Valutare la rigidità intrinseca dell'aorta murina usando la miografia a pernoli: un quadro traslazionale per interrogare l'influenza del mezzo circolante

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per valutare la rigidità intrinseca della parete aortica (modulo elastico) tramite miografia a perni e approcci per esaminare il potenziale ruolo del mezzo circolante nella modulazione della rigidità intrinseca della parete aortica.

Abstract

L'irrigidimento aortico è un fattore di rischio indipendente per malattie cardiovascolari e altre condizioni croniche, tra cui il declino cognitivo, la disfunzione renale, il deficit della vista e la riduzione della funzione glucosio-insulina. In vivo, la rigidità aortica viene comunemente valutata utilizzando tecniche basate su tonometria o ultrasuoni che visualizzano rispettivamente forme d'onda arteriose o segmenti arteriosi longitudinali. Tuttavia, le misurazioni in vivo sono influenzate da molteplici fattori—come la pressione arteriosa e l'input autonomo—che limitano la comprensione meccanicistica su come e perché cambia la rigidità aortica. I modelli murini preclinici, che permettono l'acquisizione diretta di tessuto aortico, offrono un quadro sperimentale unico per valutare sia la rigidità aortica in vivo sia le proprietà meccaniche intrinseche dell'aorta, prive di variabili fisiologiche confondenti. Questi modelli consentono anche l'interrogazione diretta del mezzo circolante (cioè l'accumulo di molecole bioattive circolanti nel flusso sanguigno) e del suo ruolo nel modulare la rigidità aortica attraverso lo spettro traslazionale preclinico a clinico. Le alterazioni nell'ambiente circolante sono emerse come fondamento meccanicistico chiave dell'irrigidimento aortico in numerose condizioni — inclusi l'invecchiamento primario e precoce associato al cancro e alle terapie oncologiche — sia negli studi preclinici che clinici, oltre che nella mediazione degli effetti degli interventi. Questo articolo fornisce una guida passo dopo passo per valutare: (1) la rigidità aortica intrinseca (modulo elastico) nei modelli murini preclinici, e (2) il contributo del milieu circolante (e dei suoi costituenti) all'irrigidimento aortico utilizzando biocampioni sia preclinici che clinici.

Introduzione

L'irrigidimento dell'aorta è un fattore di rischio indipendente per le malattie cardiovascolari e altre malattie^{croniche 1,2}. La valutazione della rigidità aortica in vivo può mancare di risoluzione meccanicistica, dato il processo fisiologico integrativo che regola la rigidità dell'aorta in vivo (ad esempio, pressione sanguigna e input autonomo⁾². Pertanto, la valutazione della rigidità intrinseca aortica (cioè rigidità della parete/modulo elastico dell'aorta) ex vivo tramite miografia a perni consente la possibilità di valutare direttamente la rigidità aortica indipendentemente dalle variabili fisiologiche confondenti². Inoltre, l'uso di un approccio sperimentale ex vivo permette di interrogare potenziali meccanismi molecolari che potrebbero mediare l'irrigidimento della parete aortica. A differenza di altri metodi consolidati per valutare la rigidità arteriosa ex vivo, come la miografia a pressione, il test planare biaxiale e i sistemi miografici ciclici/pulsatili, che si basano sulla modellazione dei sistemi fisiologici (ad esempio, pressione intraluminale ed emodinamica pulsatile), la miografia a perni consente la valutazione diretta della rigidità della parete aortica tramite forza isometrica, in contesti altamente controllati che non richiedono modellazione in vivo.

