Una singola dose endovenosa di Brucella attenuata produttrice di indolo nei topi NOD: valutazione dell'insorgenza del diabete di tipo 1 e rimodellamento immunitario degli isoli

Sommario

Questo protocollo descrive la somministrazione endovenosa di un ceppo attenuato di Brucella melitensis produttore di indolo a topi NOD/ShiLtJ, seguita da monitoraggio longitudinale del diabete, istologia pancreatica e proteomica spaziale ad alto plex opzionale e sequenziamento di RNA a singola cellula per valutare la riprogrammazione immunitaria degli isolini.

Abstract

Il diabete di tipo 1 (T1D) deriva dalla distruzione autoimmune delle cellule β pancreatiche, e le terapie attuali non riescono a ripristinare una tolleranza immunitaria duratura. I batteri metabolicamente modificati che producono metaboliti immunomodulatori rappresentano una promettente strategia terapeutica a dose singola. Qui, questo articolo presenta un protocollo completo in cui una singola somministrazione endovenosa di un ceppo attenuato di Brucella melitensis produttore di indolo, BmΔvjbR::tnaA, viene utilizzata per valutare gli effetti sull'insorgenza del diabete autoimmune in topi femmine prediabetici NOD/ShiLtJ.

Il protocollo inizia preparando BmΔvjbR::tnaA da stock di glicerolo congelati, facendolo crescere in mezzo a una fase di logaritmito medio e calcolando le unità formative di colonie basandosi sulla densità ottica. Le femmine di topi NOD, di <5 settimane, sono trattenute senza anestesia e iniettate per via endovenosa tramite vena caudale laterale con una dose batterica definita in soluzione salina tamponata con fosfato, mantenute su cuscinetti riscaldanti. La glicemia viene monitorata 2 volte a settimana dopo un digiuno di 2 ore per 70–105 giorni, con il diabete definito come glucosio ≥250 mg/dL su due letture consecutive. Agli endpoint sperimentali, il pancreas prelevato viene fissato in formalina tamponata in neutro per 72 ore, immerso in paraffina e sezionato per la colorazione di ematossilina ed eosina, immunoistochimica dell'insulina e quantificazione dell'area totale dell'isolotto. Le sezioni fissate nel formalino e la paraffina vengono sottoposte alla proteomica spaziale con un pannello di anticorpi a 25 marcatori per visualizzare le popolazioni regolatrici ed immunitarie agli effettori. Infine, il tessuto pancreasico fresco viene sottoposto a isolamento monocellulare, preparazione della libreria 3′, sequenziamento e analisi bioinformatica basata su Seurat per profilare i cambiamenti trascrizionali tra popolazioni immunitarie e stromali.

Questo protocollo integrato consente la somministrazione di terapia batterica a dose singola riproducibile e la caratterizzazione multimodale della rimodellazione immunitaria degli isolini, fornendo un quadro per testare i microbi ingegnerizzati metaboliti in modelli autoimmuni e per dissezionare i meccanismi immunitari specifici dei tessuti a risoluzione unicellulare.

Introduzione

Il diabete di tipo 1 (T1D) è una malattia autoimmune cronica caratterizzata dalla distruzione immunitaria delle cellule pancreatiche β produttrici di insulina, portando a una dipendenza da insulina a vita e a un aumento del rischio di complicazioni^{vascolari 1}. Il topo NOD/ShiLtJ ripropone caratteristiche chiave del diabete autoimmune umano, inclusa l'insulite spontanea e la progressione verso il diabete palese, ed è ampiamente utilizzato come modello preclinico per studi meccanicistici e ^{terapeutici 1,2,3}. Le attuali terapie di tipo 1D — inclusi farmaci immunosoppressivi, anticorpi monoclonali e terapie adottive regolatrici per cellule T (Treg) — possono rallentare temporaneamente la progressione della malattia ma spesso non garantiscono un ripristino duraturo della tolleranza immunitaria o una conservazione produrata della massa β^cellulare 1,2,4,5,6,7,8,9,10^{, 11}.

