Valutazione dell'efficienza della trasduzione e del targeting cellulare da parte di peptidi penetranti cellulari nel polmone del topo

Sommario

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro integrato per valutare l'efficienza della trasduzione e la specificità cellulare dei peptidi penetranti nelle cellule, utilizzando il peptide ciclicizzato R11A (cR11A; KAPWHLSSQYSAT) come esempio. Il flusso di lavoro combina FACS a frazioni accoppiate seguito da sequenziamento di RNA a singola cellula, citometria a flusso nei topi reporter AT2 e imaging confocale z-stack per confermare l'ingaggio del bersaglio peptidico associato ad AT2.

Abstract

I peptidi penetranti cellulari (CPP) sono peptidi corti (5–30 amminoacidi) capaci di attraversare le membrane cellulari e trasportare carichi macromolecolari senza la necessità di reagenti di trasfezione. Tuttavia, definire in vivo. la selettività cellulare richiede la validazione a livello di tipo cellulare. Viene presentato un flusso di lavoro integrato per valutare l'efficienza di trasduzione di un CPP ciclizzato marcato con Cy5.5, cR11A, all'interno delle cellule epiteliali alveolari di tipo II (AT2) dopo l'iniezione endovenosa retro-orbitale nei topi. I polmoni sono stati prelevati a 15 o 60 minuti dall'iniezione e analizzati utilizzando letture complementari, inclusa la selezione cellulare attivata a fluorescenza a frazioni abbinate (FACS) per isolare sospensioni monocellulari polmonari Cy5.5⁺ e Cy5.5⁻, seguita dal sequenziamento di RNA a cellula singola, citometria di flusso delle cellule singole polmonari da Sftpc-CreERT2^(+/−); Topi rapportatori AT2 ^{LSL-GFP(+/−} ) per quantificare gli eventi GFP⁺/Cy5.5⁺, e imaging confocale z-stack di criosezioni polmonari per confermare la localizzazione di cR11A-Cy5.5 con segnale associato ad AT2. Questo protocollo fornisce prove concordanti dell'ingaggio di tipo cellulare utilizzando molteplici letture complementari e fornisce un quadro riproducibile per valutare il targeting cellulare specifico delle CPP, con modifiche per diversi organi bersaglio.

Introduzione

I peptidi penetranti cellulari (CPP) sono peptidi da 5 a 30 amminoacidi che possono attraversare le membrane cellulari e facilitare la consegna intracellulare di carichi macromolecolari in una forma integra e pienamente funzionale senza la necessità di reagenti di^{trasfezione 1,2}. Lavori precedenti con metodologie combinatorie di mostrazione dei fagi in vitro e in vivo hanno identificato un peptide cardiaco di 12 amminoacidi (APWHLSSQYSRT) che viene assorbito specificamente dai cardiomiociti entro appena 5 min ^3,4. Per indagare il meccanismo di trasduzione, fu effettuata una scansione alanina che portò alla scoperta di due varianti, S7A e R11A (APWHLSSQYSAT), che mostrarono inaspettatamente un arricchimento polmonare in vivo. e furono quindi denominate peptidi miraglioni polmonari (LTP⁾⁵. Inoltre, l'aggiunta di lisina N-terminale e la ciclizzazione testa-coda hanno generato una versione ciclica di R11A (cR11A) con una stabilità sirica significativamente migliorata e un'assorbimento intracellulare nettamente aumentata rispetto alla sua controparte^{lineare 5}.

Le LTP hanno il potenziale di fornire terapie precise alle popolazioni epiteliali distali polmonari, incluse le cellule epiteliali alveolari di tipo II (AT2). Queste cellule sono fondamentali per mantenere l'omeostasi dei tensioattivi e fungono da progenitori della rigenerazione^{alveolare 6}. Tuttavia, una delle principali sfide nello sviluppo della LTP è la valutazione rigorosa della selettività cellulare in vivo. La biodistribuzione a livello di organo da sola non può distinguere la vera trasduzione cellulare dal segnale vascolare, dalla ritenzione extracellulare o dalla clearance fagocitaria e deve quindi essere integrata da misurazioni risolte da singola^{cellula 7}. Per affrontare questa limitazione, questo flusso di lavoro integra l'assegnazione trascritomica a singola cellula, la citometria di flusso basata su reporter e l'imaging a z-stack confocale per generare evidenze a livello cellulare di coinvolgimento peptidico oltre le letture di fluorescenza o biodistribuzione a livello di^{organo 8,9}.

