Screening knockout a livello epigenomico basati su CRISPR-Cas9 su cellule chemoresistenti

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per generare cellule chemoresistenti utilizzando un approccio di aumento della dose, seguito da uno screening basato su CRISPR/Cas9 utilizzando una libreria sgRNA focalizzata che mira ai modificatori epigenetici per identificare i regolatori della chemioresistenza acquisita. Il protocollo fornisce inoltre molteplici punti di ottimizzazione adattati a modelli cellulari chemoresistenti, offrendo un quadro solido per i ricercatori che studiano i meccanismi di resistenza.

Abstract

La resistenza alla chemioterapia rimane una sfida importante nel trattamento del cancro, guidata dalla capacità delle cellule tumorali di acquisire proprietà adattive, riconfigurare le vie di segnalazione e modificare la struttura della cromatina per evitare la citotossicità indotta dai farmaci. Poiché questi processi dipendono fortemente da meccanismi epigenetici che regolano l'organizzazione della cromatina e la plasticità trascrizionale, i regolatori epigenetici sono emersi come contributori chiave alla resistenza alla chemioterapia. Per indagare la resistenza al paclitaxel, uno degli agenti chemioterapici più utilizzati nel cancro al seno triplo negativo (TNBC), abbiamo utilizzato una libreria knockout focalizzata sull'epigenoma (EPIKOL), una libreria basata su CRISPR-Cas9, progettata per disturbare sistematicamente i geni coinvolti nella regolazione della cromatina. Le linee cellulari chemoresistenti sono state generate tramite un protocollo di aumento graduale della dose che riassume l'adattamento farmacologico clinicamente rilevante. Tuttavia, queste cellule resistenti mostrano un fenotipo multi-resistente ai farmaci (MDR), che pone sfide significative per una trasduzione virale efficiente e per la selezione di popolazioni cellulari stabili. In questo studio, descriviamo i principali passaggi metodologici per ottenere una trasduzione e selezione lentivirale ad alta efficienza, permettendo l'applicazione efficace di screening EPIKOL CRISPR in modelli TNBC chemoresistenti. Seguendo il protocollo descritto, è stato condotto uno screening CRISPR a livello epigenomico su cellule TNBC chemoresistenti e sono stati identificati nuovi regolatori epigenetici della chemioresistenza. Questo protocollo fornisce un quadro solido per identificare i regolatori epigenetici che contribuiscono alla resistenza acquisita ai paclitassoli utilizzando un approccio di perdita di funzione basato su CRISPR.

Introduzione

Il cancro al seno triplo negativo (TNBC) è un sottotipo di cancro al seno che rappresenta il 12–17% di tutti i tumori al^seno. È caratterizzata da una compromessa espressione del recettore degli estrogeni (ER), del recettore del progesterone (PR) e del recettore del fattore di crescita epidermico umano-2 (HER2), il che limita gravemente la disponibilità di opzioni terapeutiche mirate e lascia la chemioterapia convenzionale come modalità di trattamento^{principale 2}. Taxani e antracicline sono comunemente utilizzati nel trattamento TNBC; tuttavia, i pazienti di solito sviluppano resistenza ^2,3. L'acquisizione della chemioresistenza è un processo complesso e multidimensionale che include adattamenti genetici, metabolici, trascrizionali ed^{epigenetici 2,4}. Le alterazioni epigenetiche sono emerse come regolatori centrali della plasticità cellulare, facilitando la riprogrammazione trascrizionale dinamica che consente alle cellule tumorali di tollerare la tossicità indotta dalla^{chemioterapia 5}.

Il taxol (paclitaxel) è un membro della classe dei taxani, che causa la morte cellulare compromettendo la dinamica dei microtubuli e funziona come agente^{antimitotico 6}. Anche se i pazienti TNBC inizialmente rispondono ai regimi chemioterapici che includono Taxol, la resistenza di solito si sviluppa nel^{tempo 2}. La resistenza acquisita al Taxol è comunemente associata alla sovraespressione di trasportatori di cassette legati ad ATP (ABC), in particolare ABCB1 (MDR1, P-glicoproteina), che mediano l'efflusso di Taxol, causando una diminuzione della tossicità intracellulare^{da farmaci 7}. Poiché un'ampia gamma di agenti chemioterapeutici è substrato di questi trasportatori ABC, la loro regolazione al rialzo limita l'uso di altri farmaci chemioterapeutici, causando un fenotipo di resistenza multifarmacologica (MDR⁾⁸. L'inibizione dei trasportatori ABC si è dimostrata in gran parte inefficace come strategia per superare la resistenza multifarmacologica in contesti clinici, principalmente a causa della loro espressione ubiqua e dei ruoli essenziali nel trasporto di una vasta gamma di substrati endogeni^{ed esogeni 9}. Sebbene il verapamil, un inibitore ABCB1 di prima generazione, abbia dimostrato un beneficio clinico limitato o nullo ed è stato associato a una tossicità significativa negli studi^{clinici 10}, rimane uno strumento sperimentale prezioso per aumentare l'efficienza della selezione nei modelli in vitro di MDR.

Il fenotipo MDR è un processo dinamico e adattativo che emerge principalmente durante condizioni di stress². L'espressione del trasportatore ABC è prevalentemente controllata dai meccanismi regolatori trascrizionali ed epigenetici, piuttosto che da eventi^{mutazionali 5,11}. La limitazione di mirare direttamente ai trasportatori ABC evidenzia la necessità di identificare i regolatori a monte di queste proteine come vulnerabilità specifica delle cellule resistenti. Pertanto, l'interrogazione sistematica dei fattori epigenetici è diventata una strategia importante per identificare nuovi regolatori della resistenza alla chemioterapia e sviluppare terapie combinate che mirino a queste vulnerabilità.

Gli screening funzionali knockout basati su CRISPR-Cas9 permettono perturbazioni genomiche non imparziali e sistematiche per studiare gli effetti della perdita genica nel cancro alla scala^{genomica 12}. Tuttavia, le librerie CRISPR a livello genomico offrono una rappresentazione limitata dell'RNA guida singola (sgRNA) per gene, riducendo la sensibilità rispetto alle librerie^{focalizzate 13}. È importante sottolineare che uno screening robusto dipende non solo dalla qualità delle perturbazioni, ma anche da un modello appropriato e da un protocollo sperimentale ottimizzato. In questo contesto, studiare un processo dinamico e complesso come la resistenza ai farmaci potrebbe beneficiare di una libreria focalizzata con un protocollo¹³ personalizzato. In un lavoro precedente, abbiamo generato una libreria knockout CRISPR-Cas9 focalizzata sull'epigenoma per colpire i regolatori della^{cromatina 14}. Rispetto ad altre librerie CRISPR focalizzate sull'epigenoma disponibili pubblicamente, la libreria epigenetica knockout (EPIKOL) contiene 779 geni, costituiti da lettori di cromatina, scrittori, gomma e proteine associate, ciascuno mirato con 10 sgRNA, consentendo così di aumentare la profondità per gene e migliorare la robustezza e la riproducibilità degli screening funzionali focalizzati sulla^{cromatina 14}. EPIKOL è disponibile sia nel sistema LentiGuide, in cui Cas9 viene espresso da un vettore diverso, sia nel sistema LentiCRISPR, che include Cas9, offrendo flessibilità a seconda della linea cellulare. Raggiungere una copertura sufficiente delle librerie, definita come il numero medio di cellule per sgRNA (ad esempio, 500×–1000×), è più facile per EPIKOL rispetto alle librerie genomiche, offrendo un vantaggio nello studio delle linee cellulari chemoresistenti a crescita lenta.

Sebbene lo screening CRISPR offra un approccio potente per esaminare i meccanismi di chemioresistenza, i flussi di lavoro standard di screening aggregati non sono ottimizzati per cellule chemoresistenti con efflusso attivo di farmaci. La puromicina, un antibiotico di selezione comunemente usato nei sistemi CRISPR lentivirali, può essere pompata fuori dalle cellule resistenti tramite trasportatori ABC, principalmente ABCB1, impedendo la selezione efficace delle cellule^{trasdotte 15,16}. Questa limitazione può portare a popolazioni cellulari eterogenee, aumentando il rumore di fondo e, in ultima analisi, compromettendo la qualità dei dati. Per affrontare questa sfida, abbiamo ottimizzato la fase di selezione della puromicina inibendo temporaneamente l'efflusso di farmaci mediato da ABC con verapamilo, consentendo così un arricchimento efficiente delle cellule infette da sgRNA. Utilizzando questa strategia, abbiamo identificato il Bromodominio e il Dito Contenente PHD 1 (BRPF1) come regolatore dell'espressione di ABCB1 e della resistenza al Taxol in TNBC¹⁷. L'inibizione di BRPF1, sia geneticamente che farmacologicamente, ha ripristinato la sensibilità al Taxol nelle cellule resistenti, dimostrando l'utilità di questo protocollo ottimizzato nell'identificare bersagli aggredibili nella^{chemioresistenza 17}.

Qui, illustriamo i passaggi chiave dello screening CRISPR a selezione negativa su modelli chemoresistenti, concentrandoci in particolare sulle sfide tecniche spesso trascurate nella maggior parte dei protocolli di screening per chemioresistenza o CRISPR. Il protocollo dimostra innanzitutto un metodo di aumento graduale della dose per la generazione di cellule chemoresistenti e poi ottimizza la somministrazione virale e le condizioni di selezione per superare l'efflusso di farmaci mediato dal trasportatore ABC. Insieme, queste ottimizzazioni garantiscono un arricchimento efficiente delle cellule sgRNA-positive durante gli screening CRISPR, eliminando efficacemente le cellule non trasdotte, fornendo così una strategia robusta ed efficiente per la trasduzione e la selezione nelle cellule TNBC chemoresistenti. Infine, il protocollo evidenzia i fondamenti per identificare i risultati di screening CRISPR tramite sequenziamento di nuova generazione e analisi bioinformatica.  Insieme, questo protocollo consente un'implementazione efficace della piattaforma di screening EPIKOL per identificare potenziali target terapeutici per superare la resistenza 17,18,19.

