Associazione dell'espressione di MPO con il microambiente immunitario nel cancro al seno: approfondimenti da analisi bioinformatiche e a singola cellula

Sommario

Questo articolo presenta un flusso di lavoro bioinformatico e su singola cellula riproducibile per esplorare le associazioni tra l'espressione della mieloperossidasi (MPO) e le caratteristiche immunitarie/mieloidi nel cancro al seno. Poiché le analisi si basano su set di dati pubblici e metodi in silico, i risultati vengono interpretati come esplorativi e generativi di ipotesi.

Abstract

Il cancro al seno rimane una delle principali cause di mortalità correlata al cancro, e flussi di lavoro computazionali esplorativi possono aiutare a individuare marcatori associati al sistema immunitario per ulteriori indagini. In questo studio, abbiamo utilizzato i dati trascrittomici di tipo bulk del tumore mammario invasivo dell'atlante del genoma del cancro (TCGA-BRCA) e il dataset pubblico a singola cellula GSE161529 per esaminare le associazioni tra l'espressione della mieloperossidasi (MPO), gli esiti clinici, l'infiltrazione immunitaria, la metilazione, le annotazioni dei regolatori a monte, i profili di espressione a singola cellula, i risultati della sensibilità alla silenziamento virtuale, il recupero delle interazioni farmaco-gene e le annotazioni relative all'assorbimento, distribuzione, metabolismo, escrezione e tossicità (ADMET). L'espressione di MPO risultava inferiore nei tessuti tumorali rispetto ai tessuti non tumorali adiacenti. Un'espressione più elevata di MPO era associata a un intervallo libero da progressione più lungo, mentre le associazioni con la sopravvivenza globale e la sopravvivenza specifica per la malattia non risultavano statisticamente significative. L'analisi della curva ROC (receiver operating characteristic) ha suggerito una separazione tra tessuto tumorale e tessuto normale all'interno del dataset pubblico analizzato, ma questo risultato non deve essere interpretato come una validazione diagnostica clinica. Le analisi di deconvoluzione immunitaria e di arricchimento hanno indicato che l'espressione di MPO era principalmente associata a caratteristiche trascrittionali legate al sistema immunitario e alle cellule mieloidi, piuttosto che a una regolazione intrinseca del microambiente immunitario da parte del tumore. A risoluzione di singola cellula, il segnale di MPO risultava scarso, con soli 85 cellule positive a MPO rilevate prima dell'espansione del vicinato basata sui k-vicini più prossimi (KNN). Il segnale di MPO rilevabile e i punteggi ad esso associati sono stati interpretati con cautela, poiché potrebbero essere influenzati dall'espressione scarsa, dall'incertezza nell'annotazione del tipo cellulare, dai dropout, dai doppietti o dall'RNA ambientale. In silico L'analisi di silenziamento virtuale ha suggerito possibili alterazioni trascrizionali associate a processi immunitari e infiammatori, ma questi risultati sono stati considerati esplorativi e richiedono validazione. Il recupero di interazioni farmaco-gene basato sul database Drug-gene Interaction Database (DGIdb) e l'annotazione ADMET sono stati utilizzati esclusivamente come annotazioni chimiche preliminari e non sono stati interpretati come evidenza terapeutica. Nel complesso, questo studio fornisce un flusso di lavoro in silico riproducibile per generare ipotesi riguardo alle caratteristiche immunitarie/mieloidi associate a MPO nel cancro della mammella, che richiedono validazione in coorti esterne e conferma sperimentale.

Introduzione

Il cancro al seno è una neoplasia fortemente eterogenea correlata al sistema immunitario¹. L'evoluzione della malattia, il rischio di recidiva e di metastasi e la risposta al trattamento sono strettamente associati alla composizione e allo stato funzionale del microambiente immunitario tumorale (TIME)². Nonostante l'ottimizzazione in corso delle strategie terapeutiche comprehensive, alcuni pazienti presentano comunque progressione o recidiva, evidenziando l'urgente necessità di identificare biomarcatori molecolari in grado di caratterizzare lo stato del TIME e supportare la stratificazione del rischio, chiarificandone al contempo i meccanismi sottostanti.

La mieloperossidasi (MPO) è una perossidasi contenente eme espressa principalmente nei neutrofili e, in misura minore, nei monociti e nei macrofagi. Mediante la produzione di acido ipocloroso e altri ossidanti reattivi, la MPO contribuisce alla difesa antimicrobica ma può anche favorire lesioni tissutali ossidative e infiammazione cronica. Nel cancro, il significato biologico della MPO sembra dipendere dal contesto³. Da un lato, lo stress ossidativo mediato dalla MPO è stato implicato nella carcinogenesi e nella progressione tumorale attraverso danni al DNA, ossidazione di lipidi e proteine, segnalazione infiammatoria e rimodellamento del microambiente tumorale^4,5,6. Dall'altro lato, l'infiltrazione di cellule innate immunitarie o mieloidi positive per la MPO è stata associata a una prognosi favorevole o a un'attività immunitaria antitumorale in determinati contesti tumorali^7,8,9. Questi risultati apparentemente contrastanti suggeriscono che il significato clinico e biologico della MPO potrebbe dipendere dal tipo di tumore, dalla fase della malattia, dalla fonte cellulare della MPO e dalla composizione immunitaria del microambiente tumorale. Tuttavia, il profilo di espressione e il rilevato prognostico della MPO nel cancro al seno, in particolare a livello di singola cellula, non sono ancora completamente caratterizzati.

L'ambiente immunitario tumorale (TIME) contiene compartimenti eterogenei di origine mieloide, linfoidi, stromali ed epiteliali¹⁰. La MPO è classica associata ai neutrofili e ad altre cellule della linea mieloide, e i segnali correlati alla MPO nei profili tumorali complessivi possono quindi riflettere la composizione delle cellule immunitarie piuttosto che l'attività intrinseca delle cellule tumorali¹⁰. Nel cancro al seno, la distribuzione del segnale MPO nei dati complessivi e a singola cellula, la sua associazione con le stime di infiltrazione immunitaria e i limiti di riproducibilità delle analisi computazionali successive rimangono insufficientemente caratterizzati. Questo studio tratta pertanto la MPO come un marcatore associato all'immunità per lo sviluppo di un flusso di lavoro esplorativo, e non come un regolatore causale dimostrato del TIME o un bersaglio terapeutico validato. Rispetto alle analisi differenziali di espressione su un singolo coorte o alle stime di infiltrazione immunitaria basate su una singola piattaforma, un flusso di lavoro integrato che combini trascrittomica complessiva, deconvoluzione immunitaria, annotazione della metilazione, mappatura a singola cellula e perturbazione computazionale può fornire una visione esplorativa più ampia del contesto immunitario associato al gene. Questo approccio è utile per prioritizzare marcatori candidati e generare ipotesi verificabili, specialmente quando i dataset sperimentali non sono ancora disponibili. Tuttavia, tale integrazione computazionale non può da sola determinare la sorgente cellulare, la causalità, l'attività farmacologica o l'utilità clinica. Con il progresso dei grandi coorti pubblici sul cancro e delle tecnologie trascrittomiche a singola cellula, gli approcci di bioinformatica possono essere utilizzati per esplorare le associazioni tra espressione genica, esiti clinici, composizione delle cellule immunitarie e stati trascrizionali a livello di popolazione e a singola cellula¹¹. Metodi di perturbazione computazionale basati su reti regolatorie geniche a singola cellula possono inoltre fornire informazioni generatrici di ipotesi riguardo alla sensibilità trascrizionale associata al gene^12,13. Pertanto, questo studio ha avuto come obiettivo caratterizzare il profilo di espressione, l'associazione con la sopravvivenza, il contesto immunitario/mieloide, il profilo di metilazione, la distribuzione a singola cellula e il profilo esplorativo di perturbazione computazionale della MPO nel cancro al seno. Il flusso di lavoro complessivo è mostrato in Figura 1.

Protocollo

Acquisizione dal database TCGA

I dati di sequenziamento dell'RNA e le informazioni cliniche per il gruppo di carcinoma mammario invasivo del TCGA (TCGA-BRCA) sono stati ottenuti dal portale Genomic Data Commons¹⁴. I dati RNA-seq del flusso di lavoro STAR nel formato di trascritti per milione (TPM) sono stati estratti insieme alle annotazioni cliniche corrispondenti. Sono stati esclusi i campioni di RNA-seq privi di informazioni cliniche associate. Per le analisi basate sull'espressione, i valori TPM sono stati trasformati come log2(TPM + 1). L'espressione di MPO è stata estratta utilizzando il simbolo genico MPO e l'ID genico Ensembl ENSG00000005381.8. Per le analisi che richiedevano il raggruppamento in MPO-alto e MPO-basso, sono stati inclusi solo i campioni tumorali TCGA-BRCA, mentre i campioni normali adiacenti sono stati esclusi dall'assegnazione al gruppo. I campioni tumorali sono stati suddivisi in base al valore mediano dell'espressione di MPO, trasformata in log2(TPM + 1), tra i campioni tumorali TCGA-BRCA. I campioni con espressione di MPO maggiore o uguale alla mediana sono stati assegnati al gruppo MPO-alto, mentre i campioni al di sotto della mediana sono stati assegnati al gruppo MPO-basso. Questa strategia di raggruppamento basata sulla mediana è stata utilizzata per l'analisi della sopravvivenza, l'analisi dell'espressione differenziale, l'analisi di arricchimento, il raggruppamento per metilazione e i confronti di arricchimento delle cellule immunitarie, salvo diversa indicazione. Le caratteristiche clinico-patologiche, compresi sesso, età, etnia, stadio patologico T, grado istologico, sottotipo PAM50, stadio patologico, stato del tumore e endpoint di sopravvivenza, inclusa la sopravvivenza globale (OS), l'intervallo libero da progressione (PFI) e la sopravvivenza specifica per malattia (DSS), sono state analizzate utilizzando R versione 4.2.1.