L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire un flusso di lavoro riproducibile e multi-lettura per convalidare l'efficienza della trasduzione in vivo e la specificità cellulare del cR11A marcato con Cy5.5 nel polmone distale, con un focus sulle cellule AT2 dopo iniezione retro-orbitale. Il protocollo definisce l'identità cellulare associata ai peptidi utilizzando letture complementari e indipendenti, inclusi il sorting cellulare attivato dalla fluorescenza a frazione accoppiata (FACS) (Cy5.5⁺ vs Cy5.5⁻) seguito dal sequenziamento di RNA a singola cellula per mappare le popolazioni associate ai peptidi, una valutazione quantitativa dell'assorbimento nei polmoni reporter AT2 tramite citometria di flusso e l'imaging confocale z-stack delle criosezioni polmonari per confermare la colocalizzazione di cR11A-Cy5.5 con segnale associato ad AT2. Questo protocollo può essere facilmente adattato ad altri LTP o vettori di somministrazione e applicato ai sistemi polmonari o ad altri organi per valutare la specificità cellulare delle CPP in fase di sviluppo. È particolarmente adatto per applicazioni che richiedono la validazione a livello cellulare del targeting CPP in vivo, piuttosto che la valutazione esclusiva dell'accumulo a livello di organo.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformità con le linee guida del Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali (IACUC) della Mayo Clinic e sono state approvate secondo il protocollo numero A00006842-22-R25. Sono stati compiuti tutti gli sforzi per minimizzare la sofferenza animale e garantire una gestione etica in conformità con le normative nazionali e istituzionali pertinenti. Gli strumenti di ricerca utilizzati per questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Animali

1. Utilizzare topi adulti misti C57BL/6J (6–8 settimane) ottenuti dal Jackson Laboratory (ceppo #000664).
2. Per la quantificazione specifica di AT2, si usa Sftpc-CreERT2^(+/+) (Ceppo Jax #028054) incrociato con LSL-GFP^(+/+) (Ceppo Jax #007906) per generare Sftpc-CreERT2^(+/−); Topi reporter ^{LSL-GFP(+/−)} AT2.
3. I topi domestici in gabbie ventilate singolarmente. Assicurarsi che tutti i protocolli animali siano approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali.
4. Eseguire l'induzione del tamoxifene in Sftpc-CreERT2^(+/−); Topi ^{LSL-GFP(+/−).} Quando i topi hanno ≥6 settimane, somministrare 100 mg/kg di tamoxifene disciolto in olio di mais tramite gavage orale per tre dosi in 7 giorni. Eseguire esperimenti almeno 2 settimane dopo la dose finale per consentire la massima efficienza di ricombinazione.