Protocollo

Tutti i reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono forniti nella Tabella dei Materiali.

1. Generazione di linee cellulari triplice negative al cancro al seno resistenti al Taxol

1. Per determinare la sensibilità delle cellule al farmaco, si aggiusta la densità cellulare delle SUM159PT cellule aderenti a 2 × 10^{cellule 3} per pozzo in piastre nere inferiori a 96 pozzi con la miscela nutritiva F12 di Ham integrata con siero bovino fetale al 5% (FBS), 1% Penicillina-Streptomicina, 5 μg/mL di insulina, 10 mM HEPES e 1 μL/mL idrocortisone e incubare le cellule per 16 ore in un incubatore di colture cellulari a 37 °C con 5% di CO₂.
2. Prepara il stock di Taxol disciolto nel dimetilsolfosido (DMSO). Per trattare le cellule, prepara diluizioni seriali di Taxol in mezzi di coltura, che variano da 0,3 nM a 10 μM (ad esempio, 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1μM, 10 μM), e utilizzare il DMSO da solo come controllo del veicolo.
3. Trattare le cellule con 200 μL di dosi crescenti di Taxol (preparate nel passo 1.2) come triplicati e lasciare la piastra in incubatore di colture cellulari per 72 ore a 37 °C con il 5% di CO_2.
4. Dopo 72 ore di trattamento farmacologico, si misura la vitalità cellulare con un saggio di quantificazione della valla basato su adenosina trifosfato (ATP). Usa un lettore di microplacche per misurare la luminescenza e normalizzare i valori ai controlli DMSO. Calcola i valori della concentrazione inibitoria del 10% (IC10) e IC50 tramite regressione non lineare utilizzando un modello logistico dose-risposta a quattro parametri in un software statistico appropriato.
5. Per iniziare a generare cellule chemoresistenti, semina 2 × 10 cellule^{da 5} SUM159PT per pozzo in piastre a 6 pozzi. Incubare durante la notte a 37 °C con il 5% di_CO2.
6. Il giorno successivo, si tratti le cellule con valori di Taxol IC10 o IC50 in 2 mL di substrato colturale per 72 ore come concentrazioni iniziali.
7. Se le cellule tollerano la concentrazione attuale del farmaco, dividerle in due pozzi. Mantenere un pozzo come controllo di riserva in un mezzo fresco e sostituire il mezzo nel secondo pozzo con un mezzo che contiene il doppio della concentrazione di Taxol precedente.
   NOTA: Se le cellule necessitano di recupero a causa di cambiamenti morfologici indotti dallo stress come proiezioni cellulari anomale, ampio arrotondamento e distacco, o marcata riduzione della proliferazione, mantenerle in un mezzo privo di farmaci e attendere che le cellule diventino sane e confluenti. Poi ripeti i passaggi a partire dal passo 1.7.
8. Durante la generazione di cellule resistenti, si passa cellule genitoriali con un mezzo contenente DMSO come controllo. Regolare il volume del DMSO per corrispondere alla quantità di DMSO presente nel corrispondente trattamento con il Taxol.
9. Misurare la vitalità cellulare come nei passaggi 1.2–1.4 ogni 3–4 settimane e proseguire questa procedura fino a ottenere una differenza significativa (p < 0,05 o 10–50 volte a seconda del farmaco applicato) tra i valori IC50 delle linee cellulari parentali e resistenti. La procedura di incrementazione della dose richiede tipicamente 6–9 mesi, a seconda del farmaco utilizzato.
10. Dopo aver ottenuto cellule resistenti stabili, mantenerle nella dose di mantenimento (ultima dose applicata) del farmaco durante la coltura per preservare il fenotipo resistente.
    NOTA: La generazione di cellule chemoresistenti con il metodo di aumento della dose è un processo che richiede molto tempo, e la durata dipende da diversi fattori, tra cui la linea cellulare, il tasso di crescita intrinseco e lo specifico agente chemioterapico utilizzato. Generalmente ci vogliono 6–9 mesi, a seconda del livello di resistenza clinicamente rilevante. Un approccio alternativo per determinare differenze significative nei livelli di resistenza è valutare la concentrazione minima di farmaco a cui sopravvivono le cellule resistenti, mentre le cellule genitoriali no.
11. Caratterizzazione delle cellule resistenti: eseguire sequenziamento dell'RNA, western blotting, reazione a catena quantitativa della polimerasi (qPCR) e saggio di vitalità cellulare con trattamenti farmacologici (ad esempio, test di formazione di colonie) per caratterizzare il fenotipo cellulare resistente. Assicurati di rivalutare il fenotipo resistente dopo diversi passaggi per dimostrare che il fenotipo elevato di IC50 è stabile nel tempo.

2. Produzione di lentivirus

1. Giorno 0: Seme HEK293T cellule come 4 × 10⁶ per 100 mm di coltura tissutale con il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con 10% FBS e 1% Penicillina-Streptomicina, per raggiungere il 90% di confluenza il giorno successivo.
2. Giorno 1: Prepara miscele di polietilenimina (PEI) e DNA in DMEM senza siero (-/-) separatamente per ciascun virus. Usa la Tabella 1 e la Tabella 2 per regolare il volume e le concentrazioni di PEI e DNA in base alla resa virale desiderata.
   NOTA: Il PEI viene utilizzato quattro volte il totale di μg di DNA (ad esempio, in una lastra da 100 mm, si usano 30 μL di PEI per un totale di 7,5 μg di DNA). La produzione di virus in parabole da 100 mm è seguita in questo protocollo e il virus ottenuto da 5–10 parabole da 100 mm permetterà di effettuare più schermi. Per esperimenti di validazione o infezioni su piccola scala, un singolo pozzo di una piastra a 6 pozzi o una piastra da 60 mm è sufficiente. Poiché il cloruro lineare di polietilenimina è un agente tossico di trasfezione, assicurati che la confluenza cellulare sia al 90% al momento della trasfezione.
   1. Dopo aver miscelato accuratamente, aggiungi la miscela di DNA al tubo PEI. Mescola bene e lascia riposare i complessi PEI-DNA per 30 minuti a temperatura ambiente.
   2. Poi aggiungi i 600 μL del complesso PEI-DNA agli HEK293T, goccia a goccia. Inserire le piastre nell'incubatore virale per 16 ore a 37 °C con il 5% di_CO2.
3. Giorno 2: Sostituire il substrato delle cellule infette aspirando il PEI e il mezzo contenente virus e aggiungendo 8 mL di DMEM completo per ogni piatto di coltura tissutale da 100 mm. Incubare le cellule per permettere la produzione virale.
4. Giorno 3: Effettuare la prima raccolta di virus rimuovendo delicatamente gli 8 mL di surnatante in un tubo centrifuga di dimensioni appropriate e conservandoli a 4 °C. Se ci sono più piastre per la produzione virale, combina i soprannatanti. Poi aggiungi 8 mL di DMEM fresco e completo a ogni piatto e riporta i piatti nell'incubatore di virus.
5. Giorno 4: Ripeti i passaggi di raccolta e combini con i sopranattivi del Giorno 3.
   1. Prepara una soluzione di polietilenglicole (PEG)-8000 al 50% (p/v) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per ottenere una soluzione di stock 5× PEG. Autoclave per dissolvere e sterilizzare.
   2. Centrifugare i soprantanti virali raccolti a 300 x g per 5 minuti per pelletare le cellule residue, poi procedere alla filtrazione.
   3. Filtrare 16 mL di soprantantante virale usando un filtro da 0,45 μm (sia a siringa che a vuoto da 50 mL) nel tubo contenente 4 mL di soluzione PEG per ottenere una concentrazione finale di 1× PEG e rimuovere residui e cellule residue.
   4. Tappa il tubo e mescola invertendola. Ripeti questo passaggio per tutte le preparazioni virali. Conserva durante la notte a 4 °C al buio, con opzionale agitazione delicata.
   5. Il giorno successivo dovrebbero essere presenti precipiti visibili. Centrifuga i tubi a 1400 x g per 20 minuti a 4 °C.
      NOTA: I pellet virali precipitati con PEG possono essere conservati a 4 °C fino a 5 giorni prima della centrifugazione; tuttavia, il titolo virale può diminuire con l'incubazione prolungata.
   6. Dopo la centrifugazione, si scarta con cura il surnatante, lasciando un piccolo volume (circa 100 μL) nel tubo per evitare di disturbare il pellet.
   7. Centrifuga i tubi per 5 minuti a 300 x g per raccogliere quanta più liquidità possibile dai lati del tubo. Poi scarta con cura il soprantantante rimasto.
   8. Per concentrare il virus 100 volte, aggiungere PBS a 1/100 del volume iniziale del surnatant virale al pellet e risospendere il pellet tramite pipetting (ad esempio, se si parte con 16 mL di surnatant virale, aggiungere 120–140 μL di PBS al pellet per raggiungere un volume finale di 160 μL, tenendo conto del volume del pellet). Evitare la pipetazione vigorosa; Aliquot il virus.
      NOTA: Il titolo atteso dopo la concentrazione di PEG è >1 × 10⁸ particelle infettive/mL (ip/mL) per il sistema LentiGuide e >1 × 10⁷ per il sistema LentiCRISPR. Titoli inferiori di un ordine di grandezza possono comunque essere accettabili, ma dovrebbero essere verificati rispetto all'infettività della linea cellulare target e al volume virale richiesto.
   9. Se non è richiesta la concentrazione virale, si applica il virus per minimizzare i cicli di congelamento-disgelo. Conserva il virus concentrato o non concentrato a -80 °C. Candeggina e piatti per la spazzatura.
      NOTA: Per una descrizione più dettagliata della produzione e gestione dei lentivirali, i lettori sono indirizzati ai protocolli^{consolidati 20}. Per i problemi comuni incontrati durante la produzione del lentivirus, si veda la Tabella Supplementare 1.