Ricerca di immagini pubbliche di immunoeistochemia

Immagini rappresentative di immunoeistochemia (IHC) per MPO di tessuto mammario normale adiacente e di tessuto di cancro al seno sono state utilizzate come riferimenti qualitativi a livello proteico. Queste immagini non sono state incluse in analisi morfometriche quantitative o in analisi statistiche. Le aree racchiuse in box indicano le regioni mostrate a ingrandimento maggiore. Le barre della scala indicano 100 µm nelle immagini a 20× e 50 µm nelle immagini a 40×.

Analisi della correlazione di espressione

Il set di dati TCGA-BRCA è stato utilizzato per esaminare i geni che variano concomitantemente all'espressione di MPO nel cancro al seno. Sono stati calcolati i coefficienti di correlazione di Pearson a livello genoma intero tra MPO e i geni codificanti proteine, e sono stati selezionati i 30 geni con correlazione positiva più elevata e i 30 geni con correlazione negativa più elevata per la visualizzazione. Per le analisi di correlazione che coinvolgono multipli geni testati, i valori p nominali sono stati corretti utilizzando il metodo Benjamini-Hochberg per il tasso di scoperta di falsi positivi. La rete di interazione proteina-proteina (PPI) associata a MPO è stata costruita utilizzando il database STRUMENTO DI RICERCA PER IL RECUPERO DI GENI/PROTEINE INTERAGENTI (STRING), mantenendo le coppie di proteine con punteggi di interazione superiori a 0,40 per la visualizzazione¹⁵.

Analisi di arricchimento funzionale

I geni differenzialmente espressi (DEG) sono stati identificati confrontando i gruppi tumorali MPO-alto e MPO-basso di TCGA-BRCA utilizzando soglie di |log2FC| > 1 e un valore p aggiustato con il metodo di Benjamini-Hochberg < 0,05. L'analisi di arricchimento funzionale dei DEG è stata eseguita utilizzando il pacchetto R clusterProfiler versione 4.4.4, comprendente analisi dei processi biologici, componenti cellulari e funzioni molecolari dell'ontologia genica (GO), nonché analisi dei percorsi dell'Enciclopedia di Kyoto dei geni e dei genomi (KEGG)^{16,17,18,19,20}. I termini GO e KEGG risultati arricchiti sono stati considerati significativi quando il valore p aggiustato era < 0,05.

È stata eseguita un'analisi di arricchimento di set di geni (GSEA) utilizzando un elenco di geni preordinati basato su statistiche di espressione differenziale tra i gruppi MPO-alto e MPO-basso. È stata utilizzata la raccolta di percorsi canonici C2 di MSigDB c2.cp.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt, corrispondente a MSigDB v2022.1.Hs e contenente 3.050 set di geni^21,22. I termini arricchiti sono stati considerati significativi in base al valore p aggiustato con il metodo di Benjamini–Hochberg < 0,05, valore q FDR < 0,25 e |punteggio di arricchimento normalizzato| > 1. Ove applicabile, i punteggi Z per i termini significativamente arricchiti sono stati calcolati utilizzando il pacchetto GOplot per la visualizzazione.

Analisi dell'arricchimento di cellule immunitarie nei tumori

I componenti immunitari e stromali nella coorte TCGA-BRCA sono stati valutati utilizzando l'algoritmo ESTIMATE implementato nel pacchetto R estimate versione 1.0.13. Sono stati utilizzati come input dati di espressione trasformati in log2(TPM + 1) e sono stati calcolati, per ogni campione tumorale, il punteggio immunitario, il punteggio stromale e il punteggio ESTIMATE. TIMER/TIMER2.0 è stato utilizzato per valutare le associazioni tra l'espressione di MPO e i livelli stimati di infiltrazione delle principali popolazioni di cellule immunitarie nella coorte TCGA-BRCA, inclusi linfociti B, linfociti T CD8+, linfociti T CD4+, macrofagi, neutrofili e cellule dendritiche^23,24,25. I risultati basati su TIMER sono stati interpretati come stime dell'infiltrazione immunitaria derivate dalla corrispondente risorsa online. Per l'analisi di arricchimento delle cellule immunitarie su 24 tipi di cellule immunitarie, è stata implementata l'analisi di arricchimento dei set genici su singolo campione (ssGSEA) utilizzando il pacchetto R GSVA versione 1.46.0²⁶. La matrice delle firme immunitarie LM22 utilizzata per la deconvoluzione basata su CIBERSORT di 22 tipi di cellule immunitarie è riportata in Tabella Supplementare 1. Le correlazioni tra l'espressione di MPO e i punteggi di arricchimento delle cellule immunitarie sono state valutate mediante il coefficiente di correlazione di Spearman. Le differenze nei punteggi di arricchimento delle cellule immunitarie tra i gruppi tumorali con MPO alto e MPO basso, definiti in base alla mediana, sono state confrontate utilizzando il test della somma dei ranghi di Wilcoxon. Per le analisi che coinvolgono più tipi di cellule immunitarie, i valori p sono stati corretti mediante il metodo Benjamini–Hochberg per il tasso di falsa scoperta.

Metilazione del DNA del gene MPO

I modelli di metilazione del DNA all'interno del locus MPO sono stati valutati utilizzando MethSurv. I valori beta di metilazione dei siti CpG e le associazioni con la sopravvivenza per TCGA-BRCA sono stati ottenuti dalla piattaforma MethSurv. I siti CpG relativi a MPO selezionati sono stati visualizzati e le loro associazioni con gli esiti di sopravvivenza sono state valutate mediante gli output dell'analisi di sopravvivenza forniti da MethSurv²⁷. Per le analisi che coinvolgevano più siti CpG, i valori p sono stati corretti su tutti i siti CpG relativi a MPO testati utilizzando il metodo Benjamini-Hochberg per il tasso di scoperte false. Queste analisi di metilazione sono state interpretate come annotazioni epigenetiche esplorative.

Costruzione della rete PPI e analisi della correlazione dei geni associati ai neutrofili

Per esaminare l'associazione tra MPO e la biologia correlata ai neutrofili, è stata effettuata un'analisi di rete sistematica. Un insieme genico comprendente mediatori accertati dell'attivazione dei neutrofili e dei processi infiammatori associati è stato selezionato dalla letteratura scientifica recente. L'elenco completo dei geni correlati ai neutrofili è riportato nella Tabella Supplementare 2. I simboli genici sono stati uniformati ai simboli ufficiali, sono state rimosse le voci duplicate ed i geni disponibili sono stati incrociati con la matrice di espressione TCGA-BRCA prima dell'analisi STRING/PPI, della priorizzazione dei geni hub e dell'analisi di correlazione tra MPO e geni hub. La rete di interazioni proteina-proteina (PPI) tra questi geni è stata costruita utilizzando il database STRING (versione 11.5) con una soglia media di punteggio di interazione (>0.40). I geni hub all'interno di questa rete sono stati prioritizzati in modo algoritmico in base alla centralità di grado, che quantifica il numero di interazioni dirette per ogni nodo. I primi 20 geni con i punteggi di grado più elevati sono stati selezionati per l'analisi di correlazione successiva.

Successivamente, i profili di espressione di questi geni hub e della MPO sono stati estratti dal dataset trascrittomico TCGA-BRCA. L'associazione tra la MPO e ciascun gene hub è stata valutata statisticamente mediante correlazione rank di Spearman. Per caratterizzare i modelli di correlazione tra i geni hub stessi, è stata calcolata una matrice di correlazione di Spearman a coppie su tutti i campioni tumorali. Queste analisi di correlazione hanno fornito la base quantitativa per le visualizzazioni successive, incluse il grafico a lecca-lecca delle correlazioni tra MPO e geni hub e il diagramma a corde/mappa termica che rappresenta i modelli di correlazione tra geni hub.

Predizione di fattori di trascrizione e miRNA a monte che bersagliano MPO

Il database KnockTF (https://bio.liclab.net/KnockTF/index.php)^28,29, il database ChIP (http://chip-atlas.org/)^30,31 e il database GTRD^32,33 (https://gtrd.biouml.org/#!) sono stati utilizzati per prevedere i fattori trascrizionali bersaglio di MPO. Inoltre, il database TargetScan (https://www.targetscan.org/vert_80/) è stato impiegato per prevedere potenziali siti di legame per miRNA che bersagliano MPO. I diagrammi di Venn sono stati generati utilizzando il sito web MicroBioinformatics (https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html)³⁴.