2. Preparazione di reagenti e attrezzature

1. Prepara l'anestesia (mix funzionante ketamina/xilazina).
   1. Prepara una soluzione operativa da 5 mL: ketamina (1 mL da 50 mg/mL), xilazina (50 μL da 100 mg/mL) e soluzione salina sterile (3,95 mL).
   2. Somministrare 1 μL/g di peso corporeo tramite .iniezione intraperitoneale (dose finale: 10 mg/kg di ketamina e 1 mg/kg di xilazina).
2. Prepara peptide (cR11A-Cy5.5).
   1. Ottieni le CPP come polveri liofilizzate. Conservare le polveri a −20 °C per un massimo di 2 anni o come soluzioni standard in DMSO a −80 °C per fino a 6 mesi in tubi protetti dalla luce. Evita i cicli di gelo-scongelamento e minimizza l'esposizione alla luce. Prepara una soluzione di 10 mM di cR11A-Cy5.5 in DMSO.
   2. Pesa il topo, calcola la dose e diluisce il stock a 1 mg/kg in acqua priva di nucleasi, fino a un volume finale di 100 μL per topo.
3. Prepara il buffer di digestione (fresco; tieni sul ghiaccio).
   1. Prepara un buffer digestionale contenente 2 mg/mL di Dispase II, 0,1 mg/mL di DNasi I, DMEM/F12 e 1% (v/v) di penicillina-estreptomicina.
   2. Usa 3 mL per mouse.
4. Prepara un buffer di lavaggio enzimatico proteasi non specifico (lascia sul ghiaccio).
   1. DMEM/F12 contenente 0,05 mg/mL di DNasi I e 1% (v/v) di penicillina-estreptomicina.
   2. Usa 10 mL per mouse.
5. Prepara il tampone per la lisi dei globuli rossi (tieni sul ghiaccio).
   1. Diluire il buffer di lisi al 10× a 1× con PBS.
   2. Usa 2 mL per campione.
6. Prepara il buffer per perfusione.
   1. Usa DMEM/F12 gelato (10 mL per mouse).
7. Prepara il buffer di lavaggio.
   1. Usa DMEM/F12 con FBS al 2%.
8. Pre-raffreddare le centrifughe a 4 °C.

3. Amministrazione retro-orbitale di cR11A-Cy5.5

1. Anestetizzare il topo usando la soluzione operativa ketamina/xilazina. Confermare un'anestesia adeguata con la mancanza di ritiro degli arti in risposta al pizzicamento dei diti.
2. Iniettare 100 μL di cR11A-Cy5,5 (1 mg/kg) tramite iniezione endovenosa retro-orbitale utilizzando una siringa di insulina.
3. Avvia il timer e tieni il mouse su una borsa riscaldante sotto il monitoraggio appropriato per 15 o 60 minuti.

4. Prelievo polmonare e perfusione

1. Eutanasia il topo secondo protocolli approvati (ad esempio, inalazione di CO₂ seguita da lussazione cervicale). Metti il topo in posizione supina e spruzza il torace con etanolo al 70%.
2. Apri la cavità toracica per esporre cuore e polmoni.
3. Fai un'incisione nell'atrio destro per permettere il drenaggio durante la perfusione.
4. Inserire un ago da 26 G attaccato a una siringa da 10 mL contenente DMEM/F12 gelato nel ventricolo destro. Tieni aperta l'incisione atriale destra durante tutta la perfusione per permettere il drenaggio.
5. Perfusi manualmente senza pompa di siringa iniettando lentamente e costantemente 10 mL di DMEM/F12 in circa 1-2 minuti. Mantieni una bassa pressione durante l'iniezione ed evita un sovragonfio o una perdita visibile di polmoni dalla parete ventricolare. Continua finché i polmoni non diventano uniformemente pallidi.

5. Gonfiamento polmonare e digestione

1. Cannula la trachea con un catetere endovenoso da 20G e fissa con sutura di seta 3-0. Inietti 1 mL di buffer digeritivo con una siringa da 1 mL per gonfiare i polmoni.
2. Dissezionare i polmoni come un'unica unità intatta e trasferirlo immediatamente su un piatto di 100 mm già raffreddato su ghiaccio.
3. Separare i lobi polmonari e trasferirsi in un tubo conico da 15 mL contenente 2 mL di tampone per digestione fredda (un polmone per sonda).
4. Incubare a 4 °C per 20 ore su un oscillatore rotante (10–15 giri/min).
   NOTA: Consultare Janas PP. et ^al.10 per la metodologia dettagliata.

