Articolo metodologico

Un quadro multimodale per la valutazione di co-colture di cellule immunitarie e organoidi di tumore del colon derivati dal paziente

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DOI:

10.3791/71204

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3 settembre 2026

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1Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Oncology and Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery, Albert Einstein College of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive l'allestimento di organoidi tumorali del colon derivati da pazienti in co-coltura con linfociti autologhi, seguito dal trattamento con piccole molecole terapeutiche e inibitori dei checkpoint immunitari per valutare la reattività dei linfociti T e l'efficacia del trattamento.

Abstract

I linfociti T svolgono un ruolo chiave nell'immunoterapia del cancro, e la comprensione delle loro interazioni con i tumori è essenziale per lo sviluppo di nuove immunoterapie. Questo protocollo descrive in modo dettagliato il flusso di lavoro per l'allestimento di organoidi derivati da pazienti con carcinoma del colon-retto (PDO) ottenuti dal nostro biobanca e per lo sviluppo di sistemi di co-coltura autologhi di PDO e linfociti T. Mediante l'utilizzo della colorazione con Annexina V NIR e della caspasi-3 tagliata, abbiamo standardizzato protocolli di citometria a flusso per la colorazione di superficie e intracellulare al fine di valutare la reattività e la citotossicità dei linfociti T, nonché l'uccisione degli organoidi tumorali. Oltre all'analisi basata sulla citometria a flusso, il protocollo include approcci metodologici per saggi funzionali, come i saggi ELISpot per quantificare il rilascio di granzima B e perforina, e l'immagine in tempo reale delle cellule vive per monitorare nel tempo l'uccisione tumorale mediata dai linfociti T mediante rilevamento dell'apoptosi basato sull'Annexina V. Questo flusso di lavoro descrive inoltre l'allestimento delle condizioni di co-coltura, inclusa l'introduzione di inibitori specifici e inibitori dei checkpoint immunitari sia in regime di monoterapia che di trattamento combinato. Vengono fornite linee guida per la selezione e l'applicazione di marcatori immunologici e associati al tumore, tra cui CD137 per la reattività dei linfociti T, CD107a per la degranulazione dei linfociti T, caspasi-3 per l'apoptosi tumorale e Ki67 per la proliferazione tumorale. Nel complesso, questo articolo fornisce un quadro completo e riproducibile per l'allestimento di organoidi del carcinoma del colon-retto, la coltura e l'espansione di linfociti T autologhi, l'allestimento della co-coltura, le perturbazioni terapeutiche e le analisi successive mediante citometria a flusso, ELISpot, microscopia confocale e imaging in tempo reale delle cellule vive.

Introduzione

Il cancro del colon-retto (CCR) rimane una delle principali cause di mortalità correlata al cancro a livello mondiale, nonostante i progressi nella diagnosi precoce e nelle terapie multimodali1. Una delle sfide principali per migliorare l'esito nei pazienti è la mancanza di modelli preclinici in grado di riprodurre accuratamente l'architettura complessa, l'eterogeneità intratumorale, le interazioni tra tumore e sistema immunitario e le risposte terapeutiche osservate nel CCR umano2,3,4,5,6. I modelli convenzionali, tra cui i modelli murini geneticamente modificati (GEMM) e i trapianti eterologhi derivati da pazienti (PDX), hanno notevolmente contribuito alla ricerca sul CCR, ma presentano limitazioni significative. I GEMM spesso non riescono a riprodurre la diversità dei tumori umani e vengono sviluppati in microambienti murini sostanzialmente diversi dalla fisiologia umana. Analogamente, i modelli PDX conservano alcuni aspetti dell'eterogeneità tumorale, ma sono costosi, richiedono molto tempo, dipendono da topi immunodeficienti e hanno capacità limitata nello studio delle risposte immunitarie specifiche dell'uomo a causa delle differenze tra le specie7,8. Inoltre, restrizioni sempre maggiori sull'uso di piccoli animali evidenziano la necessità di alternative più pertinenti all'uomo e sostenibili dal punto di vista etico.

Negli ultimi anni, gli organoidi derivati da pazienti (PDO) si sono affermati come una piattaforma innovativa per la ricerca traslazionale sul cancro. Gli organoidi CRC generati da campioni chirurgici freschi o da biopsie conservano le caratteristiche istologiche, genetiche e fenotipiche dei tumori primari, inclusa la diversità clonale e gli stati cellulari responsivi alle terapie. Queste proprietà rendono i PDO strumenti preziosi per la modellizzazione delle malattie, la genomica funzionale, la scoperta di biomarcatori e la medicina personalizzata7,8,9,10,11. In particolare, l'inclusione di componenti immunitarie umane nei sistemi organoidi ha ulteriormente ampliato la loro utilità. La co-coltura di organoidi CRC con cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) o sottoinsiemi immunitari ingegnerizzati permette di studiare le interazioni tra tumore e sistema immunitario, i meccanismi di fuga immunitaria, la presentazione dell'antigene e le risposte all'immunoterapia in un sistema fisiologicamente rilevante12. Tali modelli consentono di valutare inibitori dei checkpoint, terapie con CAR-T/TCR e anticorpi bivalenti, fornendo al contempo informazioni sui biomarcatori predittivi e sui meccanismi di resistenza.

Oltre all'immunoterapia, gli organoidi CRC sono diventati sempre più importanti per lo screening farmacologico e le applicazioni di oncologia di precisione. Le colture derivate dai pazienti possono essere testate con agenti chemioterapici e terapie mirate per prevedere le risposte individuali al trattamento, con diversi studi che hanno dimostrato correlazioni tra la risposta degli organoidi e gli esiti clinici. Questi sistemi forniscono quindi un'alternativa scalabile e centrata sul paziente agli approcci convenzionali basati sugli animali10,13,14,15,16,17,18.

In questo studio viene presentato un protocollo gestibile e scalabile per la generazione di organoidi derivati da pazienti con carcinoma del colon-retto (CRC) e la loro integrazione in sistemi di co-coltura con cellule immunitarie per la ricerca traslazionale e preclinica. I tessuti tumorali vengono dissociati enzimaticamente e inclusi in una matrice extracellulare tridimensionale in condizioni di crescita ottimizzate, che preservano l'eterogeneità tumorale e la differenziazione delle linee cellulari. Gli organoidi stabiliti possono essere espansi, criopreservati, manipolati geneticamente e utilizzati per applicazioni successive, tra cui caratterizzazione molecolare, studi di perturbazione farmacologica e analisi del profilo immunitario. Inoltre, la co-coltura con PBMC consente la valutazione della citotossicità mediata dal sistema immunitario, della sensibilità al blocco dei checkpoint immunitari e dell'attivazione immunitaria specifica per il tumore.

Descriviamo inoltre protocolli per l'elaborazione dei tessuti, la valutazione della qualità degli organoidi, l'analisi citometrica in flusso, l'imaging a immunofluorescenza e il monitoraggio immunitario basato su ELISpot. Nel complesso, questi sistemi basati su organoidi forniscono una piattaforma eticamente sostenibile e clinicamente rilevante per lo studio della biologia del carcinoma colorettale (CRC), della resistenza terapeutica, dell'eterogeneità tumorale e delle risposte all'immunoterapia. I progressi continui nell'ingegnerizzazione degli organoidi e nell'integrazione del microambiente stanno consolidando ulteriormente questi modelli come pilastro fondamentale della ricerca futura sul CRC e dell'oncologia di precisione.

Protocollo

Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato ai sensi del protocollo approvato dal comitato etico (IRB) della biobanca del Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center (Einstein IRB# 2021-13730). Il coordinamento clinico e il supporto normativo sono stati forniti dall'Ufficio per le Sperimentazioni Cliniche sui Tumori (CCTO). I tessuti tumorali sono stati raccolti dopo la resezione chirurgica e la revisione istopatologica di routine, quindi processati per fissazione in formalina, generazione di organoidi derivati dal paziente o crioconservazione in DMEM con 20% di FBS e 10% di DMSO. Tutte le preparazioni dei reagenti sono riportate nella Tabella 1.