Il targeting dei Treg e di altre popolazioni regolatorie è un obiettivo principale delle terapie emergenti per il T1D, inclusi infusioni policlonali autologhe di Treg, Treg specifici per antigeni ingegnerizzati e regimi basati su^IL-2 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11 . Tuttavia, un microambiente pro-infiammatorio all'interno degli isolotti pancreatici può compromettere l'efficacia di questi approcci, sottolineando la necessità di riprogrammare localmente le reti immunitarie residenti nei tessuti ^2,7. I metaboliti del triptofano derivati dai microbi, in particolare indoli e composti correlati, possono modulare sia l'immunità innata che adattativa promuovendo la differenziazione regolatoria delle cellule T, inducendo la polarizzazione antinfiammatoria dei macrofagi e sopprimendo le risposte Th17^12,13. Le terapie microbiche vive e i batteri metabolicamente modificati rappresentano quindi una strategia promettente per somministrare metaboliti immunomodulatori in situ e rimodellare l'immunità^tissutale 12,13,14,15,16,17,18.

In precedenza abbiamo sviluppato un ceppo metabolicamente ingegnerizzato di Brucella melitensis, BmΔvjbR::tnaA, che produce costitutivamente indolo e controlla l'artrite autoimmune espandendo i Treg e rimodellando i microambienti^infiammatori 14,15,16. I ceppi attenuati di Brucella come BmΔvjbR sono stati ampiamente caratterizzati come piattaforme vaccinali e possono essere modificati geneticamente per trasportare carichi utili^{immunoregolatori} 14,15,16.

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per valutare una singola dose endovenosa di BmΔvjbR::tnaA nel modello NOD/ShiLtJ, inclusa preparazione batterica, somministrazione endovenosa standardizzata, monitoraggio del diabete e analisi multimodale del tessuto pancreastico tramite istologia, proteomica spaziale ad alto plex e RNA-seq unicellulare. Questo flusso di lavoro fornisce un quadro pratico per testare i microbi ingegnerizzati dai metaboliti come immunoterapie a dose singola nell'autoimmunità specifica per ogni organo. Un'analisi dose-risposta precedente ha dimostrato sicurezza e tollerabilità fino a 1 × 10¹⁰ CFU del ceppo attenuato.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in rigorosa conformità con le linee guida etiche e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Texas A&M University (Numero di protocollo: 2021-0123).

1. Preparazione e caratterizzazione di BmΔvjbR::tnaA

1. Background e stoccaggio del ceppo batterico
   NOTA: BmΔvjbR::tnaA deriva da Brucella melitensis 16M con delezione del regolatore della virulenza vjbR e inserzione del gene Escherichia coli tnaA per la produzione costitutiva di indoli, come descritto^{in precedenza 14,15,16}.
   1. Mantenere le scorte di glicerolo a −80 °C con il 20% di glicerolo.
2. Coltura batterica su agar selettivo
   1. Recuperare una scorta di glicerolo congelata da una stoccazione a −80 °C. Strisciare 10–20 μL su piastre triptiche di agar di soia (TSA) integrate con cloranfenicolo (25–30 μg/mL).
   2. Incubare le piastre a 37 °C in condizioni di CO₂ ambiente per 48–72 ore fino a quando le singole colonie (2–3 mm di diametro) non sono visibili.
      ATTENZIONE: Il lavoro con ceppi di Brucella richiede adeguate strutture di livello di biosicurezza (minimo BSL2). Segui i protocolli di biosicurezza istituzionali e le approvazioni richieste.
3. Preparazione in coltura liquida
   1. Scegli una targa TSA nuova (≤1 settimana). Scegli 2–3 colonie isolate usando un anello sterile.
   2. Inoculare in 10 mL di brodo di soia triptico (TSB) integrato con cloranfenico (25–30 μg/mL) in un tubo sterile da 15 mL. Incubare a 37 °C con scuotimento a 250 giri/min in condizioni di CO₂ ambientale.
      NOTA: Per l'espansione, usa una fiaschetta Erlenmeyer da 250 mL con deflesso.
4. Monitoraggio della crescita e raccolta
   1. Svuotare lo spettrofotometro usando TSB sterile integrato con cloranfenicolo.
   2. Misura OD₆₀₀ ogni 2–3 ore.
   3. Continuare l'incubazione fino a quando OD₆₀₀ raggiunge 2,0 ± 0,2 (circa 18–24 ore).
      PASSO CRITICO: Raccolta a OD₆₀₀ = 2,0 ± 0,2 per una concentrazione batterica e una vitalità costanti.
      NOTA: In queste condizioni, OD₆₀₀ ≈ 2.0 corrisponde alla fase logaritmica medio-tarda.
5. Stima della CFU
   1. Stima la concentrazione batterica usando la relazione:
      OD₆₀₀ = 1 corrisponde a 5 × 10⁹ CFU/mL.
      NOTA: Una coltura da 10 mL a OD₆₀₀ = 2.0 contiene circa 1 × 10¹¹ CFU.
   2. OPZIONALE: Prepara diluizioni seriali a 10 volte (10⁻⁶ a 10⁻⁹) in PBS sterile. Piastra 100 μL sulla TSA integrata con cloranfenicolo. Incubare a 37 °C per 48–72 ore. Conta le colonie per confermare la CFU.
6. Prelievo batterico e concentrazione
   1. Trasferire la coltura da 10 mL in un tubo conico sterile da 15 mL.
   2. Centrifugare a 3.000–4.000 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.
   3. Aspirare con cura e scartare il surnatante senza disturbare il pellet.
7. Sospensione per iniezione
   1. Aggiungere 1 mL di soluzione salina sterile e senza endotossine 1× fosfato tamponata (PBS, pH 7,4) al pellet batterico. Risospendere delicatamente pipettando 10–15 volte fino a ottenere una sospensione omogenea senza grumi visibili.
      NOTA: La concentrazione finale è di circa 1 × 10¹¹ CFU/mL.
8. Conservazione e utilizzo
   1. Tieni la sospensione batterica sul ghiaccio in un tubo chiuso. Usa la sospensione per iniezioni endovenose entro 4 ore dalla preparazione.
      NOTA: Non congelare né conservare durante la notte, poiché la vitalità batterica diminuisce.
      PUNTO DI PAUSA: I BATTERI POSSONO ESSERE TENUTI SUL GHIACCIO PER UN MASSIMO DI 4 ORE; Si consiglia l'uso nello stesso giorno.