6. Dissociazione tissutale

1. Posizionare un filtro cellulare da 100 μm su un tubo conico da 50 mL e pre-umidificare con un tampone di lavaggio enzimatico proteasi non specifico da 1 mL.
2. Trasferire il tessuto polmonare sul colino e dissociarelo delicatamente usando uno sturalavandini sterile.
3. Risciacquo con un buffer di lavaggio enzimatico proteasi non specifico da 10 mL.
4. Centrifugare a 130 × g per 15 minuti a 4 °C.
5. Risospendere il pellet in 2 mL di tampone di lisi 1× globuli rossi per 90 secondi a temperatura ambiente.
6. Tempre la lisi con un tampone di lavaggio da 10 mL.
7. Filtra attraverso un colino da 40 μm e risciacquo con il tampone di lavaggio.
8. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
9. Risospendere le cellule in 500–1.000 μL PBS + 2% FBS (≥1 × 10⁶ cellule/mL).
10. Passa attraverso un condensatore filtro da 35 μm in un tubo FACS.
    NOTA: Consulta Konishi S. et ^al.11 per la metodologia dettagliata.

7. Ordinamento FACS a frazioni accoppiate

1. Esegui l'ordinamento usando un citometro a flusso.
2. Utilizzare polmoni iniettati con PBS come controllo negativo per definire la porta Cy5.5.
3. Applicare il gating standard: esclusione di detriti, singole e celle Cy5.5⁺.
4. Ordinare le popolazioni di Cy5.5⁺ e Cy5.5⁻ in tubi separati.

8. preparazione del campione scRNA-seq

1. Tieni i campioni smistati sul freddo.
2. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C e risospendere in un buffer da 500 μL.
3. Procedere solo se la fattibilità è ≥80%.
4. Prepara librerie e sequenziamento secondo necessità.

9. Citometria di flusso nei topi reporter AT2

1. Preparare le sospensioni polmonari a singola come descritto nelle Sezioni 5–6.
2. Tingi con una tintura viva/morta riparabile (1:1.000) per 30 minuti (proteggi dalla luce).
3. Lavare e centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
4. Filtra e tieni i campioni sul ghiaccio.
5. Acquisire dati su un citometro di flusso.
6. Eseguire gating per identificare le cellule, selezionare i singolini, escludere le cellule morte e definire le popolazioni di GFP e Cy5.5.
   1. Quantificare gli eventi GFP⁺/Cy5.5⁺ come percentuale delle cellule GFP⁺.

10. Fissazione e crioprotezione

1. Gonfia i polmoni con 1 mL di PFA al 4% e fissa la trachea.
2. Fissare con 10 mL di PFA al 4% durante la notte a 4 °C.
3. Lava con PBS (3×).
4. Incubare il 15% di saccarosio durante la notte.
5. Trasferisci al 30% di saccarosio per ~48 ore.

11. Incassamento e criosezionamento

1. Prepara i crio-stampi con OCT e posiziona i polmoni e inserisci in OCT.
2. Congela usando azoto liquido. Conservare a ˗80 °C.
3. Taglio a 10 μm dopo l'equilibrio. Asciuga all'aria durante la notte.

12. Imaging e analisi

1. Lavare le sezioni con PBS (3×).
2. Monta con un mezzo DAPI.
3. Procura le pile z confocali.
4. Usa le impostazioni di imaging appropriate.
5. Esegui la ricostruzione 3D.
6. Quantificare la colocalizzazione usando soglie coerenti.
   Metodi opzionali:
   Questi metodi opzionali non sono inclusi nel flusso di lavoro rappresentativo, ma possono essere incorporati per consentire l'esaurimento o l'analisi della popolazione immunitaria CD45⁺, che costituisce una grande proporzione delle cellule^{polmonari 12}.
   NOTA: Utilizzare la deplezione o l'esclusione CD45⁺ quando l'analisi è focalizzata sulle popolazioni polmonari non immuni, poiché questi passaggi rimuovono o separano i segnali di assorbimento delle cellule immunitarie e modificano la composizione cellulare del campione. La colorazione CD45 può essere utilizzata anche per analizzare separatamente la popolazione di cellule immunitarie CD45⁺.

