Una serie di derivati a base di triazolo e oxadiazolo dell'acetamide è stata sintetizzata e valutata come inibitori dell'urease e della α-glucosidasi. Il composto 8c ha mostrato la maggiore inibizione dell'ureasi, mentre il 9e ha superato l'acarbosio contro la α-glucosidasi. Gli studi di legame con BSA e in silico hanno confermato le loro proprietà simili a quelle dei farmaci, identificando entrambi i composti come candidati lead promettenti.
Articolo di ricerca
Sintesi, valutazione biologica e studi in silice di nuovi acetamidi a base di triazolo e ossadialo come inibitori dell'ureasi e della α-glucosidasi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo studio ha indagato il potenziale terapeutico dei nuovi derivati a base di 1,2,4-triazolo e 1,3,4-ossadiazolo come inibitori a doppio bersaglio dell'urease e della α-glucosidase, due enzimi implicati rispettivamente nei disturbi gastrointestinali e nel diabete di tipo 2. È stato impiegato un approccio integrato che combina sintesi organica a più fasi, valutazione biologica in vitro , docking molecolare, previsione ADME in silico e analisi della teoria del funzionale della densità (DFT) per identificare potenti composti lead con proprietà farmacocinetiche favorevoli. Partendo dall'acido benzoico, una serie di derivati 1,2,4-triazolo (8a–c) e 1,3,4-ossazolo (9d–f) contenenti parti acetamide sostituite sono state sintetizzate con successo. Tutti i composti hanno mostrato attività inibitoria contro entrambi gli enzimi bersaglio. Il composto 8c è stato l'inibitore dell'urease più potente (IC₅₀ = 6,14 ± 1,06 μM), mentre il composto 9e ha mostrato la più forte inibizione della glucosidasi α (IC₅₀ = 27,29 ± 0,41 μM), superando l'inibitore di riferimento acarbosio (IC₅₀ = 38,25 ± 0,12 μM). Le analisi computazionali hanno supportato i risultati sperimentali: le previsioni ADME indicavano proprietà favorevoli simili a quelle dei farmaci, e l'aggancio molecolare mostrava forti interazioni di legame, con il composto 8a che mostrava la più alta affinità per la α-glucosidasi (−7,165 kcal/mol) e il composto 9e il legame più forte all'urasie (−7,30 kcal/mol). I calcoli DFT hanno ulteriormente correlato l'attività biologica con le proprietà elettroniche, rivelando gap energetici relativamente piccoli tra HOMO–LUMO e i composti più attivi, 8c (0,14831 a.u.) e 9e (0,14302 a.u.). Collettivamente, questi risultati identificano i composti 8c e 9e come promettenti impalcature di piombo per lo sviluppo di inibitori di nuova generazione di urease e α-glucosidasi.
Introduzione
Le parti eterocicliche sono state precedentemente segnalate in molti farmaci esistenti, e gli eterocicli rappresentano una classe importante di inibitori enzimatici, utilizzati nel trattamento delle malattie metaboliche einfettive. 1. Tra gli eterocicli, gli 1'3'4-ossadiazoli sono uno dei più studiati nella scoperta di farmaci e sono stati segnalati come agenti antivirali, antibatterici, antitumorali, ipotensi, neuroprotettivi, anticonvulsivi e antitubercolari2, 3,4,5. Analogamente, i derivati 1'2'4-triazolo hanno mostrato attività anticonvulsive, antibatteriche, antivirali, antitubercolari, antidiabetici, antinfiammatorie, antiproliferative, antiantimalariche e inibitoriedell'urease. 6,7. I composti contenenti acetamide possiedono un forte profilo farmacologico e sono stati utilizzati come intermedi sintetici nella chimica eterociclica, oltre che antidiabetici, anticoagulanti e agenti chemosensibilizzanti, che li rendono strutture guida attraenti per la scoperta di farmaci 8,9.
Sono stati condotti sforzi significativi allo sviluppo di inibitori multitarget di α-glucosidasi e ureasi. L'inibizione della α-glucosidasi ritarda la digestione e l'assorbimento dei carboidrati, abbassando così i livelli di glucosio nel sangue postprandiale nei pazienti con diabete mellito di tipo 2. Gli inibitori attuali come l'acarbosio sono efficaci ma sono associati ad effetti collaterali gastrointestinali, il che crea la necessità di inibitori strutturalmentediversificati 10,11. L'uraase scompone l'urea in ammoniaca e anidride carbonica. La reazione permette al batterio Helicobacter pylori', che causa ulcere e rende l'ospite più suscettibile al tumore gastrico, di sopravvivere nello stomaco e quindi l'ureasasi è un bersaglio importante nello sviluppo di farmaci anti-ulcero. A L'obiettivo terapeutico è lo sviluppo di nuovi inibitori per entrambi glienzimi 9,12.
Tuttavia, nonostante gli studi disponibili sugli impalcature 1'2'4-triazolo e 1'3'4-ossadiazolo, sono stati riportati pochissimi studi relativi ai derivati acetamidici 1'2'4-triazolo e 1'3'4-ossazolo contenenti una parte tioetra come inibitori doppi α-glucosidasi eurasi. Il loro comportamento di legame proteico e la caratterizzazione computazionale hanno ricevuto anche un'attenzione limitata in questo contesto. In questo contesto, Abbiamo proposto che fondendo il triazolo o oxadiazolo e i frammenti di acetamide sostituiti nello stesso quadro molecolare si otterrebbe un profilo inibitorio enzimatico soddisfacente con proprietà fisicochimiche accettabili.
Per testare questa ipotesi, sono state sintetizzate e valutate una serie di derivati acetamidi a base di 1,2,4-triazolo (8a–c) e derivati acetamidici a base di 1,3,4-ossazolo (9d–f) e valutati per la loro attività inibitoria contro α-glucosidasi e ureasi. Le interazioni di legame dei composti più attivi (8a, 8c e 9e) con l'albumina sierica bovina (BSA) sono state studiate tramite spettroscopia di fluorescenza, determinazione della costante di legame e analisi termodinamica. Inoltre, sono stati effettuati calcoli di aggancio molecolare, ADME e teoria del funzionale della densità (DFT) per indagare i loro modi di legame, le proprietà farmacocinetiche e le caratteristiche elettroniche.
Protocollo
Tutti i reagenti erano di grado analitico e utilizzati senza ulteriore purificazione. Il progresso della reazione è stato monitorato tramite cromatografia a strato sottile (TLC) su gel di silice utilizzando n-esano/acetato di etil (7:3–6:4, v/v), con macchie visualizzate sotto luce ultravioletta. Salvo diversa indicazione, tutte le reazioni sono state eseguite sotto atmosfera ambiente. I composti sintetizzati sono stati caratterizzati da spettroscopia a trasformata di Fourier infrarosso (FTIR), NMR a 1H e NMR a 13C. Gli spettri NMR a 1H e 13C sono stati registrati in CDCl₃ rispettivamente a 600 MHz e 150 MHz, e sono stati riportati spostamenti chimici in ppm rispetto al segnale residuo del solvente. Il percorso sintetico è raffigurato nella Figura 1. I dati completi di caratterizzazione fisicochimica per tutti i composti sintetizzati sono forniti nel File Supplementare 1.
Sintesi del benzoato etilico (1)
L'acido benzoico (50 g, 0,41 mol) è stato inserito in una fiaschetta a fondo rotondo da 500 mL e è stato aggiunto etanolo assoluto (150 mL). Acido solforico concentrato (6 mL) veniva aggiunto a goccia come catalizzatore sotto agitazione magnetica continua. La miscela di reazione veniva riscaldata sotto reflusso a 78 °C per 4–6 ore utilizzando un condensatore raffreddato ad acqua. I progressi della reazione sono stati monitorati da TLC. Al completamento, la miscela veniva raffreddata a temperatura ambiente e neutralizzata con carbonato di sodio acquoso saturo fino a raggiungere il pH 7–8. La miscela di reazione veniva trasferita in un imbuto separativo, e lo strato organico veniva raccolto, lavato con acqua distillata e essiccato su solfato di sodio anidro. Dopo la filtrazione, il benzoato etilico (1) veniva utilizzato direttamente nella fase successiva senza ulteriore purificazione (Figura 1).
