAP2C/PDPN o SOX17/POUF51 sugli hPGCLC hanno validato i risultati della citometria a flusso (Figura 4D). Questi risultati suggeriscono che adattare la densità di semina ai specifici hiPSC è importante per ottenere un'efficienza ottimale di differenziazione. La combinazione di immunofluorescenza e citometria a flusso aumenta la robustezza del saggio di differenziazione hPGCLC.

Figura 1: flusso di lavoro di differenziazione degli hPGCLC e qualità degli hiPSC. (A) Schema del flusso di lavoro utilizzato in questo studio. Le hiPSC sono state mantenute (nel mezzo di coltura) e hanno raggiunto una confluenza del 60–80% il giorno della differenziazione (Giorno 0, D0). Su D0, gli hiPSC sono stati dissociati in singole cellule e impiattati nella densità di semina desiderata (nel mezzo di impiccamento). Il giorno successivo, le cellule sono state trattate con mezzo di differenziazione (D1–D3), seguito da mezzo di commutazione (D3–D5). Su D5, gli hPGCLC sono stati utilizzati per immunofluorescenza o citometria a flusso. (B) Immagini in campo chiaro (fila superiore - ingrandimento 4x); immunofluorescenza per SOX2, colorazione con FALOIDINA e colorazione DAPI (riga centrale); e per POU5F1, colorazione con FALOIDINA e colorazione DAPI (riga inferiore) che mostrano hiPSC con confluenza diversa. Barre di scala = 50 μm. I disegni nella Figura 1A sono stati creati dagli autori utilizzando strumenti di disegno di base in Adobe Illustrator; non veniva utilizzato alcun software o strumento a pagamento. Pertanto, non era richiesta alcuna licenza per il copyright. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Effetto di vari substrati di rivestimento durante la coltura hiPSC. Immagini a campo chiaro (riga superiore); immunofluorescenza per SOX2, colorazione con FALOIDINA e colorazione DAPI (riga centrale); e per POU5F1, colorazione con PHALOIDINA e colorazione DAPI (fila inferiore) che mostrano hiPSC coltivati su diversi substrati di rivestimento. Barre della scala = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Effetto di vari substrati di rivestimento durante la coltura hiPSC sulla differenziazione degli hPGCLC. Immagini in campo chiaro (fila in alto - ingrandimento 10x); immunofluorescenza per SOX17, TFAP2C, PDPN e colorazione DAPI (riga centrale); e per la differenziazione POU5F1, SOX17 e DAPI (fila inferiore) degli hPGCLC (usando Geltrex) al giorno 5, partendo dagli hiPSC coltivati su diversi substrati di rivestimento. La linea gialla tratteggiata evidenzia le regioni con hPGCLC. Barre di scala = 25μm (fila superiore) e 50 μm (righe centrali e inferiori). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Effetto della densità di semina hiPSC sulla differenziazione degli hPGCLC. (A) Immagini del campo chiaro al giorno 1 (D1) e D3 della differenziazione degli hPGCLC utilizzando diverse densità di semina hiPSC (40K celle/^{cm 2}, 60K cellule/cm2, 80K/cm²). Barre di scala = 250 μm. ingrandimento 4x. (B) Grafici rappresentativi di citometria a flusso che mostrano la strategia di gating per quantificare la percentuale di HPCAM+/ITGA6+ hPGCLC. Per questo, sono stati utilizzati M199 hiPSC (su Geltrex) con una densità di semina di 40K celle/^cm2. (C) Grafico a barre che mostra le percentuali di hiPGCLC EPCAM+/ITGA6+ a D5 quando si utilizzano hiPSC (M199 e M54) coltivati su diversi rivestimenti e seminati a densità differenti. (D) Immunofluorescenza per SOX17, TFAP2C, PDPN e colorazione DAPI (pannello sinistro); e SOX17, POU5F1 e colorazione DAPI (pannelli destra) a D5 della differenziazione hPGCLC usando hiPSC (M199 e M54, su Geltrex) seedati a celle 40K e 80K/cm2. Barre della scala = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

