Analisi quantitativa 3D non distruttiva del legamento parodontale residuo su premolari umani estratti tramite scansione intraorale

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo digitale 3D quantitativo e non distruttivo per valutare i legamenti parodontali residui sui denti estratti. Utilizzando la scansione intraorale e software di reverse engineering, abbiamo stabilito un flusso di lavoro ex vivo per la valutazione parodontale, fornendo una base metodologica per confrontare le tecniche di estrazione nella ricerca preclinica.

Abstract

La ripiantumazione intenzionale dei denti è un trattamento prezioso per preservare i denti naturali con lesioni endodontiche. Il suo successo dipende in modo critico dalla vitalità e dall'integrità strutturale del legamento parodontale residuo (PDL). I metodi tradizionali di valutazione, come la sezionazione istologica o la fotografia bidimensionale, sono distruttivi o limitati da errori di proiezione. Per affrontare queste limitazioni, questo protocollo presenta un metodo quantitativo non distruttivo per valutare il PDL residuo utilizzando scansioni intraorali ad alta precisione. I denti estratti sono stati colorati per visualizzare il tessuto PDL e scansionati tridimensionalmente per generare modelli digitali ad alta fedeltà. I dati sono stati analizzati utilizzando software di reverse engineering, dove è stata definita una regione di interesse e la copertura residua PDL è stata quantificata tramite la soglia di colore. Questo approccio calcola la vera area di copertura 3D del PDL senza compromettere il campione biologico. Per valutare la sensibilità e l'utilità di questo protocollo, è stato applicato per confrontare le estrazioni minimamente invasive (MI) con periotomi con le estrazioni convenzionali con forcipe. L'analisi digitale ha rivelato che il metodo MI ha conservato significativamente più tessuto PDL (61,99%) rispetto al metodo convenzionale (50,46%). Inoltre, un successivo saggio di vitalità cellulare ha confermato i risultati digitali, dimostrando un'attività metabolica significativamente superiore nel gruppo MI. In definitiva, questo lavoro stabilisce un flusso di lavoro proof-of-concept per la valutazione quantitativa ex vivo della PDL, fornendo una solida base metodologica per confrontare le tecniche di estrazione nella ricerca preclinica.

Introduzione

La ripiantumazione intenzionale dei denti è sempre più riconosciuta come una modalità di trattamento valida e di ultima risorsa per preservare denti naturali che altrimenti sarebbero considerati senza speranza. È indicato per la gestione di lesioni periapicali persistenti, perforazioni dei canali inaccessibili o lesioni reassorbtive estese che non possono essere gestite non^{chirurgicamente 1,2}. La procedura standard prevede l'estrazione intenzionale del dente interessato, seguita da un'ispezione visiva extraorale, un intervento terapeutico (inclusa resezione della radice, preparazione e otturazione della fine della radice) e successiva reimpianto nell'alveolo^{originale 1,2}.

La presenza e l'integrità di tessuto residuo vitale del legamento parodontale (PDL) sulla superficie radicolare sono i fattori prognostici più critici che determinano il modello di guarigione dopo la ripiantumazione del^{dente 3,4}. Una barriera PDL sana e intatta è essenziale per ristabilire la mobilità fisiologica e prevenire complicazioni come la riabsorzione sostitutiva (anchilosi) o la riassorbimento infiammatorio delle radici. Tuttavia, l'avulsione di un dente dall'alveola alveolare, sia traumatica che intenzionale, interrompe intrinsecamente l'attacco delle fibre PDL e recide l'apporto^{neurovascolare 5}. Di conseguenza, la ricostruzione biologica della PDL è cruciale per la guarigione parodontale dei denti^{ripiantati 3}. Ricerche approfondite hanno stabilito che massimizzare la vitalità e il volume del tessuto residuo di PDL durante le procedure cliniche extraorali costituisce un fattore prognostico critico, e la sua importanza per la sopravvivenza funzionale a lungo termine dei denti ripiantati è ben documentata nella^{letteratura 6,7}.