1. Stabilimento di colture di organoidi tumorali da tessuto bioptico o di resezione (4 h)

  1. Posizionare il tessuto tumorale appena ottenuto in una piastra di Petri sterile e lavarlo 5 volte con il buffer di lavaggio per organoidi, ogni volta per 5 minuti sul ghiaccio. Utilizzando una lametta sterile o aghi fini, dissezionare il tessuto in piccoli cubi di circa 1–2 mm3.
    NOTA: Mantenere il tessuto umido con soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) fredda durante la dissezione per evitare che si secchi.
  2. Trasferire i frammenti di tessuto dissezionati in un tubo Falcon da 15 mL, lavarli una volta con soluzione salina tamponata al fosfato di Dulbecco (DPBS) e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Rimuovere con attenzione il soprannatante, quindi trasferire i cubetti di tessuto in una piastra sterile a 6 pozzetti o in una piastra di Petri da 35 mm.
  3. Utilizzando forbici sterili, angolate e autoclavate, ridurre ulteriormente il tessuto in pezzi più piccoli. Preparare una soluzione 1X di Collagenasi/DNA-Idrolasi delicata, diluendo 1 mL in 9 mL di DPBS. Aggiungere 10 µL di Y-27632 (inibitore ROCK) e 20 µL di Primocin.
  4. Aggiungere la soluzione di dissociazione preriscaldata nel tubo da 15 mL contenente i pezzi di tessuto. Rivestire nuovamente la punta del pipetto P1000 prima di aspirare e rilasciare più volte per agitare i frammenti di tessuto.
  5. Incubare il tubo da 15 mL in un bagno d'acqua oscillante a 37 °C per 30 minuti, capovolgendolo ogni 10 minuti. Lasciare sedimentare i frammenti di tessuto, trasferire la maggior parte della soluzione di digestione in un nuovo tubo e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
  6. Aggiungere 1 mL di DMEM al tubo originale da 15 mL e pipettare vigorosamente con una punta P1000 rivestita per dissociare meccanicamente i frammenti di tessuto e rilasciare ulteriori cripte.
  7. Controllare l'avanzamento al microscopio per verificare se il tessuto si sta frammentando in cellule singole o piccoli aggregati. Trasferire 10–20 µL della soluzione di DMEM con i frammenti di tessuto in una piastra di Petri ed esaminare al microscopio alla ricerca di cripte.
    NOTA: Il tempo di incubazione varia a seconda del tipo di campione. Per biopsie, il tempo di incubazione è 15–30 minuti, mentre per resezioni chirurgiche è 45–60 minuti.
  8. Una volta rilevate le cripte (o dopo 30 minuti per biopsie/60 minuti per resezioni), arrestare la digestione aggiungendo un volume uguale di mezzo basale freddo, quindi centrifugare a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
  9. Lavare il pellet con DPBS per risospendere, quindi centrifugare nuovamente. Facoltativamente, trasferire la sospensione in un tubo conico e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per ottenere un pellet cellulare.
    NOTA: Per CRC, la lisi dei globuli rossi di solito non è necessaria.
  10. Se il pellet appare rosso, lisare gli eritrociti incubando in 5 mL di buffer per la lisi dei globuli rossi per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo la lisi, riempire immediatamente il tubo con PBS e centrifugare nuovamente.
  11. Lavare il pellet una volta con DPBS. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere il soprannatante. Risospendere il pellet in un piccolo volume di mezzo. Contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro con esclusione al blu di tripano o un contatore cellulare automatico.
  12. Risospendere le cellule in Matrigel freddo (matrice della membrana basale) (Opzionale: concentrazione di circa 1,5–3 x 104 cellule per 10 µL di mezzo). Mescolare la sospensione cellulare con matrice della membrana basale utilizzando punte larghe refrigerate (alcuni laboratori usano un rapporto 1:1 tra matrice della membrana basale e mezzo completo per organoidi).
    NOTA: Mantenere la matrice della membrana basale e tutte le miscele fredda sul ghiaccio per evitare una polimerizzazione prematura.
  13. Piastrare circa 50 µL di gocce della miscela cellule–matrice della membrana basale in ogni pozzetto di una piastra da coltura sterile a 24 pozzetti preriscaldata. Incubare la piastra a 37 °C per 10–12 minuti per consentire alla matrice della membrana basale di solidificarsi in forma di cupola (posizionare la piastra capovolta).
  14. Dopo la solidificazione della matrice della membrana basale, capovolgere la piastra in posizione normale. Aggiungere con attenzione 500 µL/pozzetto di mezzo PDO contenente inibitore ROCK (1:1000) e Primocin (1:500).
    NOTA: Utilizzare il Primocin in tutti i mezzi di coltura fino all'istituzione di una biobanca di organoidi congelati per prevenire contaminazioni.
  15. Sostituire il mezzo per organoidi due volte alla settimana con mezzo per organoidi completo e fresco. Monitorare regolarmente la crescita degli organoidi al microscopio.

2. Isolamento di PBMC umani dal sangue (2 h)

  1. Aliquotare 5 mL di Histopaque in provette sterili da 15 mL Falcon, portare a temperatura ambiente ed aggiungere con attenzione un volume uguale di sangue umano fresco (fino a 5 mL) in alto. Sovrapporre lentamente il sangue lungo la parete della provetta sopra il Ficoll senza disturbare l'interfaccia; mantenere il volume totale ≤10 mL per provetta.
    NOTA: Mantenere strati distinti di Ficoll e sangue prima della centrifugazione per una separazione ottimale.
  2. Se si utilizzano più provette, bilanciarle correttamente nella centrifuga. Evitare mescolamenti o agitazioni. Il l'interfaccia sangue-Ficoll deve rimanere intatta
  3. Centrifugare a 1500 x g per 15 min a temperatura ambiente. Utilizzare 0 impostazioni del freno per evitare la perturbazione del gradiente. Dopo la centrifugazione, si formeranno strati distinti: a) lo strato inferiore di globuli rossi (RBC), b) la buffy coat intermedia di PBMC e c) lo strato superiore di plasma. Aspirare delicatamente e scartare il plasma fino a quando non diventa visibile lo strato della buffy coat.
    NOTA: Maneggiare delicatamente il tubo per evitare di disturbare lo strato di PBMC.
  4. Utilizzando una pipetta sterile nuova, aspirare con attenzione il strato del buffy coat contenente PBMC e trasferire le cellule in un nuovo sterile Tubo Falcon da 15 mL. Per rimuovere il Ficoll e le piastrine, lavare le cellule due volte con 10 mL di PBSA (PBS + 0,1% BSA) mediante centrifugazione a 1000 x g per 7 min a temperatura ambiente, scartando con attenzione il soprannatante dopo ogni lavaggio.
  5. Per rimuovere le piastrine residue, lavare una volta con PBSA, centrifugare a 200 x g per 7 min a temperatura ambiente. Scartare con attenzione il soprannatante. Se il pellet appare rosso, eseguire la lisi dei globuli rossi incubando in 5 mL di buffer per la lisi dei globuli rossi a 37 °C per 5 min, quindi lavare con PBSA e centrifugare a 200 x g per 7 min a temperatura ambiente.
  6. Risospendere il pellet di PBMC in 2 mL di DPBS o mezzo di coltura e determinare il numero di cellule vitali utilizzando l’esclusione al blu di tripano con emocitometro o contatore cellulare automatico. Se non utilizzate immediatamente, criopreservare le PBMC a 5–10 x 106 cellule/mL in 90% FBS e 10% DMSO. Congelare gradualmente a –80 °C per tutta la notte, quindi trasferire in azoto liquido per il congelamento a lungo termine.
  7. Espansione dei PBMC (7–12 giorni):
    1. Pellettare le cellule mediante centrifugazione a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente. Risospendere a 5 x 105 cellule/pozzetto in mezzo di espansione per linfociti T e attivare con un cocktail CD3/CD28.
    2. Stimolare le cellule con 500 UI/mL di IL-2 e incubare per 3 giorni. Al giorno 3, mescolare e contare le cellule, quindi espandere la coltura aggiungendo un mezzo di espansione per linfociti T integrato con IL-2.
    3. Regolare le cellule a una concentrazione di 1–2,5 x 10^5 cellule/mL in mezzo completo per l'espansione dei linfociti T, incubare per 2 giorni e monitorare la vitalità ogni 2–3 giorni durante l'espansione.
      NOTA: sostituire con mezzo completo fresco e caldo ogni 2-3 giorni (non superare >3 giorni). I PBMC possono essere criopreservati in un mezzo di congelamento per linfociti T per un uso futuro.

