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Articolo di ricerca
* These authors contributed equally
Nei pesci zebra, la mollugina a dosi sicure (≤200 µg/mL) è stata associata a un miglioramento della rigenerazione della coda, accompagnato da modifiche nell'espressione genica dei geni legati all'apoptosi, nei marcatori infiammatori, nell'attività degli enzimi antiossidanti e nei marcatori associati ai macrofagi. Questi risultati suggeriscono che la mollugina possa modulare la risposta locale alla lesione durante la rigenerazione della coda nei pesci zebra.
La mollugina è un composto naturale naftochinonico con attività antinfiammatorie e antiossidanti riportate in letteratura, ma il suo ruolo nella rigenerazione tissutale rimane in gran parte poco chiaro. In questo studio, è stato utilizzato un modello di amputazione della coda del pesce zebra per indagare gli effetti della mollugina sulla riparazione della ferita e sulle risposte immunitarie e redox associate. Gli embrioni di pesce zebra sono stati trattati con mollugina a concentrazioni di 22 µg/mL, 66 µg/mL e 200 µg/mL dopo la lesione della coda. Il trattamento con mollugina è stato associato a un miglioramento del recupero dell'area della coda in maniera dose-dipendente, accompagnato da una ridotta espressione di geni legati all'apoptosi e dalla soppressione di mediatori pro-infiammatori, tra cui IL-1β, IL-6, TNF-α, TLR4 e NF-κB1. Parallelamente, la mollugina ha ripristinato l'attività degli enzimi antiossidanti superossido dismutasi e catalasi. L'analisi mediante imaging a fluorescenza in pesci zebra Tg(mpeg1:GFP) ha mostrato un effetto tempo-dipendente della mollugina sull'accumulo di macrofagi, senza una riduzione evidente a 24 h, ma con una diminuzione dell'area positiva ai macrofagi a 48 h nei gruppi trattati con 66 e 200 µg/mL rispetto al gruppo modello lesionato. L'analisi mediante qRT-PCR ha inoltre evidenziato una ridotta espressione del marcatore associato all'M1 iNOS e un aumento dell'espressione del marcatore associato all'M2 arginasi-1. Nel complesso, questi risultati suggeriscono che la mollugina potrebbe favorire la rigenerazione della coda del pesce zebra in associazione a modifiche dei marcatori infiammatori, dello stress ossidativo, legati all'apoptosi e ai macrofagi. Sono necessari ulteriori studi per definire i meccanismi cellulari e molecolari sottostanti.
La rigenerazione dei tessuti è un processo fisiologico fondamentale attraverso il quale gli organismi riparano i danni, coinvolgendo una complessa regolazione della proliferazione cellulare, della differenziazione e del mantenimento dell'omeostasi microambientale1. Tra i modelli vertebrati, il pesce zebra si è affermato come un sistema chiave per lo studio dei meccanismi di riparazione delle ferite grazie alla sua notevole capacità rigenerativa. In particolare, la rigenerazione della pinna caudale nel pesce zebra comprende la coordinazione spazio-temporale di numerosi eventi biologici, tra cui la regolazione dell'infiammazione, l'equilibrio della risposta ossidativa e il controllo dell'apoptosi2,3. Negli ultimi anni, le attività farmacologiche dei prodotti naturali sono diventate un punto focale nella ricerca sulla medicina rigenerativa. I composti naftochinonici, in particolare, sono stati ampiamente studiati per i loro diversi effetti biologici4. La mollugina è un composto naftochinonico derivato da piante della famiglia delle Rubiacee e negli studi precedenti ha mostrato attività anti-infiammatorie, antiossidanti e di regolazione del ciclo cellulare5,6. Tuttavia, il suo meccanismo d'azione nella rigenerazione dei tessuti rimane poco chiaro, e il suo potenziale ruolo nella modulazione del microambiente infiammatorio e nella polarizzazione delle cellule immunitarie richiede un'indagine sistematica.