Sintesi della benzoidraizide (2)
Il benzoato etilico (1; 0,41 mol) veniva disciolto in etanolo assoluto (100 mL), e l'idrazina idratata (80%, 25 mL, in eccesso) veniva aggiunta sotto mescolamento continuo. La miscela di reazione veniva riscaldata a reflusso a 78 °C per 4–5 ore sotto aria utilizzando un condensatore raffreddato ad acqua. I progressi della reazione sono stati monitorati da TLC. Al completamento, il precipitato cristallino bianco della benzoidraizide (2) veniva raccolto tramite filtrazione, lavato con etanolo freddo, essiccato a peso costante a temperatura ambiente e utilizzato nelle successive fasi sintetiche (Figura 1).
Sintesi del 5-fenil-1,3,4-ossadiazolo-2-tiolo (3)
Benzoidraide (2; 10 g, 0,073 mol) e idrossido di potassio (4,12 g, 0,073 mol) sono stati inseriti in una fiaschetta a fondo arrotondato da 250 mL contenente etanolo (30 mL). La miscela veniva riscaldata a reflusso a 78 °C per 10 minuti utilizzando un condensatore raffreddato ad acqua. Veniva poi aggiunto disolfuro di carbonio (CS₂; 5 mL, 0,083 mol) e il reflusso continuava per altre 3–4 ore. I progressi della reazione sono stati monitorati da TLC. Al completamento, la miscela di reazione veniva trasferita in acqua distillata e riscaldata con una mescolata continua. L'acido cloridrico diluito veniva aggiunto a goccia fino a raggiungere il pH di 5, causando la precipitazione del composto (3) (Figura 1). Il precipitato veniva raccolto tramite filtrazione, lavato accuratamente con acqua distillata fredda, asciugato a peso costante e pesato per determinarne la resa. Il composto è stato caratterizzato da spettroscopia FTIR, NMR a 1H e NMR a 13°C.
Sintesi di 4,5-difenil-4H-1,2,4-triazolo-3-tiolo (4)
La benzoidraizide (2; 5 g, 0,037 mol) e il fenilisotiocianato (4 mL, 0,037 mol) furono inseriti in una fiaschetta a fondo arrotondato da 100 mL dotata di condensatore raffreddato ad acqua. La miscela di reazione è stata riscaldata sotto reflusso a 78 °C fino al completamento della formazione dell'intermedio tiosemicarbazide, come confermato dalla TLC utilizzando n-esano/acetato di etil (7:3, v/v). Idrossido di potassio (2 g, 0,036 mol), disciolto in etanolo (20 mL), è stato poi aggiunto e il reflusso è continuato fino alla formazione del composto (4), come confermato da TLC. La miscela reazionale veniva trasferita in acqua distillata, riscaldata con mescolamento continuo e acidificata con acido cloridrico diluito al pH 5 per precipitare il composto (4) (Figura 1). Il precipitato è stato raccolto tramite filtrazione, lavato accuratamente con acqua distillata fredda, essiccato a peso costante e caratterizzato da spettroscopia FTIR, NMR a 1H e NMR a 13°C.
Sintesi degli intermediari bromoacetamidi 7(a–f)
Ogni derivato dell'anilina sostituito 5(a–f) (1 equiv.) veniva disciolto nel cloroformio e raffreddato in un bagno di ghiaccio per mantenere la temperatura di reazione a 0–5 °C. Il bromoacettile bromuro (6, ≥98%, 1 equival) è stato aggiunto a gocce con mescolamento continuo. Durante la reazione, è stata aggiunta una soluzione acquosa di carbonato di sodio al 18% secondo necessità per mantenere il pH della reazione tra 9 e 10 neutralizzando l'acido bromico generato. Dopo l'aggiunta del bromuro di bromoacetile, la miscela di reazione veniva lasciata riscaldare a temperatura ambiente e mescolata fino a quando il TLC confermava il consumo completo del materiale di partenza. Gli intermedi di bromoacetamide risultanti, 7(a–f), sono stati raccolti tramite filtrazione, lavati con acqua distillata fredda, essiccati a peso costante e utilizzati direttamente nella fase successiva di sintetica senza ulteriore purificazione (Figura 1).
Sintesi di derivati acetamidi a base di triazolo 8(a–c)
Il derivato del triazolo (4; 0,5 g, 0,002 mol) è stato disciolto in N, N-dimetilformamide (10 mL) in una fiaschetta a fondo arrotondato da 50 mL. L'intermedio bromoacetamidico appropriato (7a, 7b o 7c; 0,002 mol, 1 equiv.) è stato aggiunto con mescolatura continua, seguito da idruro di sodio (0,05 g, 0,002 mol) per favorire l'alchilazione S. La miscela di reazione è stata mescolata a temperatura ambiente per 24–48 ore, con il progresso della reazione monitorato tramite TLC. Al completamento, la miscela di reazione veniva versata in acqua ghiacciata per indurre precipitazioni. Il precipitato è stato raccolto tramite filtrazione, lavato accuratamente con acqua fredda, asciugato e caratterizzato tramite spettroscopia FTIR, NMR a 1H e NMR a 13°C (Figura 1).
Sintesi di derivati acetamidici a base di osadiazolo 9(d–f)
Il derivato dell'oxadiazolo (3; 0,5 g, 0,002 mol) è stato disciolto in N, N-dimetilformamide (10 mL) in una fiaschetta a fondo arrotondato da 50 mL. È stato aggiunto il corrispondente intermediario bromoacetamide, 7d, 7e o 7f (0,002 mol, 1 equiv.), seguito da idruro di sodio (0,05 g, 0,002 mol) per facilitare l'alchilazione S. La miscela di reazione è stata mescolata a temperatura ambiente per 24–48 ore, con il progresso monitorato tramite TLC. Al completamento, la miscela veniva versata in acqua ghiacciata per precipitare il prodotto. Il precipitato è stato raccolto tramite filtrazione, lavato accuratamente con acqua fredda, asciugato e caratterizzato tramite spettroscopia FTIR, NMR a 1H e NMR a 13°C (Figura 1).
Saggio di inibizione α-glucosidasi
L'attività inibitoria della α-glucosidasi è stata valutata miscelando 50 μL della soluzione campione di prova con 100 μL di soluzione di α-glucosidasi (0,35 U/mL) preparata in tampone fosfatico (pH 6,8). La miscela di reazione è stata incubata a 37 °C per 10 minuti, poi sono stati aggiunti 100 μL di 1,5 mM di p-nitrofenil-α-D-glucopiranosido come substrato. Dopo un'ulteriore incubazione a 37 °C per 20 minuti, la reazione è stata interrotta aggiungendo 1 mL di 1 M carbonato di sodio (Na₂CO₃). L'assorbanza è stata misurata a 400nm 14. L'acarbosio veniva usato come controllo positivo. La miscela di reazione senza il composto di prova fungeva da controllo negativo, mentre la miscela di reazione senza enzima veniva usata come blank.
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicata e i risultati sono espressi come media ± deviazione standard (SD). La percentuale di inibizione dell'attività della α-glucosidasi è stata calcolata utilizzando la seguente equazione(1)14:
(1)
dove As rappresenta l'assorbenza della soluzione del campione di prova, Ab è l'assorbanza del reagente in bianco (senza α-glucosidasi), e A0 è l'assorbanza del controllo negativo (senza il campione). I valori di IC50 sono stati determinati testando concentrazioni di composti che variavano da 3,125 a 100 μM. L'analisi di regressione non lineare è stata effettuata utilizzando software di grafica standard.