3. Co-coltura di organoidi (4 giorni):

  1. Preparazione e controllo qualità:
    1. Assicurarsi che gli organoidi siano sani, privi di contaminazioni e fenotipicamente caratterizzati prima della co-coltura. Ottenere i PBMC da donatori consenzienti o da fonti commerciali e confermare la vitalità e il fenotipo di base prima dell'uso.
    2. Stabilire se i PBMC verranno utilizzati freschi, riposati o pre-attivati, e se sono autologhi o allogenici. Valutare la vitalità degli organoidi, l'uniformità delle dimensioni e l'espressione dei marcatori prima della co-coltura.
    3. Convalidare la vitalità dei PBMC e la composizione immunitaria di base (marcatori CD3, CD4, CD8, NK, monociti), registrare i metadati del donatore.
  2. Isolamento degli organoidi per la co-coltura con PBMC:
    1. Rimuovere il mezzo di coltura e aggiungere in ogni pozzetto una soluzione di recupero cellulare preriscaldata per sciogliere la matrice extracellulare e rilasciare gli organoidi. Risospendere delicatamente gli organoidi con una punta pipettatrice a largo diametro e incubare brevemente finché la matrice non si dissolve e gli organoidi vengono rilasciati.
    2. Trasferire la sospensione in una provetta di raccolta, aggiungere 0,5 M EDTA se necessario e regolare il volume con un tampone equilibrato. Centrifugare per ottenere il pellet degli organoidi, eliminare il soprannatante, lavare con mezzo basale contenente integratori (HEPES e Glutamax) e antibiotici, quindi centrifugare nuovamente per riottenere il pellet.
    3. Risospendere gli organoidi in mezzo di coltura completo, seminare in una piastra trattata per colture cellulari e consentire un periodo di recupero di circa 24 ore prima di ulteriori lavorazioni.
  3. Recupero parallelo dei PBMC:
    1. Scongelare rapidamente i PBMC criopreservati seguendo le procedure standard e diluirli immediatamente in mezzo di espansione per linfociti T preriscaldato per minimizzare lo shock osmotico.
      NOTA: Una certa perdita cellulare è tipica durante lo scongelamento; il preriscaldamento del mezzo migliora il recupero.
    2. Centrifugare i PBMC scongelati a 400 x g per ottenere il pellet cellulare, rimuovere il mezzo di congelamento e incubare brevemente in mezzo di espansione per linfociti T contenente benzonasi per ridurre l'aggregazione cellulare e migliorare la qualità della sospensione monocellulare.
    3. Lavare e riottenere il pellet dei PBMC in mezzo di espansione fresco, quindi risospendere in mezzo di coltura per linfociti T integrato con citochine (ad esempio, IL-2) per sostenere vitalità e recupero. Seminare i PBMC in una piastra multipozzetto per un periodo di riposo notturno prima della co-coltura.
  4. Preparazione pre-co-coltura (1 giorno prima della co-coltura):
    1. Trattare opzionalmente gli organoidi con una citochina immunostimolatoria (ad esempio, IFN-γ) prima della co-coltura per potenziare i percorsi di presentazione dell'antigene.
    2. Preparare la piastra per la co-coltura almeno 24 ore in anticipo rivestendo i pozzetti con un anticorpo co-stimolatorio (ad esempio, anti-CD28) e conservare a 4 °C. Prima dell'uso, rimuovere l'anticorpo non legato e lavare i pozzetti due volte con DPBS.
  5. Dissociazione degli organoidi in cellule singole (giorno dell'esperimento di co-coltura):
    1. Raccogliere gli organoidi pre-stimolati, ottenere il pellet e rimuovere il soprannatante, quindi risospendere in un reagente enzimatico di dissociazione (ad esempio, TrypLE) insieme a eventuali cellule aderenti per recuperare l'intera popolazione cellulare.
    2. Incubare con mescolamento delicato e monitorare al microscopio finché la maggior parte degli organoidi non si dissocia in cellule singole o piccoli aggregati, evitando un'eccessiva digestione.
    3. Neutralizzare il reagente di dissociazione con tampone, ottenere il pellet cellulare, rimuovere il soprannatante e risospendere in mezzo di coltura per linfociti T per il conteggio e la miscelazione.
  6. Conteggio cellulare e preparazione per la co-coltura:
    1. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare e determinare il numero di cellule vitali utilizzando un emocitometro o un contatore automatico con un colorante per la vitalità. Regolare il rapporto tumore–PBMC alla densità desiderata nel mezzo per linfociti T.
    2. Preparare i PBMC ottenendo il pellet, risospendendoli in mezzo fresco e determinando il numero di cellule vitali. Lavare e risospendere i PBMC in mezzo per linfociti T integrato con citochine (ad esempio, IL-2) e anticorpi immunomodulatori opzionali (ad esempio, anti-PD-1) secondo necessità.
  7. Eseguire la co-coltura:
    1. Combinare cellule tumorali dissociate e PBMC al rapporto effettore:bersaglio desiderato. Lavare i pozzetti rivestiti con anti-CD28 prima di aggiungere le cellule, evitando l'essiccamento.
    2. Seminare la miscela organoide–PBMC al volume richiesto per il saggio e incubare in condizioni di coltura standard. Rinnovare o suddividere le colture secondo necessità durante l'esperimento.
  8. Progettazione sperimentale e controlli (per la strategia di trattamento):
    1. Utilizzare il sistema di co-coltura per valutare come farmaci (ad esempio, inibitori dei checkpoint o piccole molecole) modulano le risposte dei PBMC agli organoidi tumorali.
    2. Includere repliche biologiche (più linee di organoidi e donatori di PBMC) e repliche tecniche (almeno tre pozzetti per condizione).
    3. Includere controlli: solo organoide, solo PBMC (veicolo o attivati), organoide + PBMC (veicolo), organoide + farmaco, e PBMC + farmaco.
  9. Quadri temporali tipici per i punti di analisi della co-coltura:
    1. Analizzare le co-colture a 24, 48 e 72 ore dall'inizio per valutare l'attivazione immunitaria, la proliferazione, la secrezione di citochine, l'apoptosi e la distruzione delle cellule tumorali.
    2. Valutare i marcatori precoci di attivazione e la secrezione di citochine a 24 ore, e analizzare citotossicità, proliferazione e marcatori di attivazione/esaurimento a 48–72 ore mediante citometria a flusso, imaging o saggi di vitalità.
      NOTA: Punti temporali successivi (ad esempio, giorni 5–7) possono essere inclusi per valutare l'attivazione cronica, l'esaurimento immunitario o le risposte farmacologiche a lungo termine.
  10. Colorazione immunofluorescente degli organoidi:
    1. Lavare i vetrini in PBS per 5 minuti e fissarli in una soluzione di paraformaldeide al 4% (PFA) per 20 minuti a temperatura ambiente (RT). Dopo la fissazione, lavare i vetrini in PBS due volte per 5 minuti ciascuno.
      NOTA: Mantenere gli organoidi idratati durante tutta la colorazione. I vetrini possono essere conservati in PBS a temperatura ambiente per un massimo di 3 ore se necessario, ma evitare la conservazione notturna in PBS.
    2. Permeabilizzare gli organoidi con Triton X-100 0,1–0,5% in PBS per 15–20 minuti a temperatura ambiente per consentire la colorazione intracellulare e nucleare preservando la struttura degli organoidi.
      NOTA: Evitare una permeabilizzazione eccessiva, poiché può alterare la struttura degli organoidi. Una corretta permeabilizzazione assicura una colorazione uniforme del citoplasma e del nucleo preservando la morfologia per l'imaging.
    3. Lavare i vetrini due volte con tampone IF 1x e bloccare con BSA 1–10% (o siero omologo) in tampone IF per 60–120 minuti a temperatura ambiente per ridurre la colorazione non specifica.
      NOTA: L'BSA è adatto per un blocco generale, ma si raccomanda l'uso di siero omologo per la colorazione di marcatori specifici, al fine di ridurre il legame non specifico e migliorare la specificità del segnale.
    4. Lavare i vetrini tre volte (5 minuti ciascuno) e incubare con anticorpi primari (10–50 µg/mL) in tampone di blocco con siero 1% in una camera umidificata per tutta la notte a 4 °C.
      NOTA: Coprire i vetrini con parafilm per prevenire l'evaporazione e ottimizzare la concentrazione dell'anticorpo primario mediante titolazione per ottenere una colorazione specifica con fondo minimo.
    5. Lavare i vetrini in IF 1x per 3 x 5 minuti.
      NOTA: Il lavaggio deve essere ottimizzato per ogni singola colorazione con anticorpo. Se si utilizzano più anticorpi primari contemporaneamente, il lavaggio deve essere standardizzato.
    6. Incubare i vetrini con anticorpi secondari coniugati a fluorofori (1:200–1:500 in tampone di blocco con siero 1%) in una camera umidificata per tutta la notte a 4 °C o per 2 ore a temperatura ambiente al buio.
      NOTA: Dopo l'aggiunta dell'anticorpo secondario, eseguire tutti i passaggi successivi al buio per prevenire lo sbiancamento dei fluorofori.
    7. Lavare i vetrini con tampone IF 1x (2 x 5 minuti) seguito da PBS (5 minuti). Incubare con DAPI (1 µg/mL) e anticorpi coniugati ad AlexaFluor-594 (20 µg/mL) in tampone di blocco con siero 5% per 1 ora a temperatura ambiente al buio, quindi lavare con PBS (3 x 5 minuti).
    8. Aggiungere mezzo di montaggio sui vetrini e coprivetrini, quindi capovolgere il coprivetrino sul vetrino evitando bolle d'aria. In alternativa, se si utilizza un mezzo di montaggio contenente DAPI, omettere la colorazione con DAPI. Utilizzare un mezzo di montaggio rigido per applicazioni di scansione dei vetrini.
    9. Lasciare asciugare i vetrini a temperatura ambiente per un'ora, conservarli a –20 °C e acquisire le immagini mediante microscopia confocale o uno scanner di vetrini.