Dopo una lesione, l'infiammazione viene rapidamente attivata ed influenza direttamente la riparazione del tessuto. Un segnale infiammatorio moderato è essenziale per rimuovere il tessuto necrotico e avviare il programma di rigenerazione, mentre una cascata infiammatoria eccessiva può aggravare lo stress ossidativo e portare alla fibrosi del tessuto7. Le citochine, tra cui IL-1β, IL-6 e TNF-α, aumentano notevolmente dopo la lesione e sono accompagnate dall'attivazione della via di segnalazione TLR4/NF-κB, che porta a risposte infiammatorie amplificate e al rimodellamento del tessuto8,9. La molecola di adesione intercellulare-1 (ICAM-1) e il legante chemochina CC-2 (CCL-2) sono anch'esse elevate dopo la lesione e sono associate a un reclutamento aumentato di neutrofili e macrofagi nei tessuti danneggiati10. In particolare, lo squilibrio ossidativo aggrava ulteriormente il danno tissutale, e l'attività ridotta della superossido dismutasi (SOD) e della catalasi (CAT) indica una capacità antiossidante compromessa2,11.
I macrofagi svolgono un ruolo chiave come regolatori del microambiente infiammatorio, e la loro polarizzazione funzionale influisce in modo significativo sul processo rigenerativo12. I macrofagi M1 sono associati all'espressione della sintasi dell'ossido nitrico inducibile (iNOS) e all'attività infiammatoria, mentre i macrofagi M2 esprimono l'arginasi-1 (Arg-1) e sono legati alla riparazione dei tessuti13,14. La polarizzazione dei macrofagi è influenzata da citochine locali, stress ossidativo e segnali legati all'apoptosi. In questo contesto, la rete regolatoria dell'apoptosi composta dalle proteine della famiglia della linfoma B-cellula-2 (Bcl-2) e dalla caspasi-3 non solo influenza la sopravvivenza cellulare nel sito della lesione, ma modula anche in modo indiretto il comportamento chemotattico delle cellule immunitarie attraverso il rilascio di segnali "find-me"15. Pertanto, esplorare strategie di intervento che modulino contemporaneamente le risposte infiammatorie, lo stress ossidativo e la polarizzazione dei macrofagi potrebbe contribuire a migliorare la rigenerazione tissutale.
I composti naturali hanno dimostrato vantaggi unici nella modulazione di questi processi biologici. Studi recenti hanno confermato che le sostanze naftochinoniche, grazie alle loro strutture coniugate, possiedono la capacità di eliminare i radicali liberi; il loro nucleo benzochinonico può influenzare le vie di segnalazione sensibili allo stato redox attraverso meccanismi di trasferimento di elettroni16,17. È stato riportato che la molluggina attenua le risposte infiammatorie nella colite indotta da DSS, con una ridotta produzione di citochine pro-infiammatorie e una diminuzione dell'espressione di TLR4 nei tessuti del colon18. È stato inoltre dimostrato che la molluggina inibisce la segnalazione TAK1-NF-κB/MAPK e attiva la via Keap1-Nrf2 nei macrofagi6; tuttavia, il suo impatto sulla polarizzazione dei macrofagi e sulla rete apoptosi-antiapoptosi in un modello di ferita in vivo non è ancora stato chiarito. Inoltre, gli effetti biologici della molluggina in funzione della dose e il suo ruolo regolatorio durante il processo rigenerativo rimangono da chiarire in modo sistematico.
Lo studio attuale ha esaminato gli effetti della Mollugina in un modello di rigenerazione della pinna caudale del pesce zebra. In particolare, abbiamo analizzato la ricrescita della coda, l'espressione genica correlata all'apoptosi, il segnale infiammatorio, l'attività degli enzimi antiossidanti e le risposte associate ai macrofagi dopo il trattamento con Mollugina. I nostri risultati indicano che il trattamento con Mollugina è associato a un miglioramento della rigenerazione della coda e a modifiche di diversi marcatori della risposta alla lesione in questo modello di pesce zebra.