Il mezzo circolante (cioè l'accumulo di molecole bioattive nel flusso sanguigno), che entra in contatto diretto e frequente con l'aorta, è comunemente alterato in contesti di irrigidimento aortico (ad esempio, invecchiamento cronologico/primario e invecchiamento precoce, come nei sopravvissuti al cancro o nei modelli di sopravvivenza al cancro)^3,4. Abbiamo stabilito, utilizzando biocampioni preclinici (murini) e clinici (umani) (plasma e siero), che il milieu circolante contribuisce direttamente all'irrigidimento aortico sia nel^{primario 4} che nell'invecchiamento^{precoce 3}. Inoltre, abbiamo stabilito un quadro sperimentale per determinare il contributo diretto di alcuni costituenti selezionati all'interno dell'ambiente circolante nella mediazione del loro effetto sull'irrigidimento^{aortico 3,5,6}. Qui, delineiamo e descriviamo gli approcci sperimentali passo dopo passo per valutare la rigidità intrinseca dell'aorta e il contributo del milieu circolante (e dei suoi costituenti) all'irrigidimento aortico utilizzando la miografia a pini e forniamo risultati rappresentativi (con figure e citazioni).

Protocollo

Maschi di topi selvatici C57BL/6J giovani adulti (4 mesi di età) sono stati utilizzati durante tutto lo studio. L'alloggio e le procedure che coinvolgono topi sperimentali sono stati approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) del Campus Medico Universitario del Colorado Anschutz.

1. Preparazione di soluzione fisiologica fisiologica fredda (CPSS)

1. Prepara la soluzione di Rc Ca²⁺ Ringer in 1 L di_{diH 2}O e conserva a 4 °C (Tabella 1).
2. Aggiungere 13,9 g di MOPS in 100 mL di_{diH 2}O per preparare la soluzione di stocco tampone MOPS e conservare a 4 °C.
3. Aggiungere 0,186 g di EDTA in 100 mL di_{diH 2}O per preparare la soluzione di stocco EDTA, pH a 8,0 e conservare a temperatura ambiente.
4. Prepara soluzioni CPSS contenenti stock preparate sopra e le sostanze chimiche elencate di seguito (Tabella 2). Portare il volume totale a 2 L con_{diH 2}O, pH a 7,4 a 34 °C e filtrare CPSS attraverso un filtro ≤ 0,45 μm. Distribuire in tubi conici da 50 mL e conservare a -20 °C.

2. Dissezione dell'aorta del topo (Figura 1, Figura 2 e Figura 3)

1. Anestesiare il topo con isoflurano inalato (2,5%) e posizionare il topo in posizione dorsale reclinata (Figura 1A-C).
2. Una volta che il topo è sotto il piano chirurgico dell'anestesia, si raccoglie sangue eseguendo una puntura cardiaca e completa il metodo di eutanasia secondaria tramite toracotomia bilaterale (Figura 1B–C).
3. Successivamente, rimuovere con attenzione l'aorta dall'arco aortico all'aorta addominale (Figura 1D–F).
4. Inserire l'aorta nel CPSS e rimuovere tutto il tessuto adiposo connettivo e perivascolare utilizzando le Forbici a Molla Vannas Fine Science Tools (2,5 mm) (Figura 2A–E).
5. Tagliare con cura tre segmenti aortici larghi 1 mm nella regione toracica appena sotto l'arco aortico (Figura 3).
6. Posizionare i due segmenti aortici da 1 mm in un tubo da 1,5 mL riempito con CPSS e conservarli a -80 °C fino agli esperimenti di miografia con perno stress-deformazione. Conservare il^{terzo segmento} in modo appropriato per le successive misurazioni istologiche descritte di seguito.

3. Esperimenti di miografia con perno a sforzo e deformazione

NOTA: Il Pin Myography System sarà utilizzato per eseguire test in vitro della rigidità aortica (Figura 4 e Figura 5).