4. Protocollo di citometria a flusso e colorazione intracellulare per organoidi

  1. Aspirare con attenzione il mezzo di coltura degli organoidi e lavare delicatamente gli organoidi una volta con PBS 1x per rimuovere il mezzo residuo e le proteine sieriche. Rilasciare gli organoidi dalla matrice extracellulare utilizzando PBS freddo o una soluzione di recupero, pipettando delicatamente per rompere la matrice, minimizzando al contempo lo stress da taglio.
  2. Trasferire la sospensione di organoidi in una provetta da centrifuga, centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 °C e rimuovere il soprannatante. Risospendere il pellet di organoidi in 250–500 µL di soluzione di TrypLE 0,05% per la dissociazione enzimatica. Incubare a 37 °C per una digestione efficiente delle giunzioni intercellulari.
    NOTA: Ogni 5 min, mescolare delicatamente la sospensione agitando leggermente e pipettando su e giù, e monitorare al microscopio finché non si ottiene una sospensione monocellulare senza eccessiva digestione.
  3. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 µm per rimuovere gli aggregati. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min a 4 °C e risospendere in PBS 1x senza tampone contenente Ca2+ / Mg2+.
  4. Contare le cellule e regolare la concentrazione a ~1 x 106 cellule/mL in tampone di marcatura. Incubare con blocco Fc (1:200) e colorante per la vitalità (ad esempio, Live/Dead Blue, 1:1000–1:3000) per ridurre il legame non specifico e identificare cellule vive/morte.
  5. Incubare le cellule per 30 min a temperatura ambiente al buio, quindi lavare una volta con PBS 1x e una volta con tampone di marcatura.
  6. Preparare il cocktail di anticorpi per la superficie cellulare mescolando ciascun anticorpo alla sua diluizione di lavoro ottimizzata nel tampone di marcatura e calcolando i volumi totali utilizzando i valori titolati in µL/test per il mix master.
    NOTA: Se il pannello contiene più fluorocromi basati su polimeri (ad esempio, Brilliant Violet, Brilliant Ultraviolet o coloranti Brilliant Blue), includere Brilliant Stain Buffer (BSB) nel cocktail di anticorpi per ridurre le interazioni tra fluorocromi e migliorare la risoluzione del segnale. Aggiungere BSB seguendo le istruzioni del produttore (tipicamente concentrazione finale 1x), mescolare delicatamente e preparare un mix master per tutti i campioni (~10% di volume aggiuntivo). Proteggere dalla luce e mantenere in ghiaccio fino all'uso.
  7. Aggiungere il cocktail di anticorpi e incubare per 30–50 min a temperatura ambiente al buio. Lavare con tampone di marcatura e PBS (senza Ca2+/Mg2+), quindi centrifugare a 500 x g per 5 min. Preparare la soluzione di fissazione/permeabilizzazione di lavoro diluendo il concentrato con il diluente. Ad esempio, 1 parte di concentrato : 3 parti di diluente (per ottenere una concentrazione lavorativa 1x o quella specificata).
  8. Aggiungere la soluzione di fissazione/permeabilizzazione per risospendere completamente le cellule (~100–200 µL per ogni milione di cellule) e incubare per 15–20 min a temperatura ambiente o a 2–8 °C, protetto dalla luce. Al termine della fissazione, lavare le cellule con tampone di permeabilizzazione 1x. Rimuovere il soprannatante. Ripetere il lavaggio almeno una volta (a volte due volte) per rimuovere l'eccesso di fissativo.
  9. Preparare un cocktail di anticorpi intracellulari diluendo gli anticorpi coniugati con fluorocromi a concentrazioni ottimizzate in tampone di permeabilizzazione 1x. Aggiungere il cocktail di anticorpi intracellulari alle cellule permeabilizzate, inclusi gli anticorpi diretti contro citochine, fattori di trascrizione o proteine fosforilate, secondo necessità.
  10. Incubare le cellule per 2 h a temperatura ambiente al buio.
    NOTA: Se necessario, l'incubazione può essere accorciata al tempo minimo raccomandato dal produttore o eseguita durante la notte a 4 °C al buio senza compromettere la qualità della marcatura.
  11. Lavare le cellule due volte con tampone di permeabilizzazione 1x e una volta con tampone di marcatura, quindi risospendere il pellet in 250–300 µL di tampone di marcatura.
  12. Filtrare la sospensione attraverso un filtro da 40 µm per ottenere una sospensione monocellulare e mantenere i campioni in ghiaccio o a 4 °C, protetti dalla luce, fino all'analisi. Evitare un prolungato stoccaggio dei campioni marcati e acquisire i campioni sul citometro il più presto possibile dopo la marcatura.
  13. Utilizzare un citofluorimetro dotato di laser e filtri appropriati compatibili con i fluorocromi. Impostare i controlli di compensazione, inclusi campioni singolarmente marcati e controlli fluorescence-minus-one (FMO).
  14. Acquisire almeno 50.000–100.000 eventi per campione per un'analisi statistica robusta. Analizzare i dati utilizzando FlowJo, FCS Express o software equivalenti. Applicare il gating su cellule vive e singole. Analizzare l'espressione dei marcatori di superficie e intracellulari.
    NOTA: Titolare ciascun coniugato anticorpo-fluorocromo mediante diluizioni seriali per identificare la concentrazione ottimale che fornisce segnale massimo, fondo minimo e chiara separazione delle popolazioni.