13. Esaurimento della popolazione cellulare CD45⁺

1. Dopo la dissociazione dei tessuti (Passo 6), si utilizza un anticorpo CD45 coniugato a una sfera magnetica (Miltenyi Biotech 130-052-301) oppure un anticorpo CD45 coniugato a un fluoroforo compatibile con Cy5.5, GFP e la colorazione viva/morta, ad esempio CD45-BV605 (BioLegend #103140). Tingi per 20 minuti a 4°C al buio.
2. Se si effettua la deplezione delle perle magnetiche CD45, segui le istruzioni del produttore per l'uso della colonna Lineage Depletion (LD) (Miltenyi Biotech 130-042-901) e procedi con la Separazione delle Cellule Magnetiche (MACS) (Miltenyi Biotech). Poi procedi con l'ordinamento FACS a frazioni accoppiate (passo 7).
3. Se si esegue la deplezione del CD45 utilizzando un anticorpo coniugato fluorescente, si lava prima la sospensione cellulare con un tampone di lavaggio per rimuovere l'eccesso di anticorpi. Poi procedi al passo 7. Dopo aver stabilito porte per escludere doppietti e detriti (Passo 7.3), inserire un gate aggiuntivo per escludere la popolazione CD45⁺ . Poi procedi al Passo 7.4.

14. Analizzare la popolazione cellulare CD45⁺ durante la citometria a flusso

1. Dopo il Passaggio 9.3, utilizzare un anticorpo CD45 coniugato a un fluoroforo compatibile con Cy5.5, GFP e la colorazione viva/morta, ad esempio CD45-BV605 (BioLegend #103140). Tingi per 20 minuti a 4°C al buio.
2. Lava la sospensione cellulare con un tampone di lavaggio per rimuovere l'eccesso di anticorpi. Poi procedi al passo 9.4. Dopo aver stabilito porte per escludere doppietti e detriti (Passo 9.6), inserire un gate aggiuntivo per escludere la popolazione CD45⁺ prima di fare il gate per stabilire le popolazioni ^GFP+ e Cy5.5^{+ 12}.

Risultati

L'applicazione efficace di questo protocollo dovrebbe generare evidenze concordanti da tre letture complementari: scRNA-seq a frazione accoppiata, citometria a flusso basata su reporter e imaging confocale z-stack.

Nell'analisi scRNA-seq a frazioni accoppiate, frazioni polmonari singole di Cy5,5⁻ e Cy5,5⁺ sono state recuperate dopo la somministrazione sistemica di cR11A-Cy5.5 e analizzate separatamente. La visualizzazione UMAP ha identificato le principali popolazioni di cellule polmonari, inclusi compartimenti immunitari, endoteliali, epiteliali e mesenchimali (Figura 1A, B). Sebbene le cellule immunitarie rappresentassero la popolazione dominante in entrambe le frazioni selezionate, la frazione Cy5,5⁺ mostrava un arricchimento relativo dei compartimenti non immuni, comprese le cellule epiteliali (Figura 1C). L'analisi dei sottoinsiemi epiteliali ha mostrato una maggiore rappresentazione delle cellule AT2 nella frazione Cy5,5⁺ rispetto alla frazione Cy5,5⁻, mentre le cellule AT1 sono rimaste basse in entrambe le frazioni (Figura 1D). Questi risultati indicano che la scRNA-seq a frazione accoppiata può identificare l'arricchimento delle cellule AT2 all'interno della frazione polmonare cR11A-Cy5.5–positiva.

La citometria di flusso è stata utilizzata per quantificare il segnale cR11A-Cy5.5 all'interno delle celle AT2 definite dal reporter. Il gating rappresentativo includeva la selezione delle celle totali tramite FSC-A/SSC-A, due gate singole sequenziali, gating a celle vive e GFP finale versus. Analisi Cy5.5 (Figura 2A–E). Nel campione di controllo, gli eventi GFP⁺/Cy5.5⁺ sono stati minimi, stabilendo la soglia di fluorescenza di fondo. Dopo la somministrazione di cR11A-Cy5.5, gli eventi positivi a GFP⁺/Cy5.5⁺ AT2 sono aumentati al 7,99% a 15 minuti e al 7,41% a 60 minuti dopo l'iniezione in questo dataset rappresentativo (Figura 2E). Questi risultati supportano il segnale rilevabile di cR11A-Cy5.5 nelle cellule AT2 reporter-positive in vivo.