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Tutte le procedure sugli animali hanno seguito le linee guida del National Research Council per la cura e l'uso degli animali da laboratorio ed sono state approvate dal Comitato Etico dell'Ospedale Generale di Fuzhou (numero di approvazione 202408002).
Allevamento di zebrafish
Tutti gli esperimenti sono stati condotti utilizzando zebrafish (Danio rerio) allevati in condizioni standard di laboratorio. Zebrafish di tipo selvatico AB sono stati utilizzati per il saggio di tossicità e per il saggio di rigenerazione dopo amputazione della coda. Zebrafish Tg(mpeg1:GFP) sono stati utilizzati specificamente per l'immagine dei macrofagi. Tg(mpeg1:GFP) è una linea reporter per macrofagi in cui l'espressione di GFP etichetta le cellule della linea macrofagica sotto il controllo del promotore mpeg1, espresso nei macrofagi. Tutte le linee di zebrafish sono state mantenute a 28,5 °C in un ciclo luce/buio di 14 h/10 h. Per gli esperimenti sono stati utilizzati solo embrioni morfologicamente normali. Per tutti gli esperimenti, gli embrioni sono stati incubati in tampone di Danieau, preparato con reagenti di grado analitico tra cui NaCl, KCl, Ca(NO₃)₂·4H₂O, MgSO₄·7H₂O e HEPES, aggiustato a pH 7,2.
Preparazione del farmaco e determinazione della sicurezza
La mollugina (40 mg) è stata sciolta in 1 mL di DMSO per ottenere una soluzione madre da 40 mg/mL. La soluzione madre è stata dapprima diluita 1:10 nel buffer di Danieau fino a 4 mg/mL, seguita da ulteriore diluizione a 22, 66 e 200 µg/mL per i trattamenti. Per determinare la concentrazione massima sicura, embrioni della linea AB a 48 ore post-fertilizzazione (hpf) sono stati dechorionati e disinfettati con ipoclorito di sodio allo 0,003% prima di essere distribuiti in piastre a 6 pozzetti (n=20, tre pozzetti per gruppo). Gli embrioni sono stati incubati con mollugina (22 µg/mL, 66 µg/mL, 200 µg/mL, 240 µg/mL, 280 µg/mL, 320 µg/mL o 360 µg/mL) in mezzo E3 per 48 h a 28,5 °C. La sopravvivenza è stata monitorata al microscopio stereoscopico, e la concentrazione più elevata con una vitalità degli embrioni ≥90% è stata stabilita come limite superiore sicuro per esperimenti successivi.
Costruzione del modello di amputazione e rigenerazione della coda
Per gli studi di rigenerazione, gli embrioni selvatici AB di 48 hpf sono stati anestetizzati con tricaina allo 0,03% preparata nel mezzo per embrioni e posizionati in posizione laterale sotto un microscopio stereoscopico. Prima dell'amputazione della coda, gli embrioni sono stati mantenuti nel buffer di Danieau. È stata eseguita un'amputazione trasversale standardizzata della coda sotto guida stereomicroscopica. La linea di amputazione è stata posizionata immediatamente a livello posteriore rispetto alla punta della notocorda, utilizzando l'estremità posteriore della notocorda come riferimento anatomico. La piega della pinna caudale distale a questo riferimento è stata rimossa mediante microbisturi per garantire un livello di lesione costante tra i campioni. Immediatamente dopo l'amputazione (0 h), sono state acquisite immagini con un microscopio stereoscopico a fluorescenza. Dopo l'amputazione, gli embrioni sono stati trasferiti nel corrispondente mezzo di trattamento a base di E3 per il saggio di rigenerazione. Le soluzioni lavorative di Mollugin sono state preparate diluendo la soluzione madre di Mollugin nel mezzo E3 fino a concentrazioni finali di 22, 66 e 200 µg/mL. Il Mollugin è stato somministrato per esposizione in bagno durante il periodo di rigenerazione. Per uniformare l'esposizione al veicolo, il gruppo di controllo non lesionato e il gruppo modello lesionato sono stati mantenuti nel mezzo E3 contenente lo 0,5% di DMSO, corrispondente alla concentrazione finale di DMSO nel gruppo con 200 µg/mL di Mollugin. Gli embrioni sono stati mantenuti in piastre a 6 pozzetti a 28,5 °C per 2 giorni, con rinnovo giornaliero del corrispondente mezzo di trattamento a base di E3. La rigenerazione è stata documentata mediante acquisizione di immagini a 24 e 48 h dall'amputazione, sia in luce bianca che in condizioni di fluorescenza, per valutare la ricrescita della coda e la distribuzione dei macrofagi. Le misurazioni delle immagini sono state effettuate con ImageJ.