Analisi a singola cellula di MPO

Il set di dati specifico GSE161529 proviene da Gene Expression Omnibus (GEO). La pre-elaborazione dei dati ha innanzitutto eseguito un filtraggio a livello cellulare per escludere le cellule di bassa qualità—quelle che soddisfano uno dei seguenti criteri: espressione genica mitocondriale superiore al 25%, conteggio totale di identificatori molecolari unici (UMI) inferiore a 5000 o meno di 2500 geni rilevati. Successivamente, sono state corrette la contaminazione da RNA ambientale e le variazioni tecniche dovute ai lotti sperimentali³⁵. È stata eseguita un'analisi delle componenti principali (PCA) per la riduzione della dimensionalità al fine di valutare la similarità cellulare, seguita da UMAP per il raggruppamento e la visualizzazione delle cellule. Quindi, in base ai geni marcatore tipici delle cellule, i diversi cluster sono stati annotati come tipi cellulari¹¹. L'insieme di geni associati a MPO utilizzato per il punteggio di firma a singola cellula è fornito nel File Supplementare 1. Prima del calcolo del punteggio, i simboli genici sono stati armonizzati con i simboli ufficiali, sono state rimosse le voci duplicate e i geni disponibili sono stati incrociati con la matrice di espressione di GSE161529. Sono stati utilizzati AUCell, Seurat AddModuleScore e ssGSEA per calcolare i punteggi associati a MPO per ogni cellula. I punteggi ottenuti dai tre metodi sono stati normalizzati con il punteggio Z, scalati in un intervallo comparabile e integrati per generare un punteggio composito associato a MPO per le analisi descrittive successive. Le reti di interazione tra cellule sono state analizzate per confrontare i modelli di comunicazione ligando-recettore inferiti che coinvolgono cellule tumorali epiteliali stratificate in base al segnale associato a MPO e diversi tipi cellulari partner. Questi risultati sono stati interpretati come modelli descrittivi di comunicazione piuttosto che come prova che le cellule che esprimono MPO mediano direttamente la comunicazione intercellulare.

Knockdown virtuale a singola cellula di MPO e analisi di arricchimento del percorso mediante scTenifoldKnk

Il silenziamento virtuale a livello di singola cellula del gene MPO è stato eseguito integrando Seurat e scTenifoldKnk. Dopo un controllo di qualità standard (200–6.000 geni per cellula; frazione mitocondriale < 10%), i dati sono stati normalizzati mediante logaritmo e sono stati selezionati 2.000 geni altamente variabili per la riduzione della dimensionalità e il clustering. Per arricchire i contesti rilevanti per MPO, sono state mantenute le cellule con punteggi compresi nel 50% superiore per un modulo genico mieloide/neutrofilo. A partire da queste cellule, un sottoinsieme prossimo a MPO è stato definito espandendo a partire da semi positivi per MPO utilizzando k = 40 vicini più prossimi nello spazio PCA. Il sottoinsieme espanso non è stato considerato una popolazione pura di cellule positive per MPO, e nessuna conclusione riguardo alle proporzioni dei tipi cellulari è stata tratta da questo passaggio di espansione KNN. Questo sottoinsieme è stato sottoposto ad analisi di silenziamento virtuale tramite scTenifoldKnk, utilizzando l'unione dei geni altamente variabili e di MPO (espresso in ≥25 cellule) come insieme genico. Sono stati identificati geni significativamente perturbati (FDR < 0,05, corretto con metodo BH). I geni risultanti sono stati ulteriormente analizzati per l'arricchimento funzionale nei processi biologici GO e nei percorsi KEGG (q < 0,05).

Ricerca esplorativa di interazioni farmaco-gene e annotazione ADMET

È stato interrogato DGIdb per ottenere registrazioni preliminari di interazioni farmaco-gene o chimico-gene associate a MPO. Poiché gli elenchi di interazioni derivati da database possono includere voci supportate da tipi eterogenei di evidenze e potrebbero non corrispondere direttamente ad agenti terapeutici clinicamente utilizzabili, i composti recuperati sono stati considerati come annotazioni esplorative piuttosto che come candidati terapeutici prioritari. Successivamente, SwissADME e ADMETlab sono stati utilizzati per riassumere le proprietà fisico-chimiche, farmacocinetiche e tossicologiche previste. Queste annotazioni in silico sono state impiegate per fornire un contesto preliminare all'interpretazione a livello di composto e per evidenziare la necessità di ulteriori analisi farmacologiche, tossicologiche e cliniche prima che possa essere valutata qualsiasi rilevanza terapeutica³⁶.

Risultati

Patterni di espressione di MPO e associazioni esplorative con la sopravvivenza nel cancro al seno

Per descrivere i modelli di espressione della MPO nei dataset sul cancro, abbiamo analizzato i dati di RNA-seq della MPO provenienti dal dataset pan-cancro del TCGA, osservando un'espressione più bassa della MPO nei tessuti tumorali di carcinoma uroteliale della vescica (BLCA), carcinoma mammario invasivo (BRCA), glioblastoma multiforme (GBM), carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (HNSC), cromofobo renale (KICH), carcinoma epatocellulare (LIHC), adenocarcinoma polmonare (LUAD), carcinoma a cellule squamose del polmone (LUSC), adenocarcinoma del pancreas (PAAD), adenocarcinoma prostatico (PRAD) e carcinoma della tiroide (THCA), e un'espressione più elevata della MPO nell'adenocarcinoma del colon (COAD), nel carcinoma papillare renale (KIRP) e in altri tessuti (Figura 2A). Abbiamo quindi valutato le associazioni tra l'espressione della MPO e gli esiti clinici per ciascun tipo di cancro. Nel coorte TCGA-BRCA, sia i confronti non appaiati che quelli appaiati hanno mostrato un'espressione della MPO più bassa nei tessuti tumorali rispetto ai tessuti normali/adiacenti (Figura 2B,C). Dopo aver stratificato i campioni tumorali del TCGA-BRCA utilizzando la soglia mediana dell'espressione tumorale della MPO, l'analisi di Kaplan-Meier ha mostrato che i pazienti con espressione più elevata della MPO presentavano un intervallo libero da progressione più lungo (Hazard Ratio (HR) = 0,67, p = 0,028) (Figura 2D). La sopravvivenza complessiva (OS) (p = 0,296; Figura supplementare 1A) e la sopravvivenza specifica per malattia (DSS) (p = 0,18; Figura supplementare 1B) non sono risultate statisticamente significative. La curva ROC tumore-versus-normale ha suggerito una separazione tra i gruppi di tessuti in questo dataset (Figura 2E), ma questa analisi non deve essere interpretata come una validazione diagnostica clinica. Questa discriminazione esplorativa potrebbe essere influenzata dall'origine del campione normale, dagli effetti di batch, dalla purezza tumorale e dalle differenze nella composizione tissutale. L'espressione della MPO era inoltre associata allo stadio patologico T (Figura 2F) e alla distribuzione del sottotipo PAM50 (Figura 2G). Sono state incluse immagini rappresentative di immunoeistochimica (IHC) per la MPO di tessuto mammario normale adiacente e di tessuto tumorale della mammella come riferimenti qualitativi a livello proteico (Figura 2H). Le aree racchiuse in box indicano le regioni mostrate a ingrandimento maggiore. Le immagini di panoramica a 20× includono barre della scala di 100 µm, mentre le immagini ad alto ingrandimento a 40× includono barre della scala di 50 µm.

Analisi di correlazione e di arricchimento di MPO nella coorte TCGA-BRCA

L'analisi della correlazione di Pearson ha identificato i primi 30 geni positivamente correlati con MPO, che mostravano un'upregolazione coordinata lungo il gradiente di espressione di MPO (Figura 3A), mentre i primi 30 geni negativamente correlati mostravano un andamento inverso dell'espressione (Figura 3B). A livello di pathway, l'espressione di MPO era significativamente e positivamente associata a diversi punteggi di firma legati al tumore, inclusi il punteggio della firma della risposta infiammatoria (r = 0.41; Figura 3C), i marcatori di EMT (r = 0,264; Figura 3D) e il punteggio dell'insieme genico legato alle specie reattive dell'ossigeno (ROS) (r = 0,415; Figura 3E), suggerendo che l'espressione di MPO si associa a stati trascrittionali infiammatori/ossidativi e a fenotipi simili ai mesenchimali nel coorte TCGA-BRCA.

Il clustering non supervisionato dei geni associati a MPO ha ulteriormente stratificato i tumori in modelli di espressione allineati alle annotazioni cliniche, inclusi lo stadio patologico T e i sottotipi intrinseci PAM50 (Figura 3F). Per esplorare una possibile connettività tra i geni associati a MPO, abbiamo costruito una rete di interazione proteina-proteina (PPI) utilizzando STRING, rivelando un modulo interconnesso tra diversi geni correlati a MPO (Figura 3G). All'interno della rete PPI, ESR1, FOXA1, XBP1, GATA3 e KRT18 mostravano un'elevata connettività nella rete all'interno di questo modulo derivato dalla correlazione. Questi risultati identificano geni che variano concomitantemente con l'espressione di MPO, ma non stabiliscono la patogenesi legata a MPO né la direzionalità delle relazioni. L'analisi dell'espressione differenziale tra i gruppi MPO-alto e MPO-basso ha rivelato differenze trascrittomiche riassunte nel grafico a vulcano (Figura 3H). Sono stati identificati complessivamente 1.159 geni upregolati e 854 geni downregolati, fornendo dati di input per analisi di arricchimento successive.