	1 pozzo di piastra a 6 pozzi	Targhetta da 60 mm	Targhetta da 100 mm	Piastra da 150 mm
PEI (volume di scorta 1 mg/mL)	6 μL	9 μL	30 μL	60 μL
Volume DMEM (-/-)	54 μL	100 μL	270 μL	540 μL

Tabella 1: Volumi obbligatori PEI e DMEM per le diverse lastre della miscela PEI.

	1 pozzo di piastra a 6 pozzi	Targhetta da 60 mm	Targhetta da 100 mm	Piastra da 150 mm
VSV-G	75 ng	150 ng	375 ng	750 ng
Gag-Pol	675 ng	1350 ng	3375 ng	6750 ng
Vettore bersaglio	750 ng	1500 ng	3750 ng	7500 ng
DMEM (-/-) regola il volume finale a	60 μL	100 μL	300 μL	600 μL

Tabella 2: Volumi di plasmidi e DMEM necessari per le diverse lastre della miscela di DNA.

3. Stabilimento di una selezione ottimizzata della puromicina per le cellule MDR

NOTA: Nelle cellule chemoresistenti che mostrano sovraespressione di ABCB1, la selezione della puromicina fallisce a causa dell'efflusso attivo di puromicina mediato da ABCB1, impedendo la selezione efficace delle cellule infette con sgRNA. Per superare questa limitazione, il verapamilo viene co-somministrato con la puromicina per inibire temporaneamente l'efflusso mediato da ABCB1, permettendo l'accumulo intracellulare di puromicina ed eliminando efficacemente le cellule non infette.

1. Determinare la concentrazione di verapamillo che blocca l'efflusso di farmaci mediato da ABCB1 senza compromettere la vitalità cellulare. Per questo, si utilizza l'agente chemioterapico a cui si è acquisita resistenza (in questo caso, Taxol) in combinazione con dosi crescenti di verapamilo.
   1. Seme SUM159PT cellule resistenti al Taxol e cellule parentali a 96 pozzi che liberano le piastre nere inferiori a 2 × 10³ cellule per pozzo in triplice. Incubare le cellule durante la notte a 37 °C con il 5% di CO_2.
   2. Trattare le cellule con diluizioni seriali di verapamil (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 e 80 μM) mantenendo una concentrazione costante del Taxol (ad esempio, la dose di mantenimento) in tutte le condizioni.
   3. Dopo 72 ore di trattamento, si valuta la vitalità cellulare con un saggio di quantificazione basato su luminescenza per ATP. Determinare la concentrazione di verapamillo che non riduce la vitalità da sola (≥90%–95% rispetto ai controlli non trattati) ma ripristina la sensibilità nelle cellule resistenti.
2. Per trovare la concentrazione di puromicina da utilizzare in combinazione con verapamil, semi SUM159PT cellule resistenti al Taxol in una piastra da 96 pozzi a 2 × 10³cellule per pozzo. Incubare la piastra per 16 ore a 37 °C con il 5% di_CO2.
   1. Preparare diluizioni seriali di puromicina (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 e 40 μg/mL) nel mezzo contenente la concentrazione di verapamilo precedentemente determinata e trattare le cellule di conseguenza.
   2. Dopo 72 ore, si misura la vitalità cellulare con un saggio di quantificazione basato su ATP basato su luminescenza e determina la concentrazione minima di puromicina che elimina tutte le cellule (≤5% di vitalità) in presenza di verapamilo. Questa concentrazione sarà utilizzata per la selezione durante lo screening CRISPR.
      NOTA: Questi passaggi di ottimizzazione della concentrazione di farmaci dipendono dalla linea cellulare e dal contesto. Fattori come la sensibilità intrinseca al farmaco, i livelli di espressione del teletrasportatore ABC e il tasso di crescita possono influenzare le concentrazioni efficaci. Pertanto, esegui questa ottimizzazione per ogni nuova linea cellulare e modello di resistenza. (Per riferimento, 5 μg/mL di puromicina in combinazione con 20 μM verapamil viene utilizzata per le cellule resistenti al Taxol impiegate in questo^{studio 17}). Per la risoluzione della selezione puromicina + verapamilo, si rifera alla Tabella Supplementare 1.

4. Titolazione virale e calcolo della molteplicità dell'infezione (MOI)

1. Giorno -1: Semi SUM159PT cellule resistenti al Taxol come 2 × 10⁵ in ogni pozzetto di una piastra da 6 pozzi con la miscela completa di nutrienti Ham's F12.
2. Giorno 0: Eseguire quattro diluizioni seriali del virus nel mix nutrizionale F12 di Ham contenente solfato di Protamina (PS) a 8 μg/mL. (Per i virus concentrati, iniziare con 1 μL e diluire dieci volte in ogni diluizione come 1 > ^10-1 > ^10-2 > ^10-3. Per i virus non concentrati, si regolano i volumi di conseguenza (ad esempio, 100 μL > 10 μL > 1 μL > 0,1 μL).
   1. Somministrare 1 mL di mezzo contenente virus a ciascuno dei quattro pozzi. Lascia un pozzo come controllo della selezione della puromicina e un altro come controllo non trattato.
3. Giorno 1: Sostituire il substrato virale con 2 mL di substrato fresco 16 ore dopo l'infezione.
4. Giorno 2: Trasferire il contenuto cellulare di ciascun pozzo in una piastra di coltura cellulare da 100 mm con il mix di nutrienti F12 di Ham contenente puromicina + verapamil alle concentrazioni determinate nel passo 3.2. Se le celle non selezionate sono sovraconfluenti, si semina una frazione definita (ad esempio, 1/2), e questo verrà preso in considerazione durante i calcoli finali.
   NOTA: Rifornire il substrato con puromicina fresca + verapamilo, se necessario, nei successivi 3-4 giorni finché tutte le cellule nella piastra di controllo non saranno morte.
5. Giorno 4–5: Quando le cellule nella piastra di controllo sono morte, determina le piastre che hanno abbastanza cellule per il conteggio. Tripsinizzare le cellule, contare e determinare il numero totale di cellule.
6. Dopo aver contato le cellule vitali, calcola l'efficienza di trasduzione e la molteplicità dell'infezione (MOI) come segue (usa la Tabella Supplementare 2 come modello):
   1. Calcola la velocità di trasduzione (frazione di cellule infette) usando la formula qui sotto
      
      
      _{N selezionate}: Numero totale di cellule dopo la selezione della puromicina nei pozzi infetti
      _{N Controllo}: Numero totale di celle nel pozzo di controllo non trasduto e non selezionato
      p: Tasso di trasduzione (frazione di cellule infette).
      NOTA: Se solo una frazione delle cellule di controllo non trattate è stata seminata, tenete conto di questo nel calcolo di N_Control
   2. Calcola il MOI. Durante la trasduzione lentivirale, gli eventi di infezione seguono una distribuzione di Poisson. Pertanto, la frazione di cellule infettate da almeno un virus è definita come:
      p =1- e ^-MOI
      Quindi, calcola MOI come:
      MOI = - ln(1-p)
   3. Calcola il titolo lentivirale (particella infettiva/millilitro, IP/mL) in base al numero di cellule infette:
      Titolo (IP/mL) = (MOI x_{N iniziativa})/ Volume del virus
      _{N iniziale}: numero di cellule seminate per infezione
      Volume del virus: volume di virus aggiunto per pozzo (in mL)
      NOTA: Calcola separatamente il titolo lentivirale per ogni infezione e determina il titolo finale prendendo la media dei pozzi che mostra la quantità proporzionale del virus e i valori del titolo. I pozzi che mostrano saturazione o deviazione dalla scala proporzionale dovrebbero essere esclusi dai calcoli del titolo.

5. Generazione e/o validazione di una linea cellulare stabile che esprime Cas9

NOTA: Questo passaggio è necessario quando si utilizza LentiGuide_EPIKOL. Se è già disponibile una linea Cas9-stabile validata, o se viene utilizzata LentiCRISPR_v2_EPIKOL, procedere direttamente alla Sezione 6.

1. Produrre lentivirus Cas9 utilizzando il vettore LentiCas9_blast come descritto nella sezione 2.
2. Infettare le cellule il giorno successivo, puntando a un MOI di 10. Calcola la quantità del virus secondo il MOI previsto nella sezione 4, utilizza la quantità calcolata di volume virale e la somministra direttamente alle cellule nella piastra che contiene il mezzo di coltura contenente 8 μg/mL di solfato di Protamina (PS).
3. Sostituire il mezzo virale con mezzo fresco 16 ore dopo l'infezione
4. Il giorno successivo, applicare la selezione della blasticidina somministrando alle cellule il mezzo di coltura contenente la concentrazione precedentemente determinata di blasticidina (concentrazione finale determinata per linea cellulare con un test di vitalità cellulare come descritto nella sezione 3) fino all'eliminazione delle cellule non infette (tipicamente 6–7 giorni).
   NOTA: Se le cellule che esprimono Cas9 vengono coltivate per lunghi periodi prima dello screening, si ripete la selezione della blasticidina per eliminare le cellule Cas9-negative.
5. Validazione Cas9 (raccomandata): Convalidare l'attività Cas9 utilizzando sgRNA di controllo che prendono di mira geni essenziali (sequenze di sgRNA sono disponibili nella libreria EPIKOL; vedi Tabella Supplementare 3) o sistemi reporter come la proteina fluorescente verde (GFP) per valutare l'efficienza del knockout e la cinetica. Metodi di validazione dettagliati si trovano in uno studio precedente¹⁹.