Per la quantificazione della rigenerazione, l'area della coda recuperata è stata misurata come area assoluta in µm2 e non è stata normalizzata rispetto alla dimensione dell'embrione o alla dimensione originale della coda. Per ridurre al minimo la variabilità, tutti gli embrioni sono stati amputati allo stesso punto di riferimento anatomico immediatamente posteriore alla punta della notocorda, e lo stesso punto di riferimento è stato utilizzato per definire la regione di misurazione tra i diversi gruppi. Le regioni di interesse sono state delineate manualmente in ImageJ sulla base del contorno della coda, e l'analisi è stata eseguita da un ricercatore cieco rispetto ai gruppi di trattamento. Per la quantificazione dell'area positiva per macrofagi, le immagini della fluorescenza GFP di embrioni Tg(mpeg1:GFP) sono state analizzate in ImageJ. La regione di lesione/rigenerazione della coda è stata definita manualmente come regione di interesse utilizzando lo stesso punto di riferimento anatomico impiegato per la misurazione dell'area della coda. Le immagini sono state convertite in scala di grigi a 8 bit e la fluorescenza di fondo è stata sottratta utilizzando le stesse impostazioni di correzione dello sfondo per tutte le immagini all'interno dello stesso esperimento. Successivamente, è stata applicata uniformemente a tutte le immagini all'interno di ciascun esperimento una soglia fissa di fluorescenza per identificare i segnali associati ai macrofagi GFP-positivi. L'area positiva per macrofagi è stata calcolata come area GFP positiva rispetto alla soglia all'interno della ROI definita. Le misurazioni si sono basate sull'area positiva alla fluorescenza piuttosto che sull'intensità della fluorescenza o sul conteggio manuale delle cellule. Tutte le analisi delle immagini sono state eseguite da un ricercatore cieco rispetto ai gruppi di trattamento.
Estrazione dell'RNA e PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)
Al termine del saggio di rigenerazione, gli embrioni di ciascuna condizione sperimentale sono stati raccolti e raggruppati (almeno 20 embrioni per gruppo) per l'analisi dell'RNA. Per ogni condizione, un replicato biologico è costituito da un campione raggruppato contenente almeno 20 embrioni dello stesso gruppo sperimentale. Sono stati preparati tre replicati biologici indipendenti raggruppati per ogni condizione e utilizzati per l'analisi statistica. L'RNA totale è stato isolato dopo omogeneizzazione meccanica in un reagente di estrazione dell'RNA a base di fenolo/guanidina. La qualità e la concentrazione dell'RNA sono state valutate mediante spettrofotometria misurando i rapporti A260/A280. La sintesi del DNA complementare (cDNA) è stata effettuata utilizzando un kit commerciale di trascrizione inversa. L'amplificazione PCR è stata eseguita con reagenti SYBR Green. Le condizioni di termociclaggio per la qRT-PCR sono state le seguenti: denaturazione iniziale a 95 °C per 30 s, seguita da 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 5 s e annealing/estensione a 60 °C per 30 s. Sono stati misurati i livelli di espressione dei geni associati all'apoptosi (caspasi-3 e Bcl-2), all'infiammazione (TNF-α, IL-1β, IL-6, NF-κB1, TLR4, CCL2 e ICAM1) e al fenotipo dei macrofagi (iNOS e arginasi-1). Il gene β-actina è stato utilizzato come gene di riferimento. Le variazioni di espressione genica sono state determinate con il metodo 2−ΔΔCt. Le informazioni sui primer sono riportate in Tabella 1.