L'imaging a pila z confocale fornisce una validazione spaziale della fluorescenza associata ai peptidi nelle sezioni del tessuto polmonare. È stato incluso un controllo non segnalatore per valutare la fluorescenza di fondo e ha mostrato un segnale minimo nei canali GFP e Cy5.5. Nei polmoni rapportatori AT2 trattati con cR11A-Cy5.5, è stata rilevata fluorescenza di Cy5.5 in prossimità delle cellule reporter positive a GFP⁺ AT2, e il canale di colocalizzazione generato da Imaris ha identificato sovrapposizione tra i segnali GFP e Cy5.5 (Figura 3A). L'analisi rappresentativa di colocalizzazione di Imaris ha mostrato una colocalizzazione dell'89,6% e dell'86,8% all'interno del compartimento GFP⁺ AT2 rispettivamente a 15 minuti e 60 minuti (Figura 3B).

I risultati subottimali possono includere un'elevata fluorescenza di fondo di Cy5.5 nei campioni di controllo, scarsa recupero delle cellule epiteliali, bassa vitalità cellulare o debole separazione degli eventi GFP⁺/Cy5.5⁺. Questi problemi indicano tipicamente perfusione incompleta, eccessivo disordine tissutale, compensazione inadeguata o soglie di imaging incoerenti.

Figura 1: SRNA-seq a frazione accoppiata identifica l'arricchimento dell'epitelio alveolare nella frazione polmonare cR11A-Cy5.5–positiva. Le sospensioni polmonari monocellulari sono state suddivise in frazioni di Cy5,5⁻ e Cy5,5⁺ dopo l'iniezione retro-orbitale di cR11A-Cy5,5, e ogni frazione è stata analizzata tramite sequenziamento di RNA a cellula singola. (A) I grafici UMAP mostrano cluster di tipi cellulari in frazioni abbinate da un mouse rappresentativo. (B) L'overlay UMAP mostra la distribuzione delle celle Cy5.5⁻ e Cy5.5⁺. Le regioni cerchiate in (A) e (B) indicano il compartimento epiteliale evidenziato per l'analisi dei sottoinsiemi epiteliali. (C) Le popolazioni immunitarie sono altamente diffuse in entrambe le frazioni, rappresentando oltre l'80% di ciascuna. Rispetto alla frazione Cy5,5⁻, la frazione Cy5,5⁺ contiene una proporzione maggiore di popolazioni endoteliali, epiteliali e mesenchimatici, indicando l'assorbimento di cR11A all'interno di queste popolazioni. (D) All'interno della popolazione epiteliale, le cellule AT2 sono più fortemente rappresentate nella frazione Cy5,5⁺ rispetto a quella Cy5,5⁻, mentre le cellule AT1 rimangono basse in entrambe le frazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Validazione della citometria di flusso dell'assorbimento di cR11A-Cy5.5 nei polmoni reporter AT2. I topi reporter AT2 sono stati somministrati cR11A-Cy5.5 tramite iniezione endovenosa retro-orbitale, e i polmoni sono stati prelevati a 15 o 60 minuti dopo l'iniezione per la preparazione a singola cellula. È mostrato un gating rappresentativo per campioni trattati con PBS vehicle control (Ctrl) e cR11A-Cy5.5: (A) le cellule sono state selezionate da FSC-A/SSC-A, (B, C) i singoletti sono stati controllati da un'esclusione di doppi basata su scatter, (D) le cellule vive sono state identificate tramite l'esclusione di colorante di vitalità e (E) GFP (AT2 reporter) contro. Cy5.5 veniva utilizzato per quantificare gli eventi GFP⁺/Cy5.5⁺. In questo dataset rappresentativo, gli eventi AT2 di GFP⁺/Cy5.5⁺ erano di circa l'8% sia a 15 minuti che a 60 minuti dopo la somministrazione di cR11A-Cy5.5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Imaging confocale e analisi della colocalizzazione di Imaris dell'assorbimento di cR11A-Cy5.5 nei polmoni reporter AT2. (A) I campi rappresentativi sono mostrati per polmoni AT2 non riportatori di controllo (Ctrl) e trattati con cR11A-Cy5.5, prelevati a 15 o 60 minuti dopo l'iniezione per criosezionamento e immagini confocali z-stack. Il segnale GFP (verde) segna le cellule AT2, mentre la fluorescenza cR11A-Cy5.5 (rosso) indica il segnale associato al peptide. Il pannello "Coloc" mostra pixel o oggetti classificati come colocalizzati da Imaris (giallo), e le immagini unite illustrano la sovrapposizione spaziale tra i due canali. Il controllo non riportato è stato incluso per valutare la fluorescenza di fondo nei canali GFP e Cy5.5. (B) La quantificazione della colocalizzazione all'interno del compartimento GFP⁺ AT2 mostra che l'89,6% e l'86,8% del segnale GFP sono colocalizzati con cR11A-Cy5.5 rispettivamente a 15 minuti e 60 minuti. Questi dati indicano una sovrapposizione robusta con le celle GFP⁺ AT2 in entrambi i momenti, supportando un ingaggio preferenziale del compartimento AT2 in vivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo protocollo identifica il targeting peptidico di specifiche popolazioni cellulari utilizzando molteplici letture indipendenti che operano a risoluzioni complementari: mappatura a livello di trascrittoma (scRNA-seq a frazione accoppiata), misurazione quantitativa basata su eventi (citometria a flusso del reporter) e conferma spaziale (stack z confocali). Insieme, questi approcci riducono ambiguità comuni insite negli studi basati su fluorescenza o biodistribuzione di massa a livello d'organo, come la fluorescenza vascolare confondente o la ritenzione extracellulare, così come l'impossibilità di assegnare un segnale associato ai peptidi a specifiche popolazioni cellulari^{polmonari 7}.