Abbiamo successivamente analizzato la rilevanza funzionale dei geni differenzialmente espressi (DEG) tra i gruppi MPO-alto e MPO-basso utilizzando il pacchetto clusterProfiler in R. L'analisi dell'arricchimento nell'ontologia genica (GO) ha indicato che questi DEG erano principalmente coinvolti in processi biologici legati al sistema immunitario, inclusa la regolazione della segnalazione mediata da recettori di superficie cellulare associati alla risposta immunitaria e l'immunità mediata da linfociti, con un arricchimento osservato anche in componenti cellulari come il complesso del recettore per linfociti T e funzioni molecolari relative all'attività di attivazione del recettore (Figura 4A). In modo coerente, l'analisi dei percorsi KEGG ha evidenziato vie associate all'immunità e all'infiammazione, tra cui l'interazione citochina-recettore per citochine, la segnalazione chemochinica, la segnalazione del recettore per linfociti T, la citotossicità mediata da cellule natural killer, la differenziazione Th1/Th2 e Th17, la segnalazione NF-κB, le immunodeficienze primarie e la rete immunitaria intestinale per la produzione di IgA (Figura 4B).

Per integrare ulteriormente la direzionalità dell'espressione con i termini funzionali, il grafico GO è stato utilizzato per calcolare i punteggi Z a livello di termine basati sui valori |log2FC| dei geni differenzialmente espressi (DEG), evidenziando nuovamente programmi trascrizionali arricchiti per funzioni immunitarie, come risposta immunitaria umorale, immunità mediata da leucociti/linfociti, attivazione della risposta immunitaria e trasduzione del segnale (Figura 4C). L'analisi di arricchimento dei set di geni (GSEA) basata sulla lista ordinata di geni ha mostrato inoltre un arricchimento di vie del sistema immunitario, tra cui sistema immunitario adattativo, interazione citochina–recettore della citochina e degranulazione dei neutrofili (Figura 4D–G). Poiché MPO è un gene associato ai mieloidi/neutrofili, questi arricchimenti vengono interpretati come evidenza che i campioni con elevata espressione di MPO mostrano segnali trascrizionali immunitari/mieloidi più forti, piuttosto che come prova che MPO stesso rimodella il microambiente immunitario.

Correlazione tra l'espressione della MPO e l'infiltrazione di cellule immunitarie nel cancro al seno

Abbiamo valutato la relazione tra l'espressione di MPO e le caratteristiche del microambiente tumorale nel coorte TCGA-BRCA. L'applicazione dell'algoritmo ESTIMATE ha rivelato correlazioni positive significative tra l'espressione di MPO e il punteggio ESTIMATE (R = 0,347, p < 0,001), il punteggio immunitario (R = 0,361, p < 0,001) e il punteggio stromale (R = 0,232, p < 0,001) (Figura 5A). La distribuzione di questi punteggi tra i campioni è mostrata in Figura 5B. L'analisi effettuata mediante la risorsa TIMER/TIMER2.0 ha indicato che l'espressione di MPO era associata ai livelli stimati di infiltrazione delle principali popolazioni di cellule immunitarie, inclusi linfociti B, cellule T CD8+, neutrofili, cellule T CD4+, macrofagi e cellule dendritiche nel coorte TCGA-BRCA (Figura 5C). Questo schema di associazione è stato ulteriormente valutato utilizzando i punteggi di arricchimento per 24 tipi di cellule immunitarie basati su ssGSEA. Dopo la correzione del tasso di falsa scoperta di Benjamini–Hochberg, l'espressione di MPO ha mostrato associazioni positive con numerosi punteggi di arricchimento delle cellule immunitarie, inclusi quelli per linfociti T, linfociti B, cellule citotossiche, sottogruppi di cellule dendritiche, macrofagi, sottogruppi di linfociti T helper, linfociti T regolatori, cellule T CD8+, cellule NK, mastociti e neutrofili (Figura 5D). Questi risultati vanno interpretati come associazioni legate alla composizione immunitaria piuttosto che come prova che MPO controlli direttamente l'infiltrazione delle cellule immunitarie. È stata generata una mappa termica per visualizzare i modelli di arricchimento delle cellule immunitarie a livello di singolo campione nel coorte TCGA-BRCA (Figura 5E). Successivamente, abbiamo confrontato i punteggi di arricchimento delle cellule immunitarie stimati tramite ssGSEA tra i gruppi tumorali con espressione di MPO alta e bassa, definiti in base alla mediana. Diversi punteggi di arricchimento delle cellule immunitarie differivano tra i due gruppi, inclusi quelli per cellule dendritiche attivate (aDC), linfociti B, cellule T CD8+, cellule citotossiche, neutrofili, linfociti T, Treg, cellule Th1, cellule Th2, cellule Th17, cellule T γδ, cellule T follicolari helper (TFH), cellule con geni altamente variabili (HVG), cellule T effettrici della memoria, cellule T centrali della memoria e linfociti T helper (Figura 5F,G). Inoltre, è stata effettuata una deconvoluzione basata su CIBERSORT utilizzando la matrice di firma LM22 per stimare le frazioni relative dei 22 tipi di cellule immunitarie, e i modelli risultanti di composizione cellulare immunitaria sono mostrati in Figura 5H.

Analisi della metilazione del DNA di MPO nella coorte TCGA-BRCA coorte

Utilizzando la stessa soglia mediana di espressione di MPO nei tumori, i campioni TCGA-BRCA sono stati suddivisi in gruppi con espressione elevata (MPO-high) e bassa (MPO-low) di MPO, e i modelli di metilazione del DNA sono stati visualizzati per ciascun gruppo (Figura 6A). All'interno del locus di MPO, alcuni siti CpG selezionati hanno mostrato associazioni con la sopravvivenza nell'analisi MethSurv, inclusi cg22331200, cg14619064 e cg11151395 (Figura 6B–G). Questi risultati legati alla metilazione sono stati interpretati come annotazioni epigenetiche esplorative e richiedono una validazione indipendente prima che possano essere tratti conclusioni prognostiche o meccanicistiche.

Associazione tra l'espressione di MPO e le reti geniche correlate ai neutrofili nel cancro al seno

La coorte TCGA-BRCA è stata utilizzata per esaminare l'associazione tra l'espressione di MPO e i geni correlati ai neutrofili. È stata costruita una rete PPI basata su STRING per i geni associati ai neutrofili, e i geni hub sono stati selezionati in base alla topologia della rete (Figura 7A). I primi 20 geni hub sono stati successivamente valutati per la loro correlazione con l'espressione di MPO. Come mostrato nel grafico a caramella, MPO ha mostrato prevalentemente correlazioni positive con diversi mediatori legati ai neutrofili, con associazioni più forti osservate per componenti del segnale chemochinico/innato immunitario come CCL5, CCL2 e TLR2, nonché TLR4, CXCR4, TNF e MMP9 (Figura 7B).

Per caratterizzare ulteriormente il modello di co-regolazione tra questi geni hub, abbiamo visualizzato le loro relazioni a coppie mediante un diagramma a corde e una mappa termica di correlazione, che hanno rivelato estese correlazioni positive tra i geni all'interno del modulo hub, in accordo con un programma trascrizionale infiammatorio/associato ai neutrofili (Figura 7C,D). Nel complesso, questi risultati indicano che un'espressione più elevata di MPO è accompagnata da un'espressione coordinata di una rete genica associata ai neutrofili nel cancro al seno.

annotazione del fattore di trascrizione candidato per MPO

Per esplorare i fattori trascrizionali candidati potenzialmente associati a MPO, sono state interrogate e sovrapposte risorse pubbliche sui fattori trascrizionali, inclusi KnockTF, ChIP-Atlas e GTRD. I fattori trascrizionali candidati sono stati ulteriormente sintetizzati mediante priorizzazione basata su reti e analisi di correlazione. Una sintesi grafica è mostrata nella Figura Supplementare 2, mentre i risultati completi in formato tabellare sono forniti nel File Supplementare 2. Poiché questi database integrano evidenze provenienti da contesti sperimentali eterogenei, l'overlap tra database e il grado nella rete sono stati utilizzati esclusivamente per l'annotazione e la priorizzazione dei candidati. Tali risultati non sono stati interpretati come evidenza funzionale di una regolazione trascrizionale diretta di MPO nel cancro al seno. I fattori candidati, tra cui MYC, sono quindi presentati come annotazioni esplorative supplementari piuttosto che come regolatori superiori validati.