5. Analisi dell'apoptosi basata sull'Annexina V mediante citometria a flusso:

  1. Controlli e reagenti essenziali:
    1. Controllo non colorato: stabilisce la linea di base della autofluorescenza cellulare, consentendo di discriminare il segnale positivo reale dal rumore di fondo.
    2. Controlli con colorazione singola: necessari per ogni fluorocromo nel pannello, per permettere una corretta compensazione (citometria convenzionale) o la separazione spettrale (citometria spettrale). Questi garantiscono una separazione accurata del segnale tra i diversi canali.
    3. Controlli con fluorescenza meno uno (FMO): essenziali per definire le finestre di analisi (gate) per popolazioni deboli o transitorie. Aiutano a prevenire la sovrastima di eventi debolmente positivi.
    4. Controllo positivo per l'apoptosi: un campione indotto deliberatamente ad andare incontro ad apoptosi (ad esempio, cellule trattate con staurosporina) conferma che il saggio rilevi in modo affidabile gli eventi apoptotici.
    5. Controlli isotipici: non utili per Annexina V stessa, poiché il legame è specifico per i fosfolipidi e non mediato da anticorpi. Tuttavia, possono essere inclusi per ulteriori anticorpi verso marcatori di superficie, se necessario.
      NOTA: utilizzare un buffer di legame per Annexina V contenente ioni calcio, poiché il legame di Annexina V dipende dal calcio; usare un buffer commerciale o validato equivalente.
    6. Un colorante vitalità impermeabile alla membrana (ad esempio, PI, 7-AAD, DAPI o coloranti vitali fissabili) viene utilizzato per distinguere le cellule apoptotiche precoci da quelle apoptotiche tardive o necrotiche. Selezionare un colorante compatibile con i laser del citofluorimetro e con le condizioni di fissazione.
  2. Procedura di colorazione:
    1. Raccogliere le cellule in co-coltura centrifugando le piastre a 500 x g per 5 minuti. Aspirare con attenzione e rimuovere il soprannatante per eliminare il mezzo di coltura e i detriti in sospensione. Lavare le cellule due volte con buffer di colorazione freddo (ad esempio, PBS con 1–2% di FBS) per ridurre la colorazione di fondo ed eliminare proteine interferenti.
    2. Se sono necessari marcatori di linea o di sottopopolazione (ad esempio, CD8 per PBMC, marcatori di cellule staminali tumorali come Lgr5 nelle cellule tumorali), incubare le cellule con miscele di anticorpi per 30–45 minuti a temperatura ambiente su un agitatore delicato, al riparo dalla luce. La colorazione della superficie in questa fase preserva l'integrità dell'antigene e permette un'analisi specifica per compartimento.
    3. Lavare le cellule due volte: prima con buffer di colorazione freddo per rimuovere gli anticorpi non legati, seguito da buffer di legame per Annexina V (ad esempio, BioLegend n. cat. 422201) per garantire la disponibilità di calcio. Regolare la concentrazione cellulare a circa 1 x 106 cellule/mL nel buffer di legame.
    4. Aggiungere 5 µL di reagente Annexina V coniugata a fluorocromo a 100 µL di sospensione cellulare per ogni campione. Il fluorocromo scelto deve essere spettralmente compatibile con gli altri coloranti nel pannello.
    5. Eseguire una colorazione di contro con un colorante di vitalità come PI, 7-AAD o DAPI. Per PI e DAPI, le diluizioni ottimali variano tipicamente da 1:1000 a 1:60.000, a seconda dello strumento e dell'intensità del laser, e devono essere determinate empiricamente. I coloranti di vitalità fissabili sono preferibili se è richiesta una fissazione successiva.
    6. Risospendere delicatamente le cellule mediante pipettaggio su e giù e incubare per 20–40 minuti a temperatura ambiente al buio. Il tempo di incubazione ottimale deve essere determinato empiricamente, poiché un'incubazione eccessiva potrebbe aumentare il legame non specifico o i falsi positivi.
    7. Aggiungere 200 µL di buffer di legame per Annexina V in ogni pozzetto (minimo 100 µL se i campioni sono altamente concentrati). Questo fornisce un volume sufficiente per la citofluorimetria e mantiene le condizioni del buffer durante l'acquisizione. Acquisire i campioni tempestivamente su un citofluorimetro calibrato, assicurandosi che le impostazioni di voltaggio siano ottimizzate per risolvere chiaramente le popolazioni negative e positive.
  3. Strategia di gating raccomandata:
    1. Utilizzare i grafici di scatter anteriore (FSC) rispetto a scatter laterale (SSC) per eliminare detriti piccoli e aggregati grandi, mantenendo solo cellule integre. Applicare il gating FSC-A vs FSC-H (o FSC-W) per rimuovere doppietti e aggregati, assicurando che vengano analizzate solo cellule singole.
    2. In base al colorante di vitalità, escludere le cellule morte fortemente positive, se appropriato. In alternativa, includere il colorante nei quadranti di analisi per Annexina V. Utilizzare marcatori di superficie per distinguere i PBMC (ad esempio, CD45+) dalle cellule tumorali (ad esempio, EpCAM+ o un altro marcatore specifico del tumore). Ciò consente una quantificazione specifica per compartimento dell'apoptosi.
    3. All'interno di ciascun compartimento selezionato, riportare Annexina V rispetto al colorante di vitalità per ottenere quattro popolazioni: a) Annexina V− / Colorante− = cellule vitali; b) Annexina V+ / Colorante− = cellule apoptotiche precoci; c) Annexina V+ / Colorante+ = cellule apoptotiche tardive o necrotiche; d) Annexina V− / Colorante+ = cellule primariamente necrotiche o artefatti (da interpretare con cautela).
    4. Ulteriormente suddividere i PBMC in sottopopolazioni (ad esempio, cellule T CD4, cellule T CD8, cellule NK, monociti) per esaminare i profili di apoptosi in specifiche popolazioni immunitarie.

6. Saggio ELISPOT per il monitoraggio delle cellule T in colture co-colturali con organoidi (3 giorni):

  1. Al Giorno 0, lavare la piastra a 96 pozzetti con membrana PVDF pre-ricoperta e attivarla. Conservare a 4 °C per 24 h seguendo il protocollo del kit ELISpot per la rilevazione dell'anticorpo/citochina di interesse.
  2. Al Giorno 1,
    1. Preparare gli organoidi come sospensione cellulare singola come descritto nella sezione 3.5. Centrifugare a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT), quindi risospendere nel mezzo CTL (fornito con il kit CTL ELISpot). Scongelare i PBMC criopreservati o utilizzare i PBMC appena isolati. Centrifugare i PBMC a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente.
    2. Risospendere i PBMC nel mezzo del kit. Eseguire la co-coltura mescolando delicatamente le cellule singole degli organoidi con i PBMC in un rapporto di 5:1. Aggiungere 200 µL/pozzetto della miscela di co-coltura in ogni pozzetto della piastra per saggio preattivata a 96 pozzetti. Agitare molto delicatamente la piastra. Incubare per 4 h a 37 °C. Dopo 4 h, rimuovere delicatamente la piastra per saggio dall'incubatore. Aggiungere i trattamenti ai pozzetti designati includendo controlli positivi e negativi appropriati.
      NOTA: Il rapporto organoidi:PBMC deve essere ottimizzato per ottenere uno sviluppo ottimale delle macchie di citochina e risultati di scansione.
  3. Al Giorno 2,
    1. Dopo 24 h di incubazione, seguire il protocollo di colorazione del produttore. Prevedere controlli per la rilevazione monocromatica e bicolore al fine di confrontare il numero di cellule che secernono i marcatori specificati. Il tempo di incubazione varia a seconda del colore e lo sviluppo delle macchie deve essere monitorato regolarmente. Scansionare la piastra seguendo le istruzioni del produttore. Riportare in grafico e confrontare le macchie immunitarie secrete.
      NOTA: In base alla progettazione sperimentale e ai marcatori di interesse, la relazione tra le cellule seminate e le macchie indica l'espressione della citochina/anticorpo in monocromia o bicolore.

7. Rilevamento in tempo reale dell'apoptosi mediante Annexina V NIR e imaging di cellule vive (3 giorni):

Abbinato all'immagineggiatura automatizzata di cellule vive, l'Annexina V NIR consente il monitoraggio in tempo reale ad alta produttività della morte cellulare apoptotica per l'analisi della risposta ai farmaci e della citotossicità.