Dato che l'estrazione interrompe intrinsecamente l'attacco della PDL, la scelta della tecnica di estrazione influenza direttamente il volume e la vitalità del tessuto residuo di PDL rimasto sulla superficie radicale. L'estrazione convenzionale con pinze applica forze rotazionali e di trazione che possono schiacciare la PDL contro l'osso alveolare o strapparla tramite attrito. Per minimizzare questo trauma, sono stati sviluppati metodi di estrazione minimamente invasivi (MI). Studi precedenti hanno riportato che i metodi MI possono ridurre significativamente il trauma chirurgico al parodontio dei denti^{colpiti 8}. Sono state sviluppate tecniche che utilizzano periotomi per spezzare l'attacco del PDL, o sistemi di estrazione verticale che evitano le forze di leva, per preservare il residuo di PDL sulla superficie radicale. Ad esempio, i casi clinici hanno documentato risultati clinici migliorati nella ripiantumazione intenzionale dei denti e nell'estrusione chirurgica quando i sistemi MI erano^{impiegati 9,10}. Questi risultati suggeriscono che minimizzare i traumi di estrazione possa migliorare la ritenzione del tessuto residuo di PDL sulla superficie radicale.

Tuttavia, nonostante il consenso clinico sui benefici dell'estrazione atraumatica, esistono poche evidenze dirette che quantifichino l'estensione del tessuto residuo di PDL conservato utilizzando metodi MI rispetto alle tecniche convenzionali. Questa lacuna di conoscenza deriva in gran parte dai limiti delle metodologie di valutazione disponibili. Le ricerche esistenti impiegano prevalentemente metodi di valutazione soggettiva o distruttiva per valutare il residuo di PDL sulla superficie radicale. La sezionazione istologica rimane lo standard per l'analisi^{cellulare 11}, ma è intrinsecamente distruttiva, rendendo il campione inutilizzabile per ulteriori studi. In alternativa, la colorazione combinata con la fotografia bidimensionale (2D) è stata utilizzata per caratterizzare il residuo di PDL¹². Tuttavia, questi metodi sono inadeguati per quantificare il tessuto residuo di PDL dell'intera superficie radicale. Una fotografia 2D non può mappare con precisione l'area superficiale di una radice complessa e curva tridimensionale; introduce inevitabilmente errori di proiezione e distorsione, portando a quantificazioni imprecise.

Negli ultimi anni, la tecnologia di scansione digitale intraorale è avanzata notevolmente, offrendo alta precisione e acquisizione rapida dei dati. Il metodo digitale è stato utilizzato in studi precedenti per misurare impronte e cambiamenti dei tessuti molli, o per valutare l'usura dei denti in giovani¹³ anni. Le applicazioni si sono persino ampliate ad analisi volumetriche complesse, come la valutazione del gonfiore facciale in chirurgia^{orale 14}. Queste tecnologie permettono la creazione di modelli tridimensionali ad alta fedeltà (3D) che possono essere manipolati e misurati tramite software di reverse engineering, offrendo una potenziale soluzione per un'analisi quantitativa non distruttiva. Tuttavia, finora, la potenziale applicazione della scansione intraorale per valutare il residuo di PDL dei denti estratti non è ancora stata esplorata.

L'obiettivo principale di questo protocollo è stabilire un flusso di lavoro standardizzato e non distruttivo che combini la colorazione biologica con la scansione intraorale ad alta precisione e il reverse engineering 3D. Creando modelli digitali ad alta fedeltà con mappe superficiali con texture colorata, questo metodo consente una misurazione più oggettiva e riproducibile del PDL residuo su tutta la superficie della radice. Questo studio applica il flusso di lavoro proposto per confrontare la copertura residua di PDL di due tecniche di estrazione, l'estrazione MI assistita da periotomi rispetto all'estrazione convenzionale con pinzep, nei premolari umani. Si ipotizza che il metodo MI preservi una proporzione maggiore di copertura residua PDL rispetto al metodo convenzionale.