Raggruppamento a singola cellula e analisi descrittiva della comunicazione cellula-cellula stratificata in base al segnale MPO

Per annotare i tipi cellulari, abbiamo innanzitutto eseguito un'analisi dell'espressione specifica per cluster basata su marcatori canonici per ciascuna linea cellulare. I livelli medi di espressione e la percentuale di cellule che esprimono questi geni chiave nei diversi cluster sono mostrati, supportando l'annotazione successiva (Figura 8A). Di conseguenza, i cluster cellulari annotati sono visualizzati in un grafico di proiezione e approssimazione di varietà uniforme (UMAP), in cui ciascuna popolazione è codificata a colori in base al tipo identificato, inclusi cellule dendritiche plasmacitoidi, cellule endoteliali, cellule mioepiteliali, cellule epiteliali in ciclo, cellule plasmatiche, cellule T citotossiche, cellule tumorali epiteliali, cellule B, cellule T CD4 attivate, monociti–macrofagi, fibroblasti e cellule T convenzionali (Figura 8B). La mappa termica mostra i livelli di espressione di geni selezionati nei diversi cluster cellulari (C1-C8). Ogni riga rappresenta un gene e ogni colonna rappresenta un cluster cellulare. Il gradiente di colore indica i livelli di espressione, con il rosso che indica un'espressione elevata e il blu un'espressione bassa. Il dendrogramma a sinistra raggruppa i geni con pattern di espressione simili (Figura 8C). Il punteggio associato all'MPO è stato calcolato per ogni cellula utilizzando il set di geni associati all'MPO fornito nel File Supplementare 1. AUCell, Seurat AddModuleScore e l'analisi di arricchimento del set di geni da singolo campione (ssGSEA) sono stati utilizzati per calcolare i punteggi per cellula. I punteggi ottenuti con i tre metodi sono stati normalizzati in Z-score, scalati in un intervallo comparabile e integrati per ottenere un punteggio composito associato all'MPO destinato all'analisi descrittiva successiva (Figura 8D).

Questa analisi delle interazioni cellula-cellula ha confrontato i modelli di comunicazione ligando-recettore inferiti tra gruppi cellulari stratificati in base al segnale associato a MPO, inclusi la rete di interazione, le mappe termiche dei modelli di segnalazione, il grafico a bolle della segnalazione in uscita e il grafico a bolle della segnalazione in entrata (Figura 8E–H). Poiché il segnale MPO era scarso a livello di singola cellula e la distribuzione apparente tra i tipi cellulari annotati potrebbe essere influenzata da dropout, RNA ambientale, doppietti e incertezza nell'annotazione, questi grafici di comunicazione devono essere interpretati come risultati descrittivi del flusso di lavoro. Essi non dimostrano che le cellule che esprimono MPO mediano o controllino la comunicazione intercellulare. Un segnale MPO rilevabile è stato osservato in un numero limitato di cellule, inclusi cellule tumorali epiteliali annotate e monociti-macrofagi (Figura 8I). Considerando che MPO è canonico delle linee neutrofili/mieloidi, questo modello richiede una validazione in set di dati singola cellula indipendenti o mediante metodi sperimentali ortogonali.

Analisi della sensibilità esplorativa di scTenifoldKnk basata su cellule sparse positive per MPO

Sono stati integrati diversi campioni 10x Genomics, seguiti da normalizzazione e selezione di geni altamente variabili (HVG), riduzione della dimensionalità basata su PCA, costruzione di un grafo di k-vicini più prossimi e raggruppamento di Louvain. I pattern di espressione genica canonici dei marcatori nei diversi cluster sono stati riassunti mediante un DotPlot, supportando l'annotazione dei tipi cellulari (Figura 9A). La visualizzazione UMAP ha mostrato le popolazioni cellulari singole annotate nel dataset integrato (Figura 9B). I marcatori canonici di linea (ad esempio, EPCAM e KRT8/KRT18 per le cellule epiteliali; PTPRC per le cellule immunitarie; MS4A1 per le cellule B; LST1/S100A8/S100A9 per le cellule mieloidi; PECAM1 per le cellule endoteliali; e COL1A1 per le linee di fibroblasti/muscolo liscio) hanno mostrato pattern di espressione specifici per cluster, confermando l'annotazione dei tipi cellulari (Figura 9C). Grafici a barre sovrapposte stratificati per campione hanno indicato che ciascun campione conteneva più cluster, con una limitata variazione complessiva tra batch (Figura 9D).

L'espressione di MPO era relativamente scarsa nel dataset single-cell, con soli 85 cellule positive a MPO inizialmente rilevate (Figura 9E). Data questa limitata quantità, l'espansione del vicinato basata su KNN è stata utilizzata esclusivamente per definire un sottoinsieme locale di cellule nel vicinato di MPO, al fine di un'analisi di sensibilità esplorativa. Questo sottoinsieme ampliato non deve essere interpretato come una popolazione puramente positiva a MPO, poiché potrebbe includere cellule vicine con espressione di MPO bassa o non rilevabile. All'interno di questo sottoinsieme del vicinato di MPO, è stato effettuato un silenziamento virtuale di MPO mediante scTenifoldKnk, come analisi computazionale di sensibilità. Il grafico a vulcano risultante, l'analisi dello spostamento della varietà, la visualizzazione dell'allineamento della varietà, i risultati di arricchimento GO/KEGG e i geni con maggiore spostamento (Figura 9F-N) hanno evidenziato programmi trascrizionali candidati associati alla presentazione dell'antigene, all'attivazione di mieloidi/linfociti, alla produzione di citochine e a vie correlate ai fagosomi. Questi risultati devono essere interpretati come output esplorativi di sensibilità trascrizionale, piuttosto che come prova diretta che MPO regoli meccanicamente tali vie nel cancro al seno. Saranno necessari dataset single-cell indipendenti e una validazione sperimentale ortogonale, come immunoidistochemia, citometria a flusso, qPCR o saggi funzionali, per confermare queste osservazioni.

Recupero esplorativo di interazioni farmaco-gene e annotazione ADMET

Come estensione esplorativa dell'analisi centrata sull'MPO, le informazioni sulle interazioni farmaco-gene sono state recuperate da DGIdb. Un riassunto grafico è mostrato nella Figura Supplementare 3, mentre i risultati a livello di composto sono forniti nella Tabella Supplementare 3. L'interrogazione di DGIdb ha restituito un insieme eterogeneo di voci chimiche associate all'MPO, inclusi composti con plausibilità clinica limitata o profili tossicologici sfavorevoli. Pertanto, sulla base dell'analisi attuale, questi composti derivati da database non sono stati considerati candidati terapeutici per il cancro al seno. Le informazioni relative all'ADMET sono state sintetizzate per fornire un'annotazione preliminare delle proprietà previste di tipo fisico-chimico, farmacocinetico e tossicologico. Il recupero di composti basato su database e l'annotazione ADMET non equivalgono alla priorizzazione clinica di farmaci. Di conseguenza, questi risultati servono soltanto come annotazioni chimiche di livello preliminare e illustrano la necessità di un accurato filtraggio farmacologico, tossicologico e clinico prima che un composto possa essere preso in considerazione per indagini terapeutiche. I risultati principali di questo studio si concentrano sull'associazione tra l'espressione dell'MPO e caratteristiche trascrizionali legate al sistema immunitario e alle cellule mieloidi.

DISPONIBILITÀ DEI DATI:

I dati trascrittomici e clinici di TCGA-BRCA sono stati ottenuti dal portale Genomic Data Commons (https://portal.gdc.cancer.gov; scaricato il 26 agosto 2025; rilascio/versione dei dati 202208). Il dataset a singola cellula GSE161529 è stato ottenuto da Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161529). Nessun nuovo dato di sequenziamento è stato generato in questo studio. Gli script di analisi sono disponibili pubblicamente all'indirizzo https://github.com/tengfeitcm/MPO.