6. Eliminazione epigenomica CRISPR, intoccazione della biblioteca lentivirale e screening

NOTA: Per garantire una mappatura accurata genotipo-fenotipo, gli screening CRISPR aggregati richiedono infezioni a basso MOI e una copertura di libreria sufficiente (tipicamente 500×–1000), a seconda della stringenza sperimentale e del comportamento delle linee cellulari. Per i principi generali dei flussi di lavoro di screening CRISPR a livello genomico aggregato, inclusa la progettazione delle librerie e la configurazione sperimentale, vedi i protocolli^{precedentemente pubblicati 21,22}. Per EPIKOL, mantenere una copertura >500x è fortemente raccomandato durante lo screening, poiché scendere sotto questa soglia aumenta il rischio di caduta stocastica dello sgRNA, specialmente nel ramo di trattamento farmacologico dello screen. I seguenti calcoli sono necessari per determinare il numero di cellule iniziali, l'efficienza della trasduzione e il volume virale necessari affinché la trasduzione EPIKOL possa eseguire infezioni a basso MOI senza compromettere la complessità della libreria.

1. Giorno -1: Seminare un numero totale di cellule calcolato qui sotto in piastre di coltura cellulare da 100 mm o 150 mm con un numero appropriato di cellule per placca.
   1. Calcola il numero di cellule infette con successo per raggiungere la copertura desiderata della biblioteca (usa la Tabella Supplementare 2 come modello):
      N_infetti = (numero di sgRNA) × (copertura del bersaglio)
   2. Calcola il numero di cellule iniziali per ogni replica per compensare la frazione di cellule non infette in caso di infezione a basso MOI (0,3–0,4):
      _{N iniziale} = N_contagiati/p
      dove p è la velocità di trasduzione (frazione di cellule infette) determinata in base alla distribuzione di Poisson (vedi passo 4.6).
      NOTA: Questa regolazione garantisce che un numero sufficiente di singole cellule infette da sgRNA sia presente nel pool in caso di infezione a basso MOI per raggiungere la copertura desiderata della libreria.
2. Giorno 0 - Trasduzione
   1. Calcola il volume virale richiesto per ogni replica
      Volume virale richiesto = (N_iniziale × MOI) / (Titolo virale (ip/mL precedentemente determinato))
      NOTA: L'efficienza di trasduzione nell'intervallo MOI target di 0,3–0,4 corrisponde approssimativamente a
      26%–33% di cellule resistenti alla puromicina prima della selezione.
   2. Infettare le cellule con il volume virale calcolato nell'intero mezzo di coltura contenente 8 μg/mL di solfato di Protamina (PS). Ridurre il volume del substrato per aumentare il contatto virus-cellula durante l'infezione (ad esempio, 8 mL invece di 10 mL per una piastra da 100 mm)
   3. Prepara miscele di infezione indipendenti per ogni replica biologica.
      NOTA: Sono raccomandate almeno due repliche biologiche; Tre sono preferibili. Le repliche biologiche devono essere trasdotte, selezionate e mantenute separatamente (inclusi cambiamenti di mezzo e passaggio) e non devono essere aggregate in nessuna fase prima del sequenziamento.
3. Giorno 1 - Sostituire il substrato virale con substrato fresco dopo 16 ore e incubare a 37 °C con il 5% di CO₂
4. Giorno 2 - Selezione delle cellule trasdotte: Applicare la selezione della puromicina in presenza di verapamil (concentrazioni determinate nel passo 3.2) per arricchire le cellule infette da sgRNA in cellule resistenti al Taxol SUM159PT. Continuare la selezione finché tutte le cellule nella piastra di controllo non infetta non saranno eliminate (tipicamente ~3 giorni).
5. Giorno 5 - Campionamento di riferimento T₀ : Dopo il completamento della selezione puromicina + verapamilo, tripsinizzare le cellule e raccogliere un pellet cellulare iniziale a tempo zero (T₀) da ciascun replica biologica corrispondente al livello di copertura deciso durante la trasduzione. Poiché servirà come riferimento per la distribuzione iniziale della libreria, raccogli i pellet cellulari non appena la selezione è completata, prima che si verifichi una perdita cellulare. Semina un numero sufficiente di cellulari per mantenere la copertura in ogni momento.
   NOTA: Dopo la selezione puromicina + verapamilo, il numero di cellule trasdotte sopravvissute varierà in base al tempo di raddoppio della linea cellulare e all'efficienza di trasduzione raggiunta. La popolazione sopravvissuta tipicamente si riprende alla densità iniziale di semina al completamento della selezione e può superarla nelle linee cellulari a crescita più rapida. Se il numero di cellule sopravvissute lo permette, raccogliere più pellet T₀ e congelare i campioni di riserva a -80 °C. Inoltre, le cellule infette da EPIKOL possono essere criopreservate in azoto liquido mantenendo la copertura. Queste scorte di riserva possono essere scongelate in caso di guasti imprevisti o per futuri approcci sperimentali alternativi (ad esempio, test di ulteriori trattamenti farmacologici). Controlla l'efficienza di trasduzione utilizzando una piastra di controllo non infetta per confermare che l'efficienza di trasduzione prevista sia stata raggiunta (vedi sezione 4). Se l'efficienza di trasduzione osservata è superiore alle aspettative, si riavvia l'esperimento per assicurarsi che la trasduzione venga eseguita a bassi MOI, prevenendo l'integrazione di più sgRNA per cellula.
6. Esecuzione dello screening: Dopo aver permesso il completamento dell'editing genomico mediato da Cas9, per la durata stabilita alla sezione 5, dividere le cellule in gruppi di trattamento.
   NOTA: Questo richiede tipicamente 7–9 giorni dopo la trasduzione, poiché l'efficienza massima del knockout viene raggiunta approssimativamente nel giorno^7-23 post-trasduzione. Per i bersagli epigenetici, una finestra di 9 giorni consente anche cambiamenti a livello di cromatina prima dell'inizio della selezione del farmaco.
   1. Dividere le cellule in bracci sperimentali preservando la copertura: uno è il braccio di controllo che è una condizione di base che riceve DMSO, e l'altro è il braccio di trattamento che riceve il Taxol.
   2. Mantenere le culture per 14–16 raddoppi della popolazione. Il livello di raddoppiamento della popolazione (PDL) è calcolato come:
      PDL = PDL_s + 3,322 (Log C_f – log_{C i})
      PDL_s = livello iniziale di raddoppio della popolazione
      C_i = numero di cella iniziale seeded
      C_f = numero totale di celle alla fine di un periodo di crescita
   3. Ad ogni passaggio, monitorare la vitalità e la cinetica della crescita ed evitare colli di bottiglia mantenendo un numero cellulare adeguato. Regolare l'intensità del trattamento se si verifica una morte cellulare eccessiva.
      NOTA: Cerca di raccogliere pellet di cella di riserva ad ogni passaggio, settimanalmente o in determinati PDL durante lo schermo. Questi campioni di riserva possono servire come punti temporali alternativi per il sequenziamento o come campioni di ottimizzazione per il processo di estrazione genomica del DNA. Criopreservare le cellule periodicamente per evitare perdite cellulari inaspettate.
7. Campionamento_finale T: Al raggiungimento del PDL desiderato, raccogliere pellet finali a punti temporali (T_final) per ogni replica e condizione mantenendo la copertura della libreria per ogni pellet. Conservare i pellet a -80 °C fino all'estrazione del gDNA a valle.
   NOTA: Cerca di terminare lo screening a PDL comparabili tra le braccia, anche se la durata della coltura varia tra le condizioni.

7. Estrazione del DNA genomico

1. Estrarre il DNA genomico (gDNA) utilizzando un metodo validato (ad esempio, MN NucleoSpin Tissue Kit), con piccoli aggiustamenti del protocollo per migliorare l'efficienza della lisi da grandi pellet cellulari aggregati.
   1. Segui il protocollo tissutale piuttosto che quello cellulare a causa della grande dimensione del pellet. Considera di aumentare i volumi dei reagenti e di utilizzare più colonne di spin per pellet di cella (non superare 5 × 10^{6 celle per} colonna) se necessario per garantire una lisi efficiente.
      NOTA: Prima della lisi, risospendere il pellet con una quantità minima di PBS (~50 μL) può migliorare l'efficienza della lisi. Una lisi incompleta del pellet può ostruire la spin column, causando una riduzione della resa di DNA.
   2. Segui le raccomandazioni per eluzioni ad alta resa e alta concentrazione. Elute gDNA in un volume ridotto di elution buffer (circa 2/3 del volume raccomandato) per colonna, soprattutto se i pellet cellulari sono divisi in più colonne.
2. Misura la qualità e la quantità del gDNA (ad esempio, Nanodrop).