È importante sottolineare che questo protocollo è progettato esclusivamente come strumento di ricerca ex vivo per ambienti di laboratorio o preclinici. La procedura prevede la colorazione, l'asciugatura all'aria, la scansione digitale e la segmentazione tramite software, con un tempo totale di analisi incompatibile con l'uso intraoperatorio durante la reforestazione intenzionale, dove il tempo extraorale deve essere ridotto al minimo. Di conseguenza, questo metodo è appropriato per (i) confrontare l'efficacia di preservazione della PDL di diverse tecniche di estrazione in condizioni controllate; (ii) formazione e calibrazione in contesti educativi; e (iii) studi di validazione che collegano le metriche di copertura digitale PDL agli esiti biologici. La sua applicabilità a denti a più radici con anatomie complesse richiede ulteriori indagini.

Protocollo

Il protocollo di ricerca è stato svolto in conformità con le linee guida del Comitato Etico della Scuola di Stomatologia dell'Università di Pechino (PKUSSIRB-202054022).

1. Selezione dei pazienti e assegnazione dei gruppi

1. Seleziona pazienti che richiedono l'estrazione dei premolari per scopi ortodontici. Assicurarsi che i premolari rispettino i criteri di inclusione in assenza di carie o malattia parodontale.
2. Escludere i pazienti con ipertensione, diabete, storia di fumo o quelli di età inferiore a 16 anni o superiori a 45 anni.
3. Assegnare casualmente i premolari in due gruppi sperimentali: il Gruppo di Controllo (estrazione convenzionale) e il Gruppo Minimamente Invasivo (MI) (estrazione assistita da periotomi).
4. Assegnare casualmente i denti di ciascun gruppo al percorso di analisi a scansione 3D o al percorso di validazione biologica (CCK-8), assicurando che vengano utilizzati campioni indipendenti per ogni metodo di valutazione.

2. Procedure di estrazione dentale

1. Eseguire tutte le estrazioni sotto anestesia locale standard.
2. Metodo A: Estrazione convenzionale (gruppo di controllo)
   1. Esegui la separazione gengivale attorno al collo del dente.
   2. Posizionare le pinze dentali nell'area cervicale della corona dentale.
   3. Applica le forze di rotazione finché il dente non si allenta. Rimuovi il dente dall'alveola usando la pinza.
3. Metodo B: Estrazione minimamente invasiva (gruppo MI)
   1. Esegui la separazione gengivali.
      ATTENZIONE: Maneggiare il periotoma con attenzione per evitare lesioni ai tessuti molli o rotture degli strumenti.
   2. Inserire un periotoma nello spazio PDL il più profondo possibile, raggiungendo almeno due terzi della lunghezza della radice.
   3. Recidi circonferenzialmente le fibre PDL intorno alla radice usando il periotoma. Allenta il dente.
   4. Tira verticalmente il dente fuori dall'alveola usando la pinza dentale.

3. Preparazione e colorazione del campione

1. Subito dopo l'estrazione, risciacqua i denti con soluzione salina sterile per 10 minuti per rimuovere sangue e detriti.
   ATTENZIONE: Il blu di toluidina è una sostanza chimica pericolosa. Indossa l'attrezzatura di protezione personale adeguata (guanti, occhiali) durante la manovrazione.
2. Tingere la superficie radicale immergendo il dente in una soluzione blu di toluidina allo 0,1% (preparata in soluzione salina tamponata con fosfato, PBS) per 40 minuti per visualizzare il tessuto PDL.
3. Risciacquo con soluzione salina per 10 minuti per rimuovere la soluzione del colorante e asciuga delicatamente la superficie con il phon con una siringa a tre vie per rimuovere l'eccesso di umidità.
   NOTA: La superficie radicale dovrebbe mostrare una colorazione uniforme blu-viola, mentre il cemento esposto dovrebbe rimanere intatto, apparendo di un beige chiaro.

4. 3D Scansione digitale

1. Calibrare lo scanner digitale intraorale secondo le istruzioni del produttore per garantire un'accuratezza di 0,02 mm.
2. Fissa la corona con una pinza emostatica per evitare di ostruire la vista della superficie radicale.
3. Scansionare l'intera superficie della radice in condizioni standard di scansione. Esegui una scansione complementare della corona per completare il modello 3D.
4. Utilizzare il software proprietario dello scanner per esportare i dati di scansione digitale come file ad oggetto 3D (OBJ) ad alta risoluzione e il pacchetto dati associato; l'immagine della texture viene salvata in formato JPG.
   NOTA: L'anteprima della scansione in tempo reale deve mostrare una mesh continua ad alta densità, priva di fori o artefatti sulla superficie della radice. L'immagine della texture dovrebbe distinguere chiaramente le aree colorate di blu dalla superficie delle radici non macchiate.