2. Acquisto, alloggiamento e preparazione dei topi NOD/ShiLtJ

1. Ottieni topi femmine NOD/ShiLtJ. Acclimatare i topi per almeno 7 giorni prima della sperimentazione.
   NOTA: Utilizzare topi femmine a causa dell'incidenza più alta e più costante del diabete.
2. I topi domestici in gabbie ventilate individualmente in condizioni specifiche prive di patogeni. Mantenere fino a cinque topi per gabbia.
3. Fornisci biancheria da letto, arricchimento ambientale, cibo e acqua ad libitum. Mantieni la temperatura tra 20 e 24 °C, l'umidità tra il 40 e il 60%, e un ciclo di luce e buio di 12 ore.
4. Usa topi sotto le 5 settimane di età. Registra il peso corporeo di base.
5. Randomizzare i topi a livello di gabbia nei gruppi di trattamento e di controllo. Assegna identificatori unici (tag orecchio o tatuaggio sulla coda) a ogni topo.
   NOTA: Mantenere un registro generale di tutti i topi e dei compiti di gruppo.
6. Trasferire le gabbie nella sala procedura almeno 30 minuti prima dell'iniezione. Posizionare le gabbie su cuscinetti riscaldanti impostati a 37–40 °C per favorire la dilatazione delle vene caudali.

3. Somministrazione endovenosa tramite vena caudale laterale

1. Utilizzando la tecnica sterile, preleva 100 μL della sospensione batterica in siringhe di insulina sterili (29G–30G). Etichetta ogni siringa con il corrispondente ID del mouse.
2. Preparare siringhe di controllo contenenti 100 μL di PBS sterile.
   NOTA: Preparare le siringhe immediatamente prima dell'iniezione.
3. Metti ogni topo in un contenitore che permette l'accesso alla coda.
   NOTA: Non usare anestesia per le iniezioni nelle vene caudali.
4. Strofina la coda con etanolo al 70% e lascia asciugare all'aria.
5. Visualizza le vene laterali della coda sotto un'illuminazione adeguata.
   CONSIGLIO: Riscalda la coda se le vene non sono visibili.
6. Tieni il terzo distale della coda con una lieve tensione. Inserire il bisello a ago con un angolo ridotto (10–15°) nella vena laterale.
7. Iniettare lentamente 100 μL per 5–10 secondi. Ritira l'ago e applica una pressione delicata con una garza sterile.
   PASSO CRITICO: Confermare il successo dell'iniezione endovenosa in assenza di resistenza, gonfiore o sbiancamento.
8. Rimetti il topo nella gabbia su una borsa riscaldante. Osserva per 5–10 minuti per eventuali segni di disagio. Annota eventuali eventi avversi.
9. Esegui iniezioni su tutti i topi in ordine casuale entro una finestra di 2 ore.