  1. Al Giorno 0, preparare gli organoidi come sospensione di singole cellule. Colorare le cellule con un tracciante GFP. Seminare le singole cellule colorate in 100 µL di mezzo completo per pozzetto. Lasciare attaccare le cellule e formare aggregati.
    NOTA: Utilizzare piastre a fondo rotondo da 96 pozzetti, con superficie ultra-antidaderenza. Densità di semina tipiche (da ottimizzare empiricamente): 5.000 cellule/pozzetto, 10.000 cellule/pozzetto. Includere pozzetti per controllo negativo non trattato, controllo del veicolo e eventuali trattamenti sperimentali (in triplicato o più).
  2. Al Giorno 1, scongelare i PBMC criopreservati o utilizzare PBMC appena isolati. Centrifugare i PBMC a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente. Risospendere i PBMC in mezzo di espansione supplementato con IL-2 e incubarli nell'incubatrice.
  3. Al Giorno 2, colorare i PBMC con un colorante tracciante giallo. Dopo la colorazione, risospendere i PBMC in RPMI. Rimuovere con molta delicatezza il mezzo degli organoidi dalla piastra. Eseguire la co-coltura mescolando delicatamente le singole cellule degli organoidi con i PBMC in rapporto 1:5. Aggiungere 200 µL di mezzo RPMI contenente i PBMC in ogni pozzetto della miscela di co-coltura. Toccare con molta cautela la piastra e posizionarla nell'incubatrice.
    NOTA: Evitare di disturbare le singole cellule degli organoidi sul fondo dei pozzetti.
  4. Incubare per 2–4 h a 37 °C. Dopo 4 h, rimuovere delicatamente la piastra dall'incubatrice.
  5. Preparare i pozzetti con i farmaci, includendo controlli positivi e negativi appropriati. Ricostruire il reagente liofilizzato di Annexina V NIR in 100 µL di mezzo completo o PBS, mescolando delicatamente. Preparare un mezzo di trattamento 2x contenente Annexina V NIR alla doppia della concentrazione finale di lavoro (ad esempio, 1:100 per una diluizione finale 1:200) e assicurarsi che il mezzo contenga ≥1 mM Ca2⁺.
  6. Aggiungere nei pozzetti una diluizione 1:200 di Annexina V NIR. Posizionare la piastra in un'incubatrice per imaging in tempo reale per le successive 48–72 h.
    NOTA: Il rapporto organoidi:PBMC deve essere ottimizzato per garantire interazioni cellula-cellula sufficienti e risposte apoptotiche misurabili.
  7. Imaging e analisi in tempo reale
    1. Utilizzare un obiettivo 4x o 10x e acquisire immagini nel canale NIR per Annexina V NIR (e canali aggiuntivi se si esegue la moltiplexazione). Scansionare la piastra ogni 4–6 h per 24–72 h, a seconda della durata del trattamento.
    2. Utilizzare un software per imaging in tempo reale come l'IncuCyte CX3. Per una quantificazione di base, analizzare il canale NIR utilizzando l'area totale o il conteggio degli oggetti; per la cinetica a livello di singola cellula, utilizzare i moduli di analisi Cell-by-Cell o Object. Se si esegue la moltiplexazione (ad esempio, tracciante cellulare giallo e GFP), verificare le note sulla separazione spettrale.

Risultati

Per iniziare, abbiamo generato organoidi tumorali da campioni di diversi pazienti utilizzando un protocollo standardizzato (Figura 1). Questi PDO richiedono tipicamente 2 settimane per l'allestimento, dopo di che possono essere espansi e sottoposti a passaggio per ulteriori ricerche. Va notato che il tempo di allestimento e la generazione degli organoidi variano in base ai tessuti. Ad esempio, alcuni tessuti necessitano di ulteriore tempo per generare gli organoidi e alcuni organoidi richiedono più tempo per raggiungere la confluenza appropriata per essere passati. Gli integratori del mezzo di coltura per gli organoidi possono essere regolati di conseguenza.

Successivamente, abbiamo utilizzato il protocollo descritto in questo articolo (Figura 2) per stabilire una co-coltura di organoidi e linfociti T. I PBMC isolati dal sangue periferico del paziente sono stati espansi come descritto. Il rapporto tumore:linfocita deve essere ottimizzato, poiché rapporti al di fuori di questo intervallo possono produrre risultati diversi. Un rapporto più basso potrebbe limitare l'entità delle interazioni tra organoidi e linfociti T.

Per valutare la funzionalità del sistema di co-coltura, abbiamo effettuato un'analisi parallela mediante imaging di immunofluorescenza di organoidi e co-coltura, confrontando Ki67 e caspasi-3 tagliata come biomarcatori di proliferazione e apoptosi, rispettivamente (Figura 3). La vitalità e la funzionalità della co-coltura sono state dimostrate mediante colorazione con Annexina V e DAPI. Per distinguere le cellule T dagli organoidi, le cellule immunitarie e gli organoidi sono stati prima colorati come descritto e analizzati mediante citometria a flusso (Figura 4A). Dopo i trattamenti, le co-colture sono state colorate con Annexina V e DAPI e analizzate mediante citometria a flusso. I marcatori Cell Trace permettono la misurazione separata dell'apoptosi delle cellule T (Figura 4B) e degli organoidi (Figura 4C).

I biomarcatori immunitari CD107a e CD137 sono stati inoltre valutati mediante citometria a flusso (Figura 5A). Entrambi i marcatori indicano tipicamente l'attivazione o la degranulazione dei linfociti T. In questo studio, dopo la co-coltura, la reattività dei linfociti T può essere valutata mediante l'espressione di CD107a e CD137 (Figura 5 B, C). Successivamente, è stato utilizzato un sistema di imaging su cellule vive per monitorare l'apoptosi delle colture co-colturali PDO-cellule T durante il trattamento. Il qualitativo (Figura 6A) e quantitativa (Figura 6B) analisi mostrano l'apoptosi degli organoidi in diverse condizioni durante un periodo di 33 ore. La piattaforma IncuCyte CX3 è stata utilizzata per monitorare in continuo le interazioni tra organoidi tumorali e PBMC. L'intervallo di scansione può essere impostato al punto temporale desiderato dopo ogni trattamento.

È stato eseguito un saggio Immunospot per quantificare la secrezione delle citochine Granzima B e Perforina in colture organoidi in co-coltura trattate con il farmaco A e anti-PD-1, in monoterapia e in combinazione, per 24 h. Abbiamo utilizzato un ELISpot a doppio colore per la co-coltura di PDO del carcinoma colorettale (Figura 7). È importante notare che il rapporto tra organoidi e linfociti può produrre profili citochinici diversi.

Preparazione del tessuto tumorale: digestione meccanica e chimica; organoidi derivati da paziente; risultati della microscopia.
Figura 1. Stabilizzazione di organoidi tumorali CRC. (A) Procedura grafica per la stabilizzazione di organoidi tumorali. (B) Organoidi derivati da paziente rappresentativi ormai stabilizzati. Immagini a ingrandimento 4X di colture PDO stabilizzate durante la crescita normale (acquisite con Echo Revolve utilizzando la microscopia a contrasto di fase). Barra della scala = 200 µm. Questa figura è stata modificata da Mohammadi M et al. 19. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Diagramma del processo di trattamento del cancro del colon: isolamento dei PBMC del paziente, espansione dei linfociti T, analisi della co-coltura.
Figura 2. Procedura grafica della co-coltura di organoidi tumorali e cellule immunitarie e analisi successiva. Gli organoidi tumorali vengono stabiliti in parallelo con l'isolamento e l'espansione delle cellule immunitarie. Sospensioni cellulari singole di organoidi tumorali e cellule immunitarie vengono co-coltivate in rapporti definiti. Dopo 24 h, le co-colture vengono trattate. Le analisi successive vengono effettuate come descritto in questo protocollo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Microscopia a fluorescenza di organoidi; colorazione con DAPI, Caspasi-3, Ki67; co-coltura di PDO CRC e PBMC.
Figura 3. Confronto tra organoidi e co-coltura dopo 24 h. È stata eseguita una microscopia confocale per valutare i marcatori Ki67 (proliferazione) e caspasi-3 clivata (apoptosi) con un ingrandimento di 40X. Gli organoidi sono stati seminati e posti in co-coltura con cellule immunitarie autologhe. Sono stati inoltre colorati con DAPI per la visualizzazione del nucleo. Barra della scala = 20 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Analisi dei dati di citometria a flusso; include grafici di vitalità cellulare. Diagramma dell'esperimento sull'apoptosi cellulare.
Figura 4. Quantificazione dell'apoptosi in colture co-colturali mediante saggio di citometria a flusso per l'apoptosi. (A) Strategia di gating in citometria a flusso che mostra l'etichettatura delle cellule tumorali con CellTrace Far Red e delle cellule T con CellTrace Far Yellow. I grafici Annexin V vs DAPI mostrano la vitalità delle cellule T e degli organoidi dopo 48 h. (B) Quantificazione della vitalità delle cellule T in diverse condizioni di trattamento. (C) Quantificazione dell'apoptosi degli organoidi tumorali in diverse condizioni di trattamento. L'esperimento è stato eseguito in triplicato. Il farmaco A e il farmaco B sono stati valutati come terapie mirate da soli e in combinazione con anti-PD-1 (nivolumab). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Diagrammi di analisi della citometria a flusso; sottopopolazioni di linfociti T CD8, PDO del CRC, co-coltura di PBMC; studio di attivazione.
Figura 5. Valutazione dei marcatori immunitari nella co-coltura di organoidi tumorali del carcinoma del colon-retto (CRC) con cellule immunitarie. (A) Strategia di gating nella citometria a flusso per rilevare linfociti T CD8+ che esprimono i marcatori di attivazione linfocitaria T CD107a e CD137. (B) Confronto dei livelli di espressione di CD107a nei linfociti T CD8+ provenienti dalle co-colture in diversi gruppi di trattamento. (C) Confronto dei livelli di espressione di CD137 nei linfociti T CD8+ provenienti dalle co-colture in diversi gruppi di trattamento. Il farmaco A e il farmaco B sono stati valutati come terapie mirate, sia singolarmente che in combinazione con anti-PD-1 (nivolumab). L'esperimento è stato eseguito in triplice replicato. L'istogramma mostra la percentuale media con deviazione standard (SD) dei marcatori nei diversi gruppi (p = 0.0023 mediante ANOVA a un fattore). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Esperimento di co-coltura di organoidi; immagini al microscopio; analisi farmacologica e grafico temporale di CRC-PDOs+PBMCs.
Figura 6. Analisi di imaging a cellule vive della co-coltura di organoidi tumorali e cellule immunitarie. (A) Immagini rappresentative a cellule vive (registrazioni a breve intervallo di tempo) di organoidi tumorali e cellule immunitarie acquisite mediante il sistema IncuCyte CX3 al Giorno 0. Gli organoidi tumorali sono etichettati in verde con un colorante fluorescente per distinguerli dalle cellule mononucleate del sangue periferico colorate con tracciante cellulare giallo, colorante fluorescente (PBMCs; blu). (B) Quantificazione della apoptosi degli organoidi tumorali durante la co-coltura in diverse condizioni di trattamento. La morte cellulare apoptotica è stata monitorata mediante il saggio Annexin V Near-Infrared (NIR) durante un imaging continuo a cellule vive per un periodo di 33 h. Barra della scala = 1 mm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Risultati dell'esperimento di co-coltura di organoidi del cancro del colon-retto; i diagrammi mostrano i livelli di secrezione e gli effetti di farmaci e trattamenti.
Figura 7. Risultati rappresentativi dell'ELISpot per la quantificazione delle citochine (granzima B e perforina) nella co-coltura di organoidi del carcinoma colorettale e cellule immunitarie. (A) Immagini rappresentative del saggio immunitario e sviluppo delle secrezioni di granzima B umano (rosso) e perforina (blu) mediante stimolazione e trattamento delle cellule effettrici dopo 24 ore di co-coltura. (B) Secrezioni a doppio colore (perforina in blu e granzima B in rosso). (C) Secrezione di perforina per ogni condizione. (D) Secrezione di granzima B per ogni condizione. Il saggio è stato eseguito in duplicato. La scansione e il conteggio sono stati effettuati utilizzando un analizzatore CTL e i dati sono stati rappresentati graficamente con GraphPad Prism. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