5. 3D ricostruzione del modello e analisi quantitativa

1. Pre-elaborazione dell'immagine
   1. Calibrazione della soglia
      1. Importa la mappa delle texture JPG nel software di editing immagini. Converti l'immagine in scala di grigi a 8 bit.
      2. Apri lo strumento Soglia (Immagine > Regola > Soglia) e ispeziona l'istogramma per registrare il valore minimo in scala di grigi che cattura tutti i pixel PDL colorati di blu. Determinare la soglia minima in scala di grigi utilizzando tre osservatori indipendenti.
   2. Importa la texture map originale in JPG nel software di editing immagini. Naviga per selezionare > gamma di colori. Scegli la modalità Ombre e imposta Range a 65 e Tolleranza al 20% (calibrato dai dati di soglia 5.1.1).
      NOTA: Verifica che tutte le regioni di PDL colorate di blu siano completamente selezionate e che non sia inclusa alcuna superficie radicale non colorata.
   3. Copia le regioni selezionate con macchie blu e incollale su un nuovo strato bianco per generare una maschera binaria (blu per PDL, bianco per la radice nuda). Salva l'immagine della texture elaborata per sovrascrivere il file JPG originale.
2. Misurazione quantitativa
   1. Importa il modello 3D elaborato nel software di reverse engineering.
   2. Utilizzare Polygons > Trim per definire la Regione di Interesse (ROI) e escludere tessuti gengivali e periapali. Impostare il limite superiore del ROI a 2 mm sotto la giunzione cementoenamenel (CEJ). Escludere il 3 mm apicale dall'analisi.
   3. Seleziona le "regioni blu migliorate" all'interno del ROI. Dopo la selezione, il tessuto residuo PDL viene accentuato di rosso.
   4. Naviga su Analisi > Calcolo >area di calcolo per calcolare l'area superficiale totale del ROI e l'area superficiale delle regioni blu (PDL residuo).
   5. Calcola la percentuale di copertura PDL usando l'Equazione 1:
      Copertura PDL (%) = (Area di PDL residuo/Area totale del ROI) x 100
3. Visualizzazione
   1. Acquisire immagini delle quattro superfici radicali (buccale, linguale, mesiale e distale) perpendicolari all'asse del dente per una valutazione visiva dettagliata.

6. Validazione biologica (saggio di vitalità cellulare)

NOTA: Questa sezione descrive i passaggi di validazione eseguiti su un sottoinsieme di campioni (n = 8 per gruppo) per corroborare l'analisi digitale.

1. Immediatamente dopo l'estrazione, si inseriscono i denti in un tubo centrifuga sterile contenente un mezzo di coltura preriscaldato (37 °C).
2. Trasportare i campioni in laboratorio in una ghiacciaia a 4°C entro 1 ora. Utilizzare il Modified Eagle Medium di Dulbecco, integrato con siero bovino fetale al 10%, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina per il trasporto del campione e il test di vitalità cellulare.
3. Risciacquare i denti con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) in un armadietto di biosicurezza immediatamente dopo l'arrivo.
4. Raschiare con cura il tessuto PDL dal terzo centrale della radice (ROI è definito da sonda parodontale graduata) utilizzando una lama sterile a temperatura ambiente entro 10 minuti dall'arrivo per massimizzare la vitalità cellulare.
5. Digerire il tessuto raccolto con tripsina-EDTA allo 0,25% per 30 minuti. Centrifugare la sospensione della cella a 120 × g per 5 minuti a temperatura ambiente (22–25 °C) per ottenere il precipitato contenente la cella.
   NOTA: Dopo la centrifugazione, dovrebbe formarsi un pellet bianco riconoscibile sul fondo del tubo. Se non si osserva alcun pellet, il campione dovrebbe essere ricentrifugato a 120 × g per un ulteriore minuto.
6. Risospendere il precipitato in una miscela di soluzione Cell Counting Kit-8 (CCK-8) da 600 μL e mezzo a un rapporto 1:10 (v/v), preparata secondo le istruzioni del produttore.
7. Una quota di questa sospensione a 200 μL per pozzo su una piastra da 96 pozzi (3 repliche tecniche per campione). Incubare la piastra a 37°C in un incubatore umidificato con il 5% di_CO2 per 3 ore.
8. Trasferire 50 μL del sovrandante da ciascun pozzo a una nuova piastra da 96 pozzi.
9. Misura l'assorbanza (Densità Ottica, OD) a 450 nm utilizzando un lettore di microplacche. Annota i valori medi di OD per confronti statistici.
   ATTENZIONE: (i) Raccogliere la soluzione di colorazione di toluidina blu e risciacquare i rifiuti come rifiuti chimici pericolosi e smaltirli secondo le linee guida istituzionali sulla sicurezza chimica; (ii) Trattare tessuti PDL, bisturi utilizzati e rifiuti di coltura cellulare come rifiuti biologici pericolosi (Livello di Biosicurezza 1) e autoclavarli o incenerirli secondo i protocolli istituzionali di biosicurezza; (iii) Scartare i DPI (guanti, punte di pipetta, asciugamani di carta) in contenitori designati per i rischi biologici.