Saggio di inibizione dell'urease
L'attività inibitoria dell'urease è stata determinata utilizzando un metodo modificato di Berthelot. La miscela di reazione consisteva in 300 μL di soluzione campione di prova, 200 μL di soluzione di urease di fagiolo jack e 200 μL di urea da 25 mM. La miscela è stata incubata in un bagno d'acqua a 37 °C per 30 minuti. Dopo l'incubazione, sono stati aggiunti 500 μL di una soluzione per sviluppare colori contenente 10 g/L di fenolo e 50 g/L di nitroprusside di sodio, seguiti da 500 μL di una seconda soluzione contenente 5% (v/v) di ipoclorito di sodio e 5 g/L di idrossido di sodio. La miscela di reazione veniva poi incubata per altri 15–30 minuti per permettere lo sviluppo del colore.
L'assorbenza della soluzione è stata misurata a 625 nm rispetto a un reagente15 a vuoto. La tiourea veniva usata come controllo positivo, la miscela di reazione senza il composto di prova come controllo negativo, e la miscela senza l'enzima urease come blank. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicata (n = 3) e i risultati sono espressi come valori medi ± deviazione standard (S.D.). La percentuale di inibizione è stata calcolata utilizzando la seguente formula matematica (2)15:
(2)
dove A0 è l'assorbanza del controllo (senza inibitore) e As è l'assorbanza del campione di prova (con inibitore). La graficizzazione e l'analisi di regressione non lineare per determinare i valori IC50 sono state eseguite utilizzando software standard di tracciamento dei dati.
Saggio di legame BSA
Le interazioni di legame tra albumina sieroica bovina (BSA) e i composti sintetizzati sono state studiate utilizzando spettroscopia di tempra a fluorescenza. Una soluzione stock di BSA da 10 μM è stata preparata in un tampone fosfato da 20 mM (pH 7,4). Per ogni esperimento di titolazione, 1,0 mL della soluzione BSA veniva miscelata con 2,0 mL di tampone fosfato in una cuvetta di quarzo. La soluzione è stata titolata tramite successive aggiunte di aliquote da 5 μL del composto di prova (1,5 mM in metanolo). Gli spettri di emissione di fluorescenza sono stati registrati nell'intervallo di lunghezze d'onda da 300–400 nm dopo l'eccitazione a 295 nm, con l'emissione massima osservata a circa 336 nm. Le misurazioni di fluorescenza sono state effettuate utilizzando uno spettrofotometro a fluorescenza dotato di software standard per l'acquisizione della fluorescenza, con larghezze di fessura di eccitazione ed emissione impostate rispettivamente a 10 nm e 2,5 nm. Per determinare i parametri termodinamici del legame, inclusi l'energia libera di Gibbs (ΔG), l'entalpia (ΔH) e l'entropia (ΔS), gli esperimenti di titolazione sono stati ripetuti a 298, 308 e 313 K.
Per indagare il meccanismo di tempra della fluorescenza, i dati sperimentali sono stati analizzati utilizzando l'equazione di Stern–Volmer (Equazione 3)16:
(3)
dove F0 e F rappresentano rispettivamente le intensità di fluorescenza di BSA in assenza e presenza del quencher; Kq è la costante della velocità di temprare bimolecolare; τ0 è la durata media della BSA in assenza di un quencher; KSV è la costante di tempra di Stern-Volmer; e [Q] è la concentrazione del squencher. La costante di legame (Kb) e il numero di siti di legame (n) sono stati successivamente determinati tracciando il doppio logaritmo secondo l'Equazione (4)16:
(4)
Inoltre, il cambiamento standard di energia libera di Gibbs (ΔG°), il cambiamento standard dell'entalpia (ΔH°) e il cambiamento standard di entropia (ΔS°) che regolano l'interazione di legame sono stati calcolati utilizzando le relazioni di Van't Hoff e Gibbs-Helmholtz espresse nelle Equazioni (5) e (6)17:
ΔG∘ = -RT ln Kb (5)
(6)
dove R è la costante universale del gas e T è la temperatura assoluta in Kelvin.
Aggancio molecolare
Tutte le simulazioni di modellazione molecolare e attracco venivano eseguite utilizzando la Schrödinger Suite (interfaccia Maestro), con l'attracco effettuato tramite il modulo Glide. Le strutture cristalline della α-glucosidasi (PDB ID: 5NN8) e dell'urease (PDB ID: 4H9M) sono state recuperate dalla RCSB Protein Data Bank. Le strutture proteiche sono state preparate utilizzando il Protein Preparation Wizard rimuovendo liganti co-cristallizzati, molecole d'acqua e eteroatomi non essenziali, aggiungendo residui e anelli mancanti, assegnando ordini corretti di legami e aggiungendo atomi di idrogeno polare. Protonazione e stati tautomerici sono stati assegnati al pH fisiologico (7,0 ± 2,0) utilizzando il modulo Epik. Le strutture proteiche preparate sono state successivamente sottoposte a una minimizzazione energetica contenuta con il campo di forza OPLS per alleviare gli scontri sterici.
Le strutture bidimensionali dei composti 3, 4, 8(a–c) e 9(d–f), insieme agli inibitori di riferimento acarbosio e tiourea, sono state preparate utilizzando il modulo LigPrep. Gli ordini di legame, la stereochimica e gli stati di ionizzazione al pH fisiologico sono stati ottimizzati, e le conseguenti conformazioni tridimensionali dei liganti sono state minimizzate energeticamente utilizzando il campo di forza OPLS.
Le griglie recettrici sono state generate utilizzando lo strumento Receptor Grid Generation, con le grid box centrate sui liganti nativi cocristallizzati per definire i siti attivi. Le dimensioni della griglia furono impostate a 25 × 25 × 25 Å per entrambe le proteine. La griglia dell'ureasi era centrata su x = −38,76, y = −44,14 e z = 66,88, mentre la griglia α-glucosidasi era centrata su x = 21,14, y = −7,56 e z = 24,37.
I calcoli di attracco venivano eseguiti utilizzando la modalità extra-precision (XP) di Glide con campionamento flessibile di ligando. Sono state generate più posizioni di legame per ogni ligando, e la posa con il punteggio di Glide docking più basso è stata selezionata per ulteriori analisi. Il protocollo di aggancio è stato convalidato riagganciando i liganti cocristallizzati nelle rispettive griglie recettori. I valori di deviazione quadratica media (RMSD) di ≤2,0 Å confermarono l'affidabilità e la riproducibilità del protocollo di attracco.
Le conformazioni di legame dei complessi agganciati sono state visualizzate utilizzando PyMOL (versione 3.1)18. Le interazioni proteina–ligando, inclusi legami idrofobi, contatti idrofobici e interazioni elettrostatiche, sono state analizzate utilizzando il Discovery Studio Visualizer19.
Analisi della teoria del funzionale della densità (DFT)
Tutti i calcoli della teoria della funzione della densità (DFT) sono stati eseguiti utilizzando la Gaussian 09, e le geometrie molecolari ottimizzate e gli orbitali molecolari di frontiera sono stati visualizzati usando GaussView 5. I derivati sintetizzati a base di triazolo e oxadiazolo a base di acetamide, 8(a–c) e 9(d–f), sono stati sottoposti a ottimizzazione geometrica nella fase acquosa utilizzando la funzione ibrida a tre parametri Lee–Yang–Parr (B3LYP) di Becke in combinazione con il set di base 6-311+G(d,p) 20. Gli effetti dei solventi sono stati incorporati utilizzando il Modello Continuum Polarizabile Simile-Conduttore (CPCM)21. Successivamente sono stati eseguiti calcoli della frequenza vibrazionale allo stesso livello teorico per confermare che tutte le strutture ottimizzate corrispondevano ai veri minimi locali sulla superficie dell'energia potenziale, come indicato dall'assenza di frequenze immaginarie.
Per comprendere le transizioni elettroniche e la stabilità cinetica dei composti sintetizzati, sono state calcolate le energie dell'orbitale molecolare più occupato (EHOMO) e dell'orbitale molecolare più basso non occupato (ELUMO). Il gap energetico di frontiera dell'orbitale molecolare (ΔE = ELUMO - EHOMO) è stato determinato per ogni derivata per valutarne la reattività chimica e la stabilità cinetica, con un gap energetico minore che indica una maggiore reattività.