1. Innanzitutto, preriscaldare le camere a 37 °C contenenti circa 6 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e scongelare segmenti aortici congelati di 1 mm.
   NOTA: Soluzioni fisiologiche alternative saline, adeguatamente ossigenate e con pH controllato, possono essere utilizzate come descritto^{in precedenza 7}.
2. Una volta ottenuti 37 °C, si segue il protocollo di calibrazione del produttore.
   1. Posizionare il ponte di calibrazione sul miografo in modo che la barra di bilanciamento a T non tocchi il perno collegato al trasduttore di forza della camera miografia dei perni.
   2. Assicurati che il perno del trasduttore di forza non sia soggetto a alcuna forza. Quando la forza relativa è stabile, si applica un peso di 2 g sul ponte a T in modo che la barra di bilanciamento a T applichi ora ~2 g di forza sul pin del trasduttore di forza.
   3. Confermare che la lettura della forza sia entro 9,71–9,91 mN. Se così fosse, la calibrazione è completa.
3. Determina la lettura di base del micrometro e registra il valore (cioè la lettura iniziale).
   1. Con un endoscopio di dissezione, determinare la distanza micrometrica di base a cui i due perni paralleli sono quasi a contatto (Figura 4).
      NOTA: Non permettere che i due perni si tocchino, poiché ciò potrebbe danneggiare o disturbare il trasduttore di forza all'interno della camera miografica.
4. Al microscopio a dissezione posiziona un segmento aortico di 1 mm sopra i due perni e registra la larghezza del segmento usando micro calibri (Figura 6A). Poi collega l'unità della camera all'interfaccia del sistema di miografia a pin.
   NOTA: Aumentare la larghezza dei perni per esercitare tensione sul segmento dell'aorta mentre si monta l'aorta per fissarla ai due perni, impedendo così che il segmento dell'aorta venga spostato.
5. Se viene applicata una tensione sull'aorta e la camera è stata collegata e montata sul sistema di miografia a perno, si riporta il micro posizionatore alla "posizione iniziale" come determinato nel passo 3.3 sopra.
6. Pre-stretching completo dell'aorta.
   1. Allunga l'aorta aumentando la distanza tra i due perni di 1 mm rispetto alla posizione iniziale del micro-posizionatore (Figura 6B).
   2. Successivamente, rilassa l'aorta riportando i pin alla lettura iniziale del micro-posizionatore. Esegui questa sequenza di stretch-relax tre volte (Figura 6A).
      NOTA: Dopo l'ultima sequenza stretch-relax, il micro posizionatore dovrebbe tornare alla lettura iniziale.
7. Sull'interfaccia del sistema di miografia a pini, zero lettura di forza per ogni camera in uso (Figura 7).
8. Inizia l'esperimento di tensione-detensione.
   1. Aumentare la lettura della forza a circa 1 mN regolando il microposizionatore (Figura 7).
   2. Dopo un equilibrio di forza di ~1 mN (3–5 s), registrare la nuova lettura del micro posizionatore al ~1 mN di forza e registrare la prima lettura di forza.
   3. Aumenta il microposizionatore di 50 μm (cioè 5 click/hash) e lascia che il segmento dell'aorta venga allungato per 3 minuti. Dopo 3 minuti, record force.
   4. Continuare ad aumentare il microposizionatore di 50 μm ogni 3 minuti e registrare la forza fino a raggiungere il "punto di scesa".
      NOTA: Il punto di spasso è la massima quantità di forza generata prima che si verifichi un danno strutturale irreversibile sull'aorta (cioè una lacerazione o una rottura nell'aorta, una significativa diminuzione della forza).
   5. Confermare il punto di sprofondamento allungando l'aorta di altri 50 μm dopo il punto di sprofondo iniziale. Assicurarsi che il valore della forza rimanga diminuito o sia leggermente superiore al punto di snervamento. Se il punto di snervamento non è confermato, si continua con aumenti di 3 minuti fino a raggiungere il punto di snervamento.
   6. Una volta confermata il punto di scesa, gli esperimenti sono completati. Inizia l'analisi ora.