4. Monitoraggio della glicemia e definizione del diabete

1. Inizia il monitoraggio della glicemia 7 giorni dopo l'iniezione. Misura la glicemia 2 volte a settimana fino al termine dello studio.
2. Rimuovi il cibo 2 ore prima della misurazione mantenendo l'accesso all'acqua.
3. Trattieni il topo. Pulisci la punta della coda con il 70% di etanolo.
4. Taglia la coda con una lancia o un ago sterile. Getta la prima goccia di sangue. Raccogli la seconda goccia su una striscia reattiva del glucometro. Annota i valori di glucosio nel sangue insieme all'identificazione del topo e alla data.
   NOTA: Usa un nuovo sito se la punta della coda si segna.
5. Definisci il diabete come glucosio nel sangue ≥ 250 mg/dL su due misurazioni consecutive separate da almeno 24 ore.
6. Eutanasiare topi che mostrano segni gravi della malattia secondo le linee guida istituzionali.

5. Raccolta, fissazione e lavorazione del pancreas

1. Eutanasia i topi secondo protocolli approvati. Disseziona e raccogli con cura il pancreas, compresi tutti i lobi.
2. Inserire il pancreas in formalina tamponata neutra al 10% con un rapporto minimo 10:1 tra il volume del fissatore e del tessuto. Riparare per 72 ore a temperatura ambiente.
   ATTENZIONE: Maneggiare la formalina in una cappa chimica con i DPI appropriati.
3. Trasferire i tessuti al 70% di etanolo dopo la fissazione.
4. Inviare tessuti fissi a una struttura di istologia per l'immersione della paraffina, sezionamento a 5 μm di spessore su vetrine carica positiva, colorazione di ematossilina ed eosina e immunoistochimica dell'insulina.
   NOTA: Richiedere sezioni non colorate se sono previste ulteriori analisi a valle.

6. Valutazione istologica e quantificazione dell'area dell'isolotto

1. Acquisire immagini intere con vetrine utilizzando uno scanner o un microscopio.
2. Immagini aperte nel software di riferimento. Annota manualmente gli isolotti usando gli strumenti appropriati.
3. Misura l'area dell'isolotto usando strumenti di annotazione.
4. Misurazioni di esportazione per analisi.
   NOTA: L'area totale dell'isolotto include cellule endocrine e infiltranti.

7. Varie analisi a valle

1. Calcola la superficie media degli isolotti per mouse. Confrontare i gruppi utilizzando test statistici appropriati.
2. Opzionale: Analisi proteomica spaziale (vedi Tabella Supplementare S1)
   1. Prepara sezioni FFPE su vetrine caricate positivamente. Invia i campioni a un fornitore di servizi di proteomica spaziale. Fornisci le specifiche dei pannelli anticorpi.
3. Opzionale: sequenziamento dell'RNA a singola cellula (vedi Tabella Supplementare S2)
   1. Preleva il pancreas e mettilo in mezzo freddo.
   2. Invia i campioni a una struttura centrale di genomica per l'isolamento di singola cellula e la preparazione della biblioteca.
   3. Processare i dati di sequenziamento utilizzando pipeline appropriate (ad esempio, Cell Ranger, Seurat).
   4. Depositare i dati di sequenziamento in un archivio pubblico prima della pubblicazione.

Risultati

Sebbene il protocollo più ampio descritto in questo manoscritto sia stato successivamente ottimizzato in un regime preventivo a dose singola, questi risultati pilota sono presentati qui esclusivamente per illustrare le letture istologiche e glicemiche attese raggiungibili con questo flusso di lavoro.

Il contesto generale della malattia e il contrasto tra pancreas diabetico sano e diabetico di tipo 1 sono illustrati schematicamente nella Fi...