Inoltre, i descrittori globali di reattività chimica—inclusi durezza chimica (η), morbidezza (S), potenziale chimico (μ), elettronegatività (X) e indice di elettrofilitia (w)—sono stati calcolati dalle energie orbitali di frontiera utilizzando le seguenti equazioni operativestandard 22:
(7)
(8)
(9)
(10)
Le proprietà elettroniche calcolate e i descrittori globali sono stati sistematicamente confrontati tra le serie per stabilire relazioni struttura-attività (SAR) che riflettano i loro profili osservati di α-glucosidasi e inibitori dell'urease.
Inoltre, sono state generate e visualizzate mappe di potenziale elettrostatico molecolare (MESP) utilizzando VESTA per mappare la distribuzione della carica tra i sistemi molecolari ottimizzati. Le superfici MESP permettevano di identificare regioni elettrofile (carenti di elettroni, favorite da attacchi nucleofili) e nucleofile (ricche di elettroni, favorite da attacchi elettrofili). Questa distribuzione del potenziale elettrostatico è stata infine correlata con le specifiche interazioni di legame non covalenti, come i legami a idrogeno e i contatti elettrostatici, osservate nelle simulazioni di aggancio molecolare.
Analisi ADME
Per valutare la somiglianza farmacologica e le proprietà biofarmaceutiche dei derivati acetamidi sintetizzati a base di triazolo e ossadiazolo 8(a–c) e 9(d–f), è stata effettuata un'analisi in silico per assorbimento, distribuzione, metabolismo ed excrezione (ADME). Le rappresentazioni semplificate del sistema molecolare di input line-entry (SMILES) di tutti i composti sintetizzati, insieme agli inibitori di riferimento acarbosio e tiourea, sono state generate utilizzando un software di modellazione molecolare e inviate al server webSwissADME 23.
I parametri fisicochimici calcolati includevano il peso molecolare (MW), la lipofilicità (logP), l'area superficiale polare topologica (TPSA), il numero di donatori di legami a idrogeno (HBD), il numero di accettori di legami a idrogeno (HBA) e il numero di legami rotabili (RB).
Le proprietà farmacocinetiche sono state valutate prevedendo l'assorbimento gastrointestinale (GI) e la permeabilità della barriera emato-encefalica (BBB). Inoltre, i composti sono stati valutati per la conformità alla regola dei cinque di Lipinski e ad altri criteri consolidati di somiglianza farmacologica per stimarne la biodisponibilità orale. Infine, il punteggio di accessibilità sintetica (SA) è stato calcolato per ogni composto su una scala che va da 1 (facile da sintetizzare) a 10 (molto difficile da sintetizzare). I profili ADME previsti e di somiglianza farmacologica dei composti sintetizzati sono stati confrontati con quelli degli inibitori di riferimento per valutarne il potenziale come candidati principali allo sviluppo di farmaci.
Risultati
Chimica e caratterizzazione dei composti sintetizzati
I derivati bersaglio dell'acetamide a base di triazolo e ossadialo sono stati sintetizzati secondo la via sintetica mostrata nella Figura 1. I composti desiderati sono stati ottenuti con rese da buone a eccellenti (69%–87%) come solidi cristallini da bianco a giallo. La loro purezza è stata confermata da TLC, determinazione del punto di fusione e analisi spettroscopiche. Gli spettri NMR rappresentativi che confermano i gruppi funzionali caratteristici dei composti sintetizzati sono mostrati nella Figura 2. Gli spettri hanno mostrato le bande di assorbimento attese corrispondenti ai gruppi funzionali ammide carbonile (C=O), N–H, C=N, C–S e aromatici C–H, supportando la sintesi riuscita dei derivati target.
Gli spettri NMR rappresentativi della H 1sono presentati nella Figura 3. Gli spettri hanno mostrato risonanze caratteristiche per il protone ammide NH, protoni aromatici, legame metilene e sostituenti metilici, che erano coerenti con le strutture proposte. Gli spettri rappresentativi della NMR a 13C sono mostrati nella Figura 4. Le risonanze di carbonio osservate hanno confermato la presenza di carbonili, atomici, metileni ed eterociclici attesi per i derivati sintetizzati. I composti rappresentativi includevano 8a (resa 87%), 8c (circa 80%–85%) e 9e (resa 69%). I dati completi di caratterizzazione fisicochimica e gli spettri NMR per tutti i composti sintetizzati sono forniti nel File Supplementare 1.
Inibizione della α-glucosidasi
Le attività inibitrici della α-glucosidasi dei composti sintetizzati sono riassunte nella Tabella 1. Tutti i composti inibivano la α-glucosidasi in misura variabile. Il composto 9e ha mostrato la maggiore attività inibitoria, con un valore IC50 di 27,29 ± 0,41 μM, seguito dal composto 8a (33,15 ± 0,07 μM) e dal composto 8c (40,93 ± 0,59 μM). I composti 8b, 9d e 9f mostrarono un'inibizione relativamente debole, con valori IC50 rispettivamente di 108,19 ± 0,18 μM, 108,10 ± 0,03 μM e 94,44 ± 0,25 μM. Il composto 9e ha mostrato una maggiore potenza inibitoria rispetto all'inibitore di riferimento acarbosio (IC50 = 38,25 ± 0,12 μM), mentre il composto 8a ha mostrato un'attività comparabile. I profili inibitori dipendenti dalla concentrazione sono presentati nella Figura 5.
Potenziale inibitore dell'urease
Le attività inibitrici dell'urease dei composti sintetizzati sono riassunte nella Tabella 1. Il composto 8c ha mostrato la più forte inibizione dell'ureasio, con un valore IC50 di 6,14 ± 1,06 μM, seguito dai composti 9e (8,14 ± 0,71 μM) e 8a (12,25 ± 0,42 μM). Questi composti hanno dimostrato un'attività inibitoria maggiore rispetto all'inibitore di riferimento tiourea (IC50 = 21,25 ± 0,15 μM). I composti 8b, 9d e 9f erano meno attivi, con valori IC50 che variavano da 82,15 a 103,05 μM. Le corrispondenti curve di inibizione dipendenti dalla concentrazione sono mostrate nella Figura 5.
Binding BSA
I parametri di estinzione della fluorescenza sono riassunti nella Tabella 2. Per i composti 8a e 9e, la costante di Stern–Volmer (Ksv) aumentava con l'aumento della temperatura, mentre la costante di tempra (Kq) superava il limite massimo controllato per diffusione (2 ×10 10 M⁻1 s⁻1), indicando un meccanismo di tempra mista statico e dinamico. Al contrario, il composto 8c ha mostrato valori di Ksv decrescenti con l'aumento della temperatura, mantenendo però valori di Kq sopra il limite controllato per diffusione, indicando prevalentemente un'estinzione statica. L'analisi termodinamica ha mostrato valori negativi di ΔH e ΔS per il composto 8a, suggerendo che durante il legame di legami di idrogeno e di van der Waals predominassero le interazioni di legaggio. I valori positivi di ΔH e ΔS ottenuti per i composti 8c e 9e indicavano che le interazioni idrofobiche erano la forza motrice principale. L'analisi dell'affinità di legame effettuata a 298 K ha dimostrato che il composto 8a ha mostrato la costante di legame più alta (Kb = 3,92 × 105 M⁻1), seguito dal composto 8c (1,54 × 104 M⁻1) e dal composto 9e (6,78 × 101M⁻1). Gli spettri di fluorescenza e i grafici di Stern–Volmer sono presentati nelle Figure 6, Figura 7, 8, 9, 10 e 11.
Analisi dell'attracco
I risultati dell'aggancio molecolare sono riassunti nella Tabella 3. Il protocollo di aggancio è stato validato riagganciando i liganti co-cristallizzati nei rispettivi siti di legame, ottenendo valori RMSD ≤2,0 Å, confermando così l'affidabilità del protocollo di aggancio (Figura Supplementare 1).