4. Analisi degli esperimenti miografici con perni stress-deformazione per determinare il modulo elastico della regione collagene e elastina

1. Utilizzando le letture di forze ottenute dal miografo, si genera una curva sforzo-deformazione usando le seguenti equazioni:
   Deformazione (λ)=∆d/[d(i)]
   qui d è il diametro e d_i è il diametro iniziale e;
   Tensione (t)=λL/[2(HD)]
   dove L è il carico unidimensionale, H è lo spessore intima del mezzo e D è la lunghezza del vaso. Una volta generate le curve sforzo-deformazione, utilizzale per calcolare le regioni ad alta e bassa forza come descritto in^{precedenza 8,9} (Figura 8).
2. Calcola la regione di alta forza (Regione del Collagene) (Figura 8B).
   1. Determinare il modulo elastico della curva sforzo-deformazione poiché la pendenza della regressione lineare si adatta agli ultimi quattro punti della curva sforzo-deformazione. Per ottenere la misurazione ad alta forza dal grafico tensione-deformazione, segui i passaggi seguenti:
      1. Clicca con il tasto destro su un punto dati sul grafico e seleziona Seleziona dati > Aggiungi > Inserisci nome della serie: Modulo elastico.
      2. Valori della Serie X: Seleziona 4 punti dati dai valori di deformazione. Questi dovrebbero essere i 3 punti quando la forza si avvicina al "punto di slassamento". Assicurati di includere il punto di svolta come quarto punto.
      3. Valori della Serie Y: Seleziona 4 punti dati dai valori di stress. Questi dovrebbero essere i 3 punti quando la forza si avvicina al "punto di slassamento". Assicurati di includere il punto di svolta come quarto punto.
      4. Clicca OK e aggiungi Linea di tendenza > Equazione di visualizzazione lineare > sul grafico > Visualizza il valore R-quadrato sul grafico.
   2. La pendenza dell'equazione è il modulo elastico ad alta forza. Assicurarsi che il valore R-quadrato sia ≥ 0,99 affinché il modulo elastico sia preciso.
3. Calcola la regione di bassa forza (regione dell'elastina) (Figura 8C)
   1. Determinare i confini della regione a dominante elastina (regione a bassa forza dove la curvatura è ~0) della curva sforzo-deformazione adattando un'equazione polinomiale di settimo ordine ai dati (r² > 0,99) e poi calcolando le radici dell'equazione. Si consideri la prima radice, il confine tra la regione a bassissima forza e quella dell'elastina, e la seconda radice, il confine tra la regione dell'elastina e l'inizio dell'impegno delle fibre di collagene.
   2. Poi determina il modulo di elasticità della regione a bassa forza come pendenza di un'equazione lineare adattata ai dati sforzo-deformazione tra le due^{radici 8,9}. Per ottenerlo:
      1. Crea un foglio di calcolo che contenga le colonne come illustrato nella Tabella Supplementare 1.
      2. Trasformalo in un documento "txt" e aprilo nello script R del software "Modulus of Elasticity".
      3. Per utilizzare i dati, si verificano le pendenze normali: il grafo^della terza derivata sull'uscita R dovrebbe avere la forma di "M".
      4. Nella scheda risultati , il valore numerico sotto la colonna Slope è il modulo di elasticità. Assicurati che il valore R-quadrato sia maggiore o uguale a 0,99 affinché il modulo di elasticità sia accurato.
      5. Per ottenere questo valore nel foglio di calcolo, seleziona i valori di deformazione (e i relativi valori di sforzo) tra la prima e la seconda derivata ottenuta dalla scheda dei risultati del codice R .
      6. Segui i passaggi descritti nel passo 4.2 per ottenere l'equazione e il valore di^R2 sul grafico del foglio di calcolo.