Discussione

Una limitazione critica degli esiti rappresentativi qui presentati è che i dati forniti per illustrare gli endpoint analitici (Figura 3) sono stati derivati da una coorte pilota iniziale utilizzando un programma a due dosi. Poiché questo protocollo è stato perfezionato in un regime preventivo a dose singola, sono necessari futuri studi su larga scala che utilizzino il protocollo a dose singola ottimizzato descritto qui per stabilire un'efficacia statistica f...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Formalina Bufferizzata Neutra al 10% (NBF)	VWR	10790-714
Controller di cromo 10x Genomics	Spazio di lavoro di Genomica Molecolare TIGSS, Texas A & Università M
70% etanolo	VWR	89125-164
Vedute adesive per microscopio FFPE	Leica Biosystems	3800084E
Panel anticorpi FFPE per topi Akoya (~25 marcatori)	Akoya Biosciences	[ID pannello/pannello personalizzato]
Bioanalizzatore o TapeStation con kit DNA HS	Spazio di lavoro di Genomica Molecolare TIGSS, Texas A & M/ Agilent
BmΔ Ceppo batterico vjbR::tnaA	Materiale di laboratorio (Song/de Figueiredo labs)
Pipeline Cell Ranger	10x Genomica	v7.1
Cloranfenicolo	Prodotti di Ricerca Internazionale	56-75-7
Kit Chromium Next GEM Single Cell 3'	Genomica 10x tramite core TIGSS
Collagenasi da Clostridium histolyticum	Millipore Sigma	C7657-100MG
Colorazione nucleare DAPI	Akoya Biosciences	[Servizio fornito]
Embedding FFPE, H& Colorazione E, insulina IHC e scansione del vetrino	Laboratorio di Istologia VMBS, Texas A & Università M	https://vetmed.tamu.edu/vmbs-histology-lab/
Strisce reattive per il glucosio	EKF Diagnostica / Fisher Scientific	22-022-649
Strisce reattive per il glucosio (alternative)	Ascensia Diabetes Care	Strisce test-test CONTOUR NEXT
Glicerolo (ingombro, 500 mL)	Millipore Sigma	G7893-500ML
Glicerolo (sterile, 100 mL)	Sigma Aldrich (G Bioscienze)	G5516-100ml
GraphPad Prism (o pacchetto sopravvivenza R)	GraphPad Software / R	v10.2
Glucometro portatile	Ascensia Diabetes Care	CONTOUR NEXT EZ
Sequencer Illumina NextSeq 2000	Spazio di lavoro di Genomica Molecolare TIGSS, Texas A & Università M
Siringhe per insulina, 29 e linea; 30 G (U-100)	VWR	10002-702
Lancete per i test del diabete	Becton, Dickinson and Company (BD)	366594
Liberase TL Grado di Ricerca	Millipore Sigma	5401020001
Cuscinetti riscaldanti a bassa temperatura	Scienza della Condotta	RWD-69025
Kit di isolamento nuclei/cellula Miltenyi	Spazio di lavoro di Genomica Molecolare TIGSS, Texas A & M/ Miltenyi Biotec
Tappetino riscaldante per mouse (alternativo)	Kent Scientific	RightTemp
Contenitori per topi	Braintree Scientific	TV-RED 150-STD
Topi NOD/ShiLtJ (femmina, 5 settimane)	Il Laboratorio Jackson	Ceppo #001976
Kit a celle di flusso P2 XLEAP a 100 cicli	Illumina tramite nucleo TIGSS
Servizio di acquisizione dati e QC PhenoCycler	Akoya Biosciences
Reagenti PhenoCycler e flusso di lavoro di imaging	Akoya Biosciences	[Servizio fornito]
Sistema PhenoCycler-Fusion	Akoya Biosciences
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 1x	Thermo Fisher	10010023
Inibitore della RNasi Protettore	Millipore Sigma	3335402001
Fluorometro per qubit e kit per test HS dsDNA	Spazio di lavoro di Genomica Molecolare TIGSS, Texas A & M/ Thermo Fisher
QuPath	Open source	v0.4.3
Software R	Progetto R	v4.0+
Seurat (pacchetto R)	Satija Lab / CRAN	v4.3
StarDist	Open source	v0.8.3
Triptone Soy Agar (TSA)	VWR	CA90002-706