7. Analisi statistica e validazione metodologica

1. Raccolta dati: Compilare i dati quantitativi, inclusi l'area totale della superficie radicale (mm²), l'area totale colorata (mm²) dall'analisi 3D, la percentuale di copertura PDL (%) e i valori OD dal test biologico.
2. Test di normalità: Valutare la distribuzione dei dati per la normalità utilizzando il test di Shapiro-Wilk.
3. Confronto di gruppi:
   1. Confronta la copertura PDL e i valori OD tra i gruppi MI e Controllo.
   2. Utilizzare un test Student's t non accoppiato per dati normalmente distribuiti o un test Mann-Whitney U per dati non normalmente distribuiti.
   3. Calcola la dimensione dell'effetto (d di Cohen) per determinare la grandezza della differenza.
4. Analisi della robustezza metodologica:
   1. Eseguire un'analisi di regressione lineare con "Area della Superficie Radice" come variabile indipendente e "Copertura PDL" come variabile dipendente.
   2. Calcola il coefficiente di correlazione di Pearson (r) per valutare se il metodo di misura è distorto dalla dimensione del dente. Una correlazione non significativa (P > 0,05) indica robustezza.
5. Analisi dell'affidabilità:
   1. Genera grafici a violino combinati con box plot per visualizzare la densità di probabilità e le caratteristiche di distribuzione dei dati.
   2. Confronta la forma e la concentrazione della distribuzione dei dati tra i gruppi.
6. Test di affidabilità intra-osservatore e inter-osservatore:
   1. Selezionare casualmente 16 campioni dal dataset totale (8 per gruppo) per la valutazione dell'affidabilità.
   2. Per la ripetibilità intra-osservatore, ripetere l'intera procedura di segmentazione e misurazione sugli stessi 16 campioni a intervalli di una settimana, per un totale di due studi.
   3. Per l'accordo tra osservatori, fornire formazione standardizzata a due osservatori indipendenti aggiuntivi sul protocollo di segmentazione.
   4. Fai eseguire indipendentemente a tutti e tre gli osservatori la definizione del ROI, la soglia del colore e il calcolo dell'area sugli stessi 16 campioni.
   5. Calcolare il Coefficiente di Correlazione Intraclasse ICC(A,1) con intervalli di confidenza del 95% per quantificare l'accordo assoluto sia per confronti intra-osservatori che inter-osservatori. Valutazione ICC del rapporto >0,90 come eccellente, 0,75–0,90 come buona, 0,50–0,75 come moderata e <0,50 come scarsa.
   6. Esegui l'analisi di Bland-Altman per tutti i confronti a coppie. Calcola la differenza media (bias) e i limiti di concordanza del 95% (differenza media +/- 1,96 SD). Un risultato non significativo del test t accoppiato (P > 0,05) indica un bias sistematico trascurabile.
7. Software: Eseguire tutte le analisi statistiche utilizzando il software appropriato. Consideriamo P < 0,05 come statisticamente significativo.