8. Preparazione della libreria di sequenziamento EPIKOL dal DNA genomico

1. Utilizzare un cabinet PCR dedicato per eseguire tutti i passaggi della libreria al fine di prevenire la contaminazione da plasmidi durante le PCR di gDNA, poiché i modelli plasmidicali si amplificano più efficacemente del DNA genomico e possono distorcere la distribuzione dello sgRNA.
   1. Pulisci lo spazio di lavoro, le micropipette e i rack con candeggina al 10% e etanolo al 70%.
   2. Aliquota tutti i reagenti (soprattutto i primer) in volumi monouso prima dell'uso per ridurre il rischio di contaminazione incrociata e cicli di congelamento-disgelo.
   3. Conserva i reagenti a -20 °C e tienili sul ghiaccio durante l'installazione della PCR.
2. Ottimizzare il volume iniziale di input del gDNA puntando a una copertura per sgRNA tra il 200× e il 500× per mantenere la complessità appropriata della libreria. Esempio: per la libreria EPIKOL, i gDNA sono preferibilmente estratti da pellet cellulari raccolti con una copertura del 1000×, e una copertura finale del 250× viene utilizzata per l'amplificazione del gDNA.
   1. Calcola l'input gDNA necessario per la copertura desiderata come segue.
      Quantità di gDNA = (Numero di sgRNA) × copertura × (66 pag DNA/nucleo)
      Esempio: 8000 gRNA × (copertura 250×) × (6,6 pg DNA/nucleo) = 13,2 μg gDNA/campione da amplificare.
   2. Eseguire una prova PCR utilizzando condizioni di reazione PCR esterne e interne nelle Tabelle 3, Tabella 4, Tabella 5 e Tabella 6 con quantità crescenti di gDNA per reazione (ad esempio, 1 μg, 3 μg, 6 μg) per determinare la quantità ottimale di gDNA per provetta.
      NOTA: Un input insufficiente di gDNA o un eccessivo ciclo PCR possono introdurre bias di amplificazione e distorcere la copertura dello sgRNA.
   3. Esegui un gel di agarosio al 2% per analizzare i prodotti PCR interni. Assicurarsi che venga osservata una banda luminosa a circa 350 bp.
   4. Basandosi sulla quantità ottimale di gDNA per provetta, si determina il numero totale di reazioni PCR richieste per campione per ottenere la copertura desiderata della libreria, evitando quantità eccessive di gDNA per singola reazione.
      NOTA: Se sono necessari 13,2 μg di gDNA totale e 3,3 μg di gDNA per reazione producono un'amplificazione ottimale, preparare quattro reazioni PCR parallele con 3,3 μg di gDNA in un volume di reazione di 100 μL. In questo contesto, il volume di gDNA non dovrebbe superare il 10% del volume della reazione per evitare l'inibizione PCR dovuta a un eccessivo input di schemi.
3. Amplificare cassette sgRNA dal template gDNA (PCR primo/esterno)
   1. Amplificare le regioni genomiche contenenti la cassetta sgRNA lentivirale integrata in modo stabile utilizzando i primer elencati nella Tabella Supplementare 2. Esegui reazioni PCR con la quantità di gDNA determinata nel passo 8.2 (vedi Tabella 3) utilizzando le condizioni di reazione PCR nella Tabella 4. Prepara un tubo di controllo PCR senza DNA modello per verificare eventuali contaminazioni e tieni i tubetti sempre sul ghiaccio.
   2. Aggiungi infine DNA Polimerasi, mescola bene picchiando o pipettando, e fai girare brevemente i tubi PCR prima di inserirli nel termociclatore. Esegui l'avvio a caldo per evitare un'amplificazione non specifica.
   3. Al completamento della PCR esterna, concentrarsi tutte le reazioni PCR in un unico tubo microcentrifuga. Non è richiesta la pulizia con PCR o la visualizzazione del gel dopo una PCR esterna. Usa direttamente il prodotto PCR in pool come modello nella seconda PCR (interna). Conserva i prodotti PCR a -20 °C.

Reagente	Volume per reazione
dNTP (10 mM ciascuno)	2 μL
Polimerasi fusionica	1 μL
Buffer GC 6'	20 μL
Innesco anteriore (10 μM)	5 μL
Primer inverso (10 μM)	5 μL
gDNA	X μL
Acqua priva di nucleasi	fino a 100 μL (67–X μL)
Totale	100 μL

Tabella 3: Reagenti necessari per la prima PCR/esterna.

Numero del ciclo	Denatura	Ricottura	Estensione
1	95 °C, 3 min
2–19	95 °C, 25 s	65 °C, 20 s	72 °C 15 s
20			72 °C 3 min

Tabella 4: Condizioni PCR per la prima PCR/esterna.

4. Eseguire codici a barre indice (secondo/PCR interno) ed estrazione gel
   1. Durante la seconda PCR (interna), viene utilizzato un primer indice inverso per codificare i campioni con codice a barre; Pertanto, utilizzare primer indice diversi per ogni campione.
      NOTA: Per le librerie generate con la backbone pLentiCrispr v2 , utilizzare primer a indice inverso che terminano con basi CT, etichettate come lenticrisprv2_rev(indice X) (vedi Tabella Supplementare 2).
   2. Per le librerie generate con la backbone pLentiGuide , usa indici che terminano con basi GT e sono etichettati come rev_index_X nella Tabella Supplementare 2.
   3. Prepara una miscela di primer a schemi anteriori combinando 2 μL da ciascuno dei nove innesco sfalsati (stock 100 μM) e aggiungendo 162 μL di acqua priva di nucleasi in un tubo microcentrifuga sterile. La concentrazione finale della miscela di primer sarà di 10 μM.
   4. Utilizzare il prodotto PCR esterno aggregato come input ed eseguire due reazioni PCR interne parallele da 100 μL per campione utilizzando le istruzioni della Tabella 5 e della Tabella 6. Prepara una reazione di controllo PCR utilizzando il controllo 'No template DNA' da PCR esterno (passo 7.3) come input per monitorare una potenziale contaminazione.
   5. Infine aggiungi DNA Polimerasi, mescola bene con il picchiato o la pipetta, poi fai girare brevemente i tubi PCR prima di inserirli nel termociclatore. Esegui l'avviamento a caldo per evitare amplificazioni aspecifiche.
   6. Combinare ed eseguire reazioni PCR interne in gel di agarosio al 2% per separare l'amplicon bersaglio.
      NOTA: Non dovrebbero essere rilevate bande nei controlli PCR senza schemio. Va osservata una banda distinta intorno a 337 pb per LentiCrispr_V2 e 357 pb per le librerie LentiGuide. Può essere presente anche una banda superiore non specifica di circa 500 pb e dovrebbe essere esclusa dal processo a valle.
   7. Carica 12 μL (10 μL di prodotto PCR + 2 μL di colorante di carico) di prodotto PCR interno per visualizzare le bande, carica il resto del prodotto PCR in pozzi fusi o adiacenti designati per l'estrazione del gel. Minimizza lo spessore dell'agarosio per massimizzare il recupero del DNA. Evita di sovraesporre le corsie di estrazione del gel mentre visualizzi per minimizzare i danni al DNA indotti dai raggi UV durante l'escissione del gel.
   8. Purifica i prodotti PCR dal gel di agarosio utilizzando un kit di estrazione del gel specifico (ad esempio, NucleoSpin Gel e PCR Clean-up) seguendo le istruzioni del produttore. Misura la concentrazione di DNA usando uno spettrofotometro. Conserva i prodotti PCR a -20 °C.
      NOTA: È richiesta una concentrazione minima di >20 ng/μL dopo l'estrazione del gel per un corretto sequenziamento. Se la resa richiesta non è stata raggiunta nemmeno con tre reazioni interne PCR parallele, si isola nuovo gDNA e si ripete il processo.

Reagente	Volume per reazione
dNTP (10 mM ciascuno)	2 μL
Polimerasi fusionica	1 μL
Buffer GC 6'	20 μL
Primer per miscela a stagger anteriore (10 μM)	5 μL
Primer dell'indice inverso (10 μM)	5 μL
PCR esterna	5 μL
Acqua priva di nucleasi	62 μL
Totale	100 μL

Tabella 5: Reagenti necessari per la seconda PCR/interna.

Numero del ciclo	Denatura	Ricottura	Estensione
1	95 °C, 3 min
2–25	95 °C, 25 s	65 °C, 20 s	72 °C 15 s
26			72 °C 3 min

Tabella 6: Condizioni PCR per la seconda/PCR interna.

9. Sequenziamento

1. Determina il numero richiesto di letture mappate in base alla copertura della biblioteca definita all'inizio dello schermo. Assumendo un'efficienza di mappatura del 60%–70%, richiedi un numero maggiore di letture totali per compensare la perdita di lettura. Per una copertura del 1000× della libreria EPIKOL, sono necessarie ~8 milioni di letture mappate, corrispondenti a 10–12 milioni di letture totali.
2. Eseguire il controllo qualità delle librerie di sequenziamento utilizzando Tapestation o Bioanalyzer prima del sequenziamento per confermare la dimensione e l'integrità della libreria.
3. Raccogliere librerie di sequenziamento da campioni diversi prima del sequenziamento, poiché sono univocamente codificate con primer indice.
4. Conferma i requisiti di struttura di lettura (orientamento R1/R2) e demultiplexing con la funzione di sequenziamento. Il sequenziamento a coppie 2× 150 bp è suggerito in Illumina HiSeq, Novaseq o in una piattaforma di sequenziamento equivalente compatibile con Illumina. Considera di richiedere almeno il 5% di spike-in PhiX per migliorare la diversità del sequenziamento.

10. Panoramica dell'analisi del sequenziamento per EPIKOL

1. Usa la pipeline di analisi MAGeCK per analizzare i file FASTQ a doppio^{livello 24}. Organizza ogni replica biologica come un singolo file di input.
2. Utilizzare il file di input sgRNA di EPIKOL compatibile con MAGeCK come libreria di riferimento (fornita nella Tabella Supplementare 4) e applicare la funzione di conteggio per quantificare le letture degli sgRNA dai singoli file FASTQ per creare file grezzi per ogni replica e condizione.
   1. Normalizzare ogni file di conteggio utilizzando la normalizzazione Reads per million (RPM) per verificare la qualità e la distribuzione di ogni campione visualizzando i grafici di conteggio degli sgRNA^{normalizzati 14}.
3. Esegui una seconda funzione -count per unire i conteggi in un singolo file usando la normalizzazione della mediana con le impostazioni predefinite.
4. Esegui la funzione -test per identificare i cambiamenti a livello genico utilizzando file grezzi di conteggio uniti. Per valutare le prestazioni dello screening, confrontare i campioni_finali di T con quelli di T₀ e verificare la distribuzione degli sgRNA di controllo non targeting e degli sgRNA essenziali con targeting genico.
   NOTA: È fondamentale valutare la deplezione dei geni di controllo positivo in ciascun braccio di screening per valutare le prestazioni dello screening. Si prevede che si veda variabilità biologica tra repliche nel braccio screening trattato con farmaci, poiché l'esposizione a farmaci può causare differenze stocastiche nella risposta cellulare. Questa variabilità è intrinseca agli screening per la chemioresistenza e non indica necessariamente scarsa qualità degli screen. Pertanto, durante il hit-calling, devono essere analizzati insieme almeno tre ripetizioni biologiche, e i hit devono essere determinati come i geni che hanno almeno 6 sgRNA efficaci su 10.
5. Per identificare i cambiamenti indotti dal farmaco nelle abbondanze di sgRNA e negli effetti a livello genico, confrontare i campioni trattati con T final-Taxol con quelli con T_final-DMSO, utilizzando il gruppo DMSO come controllo.
6. Applicare un cutoff del tasso di falsa scoperta (FDR) di FDR < 0,05 per identificare i geni impoveriti nel gruppo di trattamento e rivelare i geni che contribuiscono alla fitness o resistenza delle cellule resistenti al Taxol.