La gametogenesi in vitro costituisce una potente piattaforma sperimentale per indagare lo sviluppo della linea germinale umana, la tossicità riproduttiva e l'infertilità in condizioni di coltura controllata e su base specifica per paziente. Sebbene siano stati riportati¹⁸ più protocolli per differenziare gli hPGCLC dagli hiPSC, i progressi nel campo sono stati ostacolati dalla limitata disponibilità di approcci standardizzati, scalabili e riproducibili nei laboratori. Studi recenti hanno descritto approcci semplificati ed efficienti per l'induzione di hPGCLC, tra cui la differenziazione micropattern^{basata su BMP4 27}, una piattaforma monostrato rapida 2D che consente la generazione di hPGCLC entro 3,5^{giorni e 28}, e un sistema di coltura 3D che modella lo sviluppo peri-impianto e la segnalazione paracrina di nicchia³³. Anche se questi protocolli supportavano efficacemente la differenziazione hPGCLC, mancavano ancora della capacità di servire come piattaforme ad alto throughput. Perché gli studi basati su hPGCLC siano ampiamente applicabili, in particolare per gli screening tossicologici riproduttivi, i protocolli devono essere robusti, tecnicamente accessibili e compatibili con i test quantitativi a valle. Qui viene presentata un'analisi passo dopo passo del protocollo BMEx-differenziazione dell'hPGCLC, sottolineando parametri tecnici critici che determinano la riproducibilità e le prestazioni.

Un fattore determinante principale per una differenziazione di successo è lo stato iniziale di pluripotenza degli hiPSC. Il numero di passaggi, la salute cellulare, le caratteristiche specifiche delle linee e le condizioni della coltura pre-differenziazione possono influenzare gli esiti di differenziazione dell'hPGCLC. Inizialmente, durante la manutenzione dell'hiPSC, l'attenzione può essere rivolta al substrato di rivestimento, alla densità della cellula di semina e al formato della piastra di coltura, che insieme definiscono l'architettura della colonia e gli ambienti di segnalazione all'inizio della differenziazione hPGCLC. Il presente studio dimostra l'effetto dell'uso di hiPSC coltivati su diversi rivestimenti e diverse densità di semina sulla differenziazione degli hPGCLC (su Geltrex). Entrambe le linee hiPSC testate qui hanno mostrato la massima efficienza di differenziazione a 20.000–40.000 cellule/cm di densità di^{semina 2} . Questo sottolinea la necessità di determinare le densità di semina ottimali quando si introducono nuove linee cellulari, si segue un passaggio prolungato o si modificano layout sperimentali o formati di piastre di coltura. Anche cambiamenti apparentemente minori nei rapporti superficie-volume o nella cinetica della crescita possono richiedere ottimizzazione per preservare un'alta efficienza di differenziazione. Di conseguenza, si raccomanda agli utenti di effettuare esperimenti pilota su piccola scala per determinare prima le condizioni ottimali per la differenziazione hPGCLC.

Nonostante la sua robustezza, il metodo presenta delle limitazioni che vanno riconosciute. Sebbene compatibile con molteplici rivestimenti e densità, l'efficienza di differenziazione rimane sensibile alle proprietà intrinseche dell'hiPSC, inclusi lo stato epigenetico e la storia del passaggio, che non sono completamente controllabili. Diversi hiPSC testati sembravano incapaci di differenziarsi in hPGCLC²⁶. Soprattutto, a differenza della vitronectina, che è un prodotto completamente definito, BMEx è un prodotto di origine animale soggetto a variazioni da batch a lotto, che può influire sulla riproducibilità. Sebbene diversi lotti di Matrigel, Cultrex e Geltrex siano stati precedentemente testati e hanno prodotto risultati^{coerenti 26}, ciò rimane una preoccupazione e dovrebbero essere considerate alternative completamente definite a BMEx per garantire futura riproducibilità e trasferibilità. Qui sono state utilizzate due linee maschio (XY) hiPSC, ma questo protocollo è stato testato sia con linee femminile (XX) che maschile (XY)²⁶. Infine, mentre il protocollo ha portato alle hPGCLC, che si sono dimostrate trascrizionalmente simili alle hPGC e competente per uno sviluppo^{successivo 26,34}, la maturazione successiva nelle fasi cellulari germinali non è stata affrontata qui. Sebbene la scalabilità sia stata dimostrata per applicazioni in stile screening, l'adattamento basato sull'automazione e la validazione inter-laboratorio su un panel più ampio di linee hiPSC rafforzeranno ulteriormente l'utilità traslazionale.

Rispetto alle strategie di differenziazione hPGCLC esistenti, questo protocollo offre diversi vantaggi. A differenza degli approcci altamente specializzati o limitati a matrici, essa accoglie substrati di manutenzione hiPSC comunemente utilizzati e formati di lastre di coltura, riducendo così le barriere tecniche. L'enfasi sull'ottimizzazione della densità e sul controllo qualità nelle prime fasi migliora ulteriormente la riproducibilità, una sfida persistente nel campo della gametogenesi in vitro .