In base all'attività biologica e ai punteggi di attracco, sono stati selezionati i composti 8a, 8c e 9e per un'analisi dettagliata dell'interazione. Le pose rappresentative di attracco all'interno del sito attivo α-glucosidasi sono presentate nella Figura 12A–D. Il composto 8a ha mostrato il punteggio di attracco più alto (−7,165 kcal/mol), seguito dai composti 8c (−6,80 kcal/mol) e 9e. Questi composti hanno stabilito interazioni di legami idrogeno con residui catalitici chiave, tra cui D282, D404, D616, R600, S523 e H674.
Le pose di attracco rappresentative all'interno del sito attivo dell'urase sono mostrate nella Figura 12E–H. Il composto 8c ha stabilito legami a idrogeno con A636, Q635 e R439, mentre il composto 9e ha formato un'estesa rete di legami a idrogeno che coinvolgeva E493, D494, H593, R609 e A636. Il composto 8a ha inoltre dimostrato interazioni favorevoli con i residui del sito catalitico. Nel complesso, l'analisi dell'aggancio ha supportato i risultati sperimentali dell'inibizione.
Studi sulla DFT
I descrittori chimici quantistici calcolati sono riassunti nella Tabella 4. Le distribuzioni degli orbitali molecolari di frontiera e le mappe di potenziale elettrostatico molecolare dei composti di riferimento sono presentate nella Figura 13, mentre le analisi corrispondenti per i composti sintetizzati sono mostrate nelle Figure 14 e 15.
Tra i composti sintetizzati, 9e ha mostrato il più piccolo divario energetico HOMO–LUMO (0,14302 u.), seguito da 8c (0,14831 u.) e 8a (0,15788 a.u.). Le mappe del potenziale elettrostatico molecolare identificano regioni ricche e carenti di elettroni che possono contribuire alle interazioni intermolecolari. I descrittori calcolati della reattività globale, inclusi potenziale di ionizzazione, affinità elettronica, elettronegatività, potenziale chimico, durezza, morbidezza e indice di elettrofilitia, sono elencati nella Tabella 4. I composti della serie 9 mostravano gap HOMO–LUMO più bassi e un'elettrofilicità superiore rispetto ai corrispondenti derivati della serie 8.
Analisi ADME
Le proprietà farmacocinetiche previste sono riassunte nella Tabella 5. Tutti i composti sintetizzati soddisfavano i principali criteri di somiglianza con i farmaci. I derivati della serie 9 non mostravano violazioni di Lipinski, mentre ogni composto della serie 8 presentava una violazione. Si prevedeva che tutti i composti presentassero un'elevata assorbimento gastrointestinale, nessuna permeabilità della barriera emato-encefalica e conteggi accettabili di legami di idrogeno tra donatori e accettori. I punteggi di biodisponibilità sono stati costantemente previsti a 0,55. I punteggi di accessibilità sintetica variavano da 5,70 a 6,39, indicando una complessità sintetica moderata.
DISPONIBILITÀ DEI DATI:
I dataset e i materiali di supporto generati durante questo studio sono stati depositati nel repository Zenodo e sono disponibili pubblicamente su https://doi.org/10.5281/zenodo.21238952.
Figura 1: Via sintetica per la preparazione di derivati acetamidi a base di triazolo e ossadiazolo. Schema di reazione che illustra la sintesi dei composti intermedi e finali 8(a–c) e 9(d–f). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Spettro NMR del composto 8a. (A) 1H spettro NMR del composto 8a. (B) 13C spettro NMR del composto 8a. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Spettri NMR del composto 8c. (A) 1H Spettro NMR del composto 8c. (B) 13C Spettro NMR del composto 8c. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Spettri NMR del composto 9e. (A) Spettro NMR 1Hdel composto 9e. (B) Spettro NMR 13Cdel composto 9e. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Attività inibitorie dei composti sintetizzati contro α-glucosidasi e ureasi. (A) Percentuale di inibizione di α-glucosidasi e ureasasi da parte dei composti 3, 4, 8(a–c) e 9(d–f) rispetto agli inibitori di riferimento acarbosio e tiourea, rispettivamente. (B) IC50 valori degli stessi composti contro α-glucosidasi e ureasi. I dati sono presentati come media ± SD (n = 3). La significanza statistica è stata determinata rispetto all'inibitore di riferimento corrispondente (p < 0,05, p < 0,01, p < 0,001, p < 0,0001; ns = non significativo). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Analisi di tempra fluorescente dell'albumina sierica bovina (BSA) tramite il composto 8a. (A) Spettri di emissione di fluorescenza di BSA (3,33 × 10⁻6 M) dopo l'aggiunta incrementale del composto 8a a 298 K. (B) Grafici di Stern–Volmer ottenuti a 298, 308 e 313 K. (C) Grafico doppio logaritmico di log[(F₀ − F)/F] contro log Q. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Analisi di tempra fluorescente dell'albumina sierica bovina (BSA) tramite il composto 8b. (A) Spettri di emissione di fluorescenza di BSA (3,33 × 10⁻6 M) dopo l'aggiunta incrementale del composto 8b a 298 K. (B) Grafici di Stern–Volmer ottenuti a 298, 308 e 313 K. (C) Grafico doppio logaritmico di log[(F₀ − F)/F] contro log Q. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Analisi di tempra a fluorescenza dell'albumina sierica bovina (BSA) tramite il composto 8c. (A) Spettri di emissione di fluorescenza di BSA (3,33 × 10⁻6 M) dopo l'aggiunta incrementale del composto 8c a 298 K. (B) Grafici di Stern–Volmer ottenuti a 298, 308 e 313 K. (C) Grafico doppio logaritmico di log[(F− F)/F] contro log Q. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Analisi di temprare a fluorescenza dell'albumina sierica bovina (BSA) tramite composto 9d. (A) Spettri di emissione di fluorescenza di BSA (3,33 × 10⁻6 M) dopo aggiunta incrementale del composto 9d a 298 K. (B) Grafici di Stern–Volmer ottenuti a 298, 308 e 313 K. (C) Grafico doppio logaritmico di log[(F₀ − F)/F] contro log Q. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: Analisi di tempra fluorescente dell'albumina sierica bovina (BSA) tramite il composto 9e. (A) Spettri di emissione di fluorescenza di BSA (3,33 × 10⁻6 M) dopo l'aggiunta incrementale del composto 9e a 298 K. (B) Grafici di Stern–Volmer ottenuti a 298, 308 e 313 K. (C) Grafico doppio logaritmico di log[(F₀ − F)/F] contro log Q. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 11: Analisi di tempra fluorescente dell'albumina sierica bovina (BSA) tramite il composto 9f. (A) Spettri di emissione di fluorescenza di BSA (3,33 × 10⁻6 M) dopo l'aggiunta incrementale del composto 9f a 298 K. (B) Grafici di Stern–Volmer ottenuti a 298, 308 e 313 K. (C) Grafico doppio logaritmico di log[(F₀ − F)/F] contro log Q. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 12: Modalità di legame degli inibitori di riferimento e composti sintetizzati selezionati all'interno dei siti attivi α-glucosidasi e urease. (A) Posizione di legame dell'acarbosio all'interno del sito attivo α-glucosidasi. (B) Posizione di legame del composto 8a. (C) Posizione di legame del composto 8c. (D) Posizione di legame del composto 9e. (E) Posizione di legame della tiourea all'interno del sito attivo dell'ureasio. (F) Posa di legame del composto 8a. (G) Posa di legame del composto 8c. (H) Posa di legame del composto 9e. I legami a idrogeno sono rappresentati da linee tratteggiate gialle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 13: Orbitali molecolari di frontiera e mappe del potenziale elettrostatico molecolare (MEP) degli inibitori di riferimento. (A) Acarbosio. (B) Tiourea. Sono mostrate le superfici dell'orbitale molecolare occupato più alto (HOMO), dell'orbitale molecolare più basso non occupato (LUMO) e della MEP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 14: Orbitali molecolari di frontiera e mappe del potenziale elettrostatico molecolare (MEP) delle derivate triazoli. (A) Composto 8a. (B) Composto 8b. (C) Composto 8c. Le superfici HOMO, LUMO e MEP sono mostrate per ciascun composto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 15: Orbitali molecolari di frontiera e mappe del potenziale elettrostatico molecolare (MEP) dei derivati dell'ossadiazolo. (A) Composto 9d. (B) Composto 9e. (C) Composto 9f. Le superfici HOMO, LUMO e MEP sono mostrate per ciascun composto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Codici | Urease | α-Glucosidasi | ||
| Inibizione (%) a 0,5 mM | IC50 (μM) | Inibizione (%) a 0,5 mM | IC50 (μM) | |
| 3 | 67,54 ± 1,03 | 41,51 ± 0,01 | 63,09 ± 0,25 | 79.12 ± 0.43 |
| 4 | 62,51 ± 0,42 | 45,14 ± 0,14 | 65,26 ± 0,55 | 70,28 ± 0,42 |
| 8a | 95.22 ± 1.55 | 12.25 ± 0.42 | 95,01 ± 0,57 | 33.15±0.07 |
| 8b | 62.64 ± 1.01 | 82.15 ±1.48 | 38.02 ± 1.71 | 108.19 ± 0.18 |
| 8c | 99,39 ± 0,27 | 06.14 ± 1.06 | 90,51 ± 0,01 | 40,93 ± 0,59 |
| 9d | 47,51 ± 1,01 | 103.05 ± 0.54 | 39.08 ± 0.25 | 108.10 ± 0.03 |
| 9e | 98,57 ± 0,04 | 08.14 ± 0.71 | 91,55 ± 0,34 | 27.29 ± 0.41 |
| 9f | 58.07 ± 1.68 | 85,15 ± 0,12 | 43.15 ± 0.42 | 94,44 ± 0,25 |
| Tiourea | 96,24 ± 0,16 | 21.25 ± 0.15 | - | - |
| Acarbosio | - | - | 92.23 ± 0.14 | 38.25 ± 0.12 |
Tabella 1: Attività inibitorie dei composti sintetizzati contro α-glucosidasi e ureasi. Valori IC50 e percentuale di inibizione dei composti 8(a–c) e 9(d–f) rispetto agli inibitori di riferimento acarbosio e tiourea. I dati sono presentati come media ± SD (n = 3). Abbreviazioni: IC50 = concentrazione inibitoria mezza massima; SD = deviazione standard.
| Compound | 298K | 308K | 313K | ||||||
| N | Kb (M-1) | ΔG | ΔH | ΔS (J/mol. K) | N | Kb (M-1) | N | Kb (M-1) | |
| (kJ/mol) | (kJ/mol) | ||||||||
| 8a | 1.28 | 3,92 x105 | -32.55 | -218.28 | -623.24 | 1.12 | 6.49 x104 | 0.85 | 4.33 x103 |
| 8b | 1.31 | 6.49 x105 | -34.24 | -306.6 | -913.96 | 1.1 | 6.95 x104 | 0.66 | 1.07 x103 |
| 9d | 1.47 | 2.41 x106 | -36.32 | -204.1 | -563.01 | 1.17 | 1.44 x105 | 1.04 | 4.84 x104 |
| 9e | 0.62 | 6.78 x101 | -10.32 | 243.16 | 850.61 | 0.81 | 1.32 x103 | 0.91 | 7.93 x103 |
| 9f | 1.11 | 4.69 x104 | -26.35 | 178.13 | 686.21 | 1.26 | 2.99 x105 | 1.41 | 1.67 x106 |
| 8c | 0.91 | 1.54 x104 | -23.98 | 341.31 | 1225.82 | 1.36 | 1.53 x105 | 1.6 | 1.10 x107 |
Tabella 2: Costanti di legame e parametri termodinamici per le interazioni di composti selezionati con albumina sierica bovina (BSA). Costante di legame (Kb), numero di siti di legame (n), costante di estinzione di Stern–Volmer (Ksv), costante del tasso di temprare bimolecolare (Kq), energia libera di Gibbs (ΔG), variazione entalpia (ΔH) e variazione di entropia (ΔS) per i composti 8a, 8c e 9e determinati a 298, 308 e 313 K. Abbreviazioni: BSA = albumina sierica bovina; Kb = costante di legame; n = numero di siti di legame; Ksv = costante di tempra di Stern–Volmer; Kq = costante della velocità di temprare bimolecolare; ΔG = Energia libera di Gibbs; ΔH = variazione dell'entalpia; ΔS = variazione dell'entropia.
| Composti | Alfa Glucosidasi (kcal/mol) | Urease (kcal/mol) |
| Acarbosio | −6,90 | - |
| Tiourea | - | −5,80 |
| 3 | −4,35 | −4,50 |
| 4 | −4.10 | −4.30 |
| 8a | −7.165 | −7.624 |
| 8b | −5.20 | −5,45 |
| 8c | −6,80 | −7.10 |
| 9d | −5.10 | −5.35 |
| 9e | −6,70 | −7,30 |
| 9f | −5.00 | −5,25 |
Tabella 3: Punteggi di docking molecolare dei composti sintetizzati rispetto a α-glucosidasi e urease. Punteggi di docking (kcal/mol) dei composti 8(a–c) e 9(d–f), insieme agli inibitori di riferimento acarbosio e tiourea, contro α-glucosidasi e ureasi. Abbreviazioni: kcal/mol = kilocalorie per mole.
| Ligando | Momento dipolo (Debye) | HOMO | LUMO | Energia | Ionizzazione | Affinità elettronica (eV) | Electro- negatività χ (eV) | Electro- potenziale chimico μ (eV) | Durezza η (eV) | Morbidezza | Electro- Filitia |
| (a.u.) | (a.u.) | Gap (ΔEGap) | Potenziale (eV) | S (eV) | ω (eV) | ||||||
| Acarbosio | 8.1124 | -0.1597 | -0.0336 | 0.12612 | 4.345 | 0.913 | 2.629 | -2.629 | 1.716 | 0.291 | 2.015 |
| Tiourea | 7.619 | -0.2193 | -0.0179 | 0.20135 | 5.967 | 0.488 | 3.228 | -3.228 | 2.739 | 0.182 | 1.903 |
| 8a | 8.8025 | -0.2044 | -0.0466 | 0.15788 | 5.566 | 1.266 | 3.416 | -3.416 | 2.15 | 0.233 | 2.71 |
| 8b | 8.2451 | -0.2033 | -0.0467 | 0.15659 | 5.534 | 1.27 | 3.402 | -3.402 | 2.132 | 0.234 | 2.72 |
| 8c | 8.319 | -0.2039 | -0.0555 | 0.14831 | 5.55 | 1.511 | 3.53 | -3.53 | 2.02 | 0.247 | 3.08 |
| 9d | 3.8264 | -0.2065 | -0.0621 | 0.14432 | 5.619 | 1.691 | 3.655 | -3.655 | 1.964 | 0.255 | 3.4 |
| 9e | 4.0969 | -0.2052 | -0.0621 | 0.14302 | 5.584 | 1.691 | 3.637 | -3.637 | 1.947 | 0.257 | 3.4 |
| 9f | 4.298 | -0.2059 | -0.0627 | 0.14324 | 5.604 | 1.704 | 3.654 | -3.654 | 1.95 | 0.256 | 3.42 |
Tabella 4: Descrittori della teoria del funzionale della densità (DFT) dei composti sintetizzati. Calcolati descrittori chimici quantistici dei composti 8(a–c) e 9(d–f), insieme ai composti di riferimento acarbosio e tiourea, inclusi energie HOMO e LUMO, gap energetico HOMO–LUMO (ΔE), potenziale di ionizzazione (IP), affinità elettronica (EA), elettronegatività (χ), potenziale chimico (μ), durezza chimica (η), morbidezza chimica (S), momento dipolare (D) e indice di elettrofilitia (ω). Abbreviazioni: DFT = teoria del funzionale della densità; HOMO = orbitale molecolare più occupato; LUMO = orbitale molecolare più basso non occupato; ΔE = divario energetico HOMO–LUMO; IP = potenziale di ionizzazione; EA = affinità elettronica; χ = elettronegatività; μ = potenziale chimico; η = durezza chimica; S = morbidezza chimica; D = momento dipolare; ω = indice di elettrofilichia.