Saggi di attività per SOD e CAT
I livelli di SOD e CAT sono stati utilizzati per valutare lo stato antiossidante dopo la lesione della coda. A 48 h dall'amputazione, i pesci zebra di ciascun gruppo sono stati raccolti e omogeneizzati in PBS freddo. Dopo la centrifugazione, gli estratti chiarificati sono stati utilizzati per la misurazione di SOD e CAT mediante kit commerciali per saggi di attività. L'attività della SOD è stata misurata usando un kit per saggio basato sul WST-1, secondo le istruzioni del produttore. I campioni sono stati caricati su piastre per saggi a 96 pozzetti insieme ai campioni standard e l'assorbanza è stata letta con un lettore per micropiastre. Le attività enzimatiche sono state determinate a partire dalle curve standard. Tutti i saggi sono stati eseguiti in triplicato.
Analisi statistica
I dati sono espressi come media ± errore standard della media (SEM) di almeno tre esperimenti indipendenti. Per il saggio di tossicità, ogni esperimento indipendente è costituito da un lotto di embrioni, con 20 embrioni per gruppo e pozzetti in triplicato. Per l'analisi dell'immagine della rigenerazione e dell'immagine dei macrofagi nei zebrafish Tg(mpeg1:GFP), singoli embrioni sono stati utilizzati come unità di misura, e sono stati analizzati 10 embrioni per gruppo. Per l'analisi qRT-PCR, un replicato biologico è costituito da un campione raggruppato contenente almeno 20 embrioni dello stesso gruppo sperimentale, e sono stati analizzati tre replicati biologici raggruppati indipendenti per ogni condizione. Per l'analisi dell'attività SOD e CAT, sono stati analizzati cinque replicati biologici raggruppati indipendenti per ogni condizione. Le differenze tra i gruppi sono state analizzate mediante ANOVA a un fattore con test post hoc di Tukey. Le analisi statistiche sono state eseguite con GraphPad Prism. Le differenze con p < 0,05 sono state considerate significative.
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Determinazione della tossicità e della dose sicura
Per studiare gli effetti della mollugina, abbiamo innanzitutto eseguito test di tossicità. I risultati hanno indicato che la mortalità degli embrioni di pesce zebra è rimasta bassa a concentrazioni fino a 200 µg/mL, mentre è stata osservata un'aumentata mortalità a concentrazioni superiori a 200 µg/mL (Tabella 2). Pertanto, la dose massima sicura è stata stabilita in 200 µg/mL, mentre le dosi bassa e media sono state fissate rispetti...
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In questo studio, abbiamo esaminato gli effetti della Mollugine sulla rigenerazione della coda del pesce zebra. Nell'intervallo di dosi testato, il trattamento con Mollugine è stato associato a un miglior recupero della superficie caudale dopo lesione, insieme a modifiche nell'espressione genica dei geni legati all'apoptosi, nei marcatori infiammatori, nell'attività degli enzimi antiossidanti e nei marcatori associati ai macrofagi.
Il pesce zebra, come modello prominenente per lo studio della ...