Figura 1: Diagramma di flusso del processo di raccolta e analisi dei dati. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Modelli di espressione di MPO e associazioni esplorative con la sopravvivenza nel cancro al seno. (A) I livelli di espressione di MPO sono stati analizzati in 33 tipi distinti di cancro e nei rispettivi tessuti normali adiacenti utilizzando il database TCGA. (B) Campioni non appaiati sono stati selezionati dal dataset TCGA-BRCA per analizzare l'espressione di mRNA di MPO nel tessuto tumorale e normale del seno. (C) Campioni appaiati sono stati selezionati dal dataset TCGA-BRCA per analizzare l'espressione di mRNA di MPO nel tessuto tumorale e normale del seno. (D) Analisi di Kaplan-Meier del PFI nei pazienti stratificati in base alla cutoff mediana dell'espressione tumorale di MPO nella coorte TCGA-BRCA. (E) Curva ROC esplorativa per valutare la capacità discriminante tra tessuto tumorale e normale basata sull'espressione di MPO nel dataset trascrittomico pubblico analizzato. (F) Espressione di MPO nei diversi stadi patologici T. (G) Espressione di MPO nei sottotipi molecolari PAM50, con etichette dei sottotipi indicate. (H) Immagini rappresentative di immunohistochimica (IHC) per MPO di tessuto normale adiacente al seno e di tessuto tumorale del seno. Le aree racchiuse in box indicano le regioni mostrate a maggiore ingrandimento. Le immagini di panoramica a 20× includono barre della scala di 100 µm, mentre le immagini a maggiore ingrandimento a 40× includono barre della scala di 50 µm. Queste immagini sono fornite come riferimenti qualitativi a livello proteico e non sono state utilizzate per analisi morfometriche quantitative o statistiche. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Analisi di correlazione e di espressione differenziale associata a MPO nel cancro al seno. (A) I primi 30 geni codificanti positivamente correlati con l'espressione di MPO a livello di mRNA, basati sui coefficienti di correlazione di Pearson ottenuti dal database TCGA. (B) I primi 30 geni codificanti negativamente correlati con l'espressione di MPO a livello di mRNA, basati sui coefficienti di correlazione di Pearson. (C) Grafici a dispersione che illustrano le correlazioni di Spearman tra MPO e geni sovraespressi in risposta infiammatoria. (D) Grafici a dispersione che illustrano le correlazioni di Spearman tra MPO e geni sovraespressi dai marcatori di EMT. (E) Grafici a dispersione che illustrano le correlazioni di Spearman tra MPO e geni sovraespressi da ROS. (F) Mappa termica dei cluster genici associati a MPO basata sul significato clinico (stadio T e PAM50). (G) Rete PPI predetta tramite il database STRING per le proteine associate a MPO. (H) Grafico a vulcano dei geni differenzialmente espressi tra gruppi tumorali con livelli elevati e bassi di MPO, definiti in base alla mediana, nel cohort TCGA-BRCA. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Analisi dell'arricchimento di MPO nel cancro al seno. (A) Analisi dell'arricchimento dell'ontologia genica dei 2.013 geni a espressione differenziale tra i gruppi MPO-alto e MPO-basso. (B) Analisi dell'arricchimento del percorso dell'Enciclopedia di Kyoto dei Geni e dei Genomi (KEGG) dei 2.013 geni a espressione differenziale. (C) Visualizzazione integrata dell'arricchimento dell'ontologia genica che combina i termini arricchiti con la direzione dell'espressione differenziale e i valori di |log2FC|. (D) Grafico rappresentativo di arricchimento GSEA per un insieme di geni legati al sistema immunitario associato a MPO; nel pannello sono indicati il nome dell'insieme di geni, il punteggio di arricchimento normalizzato e il valore q FDR. (E) Grafico rappresentativo di arricchimento GSEA per un ulteriore insieme di geni legati al sistema immunitario associato a MPO; nel pannello sono indicati il nome dell'insieme di geni, il punteggio di arricchimento normalizzato e il valore q FDR. (F) Grafico rappresentativo di arricchimento GSEA per un ulteriore insieme di geni legati al sistema immunitario associato a MPO; nel pannello sono indicati il nome dell'insieme di geni, il punteggio di arricchimento normalizzato e il valore q FDR. (G) Grafico rappresentativo di arricchimento GSEA per un ulteriore insieme di geni legati al sistema immunitario associato a MPO; nel pannello sono indicati il nome dell'insieme di geni, il punteggio di arricchimento normalizzato e il valore q FDR. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Correlazione tra arricchimento delle cellule immunitarie ed espressione della MPO nel cancro al seno. (A) Diagrammi a dispersione che mostrano le correlazioni tra l'espressione della MPO e il punteggio ESTIMATE, il punteggio immunitario e il punteggio stromale. (B) Diagrammi a scatola (box plot) che mostrano le differenze nei punteggi ESTIMATE, immunitario e stromale tra i gruppi tumorali con espressione della MPO alta e bassa definiti in base alla mediana. (C) Analisi basata su TIMER/TIMER2.0 che mostra le associazioni tra l'espressione della MPO e l'infiltrazione stimata delle principali popolazioni di cellule immunitarie. (D) Diagramma a bastoncino (lollipop plot) che mostra le correlazioni di Spearman tra l'espressione della MPO e i punteggi di arricchimento stimati mediante ssGSEA per 24 tipi di cellule immunitarie. I valori p derivanti da multiple correlazioni tra cellule immunitarie sono stati aggiustati utilizzando il metodo Benjamini–Hochberg per il tasso di falsa scoperta. (E) Mappa termica (heatmap) che illustra i modelli di arricchimento delle cellule immunitarie a livello campione nell'intera coorte TCGA-BRCA. (F) Diagrammi a scatola che mostrano il primo insieme di differenze nei punteggi di arricchimento delle cellule immunitarie stimati mediante ssGSEA tra i gruppi tumorali con espressione della MPO alta e bassa definiti in base alla mediana; i confronti tra gruppi sono stati effettuati utilizzando il test della somma dei ranghi di Wilcoxon con correzione di Benjamini–Hochberg. (G) Diagrammi a scatola che mostrano il secondo insieme di differenze nei punteggi di arricchimento delle cellule immunitarie stimati mediante ssGSEA tra i gruppi tumorali con espressione della MPO alta e bassa definiti in base alla mediana; i confronti tra gruppi sono stati effettuati utilizzando il test della somma dei ranghi di Wilcoxon con correzione di Benjamini–Hochberg. (H) Grafico a barre sovrapposte (stacked bar plot) che mostra le frazioni di cellule immunitarie stimate mediante CIBERSORT in base alla matrice di firma LM22 per 22 tipi di cellule immunitarie nei gruppi tumorali con espressione della MPO bassa e alta definiti in base alla mediana. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Analisi della metilazione del DNA del gene MPO nel cancro al seno. (A) Mappa termica che mostra i modelli di metilazione di MPO nei gruppi con espressione di MPO alta e bassa definiti in base alla mediana. (B) Curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier che dimostra il significato prognostico della metilazione nel sito cg27456487. (C) Curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier che dimostra il significato prognostico della metilazione nel sito cg02668773. (D) Curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier che dimostra il significato prognostico della metilazione nel sito cg07110356. (E) Curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier che dimostra il significato prognostico della metilazione nel sito cg11151395. (F) Curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier che dimostra il significato prognostico della metilazione nel sito cg14619064. (G) Curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier che dimostra il significato prognostico della metilazione nel sito cg22331200. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 7: Analisi delle correlazioni tra MPO e geni associati ai neutrofili a livello di mRNA mediante il database TCGA. (A) Visualizzazione della rete di interazione proteica, che mostra le interazioni tra la proteina centrale e altre proteine. (B) Analisi di correlazione dei 20 geni principali associati ai neutrofili con MPO, che mostra i coefficienti di correlazione e la distribuzione dei valori P per diversi geni. (C) Diagramma a corde delle correlazioni tra i 20 geni principali associati ai neutrofili, che rappresenta visivamente l'intensità e la direzione delle associazioni geniche. (D) Mappa termica di correlazione dei 20 geni principali associati ai neutrofili, che mostra i coefficienti di correlazione e i livelli di significatività attraverso gradienti di colore e marcatori statistici. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 8: Raggruppamento a singola cellula e analisi della comunicazione cellula-cellula associata a MPO nel dataset di singola cellula del cancro al seno. (A) DotPlot dei geni marcatore canonici nei diversi cluster per l'annotazione dei tipi cellulari. (B) Visualizzazione UMAP delle popolazioni cellulari annotate. (C) Mappa termica dei geni marcatore selezionati nei diversi cluster cellulari. (D) DotPlot che riassume i punteggi associati a MPO nei diversi tipi cellulari annotati, calcolati utilizzando AUCell, ssGSEA e Seurat AddModuleScore sulla base del set genico fornito nel File Supplementare 1. (E) Rete di interazione cellula-cellula che mostra la comunicazione tra le cellule tumorali epiteliali stratificate per segnale associato a MPO e altri tipi cellulari; la larghezza delle linee rappresenta l'intensità dell'interazione e la dimensione dei nodi riflette l'attività complessiva dell'interazione. (F) Mappe termiche che mostrano i modelli di segnalazione in uscita e in entrata tra i diversi tipi cellulari. (G) Grafico a bolle dei percorsi di segnalazione in uscita dalle cellule tumorali epiteliali stratificate per segnale associato a MPO verso altri tipi cellulari. (H) Grafico a bolle dei percorsi di segnalazione in entrata da altri tipi cellulari verso le cellule tumorali epiteliali stratificate per segnale associato a MPO. (I) Distribuzione dell'espressione di MPO nei diversi tipi cellulari annotati. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 9: Analisi dell'atlante single-cell e silenziamento virtuale esplorativo dell'output di sensibilità alla MPO. (A) DotPlot che mostra l'espressione dei geni marcatori canonici nei diversi cluster di cellule singole; la dimensione del punto rappresenta la percentuale di cellule che esprimono ciascun marcatore, mentre l'intensità del colore rappresenta il livello medio di espressione. (B) Visualizzazione UMAP delle popolazioni di cellule singole annotate, in cui ogni colore rappresenta un tipo cellulare o un cluster distinto. (C) Visualizzazione UMAP dell'espressione dei principali geni marcatori, che mostra la distribuzione dell'espressione dei geni marcatori per i diversi tipi cellulari, inclusi i leucociti mieloidi. (D) Grafico a barre sovrapposte delle proporzioni dei cluster cellulari nei diversi campioni. (E) Visualizzazione UMAP dell'espressione del gene MPO. (F) Grafico a violino che mostra le metriche di controllo qualità (QC) del sequenziamento a singola cellula. (G) Grafico di clustering dei principali geni marcatori. (H) DotPlot dei geni marcatori canonici a livello di cluster. (I) Grafico a vulcano dei geni modificati nell'analisi di sensibilità al silenziamento virtuale. (J) Grafico a dispersione di spostamento rispetto alla significatività. (K) Grafico a frecce di allineamento della varietà (manifold alignment). (L) Analisi di arricchimento GO BP (biological processes) dei geni derivanti dall'output del silenziamento virtuale. (M) Analisi di arricchimento del percorso KEGG dei geni derivanti dall'output del silenziamento virtuale. (N) I 20 geni con lo spostamento maggiore nella varietà (manifold displacement) dopo l'esclusione di MPO. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura supplementare 1: Analisi aggiuntive della sopravvivenza per MPO nella coorte TCGA-BRCA. (A,B) Questo file contiene analisi supplementari della sopravvivenza di Kaplan-Meier per (A) la sopravvivenza globale e (B) la sopravvivenza specifica per la malattia, stratificate in base alla soglia mediana di espressione tumorale di MPO. Queste analisi sono fornite come analisi aggiuntive degli esiti alla Figura 2D e non sono risultate statisticamente significative nella coorte attuale.Cliccare qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Annotazione esplorativa dei fattori trascrizionali candidati per MPO. (A) Diagramma di Venn che mostra l'intersezione dei fattori trascrizionali candidati provenienti da tre risorse pubbliche di fattori trascrizionali. (B) Risultato del confronto dell'espressione di MYC. (C) Mappa termica delle correlazioni tra fattori trascrizionali con etichette per righe e colonne. (D) Risultato della correlazione tra MPO e MYC. (E) Risultato dell'analisi di sopravvivenza per MYC. (F) Risultato dell'analisi ROC per MYC. Gli output relativi a MYC sono mostrati solo come annotazioni supplementari di fattori trascrizionali candidati e non vengono utilizzati per supportare conclusioni meccanicistiche sui regolatori a monte.Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Risultato dell'analisi esplorativa di recupero di farmaci-geni da DGIdb per MPO. I nodi grigi rappresentano il gene MPO, i nodi arancioni rappresentano le voci di piccole molecole recuperate e le linee di collegamento indicano relazioni farmaco-gene predette dalle basi di dati.Cliccare qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 1: La matrice delle firme cellulari LM22 utilizzata per l'analisi di descomposizione delle cellule immunitarie basata su CIBERSORT per 22 tipi di cellule immunitarie. I simboli genici sono stati armonizzati, le voci duplicate sono state rimosse e i geni disponibili sono stati incrociati con le corrispondenti matrici di espressione TCGA-BRCA o GSE161529 prima dell'analisi successiva.Cliccare qui per scaricare il file.