Risultati

Per studiare i regolatori epigenetici della chemioresistenza nel TNBC, il protocollo complessivo che utilizza la linea cellulare SUM159PT è mostrato nella Figura 1. Innanzitutto, i valori di IC₁₀ e IC₅₀ di Taxol nelle cellule SUM159PT sono stati determinati trattando le cellule con concentrazioni crescenti di Taxol (Figura 2A). È stato utilizzato un metodo di aumento graduale della dose per generare cellule SUM159PT resistenti al Taxol. Dopo diversi mesi, uno spostamento nei valori di IC50 illustra l'affermazione efficace di un fenotipo resistente utilizzando questo protocollo rispetto alle cellule di controllo che sono state attraversate in parallelo senza esposizione al Taxol (Figura 2B).

Figura 1: Schema dello schermo EPIKOL nelle cellule SUM159PT resistenti al Taxol. Flusso di lavoro complessivo dello screening EPIKOL nelle cellule SUM159PT resistenti al Taxol generate. La figura è stata creata con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Una volta stabilite le cellule resistenti, furono condotti diversi esperimenti per caratterizzarne i cambiamenti fenotipici e molecolari. Le capacità di proliferazione delle cellule resistenti sotto trattamento con Taxol sono state valutate con un test di formazione della colonia rispetto alle cellule parentali. Come si vede nella Figura 2C,D, le cellule resistenti mantengono la loro capacità proliferativa sotto trattamento con Taxol mentre le cellule genitoriali non possono sopravvivere. Questo saggio è uno dei passaggi importanti nella caratterizzazione delle cellule resistenti e dimostra come la capacità proliferativa sotto trattamento farmacologico possa essere valutata tra cellule genitoriali e resistenti.

Come parte della caratterizzazione delle cellule resistenti, è stato eseguito il sequenziamento dell'RNA su cellule parentali e resistenti per analizzare i cambiamenti trascricomici associati alla chemioresistenza (Figura 2E). Tra i geni più alzati nelle cellule resistenti vi era ABCB1, seguito da un paio di altri trasportatori ABC, tra cui ABCB4 e ABCA5. La regolazione all'alza dell'espressione di ABCB1 è stata validata con la reazione a catena quantitativa della polimerasi (qPCR), e questo illustra come i cambiamenti nell'espressione genica dei candidati possano essere convalidati usando qPCR (Figura 2F).

Figura 2: Generazione di cellule resistenti e la loro caratterizzazione. (A) Schema che mostra la generazione di cellule SUM159PT resistenti al Taxol con il metodo di aumento della dose. (B) Curva di risposta alla dose che mostra la differenza tra i valori IC50 delle cellule parentali e quelle resistenti generate. IC50 parentale = 6 nM e IC50 resistente al Taxol = 355,4 nM. (C) Analisi della formazione della colonia in presenza di Taxol. (D) Quantificazione delle aree di colonia in (C.) Analisi bidirezionale della varianza (ANOVA) con il test post hoc di Tukey è stata applicata utilizzando Prism 8 (GraphPad Software). I livelli di significatività sono stati fissati come *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. (E) Grafici vulcanici che mostrano geni espressi differenzialmente nelle cellule di Taxol-Res rispetto a quelle parentali, con un cutoff di LFC>2 e p<0,001. (F) validazione qPCR dell'espressione dell'mRNA ABCB1 nelle cellule genitori e Taxol-Res. Valori P determinati dal test t di Student a due code rispetto al gruppo di controllo; **P < 0,01. Il Pannello A è stato creato con BioRender.com. La figura del pannello E è stata modificata con il permesso di Yedier-Bayram et ^al.17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dopo aver evidenziato la sovraespressione di ABCB1 e altri trasportatori ABC nelle cellule resistenti al Taxol e considerando l'ampio spettro del substrato di ABCB1, è stata valutata la presenza del fenotipo MDR. A tal fine, le cellule resistenti al Taxol sono state trattate con molteplici farmaci noti come substrati del trasportatore ABCB1 e con diversi meccanismi d'azione, e la loro sensibilità al farmaco è stata valutata (Figura 3A,B). In linea con il profilo di espressione osservato dal trasportatore ABC, le cellule resistenti al Taxolo hanno mostrato anche resistenza a Doxorubicina e Vincristina, confermando la presenza del profilo MDR e illustrando come il fenotipo di resistenza multifarmaco possa essere valutato funzionalmente.

Il fenotipo MDR rappresenta una sfida per l'approccio di screening basato su CRISPR, EPIKOL, dato che la libreria richiede la selezione della puromicina per arricchire le cellule trasdotte. Poiché la puromicina può essere pompata fuori dalle cellule tramite efflusso di farmaci mediato da ABCB1, la selezione della puromicina potrebbe non essere efficiente nelle cellule resistenti (Figura 3C). Pertanto, le cellule non trasdotte possono sopravvivere alla selezione, confondendo i risultati dello screening.

Per affrontare questa limitazione, il processo di selezione delle cellule chemoresistenti con profilo MDR è stato ottimizzato prima dello screening EPIKOL. Il verapamilo, un inibitore ABCB1 di prima generazione, è stato utilizzato per bloccare l'efflusso di farmaci mediato dal trasportatore ABC, permettendo così l'accumulo intracellulare di agenti chemioterapeutici o puromicina (Figura 3D). Sebbene il verapamil da solo non abbia influenzato la vitalità cellulare, ha ripristinato la sensibilità farmacologica quando combinato con agenti chemioterapeutici (Figura 3E,F). Analogamente, le curve di uccisione della puromicina combinate con dosi non tossiche di verapamillo hanno dimostrato che l'inibizione di ABCB1 ripristina la sensibilità alla puromicina (Figura 3G,H). Questo garantisce che le cellule sopravvissute alla selezione siano quelle che vengono trasdotte con successo, piuttosto che quelle che sfuggono alla selezione a causa dell'efflusso di farmaci guidato da ABCB1. Stabilire un flusso di lavoro efficace di selezione nelle cellule chemoresistenti è fondamentale per risultati affidabili dello screening EPIKOL.

Figura 3: Fenotipo di resistenza multifarmacologica ed effetto del verapamil sulle cellule resistenti. Curve di risposta alla dose che mostrano la differenza tra i valori IC50 delle cellule parentali e quelle generate e resistenti con (A) Doxorubicina, (B) Vincristina, (C) Puromicina. (D) Schema che mostra la selezione di cellule di SUM159PT resistenti al Taxolo con e senza verapamil. La figura è stata creata con BioRender.com. (E) Test di vitalità cellulare con cellule Taxol-Res per determinare la concentrazione ottimale di verapamillo con Taxol. (F) Il verapamil risensibilizza le cellule resistenti al Taxol al Taxol. (G) Il verapamil non altera la risposta delle cellule genitoriali alla puromicina. (H) Il verapamilo ripristina la sensibilità alla puromicina nelle cellule Taxol-Res. I pannelli A, B e F sono stati riutilizzati con il permesso di Yedier-Bayram et ^al.17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per trovare nuovi regolatori della chemioresistenza nel TNBC, è stato effettuato uno screening EPIKOL con cellule SUM159PT resistenti al Taxol, come illustrato nella Figura 4A. Poiché le cellule resistenti crescono più lentamente rispetto alle cellule^{parentali 17}, i livelli di raddoppiamento della popolazione sono stati monitorati durante lo screening sia nei gruppi trattati con Taxol che in quelli trattati con DMSO per determinare il tempo necessario per raggiungere 16 raddoppiamenti della popolazione (Figura 4B). Di conseguenza, lo screening EPIKOL per il gruppo trattato con DMSO è stato completato intorno al giorno 35, mentre il gruppo trattato con Taxol è stato coltivato per ulteriori 15 giorni per raggiungere lo stesso livello di raddoppio della popolazione.

Dopo il sequenziamento, è stata utilizzata la pipeline di analisi MAGeCK per combinare l'effetto degli sgRNA che mirano allo stesso gene e rivelare i cambiamenti a livello genico al knockout²⁴. La libreria EPIKOL include sgRNA che mirano a geni essenziali come controlli positivi; il primo passo di controllo qualità è stato valutare se questi sgRNA fossero esauriti come previsto. I grafici a cascata illustrano i cambiamenti di piega Log2 dei geni essenziali attraverso diversi confronti (Figura 4C–E). Quando i campioni finali di punti temporali di condizioni trattate con DMSO o Taxol sono stati confrontati con il momento iniziale, quasi tutti i geni essenziali sono stati esauriti al momento dell'eliminazione, indicando una performance efficace allo screening (Figura 4C,D). Tuttavia, questa deplezione non è chiaramente osservata quando i due campioni finali (trattati con DMSO e trattati con Taxol) sono stati confrontati tra loro, come previsto, poiché i geni essenziali sono necessari per la sopravvivenza cellulare in entrambe le condizioni (Figura 4E).

Una visualizzazione alternativa dei risultati dello schermo è il grafico del vulcano, che mostra le variazioni di piega Log2 insieme alla significatività statistica (il valore p o valori FDR). Nello screening EPIKOL eseguito in cellule resistenti al Taxol, sono stati identificati più geni di controllo positivi come significativamente impoveriti, supportando ulteriormente l'affidabilità dello screening poiché la riduzione degli sgRNA che mirano ai geni di controllo positivi illustra un tipico controllo di qualità di uno screening riuscito (Figura 4F). Oltre ai controlli genici essenziali, la libreria EPIKOL include sgRNA di controllo positivo specifici per contesto che mirano a diversi geni trasportatori ABC. Come previsto, i conteggi normalizzati degli sgRNA ABCB1 in diversi gruppi hanno evidenziato la significativa riduzione degli sgRNA che mirano ad ABCB1, in particolare nel gruppo trattato con Taxol (Figura 4G). Nel complesso, questo dimostra come i cambiamenti a livello di sgRNA possano essere interpretati per identificare geni candidati associati alla risposta ai farmaci.