5. Valutazione del diametro aortico e dello spessore della parete

1. Inserire l'ultimo segmento aortico di 1 mm in un criomold riempito con composto a temperatura di taglio ottimale (OCT). Orientare l'anello con il lumen piatto e centrato sul fondo dello stampo con l'asse luminale perpendicolare alla superficie di taglio per ottenere sezioni trasversali.
2. Prepara un contenitore di 2-metilbutano raffreddato in azoto liquido e poi immergi il cryomold in freddo 2-metilbutano finché l'OCT non diventa bianco opaco.
3. Conserva il criomold a -80 °C fino alla sezione. Imposta la temperatura del criostato alla temperatura di taglio OCT appropriata (≈-20 °C) e poi monta il blocco congelato sul supporto del campione.
4. Una volta fissato al supporto, si taglia con cura il blocco mantenendo lo spessore a 7 μm finché non appare il tessuto di protezione.
5. Etichettare un vetrino con l'ID del topo e tagliare 4–5 sezioni trasversali del tessuto aortico con uno spessore di 7 μm.
6. Per trasferire il tessuto tagliato sulle vetrine, posizionare tutte le sezioni tagliate sulla fase criostatica (chiamata anche fase del coltello) prima di posizionare direttamente sopra di esse la vetrina etichettata.
7. Una volta completato il trasferimento, si asciuga all'aria lo scivolo.
8. Sezioni dell'immagine con ingrandimento 10x su un microscopio a campo chiaro. Salva le immagini in formato JPG/TIFF con una barra di scala in basso nell'immagine.
9. Per l'analisi, apri ImageJ, vai su File > Open e seleziona l'immagine aortica.
10. Una volta che l'immagine aortica è attiva, zooma nella barra della scala usando l'icona Control + + e poi usa lo strumento linea per misurare la lunghezza della barra della scala. Per popolare il risultato, premi Control + M. La misura calcolata sotto la lunghezza è la misurazione della barra della bilancia.
11. Per calibrare il software, vai su Analizza > imposta scala. Per la distanza in pixel, inserisci la lunghezza della linea calcolata da ImageJ nel passo 8. Per la distanza nota inserisci la lunghezza effettiva della barra della scala e, sotto le unità di unità di misura (μm, mm, cm, ecc.).
12. Seleziona la casella globale per calibrare automaticamente tutte le immagini successive. Si noti se la barra di scala nelle altre immagini differisce o se ImageJ è chiusa; in tal caso, è necessaria una ricalibrazione.
13. Per lo spessore della parete, usa lo strumento a linea retta e traccia una linea perpendicolare dal bordo luminale al bordo esterno dell'avventizia. Premi Control + M per compilare automaticamente la lunghezza nella scheda risultati.
14. Ripeti il passo 5.13 per eseguire misurazioni in 6 posizioni equidistanti attorno alla circonferenza dell'aorta e registra ogni valore.
15. Per calcolare lo spessore medio per aorta del topo, si fa la media di tutti gli spessori ottenuti da 4–5 campioni dello stesso topo.
16. Per misurare il diametro luminale, seleziona lo strumento poligonale e traccia il bordo luminale interno in senso orario. Registra il perimetro (μm) premendo Control + M.
17. Ripeti il tracciamento in senso antiorario, partendo da un punto diverso. Assicurati che i due valori di circonferenza siano vicini e mediali per quell'anello aortico.
18. Ripeti il passo 5.16 per i 4–5 campioni aortici dello stesso topo e fai la media di tutti i valori di circonferenza.
19. Per calcolare il diametro, si usa l'equazione: Diametro (μm) = Perimetro/3,14.

6. Modulo elastico aortico mediato dal mezzo circolante

NOTA: Per determinare se fattori circolanti o composti specifici alterano la rigidità aortica intrinseca, gli anelli aortici toracici provenienti da topi ingenui interventi possono essere incubati ex vivo in condizioni di coltura standard definite (37 °C, 5% CO₂, 20%_O2, umidificato) (Figura 9).