NumeroBuffer/reagenteProceduraCommenti
1Mezzo CRC PDOScongelare L-WRN, coltivare per il tempo specificato per raggiungere la confluenza, raccogliere il mezzo e aggiungere mezzo fresco ogni giorno per un massimo di 12-14 giorni. Aggiungere Advanced DMEM al mezzo raccolto, filtrare e integrare immediatamente dopo la filtrazione con GLUTAMAX I, HEPES, [LEU15]-Gastrin I Human, B-27 (senza siero), N2, Penicillina-Streptomicina e N-AcetilcisteinaNel giorno di inizio dell'esperimento, aggiungere al mezzo di coltura degli organoidi un secondo insieme di integratori: A83-01, SB202190, EGF, nicotinamide e PGE2. Aggiungere Y-27632 e Primocin durante la prima settimana dopo lo scongelamento e il passaggio. Conservare a -80 °C.
2Mezzo di lavaggio per organoidiAggiungere Primocin 1:500, Gentamicina 1:200, 1% Penicillina/Streptomicina e Amfotericina 1:100 nel PBS
3Mezzo di scongelamento per linfociti TIntegrare RPMI-1640 con 1% Penicillina/Streptomicina e 10% FBS
4Mezzo di crescita per linfociti TAggiungere 10% albumina sierica umana e 1% Penicillina/Streptomicina a RPMI-1640.Conservare il mezzo a 4 °C per non più di 1 mese
5Mezzo di espansione per linfociti TIntegrare il mezzo di crescita per linfociti T con 500 UI/mL di IL-2 e cocktail CD3/CD28.Preparare al momento
6Mezzo di congelamentoPreparare DMSO al 10% in FBS
7Buffer di rivestimentoAggiungere 1% BSA e 15 mM HEPES ad Advanced DMEM/F12Conservare il buffer a 4 °C fino a 3 mesi
8Buffer FACSAggiungere 1% FBS al PBSConservare a 4 °C
9Buffer IFAggiungere 0,2% Triton X-100 e 0,05% Tween-20 al PBSConservare a 4 °C
10Buffer di bloccoAggiungere 1% albumina sierica bovina (BSA) al buffer IFConservare a 4 °C

Tabella 1: Preparazione dei reagenti. In questo protocollo vengono descritte la composizione e la preparazione di tamponi, mezzi, soluzioni di colorazione e integratori utilizzati per la coltura di organoidi derivati da pazienti con cancro del colon-retto, l'isolamento e l'espansione di PBMC, la co-coltura di organoidi e cellule immunitarie, nonché per saggi di citofluorimetria, immunofluorescenza, ELISpot e imaging di cellule vive.

Discussione

In questo protocollo, è stato descritto un metodo pratico e riproducibile per generare organoidi derivati da pazienti (PDO) e linfociti T espansi a partire dal nostro archivio biobanca. Sono stati inoltre descritti in dettaglio l’impostazione della coltura in co-coltura PDO-CRC per i campioni dei pazienti con diverse mutazioni e il relativo regime di trattamento. I risultati ottenuti hanno dimostrato l’effetto del trattamento sui modelli di co-coltura.

Il sistema di coltura in co-coltura di organoidi descritto qui fornisce una piattaforma solida e adattabile per modellare interazioni biologiche complesse in vitro. Integrando PBMC con organoidi derivati da pazienti corrispondenti, questo protocollo riproduce in modo più accurato la dinamica del segnale degli organoidi e la loro eterogeneità funzionale rispetto alla coltura cellulare convenzionale in 2-D. A differenza di approcci precedenti caratterizzati da minore riproducibilità o limitata vitalità, il nostro metodo ottimizza le condizioni di coltura per mantenere sia l'integrità degli organoidi che l'attività delle cellule T nei tempi desiderati20,21. Un punto di forza chiave di questo protocollo è la sua flessibilità. Può essere applicato a diversi tipi di organoidi, inclusi modelli intestinali, epatici e polmonari, e supporta la co-coltura con una varietà di cellule immunitarie13,14,20,21,22,23. Questa adattabilità consente ai ricercatori di personalizzare il metodo in base alle specifiche domande biologiche, dall'analisi delle interazioni ospite-patogeno alla valutazione delle risposte terapeutiche in un contesto specifico per il paziente13,20,24,25. Inoltre, il flusso di lavoro è compatibile con analisi successive, inclusi trascrittomica, metabolomica e imaging, ampliandone così l'utilità per studi meccanicistici e traslazionali26,27.

Questi protocolli sono ampiamente applicabili in diversi ambiti dell'immunologia tumorale, dell'oncologia traslazionale e della medicina personalizzata13,20,21. La piattaforma di co-coltura organoide-immunitaria fornisce un sistema fisiologicamente rilevante e scalabile per lo studio delle interazioni specifiche tra tumore e sistema immunitario del paziente, la valutazione di immunoterapie e trattamenti mirati, e l'identificazione di biomarcatori di risposta o resistenza13,14,20,21. Integrando saggi funzionali come la citometria a flusso, l'ELISpot e l'imaging di cellule vive, questi metodi consentono un'analisi completa dell'attivazione immunitaria, della citotossicità e del comportamento tumorale13,14,20,21. L'uso di organoidi tridimensionali derivati da pazienti migliora ulteriormente la rilevanza traslazionale preservando l'eterogeneità tumorale e le caratteristiche del microambiente, rendendo questi protocolli strumenti preziosi per i test preclinici di farmaci e lo sviluppo di immunoterapie di nuova generazione13,14,20.