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Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Lo studio attuale è stato finanziato dalla Commissione Sanitaria della Provincia di Fujian, Cina (Concessione n. 2022QNA085).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre per coltura cellulare a 6 pozzetti | Corning | 3516 | |
| Kit per saggio della catalasi (CAT) | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
| Cloroformio | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Lettore di micropiastre CMax Plus | Molecular Devices | iD3s | |
| Tampone di Danieau’s – Ca(NO3)2·4H2O | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., Cina | N/A | Concentrazione finale nel tampone di Danieau’s: 0,6 mM. |
| Tampone di Danieau’s – HEPES | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., Cina | N/A | Concentrazione finale nel tampone di Danieau’s: 5 mM; pH regolato a 7,2. |
| Tampone di Danieau’s – KCl | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., Cina | N/A | Concentrazione finale nel tampone di Danieau’s: 0,7 mM. |
| Tampone di Danieau’s – MgSO4·7H2O | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., Cina | N/A | Concentrazione finale nel tampone di Danieau’s: 0,4 mM. |
| Tampone di Danieau’s – NaCl | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., Cina | N/A | Concentrazione finale nel tampone di Danieau’s: 58 mM. |
| Dimetilsulfossido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Mezzo embrionale E3 | Preparato in laboratorio (ricetta standard) | N/A | Ricetta standard. |
| Primer specifici per qPCR (tnfα, il1β, il6, nfkb1, tlr4, ccl2, icam1, inos, arginasi-1, caspasi-3, bcl2, β-actina) | Sangon Biotech | N/A | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | N/A | Versione 8.0. |
| Software ImageJ | Istituti Nazionali di Sanità (NIH) | N/A | Versione 1.52n. |
| Mollugina (≥98%, HPLC) | Sigma-Aldrich | SMB00431 | Composto attivo estratto da Rubia cordifolia, disciolto in DMSO a 40 mg/mL e diluito a 22, 66 e 200 µg/mL nel mezzo E3. |
| Omotenizzatore tissutale motorizzato | IKA, T10 basic ULTRA-TURRAX (o equivalente) | N/A | |
| NovoScript 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix | Novoprotein | abs60077 | |
| Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH 7,4 |
| Sistema di PCR in tempo reale (Archimed X4) | Sansure Biotech Inc. | Archimed X4 | |
| Microcentrifuga refrigerata | SCILOGEX | CF1524R | |
| Punte libere da RNA | Sangon Biotech | F603222-0010 | |
| RNAiso Plus | Takara Bio Inc. | 9109 | Reagente per l'estrazione dell'RNA a base di fenolo/guanidina. |
| Provette microcentrifuga libere da RNasi, 1,5 mL | Axygen / Eppendorf | N/A | |
| Microscopio stereoscopico a fluorescenza SMZ800N | Nikon | SMZ800N | Microscopio stereoscopico a fluorescenza utilizzato per acquisire immagini di larve Tg(mpeg1:GFP) e quantificare l'aggregazione dei macrofagi. |
| Soluzione di ipoclorito di sodio | McLean, USA | N/A | Soluzione lavorativa allo 0,003%. |
| Mix qPCR SYBR Green (2× SYBR qPCR Mix) | Novoprotein | E096 | |
| Stereomicroscopio SZX16 | Olympus | SZX16 | Utilizzato per osservazioni morfologiche, valutazione della tossicità e amputazione della pinna caudale delle larve. |
| Kit per saggio della superossido dismutasi totale (T-SOD) | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-3 | |
| Pesce zebra transgenico Tg (mpeg1:GFP) | Anburui, Fujian, Cina (o colonia interna) | N/A | Linea reporter dei macrofagi. |
| Tricaina metansolfonato (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | Soluzione lavorativa allo 0,03%. |
| Acqua distillata UltraPure priva di DNasi/RNasi | Invitrogen | 10977023 | |
| Pesce zebra selvatico, ceppo CZ98 (Danio rerio) | Anburui, Fujian, Cina | N/A | Embrioni fecondati e larve ottenuti da riproduttori adulti. |
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