Risultati

Il flusso di lavoro sperimentale stabilito in questo studio ha dimostrato con successo un protocollo non distruttivo per la valutazione quantitativa della PDL residua sui denti estratti. Come illustrato nel disegno sperimentale (Figura 1), il protocollo integrava procedure di estrazione clinica con acquisizione digitale e validazione biologica. L'applicazione della scansione digitale intraorale, seguita dal reverse engineering 3D, ha permesso una ricostruzio...

Discussione

Il successo della ripiantumazione intenzionale dipende in modo cruciale dalla conservazione delle cellule PDL vitali sulla superficie radicale. Sebbene i metodi di estrazione dell'IM siano stati clinicamente sostenuti per ridurre i^{traumi 8,9,10}, quantificarne il beneficio biologico sul tessuto residuo di PDL è rimasto una sfida a causa della mancanza di strumenti di valutazione oggettiva. Questo...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
96-well plate	Servicbio	CCP-96H	Piastra multi-pozzetto per coltura cellulare e misurazione dell'assorbanza
Armadio di sicurezza biologica	Thermo Fisher Scientific	1300 Series4 A2	Armadio di sicurezza biologica di classe II per procedure sterili
Kit di conteggio cellulare-8 (CCK-8) soluzione	MedChemExpress	HY-K0301	Reagente per il test di vitalità cellulare
Centrifugatrice	Ustc Zonkia Zcientific Instruments	SC-3610	Centrifugatrice di laboratorio per precipitazione cellulare
Terreno di coltura	Gibco	DMEM 11965	Terreno basale per il trasporto e l'incubazione cellulare
Forcipe dentale	Jinzhong Surgical instruments	K0F130/K0F100	Strumento standard per l'estrazione dentale
Siero fetale bovino	Anhui Kangyuan Biotechnology Co., Ltd	KY-01003S	Supplemento di siero fetale bovino per il terreno di coltura
Sonda parodontale graduata	Jinzhong Surgical instruments	K6F040	Aiuta a raschiare il PDL dal terzo medio della radice
Forcipe emostatico	Jinzhong Surgical instruments	J31130	Strumento chirurgico utilizzato per fissare il dente durante la scansione
Incubatore umidificato	Thermo Fisher Scientific	Forma	Incubatore per coltura cellulare mantenuto a 37°C con 5% di CO2
Software di editing delle immagini	Adobe Systems Inc.	Adobe Photoshop CC 2018	Software per la selezione del colore
Software di editing delle immagini	Wayne Rasband, National Institutes of Health	ImageJ2 v2.14.0	Software per la soglia di colore
Scanner digitale intraorale	Aidite (Qinhuangdao) Technology Co., Ltd.	Aidite Cameo	Scanner ottico per l'acquisizione di modelli digitali 3D
Anestesia locale	Produits Dentaires Pierre Rolland	Primacaine Articaine	Agente anestetico dentale (ad esempio, Articaina o Lidocaina)
Lettore di micropiastre	Biotek	Elx808	Spettrofotometro per la misurazione dell'OD a 450 nm
Penicillina/Streptomicina	Gibco	15070063	Supplemento antibiotico per il terreno di coltura
Periotomo	Carl Martin	LS529PT	Strumento di estrazione minimamente invasiva
Software di reverse engineering	Geomagic Inc.	Geomagic Studio 2013	Software di modellazione 3D per il calcolo dell'area superficiale
Tubo per centrifugazione sterile	Servicbio	EP-1500-J	Tubo di plastica per la raccolta e l'elaborazione dei campioni
Soluzione salina tamponata sterile (PBS)	Gibco	10010	Buffer di lavaggio per campioni biologici
Lamina di bisturi sterile	Jiayuan Medical Devices	Lamina di bisturi sterile	Lamina per il raschiamento del tessuto PDL
Salsaline sterile	Servicbio	G4702-500ML	Soluzione salina per il risciacquo dei denti estratti
Blu di toluidina	Fornitore di laboratorio generale	Blu di toluidina (soluzione allo 0,1%)	Colorante biologico per la visualizzazione del legamento parodontale
Tripsina	Gibco	25200056	Reagente enzimatico per la digestione dei tessuti