Nonostante i loro vantaggi, i modelli organoidi presentano ancora delle limitazioni. L'efficienza di stabilimento degli organoidi varia in base al tipo di tumore, alla qualità del campione e alla storia dei trattamenti precedenti, in particolare nei tumori sottoposti a trattamenti intensivi20,21. Inoltre, negli organoidi spesso mancano componenti chiave del microambiente tumorale, come fibroblasti, vascolarizzazione e segnalazione stromale14,20,21. Sebbene i sistemi di co-coltura migliorino la modellizzazione delle interazioni tra tumore e sistema immunitario, mantenere la vitalità e la funzionalità delle cellule immunitarie in vitro rimane una sfida13,14,20,21. La variabilità delle condizioni di coltura e delle matrici extracellulari tra diversi laboratori limita inoltre la standardizzazione e la riproducibilità14,20,21.

I futuri progressi nella ricerca sugli organoidi si concentreranno sull'integrazione di fibroblasti, cellule endoteliali, microbiota e cellule immunitarie autologhe per mimare in modo più accurato il microambiente tumorale e migliorare i test di immunoterapia personalizzata28. I sistemi emergenti di organi-su-cip e l'ingegneria basata su CRISPR/Cas9 miglioreranno ulteriormente la modellizzazione delle malattie, gli studi funzionali e lo screening terapeutico. La standardizzazione attraverso iniziative di biobanking dovrebbe migliorare scalabilità, riproducibilità e traduzione clinica. Nel complesso, questo protocollo fornisce una piattaforma riproducibile e fisiologicamente rilevante per lo studio delle interazioni tra organoidi e sistema immunitario, sostenendo la ricerca traslazionale e di oncologia di precisione.

Dichiarazioni

C.K. dichiara i seguenti conflitti di interesse, tutti non correlati al presente manoscritto: Loki Therapeutics (finanziamento per la ricerca), Teiko (consulente), Seattle Genetics (consulente), Insights Driven Research (consulente), BMS (consulente), Guardant Health (consulente), OMNI Oncology (consulente), Exelixis (consulente), Nuvectis Pharma (consulente, farmaci), Real CME (onorari). C.K. e N.T. sono co-inventori della domanda provvisoria statunitense 63/746,435 depositata il 17 gennaio 2025, non correlata al presente manoscritto. Gli altri autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center CCSG (P30CA013330). Ringraziamo Hillary Guzik, Rotem Alon, Jinghang Zhang, Swathi Swaminathan e Jacky Chuen per l'assistenza tecnica. Gli studi di citometria a flusso sono stati eseguiti utilizzando un analizzatore Cytek Aurora finanziato dagli Istituti Nazionali di Sanità (1S10OD026833-01) presso la Struttura Centrale di Citometria a Flusso del Albert Einstein College of Medicine. Le immagini confocali sono state ottenute utilizzando un microscopio Leica STELLARIS 8 finanziato dal NIH (1S10OD034397-01) presso la Struttura di Imaging Analitico del Albert Einstein College of Medicine. E.N., W.E. e C.K. sono stati sostenuti da sovvenzioni NIH T32CA200561, R01CA248536, R42CA287679 e K12CA279871. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella preparazione del manoscritto.

Ringraziamo anche l'Istituto Ruth L. e David S. Gottesman per la ricerca sulle cellule staminali e sulla medicina rigenerativa per MM, NS e NT.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Prodotti chimici, reagenti e anticorpi
Integratore B27 senza vitamina A GIBCO C12587-010
Integratore B27 GIBCO 17504-044 
N-acetilcisteina Sigma-Aldrich A9165-5G 
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636 
EGF ricombinante umano Peprotech AF-100-15 
N2Gibco17502001
A83-01 Tocris2939
SB202190 Cayman Chemicals 10010399
Prostaglandina E2 Cayman Cehmicals 14010-1 
Y-27632 Sigma-Aldrich Y-0503 
Collagenasi tipo II Sigma-Aldrich C6885 
Ialuronidasi tipo IV Sigma-Aldrich H3506 
DMEM-F12 avanzato GIBCO 12634-028 
Penicillina/streptomicina GIBCO 15070063
Ultraglutamina tipo I Lonza BE17-605E 
HEPES GIBCO 15630-056 
TrypLE Express GIBCO 12604-013 
Mezzo di congelamento per colture cellulari Recovery GIBCO 12648-010 
RPMI 1640 GIBCO 11875093
Serum umano, da plasma umano AB maschile Sigma-Aldrich H3667 
Benzonasi Merck 70746-3 
Interferone gamma ricombinante umano Peprotech 300-02 
Dispasi tipo II Sigma-Aldrich D4693 
Soluzione per recupero cellulare Corning 354253
Primocin InvivogenInvivogen ANTPM1NC9141851
IL-2 umana ricombinante (espressa in E. coli, priva di vettore)Biolegend791906
IL-7 umana ricombinante (espressa in E. coli, priva di vettore)Biolegend569706
IL-15 umana ricombinante (priva di vettore)Biolegend570306
CD107a (LAMP-1) anti-umano PE/Cianina5Biolegend328656
CD137 (4-1BB) anti-umano Brilliant Violet 711™Biolegend309832
Anticorpo CD8a anti-umano Pacific Blue™Biolegend300928
CD3-APC/Cy7 anti-umanoBiolegend317342
CD4PerCP/Cianina5.5 anti-umano CD4Biolegend980810
Granzima B anti-umano/topo Alexa Fluor® 647Biolegend515406
CD56-PE/Cy7 anti-umanoBiolegend985912
Anticorpo IFN-γ anti-umano PE/Dazzle™ 594Biolegend506530
CD274 (B7-H1, PD-L1) anti-umano PEBiolegend393608
Anticorpo anti-CD28 umano purificatoBiolegend302901
Anticorpo CD45 anti-umano Brilliant Violet 510™Biolegend304036
CD326 (EpCAM) anti-umano da topo (coniugato PE/Cy7)Biolegend324222
anti-Ki67Abcamab15580
Kit per saggio Caspasi-3 NucView® 488 per cellule viveBiotium30029
Kit di rilevamento apoptosi FITC Annexina V con PIBiolegend640914
Annexina V PE/Cianina7Biolegend640950
Colorante NIR Annexina V Incucyte®Sartorious4768
Kit di colorazione cellulare morta LIVE/DEAD™ fissabile blu, per eccitazione UVInvitrogenL23105
Cell Trace Far YellowThermo FischerC34567
Cell Trace Far redThermo FischerC34564
CMFDA verdeMedChem ExpressHY-126561 
Human TruStain FcX™ (soluzione di blocco del recettore Fc)Biolegend422302
Brilliant Stain BufferBD Biosciences563794
BD Pharmingen™ Stain Buffer (BSA)BD Biosciences554657
Perline di compensazioneBiolegends424602
Corning® Salina fosfato-tampone di Dulbecco’s, 1X senza calcio e magnesioCorning20-031-CM
Corning® Salina fosfato-tampone di Dulbecco’s, 1X con calcio e magnesioCorning20-030-CV
Anticorpo anti-PD1 umano (nivolumab)Merus/SelleckchemA2002
DietilsolfossidoFisher ScientificBP231-100 
DMEMGenesee25-500
Soluzione tampone EDTAInvitrogen15575020
FBSVWR97068-075
PBSGenesee25-507
Paraformaldeide (PFA)Thermo Scientific Chemicals0473779L
Kit soluzione di fissazione/permeabilizzazioneBD554714
Gastrina I UMANAMilliporeG9145-.1MG
GLUTAMAX IFisher Scientific35050061
Cocktail CD3/CD28 STEMCELL Technologies 10971
Mezzo di espansione ImmunocultSTEMCELL Technologies 10981
ProLong Diamond Antifade Mountant con DAPIInvitrogenP36962
Triton X-100Thermo Scientific Chemicals215680025
Soluzione di blu di tripano, 0,4%Gibco15250061
Tween-20TCI AmericaT0543500G
Attrezzature
Fluorimetro a flusso/Nucleo di citometria a flussoCytek (Wuxi) BiosciencesModello n. N7-0021
Fluorimetro a flusso/Laboratorio SinghInvitrogenATTUNE NXT (n. modello 4486517
Microscopio confocaleLeicaSTELLARIS 8
Sistema di analisi di cellule viveSartoriusIncucyte CX3

Riferimenti

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