Figura 4: Lo screening EPIKOL risulta in cellule resistenti al Taxol e grafici di esempio. (A) Schema del protocollo di schermo EPIKOL. (B) Livello di Raddoppiamento della Popolazione (PDL) delle cellule Taxol-Res. (C–E) Grafici a cascata che mostrano i risultati dello screening EPIKOL sulle cellule Taxol-Res, evidenziando geni essenziali, gruppo trattato con DMSO rispetto al punto temporale iniziale nel pannello C, gruppo trattato con Taxol rispetto al punto temporale iniziale nel pannello D, gruppo trattato con Taxol rispetto al gruppo trattato DMSO nel pannello E. (F) Grafico vulcanico che mostra cambiamenti Log2Fold dei geni nei campioni trattati con Taxol rispetto al punto temporale iniziale. I geni che hanno p<0,05 sono stati colorati e etichettati. Questa cifra è stata modificata rispetto a una precedente^{pubblicazione 17}. (G) Letture per milione (rpm) di 10 diversi grafi ABCB1 sgRNA da EPIKOL. Il Pannello A è stato creato con BioRender.com. Il pannello E è stato riutilizzato con il permesso di Yedier-Bayram et ^al.17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare 1: Tabella di risoluzione problemi.Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 2: calcolo del titolo virale e del MOI.Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 3: elenco sgRNA della libreria EPIKOL.Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 4: Primer utilizzati nella preparazione della libreria di sequenziamento EPIKOL. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Gli approcci di screening aggregato basati su CRISPR-Cas9 sono ben consolidati in diversi contesti cellulari. Tuttavia, lo screening nelle cellule chemoresistenti presenta sfide distinte e richiede ulteriori ottimizzazioni. Poiché le cellule chemoresistenti rappresentano modelli preziosi per studiare le vulnerabilità dei tumori chemoresistenti, è importante affrontare queste limitazioni nelle strategie di screening per identificare in modo affidabile i regolatori genetici o epigenetici della chemioresistenza.

La generazione di linee cellulari chemoresistenti può essere macchinosa e dipende fortemente dall'agente chemioterapico utilizzato. Sebbene le cellule possano adattarsi facilmente a certi farmaci, possono essere altamente suscettibili ad^{altri 25}. Pertanto, è importante determinare i valori IC50 specifici per linee cellulari prima del protocollo di generazione delle linee cellulari resistenti. Nei casi in cui le cellule non tollerano l'esposizione al farmaco a livello IC50 su più passaggi, è possibile partire da una concentrazione di farmaco più bassa (ad esempio, IC10-20) (vedi Protocollo sezione 1)¹⁷. Poiché l'acquisizione della resistenza è un evento stocastico, diversi pozzi/piastre di cellule possono essere trattati contemporaneamente per aumentare la probabilità di ottenere cellule resistenti. È fondamentale caratterizzare in modo completo la popolazione cellulare ottenuta ai farmaci resistenti per descrivere i cambiamenti trascrizionali e fenotipici durante la procedura di aumento della dose rispetto al loro stato ingenuo. Approcci di profilazione globale come RNA-seq possono essere impiegati per identificare geni espressi differenzialmente rispetto alla linea parentale. Dal punto di vista funzionale, la resistenza acquisita ai farmaci dovrebbe essere validata con saggi di vitalità e proliferazione cellulare per dimostrare che le cellule resistenti mantengono la sopravvivenza in condizioni di trattamento farmacologico citotossiche per le cellule genitori. Inoltre, i potenziali cambiamenti nella loro capacità proliferativa e nel tasso di crescita dovrebbero essere misurati rispetto alla linea cellulare parentale per calcolare i rispettivi PDL. Poiché la resistenza acquisita al Taxol è nota per essere mediata, almeno in parte, da effluxi farmacologici mediati da ABC, l'espressione dei principali trasportatori ABC (ad esempio, ABCB1) dovrebbe essere valutata ai livelli di mRNA e proteina tramite qPCR e Western blotting, e può essere integrata da dati trascrictomici. Sulla base del profilo di espressione del trasportatore ABC, dovrebbe essere considerata la presenza del fenotipo MDR e la resistenza ad altri agenti chemioterapeutici dovrebbe essere valutata. Nel nostro studio precedente, abbiamo caratterizzato le linee cellulari resistenti al Taxol e identificato ABCB1 come uno dei geni più alzati al massimo, e abbiamo ritenuto che la resistenza multifarmacologica mediata da ABCB1 può causare fallimento nella selezione^{della puromicina 17}. Pertanto, dopo la generazione di cellule resistenti, l'espressione dei trasportatori ABC e del fenotipo MDR devono essere valutati prima di qualsiasi procedura di trasfezione.

Il metodo di aumento della dose offre vantaggi rispetto ai protocolli di esposizione ad alte dosi ai farmaci, poiché le cellule possono essere criopreservate ad ogni fase prima di aumentare la dose, offrendo flessibilità e tutelando contro la perdita di coltura. Inoltre, l'aumento graduale della dose permette l'acquisizione di fenotipi di resistenza nel tempo, consentendo l'evoluzione adattiva; a differenza del trattamento acuto ad alta dose, che comporta la selezione di sottopopolazioni resistenti preesistenti. La sua progressione graduale permette ai ricercatori di scegliere deliberatamente il livello di resistenza desiderato al quale fermare la selezione e valutare le proprietà del fenotipo risultante. Inoltre, i passaggi intermedi dell'aumento della dose potrebbero essere sfruttati per studiare i meccanismi di resistenza acquisita in modo temporale. Secondo la questione biologica sottostante, si potrebbero ottenere diversi livelli di resistenza per studiare sia i meccanismi adattivi precoci con livelli di resistenza più bassi sia fenotipi di resistenza stabili e completamente stabiliti in cellule più resistenti. Inoltre, le soglie di resistenza clinicamente rilevanti variano sostanzialmente a seconda del farmaco, della linea cellulare e del tasso di proliferazione intrinseca; pertanto, la tempistica di aumento della dose può variare di conseguenza (nel nostro caso, la generazione di cellule resistenti al Taxol richiedeva circa 6 mesi). In linea con questa logica, nel nostro studio precedente abbiamo stabilito due diversi livelli di resistenza con SUM159PT cellule e confrontato le loro caratteristiche distinte e^{condivise 17}. Pertanto, raccomandiamo ai ricercatori di definire l'intervallo di IC50 target del farmaco di interesse in base alla rilevanza clinica e biologica.

È ben stabilito che l'astinenza della pressione del farmaco può portare alla perdita della chemioresistenza, poiché le cellule possono riprogrammare il loro epigenoma e il^{trascrisimo 25}. Per questo motivo, si suggerisce di valutare la stabilità del fenotipo di resistenza per diversi mesi. Se le cellule tendono a tornare a uno stato sensibile dopo la sospensione del farmaco, le cellule resistenti possono essere coltivate in presenza della dose di mantenimento, tipicamente corrispondente alla concentrazione finale del farmaco utilizzata durante la generazione della resistenza, per preservare il loro fenotipo di resistenza. Sebbene i modelli di linee cellulari chemoresistenti in vitro siano pratici, riproducibili e ampiamente utilizzati per studiare la chemioresistenza acquisita, potrebbero non ricapitolare completamente l'eterogeneità fenotipica osservata nei tumori dei pazienti e non avere il microambiente tumorale, le interazioni immunitarie e l'eterogeneità spaziale ^3,4,25. Inoltre, il passaggio prolungato durante la generazione della resistenza può causare alterazioni genetiche ed epigenetiche che si discostano da quelle osservate nei campioni di pazienti, limitando potenzialmente la rilevanza traslazionale degli abbinamenti identificati. Pertanto, i geni e i meccanismi candidati identificati tramite questo protocollo dovrebbero essere ulteriormente validati in sistemi sperimentali più rilevanti dal punto di vista clinico, come modelli di co-coltura, organoidi derivati dal paziente o studi in vivo. EPIKOL offre vantaggi grazie alla sua natura focalizzata se si vogliono eseguire schermi complementari su questi modelli, dove il numero massimo di celle ottenute è intrinsecamente limitato.

Le cellule chemoresistenti spesso crescono più lentamente rispetto alle loro controparti genitori, il che può rappresentare una sfida pratica per gli screening genomici che richiedono grandi popolazioni cellulari per mantenere la copertura delle biblioteche. Librerie focalizzate come EPIKOL offrono il vantaggio di effettuare uno screening con meno materiale di partenza, fornendo al contempo una maggiore profondità dello sgRNA per gene, migliorando così sensibilità e riproducibilità all'interno dello spazio target definito. Tuttavia, per design, EPIKOL cattura solo i meccanismi di resistenza epigenetica e non copre i contributori non epigenetici alla chemioresistenza. La scelta della biblioteca dovrebbe quindi essere guidata da esperimenti precedenti e dalla specifica questione biologica. Gli utenti di queste librerie dovrebbero essere consapevoli dei limiti delle biblioteche focalizzate e interpretare i risultati all'interno dell'ambito della libreria.