| Compound | AH | RB | HBA | HBD | TPSA (Ų) | iLOGP | LogP del consenso | Assorbimento gastrointestinale | Permeabilità BBB | Violazioni Lipinski | Punteggio di biodisponibilità | Punteggio SA |
| 8a | 30 | 7 | 5 | 4 | 84.86 | 4.41 | 4.71 | Alto | No | 1 | 0.55 | 6.32 |
| 8b | 30 | 7 | 5 | 4 | 84.06 | 4.41 | 4.62 | Alto | No | 1 | 0.55 | 6.34 |
| 8c | 30 | 7 | 5 | 4 | 84.26 | 4.41 | 4.11 | Alto | No | 1 | 0.55 | 6.39 |
| 9d | 24 | 6 | 5 | 4 | 90.95 | 3.08 | 2.75 | Alto | No | 0 | 0.55 | 5.71 |
| 9e | 24 | 6 | 5 | 4 | 90.82 | 3.08 | 2.27 | Alto | No | 0 | 0.55 | 5.7 |
| 9f | 24 | 6 | 5 | 4 | 90.85 | 3.08 | 2.77 | Alto | No | 0 | 0.55 | 5.73 |
Tabella 5: Proprietà previste di assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione (ADME) dei composti sintetizzati. Le proprietà fisicochimiche, farmacocinetiche e di simile simile ai farmaci previste dei composti 8(a–c) e 9(d–f) sono state generate utilizzando il server web SwissADME. Abbreviazioni: ADME = assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione; MW = peso molecolare; LogP = coefficiente ottanolo/partizione dell'acqua; TPSA = area superficiale polare topologica; RB = legami rotabili; HBA = accettatore di legami all'idrogeno; HBD = donatore di legami di idrogeno; GI = gastrointestinale; BBB = barriera emato-encefalica; SA = accessibilità sintetica.
Figura supplementare 1: Validazione dell'aggancio tramite il riaggancio di liganti nativi. (A) Sovrapposizione del ligando co-cristallizzato (posa di riferimento) e dell'acarbosio riagganciato all'interno del sito attivo della α-glucosidasi (PDB ID: 5NN8), dimostrando un allineamento stretto delle conformazioni di legame. (B) Posizione di legame della tiourea all'interno del sito attivo dell'urease (ID PDB: 4H9M), utilizzata per la validazione dell'aggancio del sistema di urease, mostrando la preservazione delle interazioni chiave all'interno della tasca catalitica. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 1: Dati di caratterizzazione fisicochimica e spettri NMR completi di 1H e 13C dei composti 3, 4, 8(a–c) e 9(d–f).Clicca qui per scaricare questo file.
Discussione
Questo studio ha sintetizzato una serie di derivati acetamidici a base di triazolo e ossadiazolo e ne ha valutato le proprietà strutturali, biologiche, computazionali e farmacocinetiche. La caratterizzazione spettroscopica tramite HRMS, analisi elementare, NMR a 1H e NMR a 13C ha confermato la sintesi riuscita delle molecole bersaglio. Gli spostamenti chimici osservati, i modelli di accoppiamento e le risonanze di carbonio erano coerenti con le strutture proposte. I segnali NH caratteristici delle amide, le risonanze metilenica, le distribuzioni aromatiche dei protoni e i segnali quaternari di carbonio hanno ulteriormente confermato il successo dell'incorporazione delle parti acetamide sostituite sia nelle impalcature triazolo che ossadiazole. I rendimenti sintetici generalmente elevati ottenuti per queste derivate dimostrano l'efficienza della via sintetica e suggeriscono che questi quadri eterociclici siano adatti a ulteriori modifiche strutturali.
È stata osservata una chiara influenza del modello sostituente sull'attività inibitoria dell'urease. Il composto 8c, contenente un sostituente 2,6-dimetil, ha mostrato la più alta attività inibitrice dell'uraasio, seguito dai composti 8a (2,3-dimetil) e 9e (2,5-dimetil), identificando queste molecole come candidati lead promettenti. Una tendenza simile è stata osservata contro la α-glucosidasi, con il composto 9e che ha mostrato la maggiore inibizione, mentre i composti 8a e 8c hanno mostrato anch'essi un'attività considerevole. Poiché i composti 8a e 8c differiscono solo nelle posizioni dei sostituenti metilici sull'anello aromatico, mentre il composto 9e differisce sia per il pattern di sostituzione che per l'impalcatura eterociclica, questi risultati suggeriscono che sia il pattern di sostituzione metilica sia l'architettura del pavimento contribuiscono all'attività biologica all'interno di questa serie. L'attività superiore del composto 8c può riflettere un orientamento più favorevole all'interno del sito attivo dell'enzima, mentre la forte attività del composto 9e suggerisce un ulteriore contributo dall'impalcatura dell'ossadiazolo insieme al modello di sostituzione 2,5-dimetilica. Queste osservazioni sono coerenti con rapporti precedenti che indicano che gli effetti sterici derivanti dalla sostituzione fenile possono influenzare il legame del sito attivo negli inibitori enzimaticici basati su triazolo eosadiazolo 24,25,26,27. Tuttavia, stabilire una relazione struttura–attività definitiva richiederà la valutazione di una serie più ampia di derivate regioisomeriche.
L'analisi delle interazioni tra i composti più attivi e l'albumina sierica bovina (BSA) tramite tempra a fluorescenza e analisi termodinamica ha dimostrato che i composti 8a e 9e seguivano un meccanismo misto di tempra statica/dinamica, mentre il composto 8c presentava prevalentemente tempra statica. I parametri termodinamici indicarono che il legame del composto 8a era principalmente guidato dal legame di idrogeno e dalle interazioni di van der Waals, mentre le interazioni idrofobe predominavano nel legame dei composti 8c e 9e. Il composto 8a ha mostrato la maggiore affinità per la BSA, con una costante di legame di 3,92 × 105 M⁻1 e una positiva energia libera di Gibbs di legame. Questi risultati indicano una formazione stabile del complesso proteina–ligando e suggeriscono il potenziale di trasporto mediato dall'albumina in condizioni fisiologiche.
I risultati sperimentali sono stati ulteriormente supportati da studi di docking molecolare, che hanno dimostrato che i composti 8a, 8c e 9e hanno adottato conformazioni di legame favorevoli all'interno dei siti attivi sia della α-glucosidasi che dell'urease. Questi composti formavano legami di idrogeno con residui chiave, tra cui D282, A284, D404, R600, D616 e H674 nella α-glucosidasi e A636, Q635, R439 e A440 nell'ureasi. Interazioni simili sono state precedentemente riportate per inibitori enzimici strutturalmentecorrelati 28,29. La maggiore discrepanza tra il punteggio di attracco e l'attività sperimentale è stata osservata per il composto 8a, che ha mostrato il punteggio di attracco più favorevole contro α-glucosidasi (−7,165 kcal/mol), mentre il composto 9e ha mostrato la maggiore potenza inibitoria in vitro (IC50 = 27,29 μM). Questa differenza non è sorprendente perché i punteggi di docking stimano il legame dei liganti all'interno di una struttura proteica relativamente rigida e non tengono conto di fattori come la solubilità dei ligandi, la flessibilità conformazionale, la desolvazione, la dinamica proteica o altri effetti della fase di soluzione che influenzano i valori di IC50 determinati sperimentalmente. Di conseguenza, le differenze tra l'affinità di legame prevista e l'attività biologica misurata rappresentano una limitazione riconosciuta dell'aggancio molecolare piuttosto che una contraddizione tra risultati computazionali ed esperimentali. Nel complesso, i dati di docking e inibizione enzimatica identificano costantemente i composti 8a, 8c e 9e come i derivati più promettenti di questa serie.