Tabella supplementare 2: Elenco dei geni associati ai neutrofili utilizzato per l'analisi STRING/PPI, la priorizzazione dei geni hub e l'analisi di correlazione tra MPO e i geni hub. Cliccare qui per scaricare il file.

Tabella supplementare 3: Risultati esplorativi del recupero di interazioni farmaco-gene tramite DGIdb e annotazioni ADMET per MPO. Questo file contiene i record di interazioni chimica-gene associati a MPO recuperati da DGIdb e le annotazioni a livello di composto predette per quanto riguarda proprietà fisico-chimiche, farmacocinetiche e tossicologiche. Questi risultati sono forniti esclusivamente come annotazioni chimiche preliminari e non devono essere interpretati come elenchi di candidati terapeutici. Non attestano inibizione di MPO, interazione con il bersaglio, specificità del ligando, selettività, sicurezza, efficacia terapeutica o idoneità clinica. I valori presenti in questa tabella rappresentano parametri predetti di natura fisico-chimica e similitudine ai farmaci per i composti elencati. Il peso molecolare è espresso in grammi per mole (g/mol). I valori relativi agli accettori di legami a idrogeno e ai donatori di legami a idrogeno indicano rispettivamente il numero predetto di accettori e donatori di legami a idrogeno. Il coefficiente di partizione ottanolo-acqua di Moriguchi indica la lipofilicità predetta. Le violazioni delle regole di Lipinski indicano il numero di criteri della regola del cinque di Lipinski non soddisfatti da ciascun composto. Il punteggio di biodisponibilità rappresenta il punteggio predetto relativo alla biodisponibilità orale, mentre l'area superficiale topologica si riferisce all'area superficiale polare topologica predetta.Cliccare qui per scaricare il file.

File Supplementare 1: Elenco dei geni associati all'MPO utilizzato per il punteggio di firma singola con AUCell, Seurat AddModuleScore e ssGSEA. Cliccare qui per scaricare il file.

File Supplementare 2: Risultati esplorativi di annotazione per fattori trascrizionali candidati e miRNA per MPO. Questo file contiene risultati di annotazione per fattori trascrizionali candidati e miRNA derivati da database basati su risorse pubbliche, tra cui KnockTF, ChIP-Atlas, GTRD e TargetScan. Queste annotazioni sono fornite esclusivamente per la priorizzazione esplorativa di candidati e non vanno interpretate come evidenza funzionale di una regolazione a monte di MPO nel cancro al seno.Cliccare qui per scaricare il file.

Discussione

Questo studio presenta un insieme di dati pubblici esplorativo e un flusso di lavoro in silico per esaminare le associazioni tra l'espressione di MPO e le caratteristiche immunitarie/mieloidi nel cancro al seno. Le analisi TCGA-BRCA hanno mostrato che l'espressione di MPO era inferiore nei tessuti tumorali rispetto ai tessuti non tumorali adiacenti e che un'espressione più elevata di MPO era associata a un intervallo libero da progressione più lungo. Tuttavia, la sopravvivenza complessiva e la sopravvivenza specifica per la malattia non sono risultate statisticamente significative. Pertanto, l'MPO non dovrebbe essere interpretato come un biomarcatore prognostico solido o consolidato sulla base delle attuali evidenze. Studi futuri dovrebbero valutare l'MPO utilizzando modelli di regressione di Cox multivariabile aggiustati per variabili clinicopatologiche consolidate, coorti di validazione indipendenti e analisi stratificate per sottotipo.

Rispetto all'analisi convenzionale di espressione differenziale su singolo coorte o alla stima dell'infiltrazione immunitaria basata su singola piattaforma, questo flusso di lavoro centrato sull'MPO integra trascrittomica su popolazione totale, arricchimento immunitario, annotazione della metilazione, mappatura a singola cellula e perturbazione virtuale per fornire una visione esplorativa più ampia delle caratteristiche immunitarie/mieloidi associate all'MPO. Tuttavia, questo flusso di lavoro rimane complementare, e non sostitutivo, rispetto alla validazione su coorti esterne, alla validazione spaziale o a livello proteico e ai saggi sperimentali di perturbazione.

I risultati relativi all'infiltrazione immunitaria e all'arricchimento devono essere interpretati come contesto immunitario associato a MPO piuttosto che come rimodellamento immunitario indotto da MPO. MPO è espressa principalmente nei neutrofili e in altre cellule della linea mieloide³⁷. Pertanto, correlazioni positive tra l'espressione di MPO e i punteggi ESTIMATE, i punteggi immunitari, i punteggi di arricchimento delle cellule immunitarie, i geni associati ai neutrofili, le vie delle citochine, le firme di presentazione dell'antigene o le vie di degranulazione dei neutrofili sono biologicamente plausibili e potrebbero riflettere in larga misura differenze nell'abbondanza delle cellule immunitarie/mieloidi all'interno dei campioni tumorali bulk. Questa interpretazione è coerente con studi precedenti che hanno mostrato come l'infiltrazione di neutrofili positivi per MPO sia associata a una prognosi favorevole nel cancro al seno e che MPO sia coinvolta nella funzione delle cellule dendritiche e nell'infiammazione tissutale mediata dalle cellule T^38,39. I dati di RNA-seq bulk non permettono di determinare se MPO abbia un'attività intrinseca nelle cellule tumorali o se il segnale osservato rifletta principalmente cellule immunitarie infiltranti. Sarebbero necessari set di dati indipendenti a singola cellula, analisi spaziali, immunoidistochemica, citometria a flusso o modelli sperimentali basati su perturbazioni per chiarire la fonte cellulare e la funzione.

L'analisi a singola cellula fornisce ulteriori informazioni descrittive ma rimane limitata da una rilevazione scarsa della MPO. Inizialmente sono state rilevate solo 85 cellule positive alla MPO prima dell'ampliamento del vicinato basato sul KNN. Sebbene l'ampliamento KNN abbia permesso un'analisi di sensibilità delle cellule nel vicinato trascrizionale locale delle cellule positive alla MPO, questa procedura potrebbe includere cellule che non esprimono direttamente la MPO. Di conseguenza, l'output di silenziamento virtuale scTenifoldKnk dovrebbe essere interpretato come un'analisi computazionale esplorativa di sensibilità piuttosto che come prova di una regolazione dei percorsi mediata dalla MPO⁴⁰. Sarà necessaria una validazione in dataset indipendenti di cancro al seno a singola cellula e in saggi sperimentali ortogonali prima di poter trarre conclusioni meccanicistiche.

L'analisi del fattore di trascrizione deve essere interpretata con cautela. L'overlapping tra le previsioni di KnockTF, GTRD e ChIP-Atlas, seguito da una priorizzazione basata sul grado, può identificare fattori di trascrizione candidati ma non consente di stabilire una regolazione trascrizionale funzionale di MPO nel cancro al seno. I fattori candidati come MYC sono stati pertanto mantenuti soltanto come annotazioni esplorative. Poiché l'attività del fattore di trascrizione è fortemente dipendente dal contesto e può variare in base al sottotipo tumorale, alla composizione cellulare, alla piattaforma dell'assay e alla strategia di pre-elaborazione, sarebbe necessaria una validazione specifica del contesto prima di assegnare a qualsiasi fattore candidato un ruolo regolatorio a monte. Tale validazione dovrebbe includere ChIP-qPCR o ChIP-seq, saggi con reporter del promotore e perturbazioni del fattore di trascrizione seguite dalla misurazione dell'espressione di MPO.