Un ostacolo importante nello screening CRISPR dei modelli chemoresistenti è l'emergere del fenotipo MDR guidato dalla regolazione all'alza del trasportatore^{ABC 9,10}. Diversi trasportatori ABC mediano l'efflusso di diversi substrati. Una volta generata una linea cellulare resistente ai farmaci, è importante valutare se la resistenza si estende ad altri agenti chemioterapeutici. La resistenza alla puromicina è causata principalmente dalla sovraespressione di ABCB1, e questo influisce sul processo di selezione degli approcci di screening CRISPR aggregati, poiché la maggior parte di queste librerie contiene cassette di selezione della puromicina per l'arricchimento delle cellule trasdotte. Qui abbiamo utilizzato verapamil, un inibitore di ABCB1 di prima generazione, per facilitare l'accumulo intracellulare di puromicina ed eliminare selettivamente le cellule resistenti non trasdotte che altrimenti sfuggerebbero alla selezione a causa dell'efflusso farmacologico mediato da ABCB1. Poiché il verapamilo si lega ad ABCB1 in modo reversibile, la funzione di ABCB1 viene ripristinata entro poche ore dopo la rimozione del verapamil. Pertanto, il verapamil non conferisce una vulnerabilità aggiuntiva alle cellule resistenti durante la fase successiva di trattamento farmacologico dello screening. Tuttavia, va riconosciuto diversi limiti del verapamil. Poiché il verapamilo è un inibitore dei canali calcici e di altri trasportatori, può influenzare la fisiologia cellulare oltre l'inibizione di^{ABCB1 10}. Inoltre, la concentrazione efficace di verapamillo varia tra le linee cellulari e i modelli MDR a seconda del livello di espressione di ABCB1 e dell'attività di altri trasportatori. Pertanto, la concentrazione di verapamillo dovrebbe essere ottimizzata per ciascuna linea cellulare, e potrebbe essere presa in considerazione una nuova generazione di inibitori di ABCB1 più specifici per ABCB1 se fossero preoccupati effetti fuori bersaglio. Come ulteriore passo fondamentale, la titolazione virale dovrebbe essere effettuata sulla cellula resistente stessa piuttosto che sulle controparti parentali, poiché l'infettività e la selezionabilità spesso differiscono per le cellule resistenti.

Un'altra considerazione importante è determinare la durata appropriata dello screening, poiché le cellule chemoresistenti spesso crescono più lentamente rispetto ai loro omologhi genitori^{abbinati 26}. Per tenere conto di questa differenza, abbiamo utilizzato calcoli di livello di raddoppio della popolazione (sezione 6 del protocollo) per valutare quando i gruppi di controllo e di trattamento hanno raggiunto la soglia desiderata di PDL. Gli screening possono quindi essere interrotti in giorni diversi, permettendo raddoppi della popolazione comparabili e consentendo un'interpretazione più sicura degli effetti degli sgRNA nel gruppo di trattamento.

Le PCR per la preparazione della libreria sono considerevolmente importanti per l'accuratezza dell'identificazione dei colpi a valle. Il bias introdotto da bassi input di gDNA e cicli PCR aumentati può portare all'amplificazione di alcune sequenze di sgRNA, causando arricchimenti o perdite di falsi positivi. Per mitigare questo, raccomandiamo di utilizzare la massima quantità possibile di gDNA, rispettare i numeri di ciclo PCR offerti da questo protocollo e eseguire reazioni parallele per il pool prima del sequenziamento. Quando possibile, la copertura bibliotecaria non dovrebbe scendere al di sotto delle soglie raccomandate (>300× copertura) per garantire una rilevazione affidabile degli sgRNA esauriti piuttosto che una caduta stocastica degli sgRNA a bassa abbondanza dovuta a una copertura bassa.

Dopo il sequenziamento, abbiamo utilizzato il framework di analisi MAGeCK e eseguito diverse analisi di controllo qualità a valle e passaggi di interpretazione^{dei dati 24}. Innanzitutto, l'analisi delle componenti principali (PCA) è stata utilizzata per valutare la distribuzione e la riproducibilità delle repliche biologiche (dati non mostrati, output MAGeCK). Si prevede un clustering replicato in PCA all'interno di ciascun braccio; Tuttavia, una maggiore variabilità nel braccio trattato dal farmaco è una caratteristica comune degli screening per la chemioresistenza, poiché il farmaco può indurre cambiamenti stocastici. Se i controlli positivo e negativo si comportano come previsto in ciascun braccio, questa variabilità non impedisce l'identificazione dei veri positivi. Successivamente, è stata applicata la normalizzazione dei conteggi di sgRNA in letture per milione (RPM) nei momenti iniziali e finali per valutare se gli sgRNA che mirano ai geni essenziali fossero esauriti come^{previsto 14}. Successivamente, la normalizzazione mediana è stata utilizzata per aggregare gli effetti a livello di sgRNA, permettendo l'identificazione di esaurimento a livello^{genico 24}. I punteggi di esaurimento a livello genico sono stati visualizzati utilizzando grafici a cascata, che classificano i geni dai più impoveriti a quelli arricchiti. Le alterazioni del numero di copie e la poliploidia derivanti da un'esposizione prolungata a farmaci possono confondere i risultati degli screening a causa di un taglio Cas9 inefficiente^{o eccessivo 27}. Sebbene EPIKOL prenda di mira i regolatori della cromatina che generalmente non sono soggetti ad amplificazioni basate su Taxol, raccomandiamo di valutare lo stato della ploidia e i cambiamenti nel numero di copie nelle cellule resistenti prima dello screening. Se si sospettano cambiamenti nel numero di copia, durante l'analisi MAGeCK possono essere applicati strumenti di correzione computazionale come CRISPRcleanR o CERES.

Negli screening che coinvolgono due bracci sperimentali, gruppi di controllo e di trattamento, sono necessari confronti diversi per interpretare correttamente le prestazioni degli screening e le dipendenze^{biologiche 17}. I confronti iniziali e finali sono adatti a valutare le prestazioni dello screening, inclusi il comportamento atteso di geni essenziali e controlli non targeting. Il confronto tra l'endpoint del gruppo di controllo (DMSO) e il punto temporale iniziale consente di identificare i geni necessari per la crescita e la fitness delle cellule resistenti in assenza di pressione del farmaco. Al contrario, il confronto di due campioni endpoint, trattato con farmaco (Taxol) e controllo (DMSO), rivela i geni specifici necessari per la resistenza al farmaco piuttosto che per la fitness generale. Va notato che il confronto diretto dei due campioni finali porta a una distribuzione distorsionata dei controlli genici essenziali, poiché sono necessari per la sopravvivenza in entrambi i gruppi. Un metodo alternativo di visualizzazione potrebbe essere il grafico Volcano, che mostra le variazioni di piega log2 insieme ai valori di significatività, permettendo l'identificazione di geni significativamente impoveriti. Una volta identificati i geni candidati, i conteggi normalizzati degli sgRNA e i grafici di visualizzazione sono utili per decidere quali sono gli sgRNA con le migliori prestazioni per i saggi di validazione a valle. Per lo screening EPIKOL, raccomandiamo di dare priorità ai geni candidati supportati dal comportamento concordante di almeno 6 su 10 sgRNA, poiché ciò fornisce maggiore fiducia negli effetti a livello genico.

Qui forniamo un protocollo ottimizzato per lo screening EPIKOL su linee cellulari resistenti al Taxol che hanno aumentato la regolazione di ABCB1 e hanno mostrato il fenotipo MDR. Questo protocollo è ampiamente applicabile a qualsiasi modello chemoresistente che mostri resistenza incrociata alla puromicina o ad altri antibiotici di selezione, consentendo così lo screening CRISPR in queste cellule. Indicazioni pratiche per le sfide tecniche più comuni incontrate in tutte le fasi del protocollo sono fornite nella Tabella Supplementare 1.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
100 mm piastra	Corning	353003	Coltura cellulare
Filtro 45 µm	Sigma-Aldrich	SLHVM33RS	Coltura cellulare
Piastra a 6 pozzetti	Corning	3506	Coltura cellulare
Piastre a 96 pozzetti fondo chiaro nero	Sigma-Aldrich	CLS356259	Per CellTiter-Glo Luminometric Assay di Vitalità Cellulare
Blasticidina	Thermo Fisher	A1113903	Per selezione
CellTiter-Glo luminescent cell viability assay	CellTiter-Glo, Promega	G7570	Per CellTiter-Glo Luminometric Assay di Vitalità Cellulare
DMEM	Gibco		Coltura cellulare
DMSO	PanReac AppliChem	A3672,0050	Coltura cellulare
FBS	Gibco	16140071	Coltura cellulare
Miscela nutriente Ham’s F12	Gibco	11765054	Coltura cellulare
Cellule HEK293T			Donazioni gentili di Robert Weinberg (MIT, Boston, USA).
HEPES	Thermo Fisher	15630080	Coltura cellulare
Idrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001-1G	Coltura cellulare
Insulina	Sigma-Aldrich	I9278-5ML	Coltura cellulare
LentiCas9-blast	Addgene	#52962	Per la generazione di linea cellulare stabile Cas9
LentiGuide-Puro	Addgene	#52963	Backbone per la clonazione gRNA
Kit MN NucleoSpin per tessuti	Macherey-Nagel	740952.5	Per l'estrazione di DNA genomico
PBS	Gibco	10010023	Coltura cellulare
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140122	Coltura cellulare
pLentiCRISPR v2	Addgene	#52961	Backbone per la clonazione gRNA
Polietilenglicole (PEG)-8000	Sigma-Aldrich	P2139-500G	Per la concentrazione di lentivirus
Polietilenimmina, lineare (PEI)	Sigma-Aldrich	765090-1G	Per la produzione di lentivirus
Solfato di protamina (PS)	Sigma-Aldrich	P4380-25G	Per l'infezione da lentivirus
psPAX2	Addgene	# 12260	Per la produzione di lentivirus
Puromicina	Thermo Fisher	A1113803	Per selezione
Cellule aderenti SUM159PT			Donazioni gentili di Robert Weinberg (MIT, Boston, USA).
Taxol	Paclitaxel, Sigma	PHR1803-200MG	Per la generazione e il mantenimento di cellule res
Trypsina-EDTA (0,05%)	Gibco	25300054	Coltura cellulare
Verapamil	Selleck Chemicals	S4202	Per selezione
VSV-G	Addgene	# 8454	Per la produzione di lentivirus