1. Dissezionare l'aorta toracica e tagliare due segmenti di anello da 1 mm per ogni condizione. Rimuovere tutto il tessuto adiposo perivascolare.
2. In una piastra a 96 pozzi, incubare gli anelli aortici in mezzi standard, che consistono in DMEM + 1% di penicillina-estreptomicina.
3. Aggiungi trattamenti sperimentali ai media. Per plasma o siero (si può usare plasma/siero non trattato per questo), usa il 10% del volume totale del mezzo. Utilizzare plasma o siero preclinico e clinico ^{(umano) 3,4,6} (Figura 9).
4. Per stabilire il ruolo causale di un fattore circolante dimostrato diverso tra i gruppi di studio, si ripete l'esposizione plasma/sierica correggendo contemporaneamente la differenza osservata di concentrazione tra i gruppi (cioè normalizza la concentrazione del fattore di interesse), determinare l'effetto diretto del fattore di interesse a una concentrazione che rappresenta la differenza media tra i gruppi, oppure bloccare la segnalazione del fattore che si ritiene sia responsabile della mediazione dell'effetto dell'ambiente circolante.
   NOTA: Gli ultimi due approcci erano stati precedentemente eseguiti, rispettivamente, con Trimetilamina-N-Ossido (TMAO⁾⁵ e con blocco del recettore per i prodotti finali di glicazione^{avanzati 3}.
5. Per chiarire il ruolo dello stress ossidativo correlato in eccesso al superossido o dei mitocondri-
   nello stress ossidativo specifico correlato al superossido in questo sistema modello, si utilizzano le seguenti rispettive concentrazioni durante l'incubazione degli anelli aortatici: TEMPOL: 1 μM ^5,10 e MitoQ: 1 μM⁶.
6. Dopo 48–72 ore di incubazione, carichi gli anelli aortici nel miografo a perno e segui i passaggi sopra descritti.

Risultati

Irrigidimento aortico legato all'età

Per la rigidità meccanica intrinseca, la forza corrispondente a ogni intervallo di stiramento viene registrata e utilizzata per i calcoli. Nei calcoli precedentemente discussi, si generano curve stress-deformazione e si calcola il modulo elastico per la 1) regione del collagene e/o 2) la regione elastina di queste curve, come descritto sopra e originariamente mostrato da Gioscia-Ryan et^al...

Discussione

L'uso della miografia a perni per la valutazione della rigidità intrinseca aortica ex vivo offre l'opportunità di valutare la rigidità intrinseca aortica indipendentemente da variabili fisiologiche in vivo potenzialmente confondenti, come pressione sanguigna e input^{autonomo 2}. Inoltre, questo approccio sperimentale ex vivo offre l'opportunità di analizzare potenziali meccanismi molecolari che potrebbero essere alla base delle differenze ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2-metilbutano	Fisher Scientific	AA19387AP
BSA	Fisher Bioreagents	BP1600
Cloruro di calcio diidrato	Sigma-Aldrich	C7902
Cryomold	Fisher Scientific	NC9511236
D-(+)-Glucosio (Dextrosio)	Sigma-Aldrich	G7021
DMEM	Fisher Scientific	MT10017CV
EDTA (A.C.S.)	Fisher Chemical	E478
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Solfato di magnesio eptaidrato	Sigma-Aldrich	M2773
MitoQ	Cayman Chemical	845959-50-4
Fosfato monosodico	Sigma-Aldrich	S5011
MOPS (sale Na)	Sigma-Aldrich	M9024
Sistema di miografia Multi Pin	Danish Myo Technology (DMT)	620M
NaCl	Fisher Chemical	S271
Penicillina-streptomicina	Fisher Scientific	15-140-148
Anticorpo RAGE	R&D System	AF1145
Piruvato di sodio	Sigma-Aldrich	P2256
TEMPOL	Sigma-Aldrich	2226-96-2
Composito Tissue-tek OCT	Sakura	4583
Trimetilammina N-ossido (TMAO)	Sigma Aldrich	317594