Anche il recupero di farmaci e geni e l'annotazione ADMET devono essere interpretati con cautela. DGIdb può restituire associazioni chimico-geniche eterogenee, inclusi composti che non sono ligandi selettivi della MPO e potrebbero avere plausibilità clinica limitata o proprietà tossicologiche sfavorevoli³⁶. Le previsioni ADMET forniscono annotazioni chimiche preliminari, ma non dimostrano l'interazione con il bersaglio, la potenza, la selettività, la sicurezza o l'efficacia terapeutica⁴¹. Pertanto, i risultati attuali a livello di composti non dovrebbero essere utilizzati per dedurre un potenziale terapeutico. Una valutazione traslazionale significativa richiederebbe un insieme curato di inibitori o sonde della MPO farmacologicamente rilevanti, un confronto con composti noti per agire sulla MPO e una validazione mediante saggi biochimici, cellulari e farmacologici. Va inoltre considerato il ruolo contesto-dipendente e potenzialmente duplice della MPO nel cancro quando si interpretano risultati legati ai farmaci. La MPO può contribuire a processi di promozione tumorale attraverso lo stress ossidativo, la generazione di ossidanti reattivi, danni al DNA, infiammazione cronica e rimodellamento del microambiente tumorale. Allo stesso tempo, l'espressione della MPO nei dataset tumorali complessivi potrebbe riflettere l'infiltrazione da parte di neutrofili o altre cellule immunitarie mieloidi, che in alcuni contesti possono essere associate a un microambiente immunitario attivo e a esiti clinici più favorevoli^39,42. L'interpretazione biologica della MPO dipende quindi dal tipo tumorale, dalla fonte cellulare, dalla fase della malattia e dalla composizione delle cellule immunitarie.

I risultati relativi alla metilazione del DNA nel locus MPO sono stati considerati anch'essi esplorativi. Alcuni siti CpG selezionati hanno mostrato associazioni con la sopravvivenza nell'analisi MethSurv, ma questi risultati richiedono una conferma indipendente prima di poter trarre conclusioni prognostiche o meccanicistiche. La regolazione epigenetica di MPO potrebbe interagire con il legame dei fattori di trascrizione e con la regolazione a livello della cromatina, ma tali interazioni rimangono puramente speculative in assenza di dati funzionali sulla cromatina o su perturbazioni sperimentali⁴³.

Le implicazioni cliniche dell'espressione della MPO devono essere interpretate con cautela. I risultati attuali non stabiliscono la MPO come biomarcatore clinicamente utilizzabile né come indicatore in grado di guidare attualmente le decisioni terapeutiche relative all'immunoterapia nel cancro al seno. Piuttosto, la MPO potrebbe riflettere un contesto immunitario associato a cellule mieloidi/neutrofili all'interno del microambiente tumorale. In studi futuri, l'espressione della MPO potrebbe essere valutata insieme a marcatori consolidati correlati all'immunoterapia, inclusi linfociti tumorali infiltranti, espressione di PD-L1, espressione genica dei checkpoint immunitari, sottotipo molecolare e firme immunitarie validate. Tali analisi dovrebbero includere coorti indipendenti, modelli multivariabili e set di dati relativi alla risposta al trattamento prima che la MPO possa essere considerata per la stratificazione dei pazienti o per le decisioni terapeutiche in ambito immunologico.

Diversi passaggi del flusso di lavoro sono fondamentali per la riproducibilità, tra cui la pre-elaborazione coerente dei dati TCGA-BRCA, il raggruppamento basato sulla mediana del solo tumore in MPO-alto/MPO-basso, soglie statistiche predefinite e correzione per test multipli, algoritmi di arricchimento delle cellule immunitarie e set di firme, controllo qualità e annotazione delle singole cellule, espansione del vicinato MPO basata su KNN e la gestione esplorativa degli output di silenziamento virtuale e di DGIdb/ADMET. Cambiamenti in questi parametri possono influenzare i risultati e le interpretazioni successivi; pertanto, devono essere riportati e riprodotti con attenzione. Per la risoluzione dei problemi, output incoerenti devono essere affrontati verificando la fonte del campione, la normalizzazione dell'espressione, la soglia di raggruppamento, la correzione per test multipli, i set di firme delle cellule immunitarie, il controllo qualità e l'annotazione delle singole cellule, la definizione del vicinato KNN, le soglie di silenziamento virtuale, i cutoff di arricchimento e i record eterogenei dei composti in DGIdb/ADMET.

Diversi limiti di questo studio devono essere riconosciuti. In primo luogo, lo studio si è basato su analisi retrospettive di database pubblici utilizzando TCGA-BRCA e dati singola-cellula disponibili pubblicamente, e pertanto potrebbe essere influenzato da eterogeneità del coorte, differenze nella fonte del campione, effetti di lotto, annotazioni cliniche incomplete e differenze nella composizione del tumore. In secondo luogo, i risultati attuali derivano principalmente da associazioni trascrittomiche e analisi in silico, e mancano di una validazione sperimentale diretta. Di conseguenza, le associazioni osservate tra espressione di MPO, caratteristiche immunitarie/mieloidi, annotazioni di metilazione, candidati fattori di trascrizione e risultati di knockdown virtuale non devono essere interpretate come meccanismi causali. In terzo luogo, il rilevamento di MPO nel dataset singola-cellula è stato scarso, con soli 85 cellule positive a MPO rilevate prima dell'espansione del vicinato basata su KNN. Il sottoinsieme espanso del vicinato di MPO potrebbe includere cellule con espressione di MPO bassa o non rilevabile e non deve essere considerato una popolazione puramente positiva a MPO. In quarto luogo, poiché MPO è prevalentemente associata ai neutrofili e ad altre cellule della linea mieloide, i segnali legati a MPO nei dati di RNA-seq in bulk potrebbero essere confusi dall'abbondanza delle cellule immunitarie, dalla purezza del tumore e dalla composizione cellulare, piuttosto che riflettere un'attività intrinseca delle cellule tumorali. Infine, il recupero di interazioni farmaco-gene basato su DGIdb e l'annotazione ADMET sono state semplici annotazioni chimiche esplorative. Questi risultati non stabiliscono inibizione di MPO, legame al bersaglio, selettività, sicurezza, efficacia terapeutica o idoneità clinica. Studi futuri, che utilizzino coorti indipendenti, validazione a livello spaziale o proteico e esperimenti funzionali, sono necessari per confermare la rilevanza biologica e clinica di questi risultati.

In sintesi, le analisi attuali dei dataset pubblici supportano un'associazione tra l'espressione di MPO e caratteristiche trascrizionali immunitarie/mieloidi nel cancro al seno, con un'espressione maggiore di MPO associata a un intervallo libero da progressione più lungo nel coorte analizzato. I risultati rimangono esplorativi e generativi di ipotesi. Non dimostrano che MPO regoli causalmente il microambiente immunitario tumorale, che MYC regoli funzionalmente MPO, o che i composti recuperati abbiano rilevanza terapeutica. I principali contributi di questo studio sono un flusso di lavoro computazionale riproducibile e un insieme di ipotesi verificabili che richiedono una validazione in coorti esterne e una conferma sperimentale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
CellChat	Pacchetto R/Open source	https://github.com/sqjin/CellChat	Analisi della comunicazione tra cellule
ChIP-Atlas	Database pubblico	https://chip-atlas.org/	Selezione dei bersagli dei fattori di trascrizione; aggiornamento 2021
clusterProfiler	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	Analisi di arricchimento GO/KEGG; v4.4.4
Cytoscape	Consorzio Cytoscape	https://cytoscape.org/	Visualizzazione e analisi della topologia delle reti
DGIdb	Università di Washington/Database pubblico	https://www.dgidb.org/	Recupero delle interazioni farmaco-gene
GDC/TCGA-BRCA	Istituto Nazionale del Cancro	https://portal.gdc.cancer.gov/	Fonte di dati trascrittomici su campione aggregato e dati clinici
Gene Expression Omnibus: GSE161529	NCBI	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/	Fonte di dataset a singola cellula
GSEA/MSigDB	Istituto Broad	https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb	Analisi di arricchimento di insiemi genici e riferimento per insiemi genici; Versione 3.0
GSVA	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/GSVA/	Valutazione della variazione degli insiemi genici/analisi ssGSEA; Versione 1.46.0
GTRD	Database pubblico	http://gtrd.biouml.org/	Selezione dei bersagli dei fattori di trascrizione; 2021
KnockTF	Database pubblico	http://www.licpathway.net/KnockTF/index.html	Risorsa per perturbazioni dei fattori di trascrizione; Versione 2.0
R	Fondazione R per il calcolo statistico	https://www.r-project.org/	Ambiente per l'analisi statistica
scTenifoldKnk	Pacchetto R/Open source	https://github.com/cailab-tamu/scTenifoldKnk	Analisi di silenziamento virtuale
Seurat	Pacchetto R/Open source	https://satijalab.org/seurat/	Pre-elaborazione e clustering a singola cellula
STRING	ELIXIR/Database pubblico	https://string-db.org/	Analisi delle interazioni proteina-proteina; v11
SwissADME	Istituto svizzero di bioinformatica SIB	http://www.swissadme.ch/	Valutazione della similitudine con farmaci; rilascio 2017/strumento web
TIMER	Risorsa web pubblica	https://timer.cistrome.org/	Analisi dell'infiltrazione immunitaria; TIMER2.0
UCSC Xena o portale TCGA collegato	UCSC	https://xenabrowser.net/	Accesso esplorativo ai dati/convalida