Le proprietà elettroniche dei composti più attivi sono state ulteriormente studiate tramite analisi di orbitali molecolari frontier (FMO) e potenziale elettrostatico molecolare (MEP). I composti con gap energetici HOMO–LUMO più bassi hanno generalmente mostrato una maggiore reattività elettronica, coerente con precedenti studi DFT su derivati strutturalmente correlati a base di triazolo eossadizolo 30. Tra i composti sintetizzati, 8a, 8c e 9e hanno mostrato gap energetici relativamente piccoli tra HOMO–LUMO, indicando caratteristiche favorevoli di trasferimento elettronico. Le loro mappe MEP hanno rivelato regioni distinte ricche e carenti di elettroni, con i composti 8c e 9e che mostrano regioni nucleofile particolarmente pronunciate che possono contribuire alle loro favorevoli interazioni enzimatiche e alle attività biologiche. I descrittori di reattività globale hanno ulteriormente supportato i risultati sperimentali e computazionali. Il composto 9e ha mostrato una combinazione favorevole di potenziale di ionizzazione, affinità elettronica, morbidezza e indice di elettrofilichia, mentre i composti 8a e 8c hanno mostrato valori di morbidezza relativamente alti, coerenti con le loro forti attività inibitorie. La maggiore elettrofilicità e morbidezza osservate per la serie 9, in particolare per il composto 9e, possono contribuire a interazioni più forti con i residui catalitici e a un aumento dell'attività biologica.
In silico La profilazione ADME dei composti 8(a–c) e 9(d–f) ha previsto caratteristiche farmacocinetiche favorevoli, tra cui un elevato assorbimento gastrointestinale, una somiglianza accettabile con il farmaco e una biodisponibilità orale soddisfacente. Non sono state identificate grandi responsabilità ADME all'interno dei parametri valutati. Collettivamente, i dati biologici in vitro , l'analisi del legame con la BSA, l'aggancio molecolare, i calcoli DFT e le previsioni in silico ADME supportano la continua indagine di questi derivati acetamidi basati su triazolo e ossadizolo come inibitori doppi dell'urease e della α-glucosidasi.
Preso insieme, questi risultati identificano i composti 8a, 8c e 9e come candidati promettenti per lo sviluppo di derivati acetamidici a base di triazolo e ossadiolo che mirano all'urease e alla α-glucosidasi. I dati combinati spettroscopici, biologici, di legame BSA, docking molecolare, DFT e ADME forniscono una solida base per studi futuri. Ulteriori indagini dovrebbero includere simulazioni di dinamica molecolare per valutare la stabilità proteina–ligando nel tempo, studi cinetici enzimatici per determinare il meccanismo di inibizione e l'estensione dell'analisi del legame BSA ai derivati rimanenti. Infine, saranno necessari studi in vivo per convalidare i promettenti risultati in vitro e in silico e per valutare ulteriormente il potenziale terapeutico di questa serie di composti.
Dichiarazioni
L'autore dichiara che non c'è conflitto di interessi
Ringraziamenti
L'autore esprime il suo apprezzamento alla Facoltà di Farmacia Clinica dell'Università Al Baha, Arabia Saudita.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1-Naftilamina | Merck | 106148 | Ammina aromatica usata per la preparazione di analoghi sostituiti |
| 2,5-Dimetilanilina | Sigma-Aldrich | D146706 | Ammina aromatica usata per la sintesi di derivati sostituiti |
| 3,4-Dimetilanilina | Alfa Aesar | A15416 | Ammina aromatica usata per la preparazione di analoghi strutturali |
| Acido Benzoico | Sigma-Aldrich | 242381 | Materiale di partenza per la sintesi dell'intermedio di benzoidrazida |
| Bromoacetil Bromuro | Sigma-Aldrich | B17601 | Reattivo elettrofilo usato nella sintesi di intermedi di bromoacetammide |
| Disolfuro di Carbonio | Sigma-Aldrich | 289116 | Reattivo chiave per la ciclizzazione al sistema dell'anello osadiazolo |
| Cloroformio | Sigma-Aldrich | C2432 | Solvente usato nei processi di estrazione e purificazione |
| Dimetilformammide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Solvente aprotico polare usato nelle reazioni di derivatizzazione e sostituzione |
| Difenilamina | Sigma-Aldrich | D23802 | Ammina aromatica usata nella sintesi di composti derivati |
| Epik (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (software) | Usato per generare stati di ionizzazione del ligando a pH 7.0; RRID: N/A |
| Etanolo | Sigma-Aldrich | E7023 | Solvente di reazione per l'esterificazione e la formazione dell'idrazida |
| Acetato di Etile | Sigma-Aldrich | 270989 | Componente di fase mobile polare nell'analisi TLC e nell'estrazione |
| Gaussian 09, Revisione D.01 (Gaussian 09W) | Gaussian, Inc. | N/A (software) | Software usato per calcoli DFT (HOMO-LUMO, MESP, descrittori di reattività globale); RRID:SCR_014897 |
| GaussView 5 | Gaussian, Inc., Wallingford, CT, USA | N/A (software) | Usato per la visualizzazione delle strutture ottimizzate e delle energie orbitali; RRID: N/A |
| Glide (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (software) | Software di docking usato per la generazione della griglia del recettore e il docking molecolare extra-precisione (XP); RRID:SCR_000187 |
| GraphPad Prism, versione 9 | GraphPad Software, Boston, MA, USA | N/A (software) | Usato per l'analisi di regressione IC50 e la valutazione statistica dei dati di inibizione enzimatica; RRID:SCR_002798 |
| Idrazina | Sigma-Aldrich | 225819 | Reattivo usato per la conversione dell'estere in benzoidrazida |
| L(+)-Glutammina | Sigma-Aldrich | G3126 | Reattivo usato negli studi di valutazione biologica |
| LigPrep (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (software) | Usato per l'ottimizzazione della struttura del ligando e la generazione di conformeri 3D; RRID:SCR_016746 |
| Idruro di Litio | Sigma-Aldrich | 201049 | Catalizzatore usato per l'attivazione del gruppo tiolo nelle reazioni di sostituzione |
| Maestro (v13.2, Schrödinger Release 2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (software) | Suite di modellazione molecolare usata per la preparazione e la visualizzazione della struttura di proteine/ligando; RRID:SCR_016748 |
| Metanolo | Sigma-Aldrich | 34860 | Solvente usato nella purificazione e nella preparazione di saggi biologici |
| n-Esano | Merck | 104391 | Componente di fase mobile non polare nell'analisi TLC |
| OPLS-2005 / OPLS-AA | Schrödinger, LLC | N/A (campo di forza) | Campo di forza usato per la minimizzazione energetica delle strutture di proteine e ligandi; RRID: N/A |
| Isotiocianato di Fenile | Merck | 807028 | Reattivo usato nella sintesi di derivati triazolici |
| Protein Preparation Wizard (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (software) | Usato per il perfezionamento della struttura del recettore prima del docking; RRID:SCR_016749 |
| Idrossido di Sodio | Sigma-Aldrich | 221465 | Base usata per l'aggiustamento del pH e la neutralizzazione della reazione |
| Acido Solforico | BDH | 10276 | Catalizzatore acido usato nella fase di esterificazione in condizioni di reflusso |
| Trimetilammina | Riedel-de Haen | 22129 | Base organica usata durante la sintesi di derivati sostituiti |
| VESTA, versione 3.5.8 | Momma & Izumi (sviluppatori); distribuito gratuitamente | N/A (software) | Usato per la visualizzazione del potenziale elettrostatico molecolare (MESP) e delle mappe di superficie HOMO-LUMO; RRID: N/A |
Riferimenti
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