Il quadro metodologico qui descritto è particolarmente rilevante per la tossicologia riproduttiva, la modellazione dell'infertilità e la biologia dello sviluppo. La sua compatibilità con formati scalabili consente lo screening composto a media e alta produttività, mentre la sua riproducibilità supporta confronti incrociati e sforzi collaborativi di consorzi. Più in generale, la standardizzazione sistematica dei protocolli di induzione hPGCLC tra i laboratori, confrontando caratterizzazione e endpoint^{funzionali 18,35}, sarà essenziale per far avanzare la gametogenesi in vitro verso piattaforme predittive rilevanti per l'uomo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7AAD Viability Staining Solution	BioLegend	420403	Dilution 1:200
Accutase	STEMCELL Technologies	7920
Advanced RPMI 1640 Medium	Gibco	12633012
Alexa Flour 488 donkey anti-mouse IgG	Invitrogen	A21202	Dilution 1:500
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG	Invitrogen	A21207	Dilution 1:500
Alexa Flour 647 donkey anti-goat IgG	Invitrogen	A21447	Dilution 1:500
Alexa Fluor Phalloidin 594	Invitrogen	A12381	Dilution 1:400
Alexa Fluor Phalloidin 647	Invitrogen	A30107	Dilution 1:400
Antibody anti-CD49f (ITGA6), Brilliant Violet 421	Biolegend	313624	Dilution 1:200
Antibody anti-CD326 (EPCAM1), PE/Cyanine7	Biolegend	324222	Dilution 1:200
Antibody anti-SOX2, rabbit polyclonal	Merck	ab5603	Dilution 1:200
Antibody anti-SOX17, goat polyclonal	R&D Systems	AF1924	Dilution 1:500
Antibody anti-OCT3/4 (POU5F1), mouse monoclonal	Santa Cruz Biotechnology	SC-5279	Dilution 1:200
Antibody anti-Podoplanin (PDPN), mouse monoclonal	Abcam	ab256561	Dilution 1:200
Antibody anti-AP-2γ (TFAP2C), rabbit polyclonal	Cell Signaling Technology	2320S	Dilution 1:300
B-27 Supplement, serum free	Gibco	17504044	Diltuion 1:100
BD FACSCanto	BD Biosciences		Attrezzatura per citometria a flusso
BD FACSDiva software version 9.0	BD Biosciences		Software
Bovine Serum Albumin (BSA), fractie V	Roche	10735086001	Sciogliere in PBST
CELLSTAR 12 Well Cell Culture Plate	Greiner	665180
CELLSTAR 15 mL Tube	Greiner	188271
CELLSTAR 6 Well Cell Culture Plate	Greiner	657160
Corning 40 µm Cell Strainers	Corning	431750
Cultrex Stem Cell Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	R&D systems	3434-101-02	Dilute to in cold DMEM-F12
DAPI (4′,6-Diamidino-2-Phenylindole)	Invitrogen	D3571	Dilution 1:500
DMEM:F12, GlutaMAX supplement	Gibco	31331028
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
EVOS M5000	Invitrogen		Attrezzatura per l'imaging
EVOS M5000 software version 1.3.660.548	Invitrogen		Software
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
FlowJo software version 10.10.0	BD Biosciences		Software
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stem-cell qualified	Gibco	A1413302	Dilute to in cold DMEM-F12
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Dilution 1:100
FlowJo software version 10.10.0	BD Biosciences		Software
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stem-cell qualified	Gibco	A1413302	Dilute to in cold DMEM-F12
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Dilution 1:100
hiPSCs M54	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0054iCTRL03	hiPSCs possono essere distribuite su richiesta con MTA
hiPSCs M199	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0199iCTRL01	hiPSCs possono essere distribuite su richiesta con MTA
LUNA-II Automated Cell Counter	Logos Biosystems		Attrezzatura per il conteggio delle cellule
LUNA-II software version 2.3.5	Logos Biosystems		Software
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free	Corning	354277	Dilute to in cold DMEM-F12
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050	Dilution 1:100
mTeSR Plus	STEMCELL Technologies	100-0276
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2011	Dilution 1:1000
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	1040051000	Sciogliere in 8% PFA in acqua prima; e diluire a 4% (1:1) con tampone fosfato 0,2 M
PIPETMAN P1000, 100–1000 µL, Metal Ejector	Gilson	F144059M
PIPETMAN P200, 20–200 µL, Metal Ejector	Gilson	F144058M
PIPETMAN P10, 1–10 µL, Metal Ejector	Gilson	F144055M
Recombinant Human BMP4, CF	R&D Systems	314-BP-050	Concentrazione in stock di 100 µg/mL in 4 mM HCL contenente 0,1% BSA
Recombinant Human EGF, CF	R&D Systems	236-EG-200	Concentrazione in stock di 50 µg/mL in PBS
Recombinant human LIF	Gibco	300-05	Concentrazione in stock di 100 µg/mL in 0,1% BSA
Recombinant Human SCF, CF	R&D Systems	11010-SC-100	Concentrazione in stock di 100 µg/mL in PBS
ReLeSR