Diversi passaggi richiedono particolare attenzione. La qualità della perfusione influisce fortemente sulla fluorescenza di fondo e sulle prestazioni di ordinamento a valle; una perfusione sufficiente è caratterizzata da un aspetto uniforme e bianco-avorio di tutti i lobi polmonari, mentre la perfusione incompleta può aumentare il segnale di Cy5.5 nei compartimenti non bersaglio. Per la dissociazione tissutale, si utilizza una digestione a freddo prolungata (4 °C, 20 h) invece delle tipiche condizioni digertive (37 °C, 1–2 h) per preservare le popolazioni epiteliali e migliorare il recupero delle cellule fragili, in particolare delle cellule alveolari di tipo I (AT1^{) 10}. Le cellule AT1 si perdono facilmente durante l'isolamento perché la loro morfologia grande e sottile le rende altamente sensibili alla digestione meccanica. Oltre alle pratiche standard di laboratorio, tra cui digestione costante, compensazione, gating e soglia di soglia (soglia di soglia), l'analisi di colocalizzazione 3D aiuta a determinare se il segnale peptidico si sovrappone al segnale del reporter AT2 invece di affidarsi solo alla sovrapposizione di fluorescenza^{bidimensionale 13}.

Un passaggio di esaurimento delle cellule immunitarie CD45⁺ può essere considerato prima della quantificazione dello scRNA-seq o della citometria di flusso. Le cellule immunitarie costituiscono una grande parte delle popolazioni cellulari polmonari e possono assorbire CPP come parte di una tipica risposta immunitaria a particelle estranee. Per quantificare con maggiore precisione l'assorbimento della CPP in popolazioni non immuni, inclusi compartimenti endoteliali, epiteliali e mesenchimi, la deplezione cellulare CD45⁺ può migliorare la sensibilità. Ciò può essere ottenuto utilizzando la deplezione basata su perle prima della selezione o escludendo le cellule CD45⁺ durante l'analisi della citometria^{a flusso 12}. Tuttavia, questa modifica dovrebbe essere usata in modo selettivo perché rimuove le informazioni di assorbimento delle cellule immunitarie e modifica la composizione cellulare del campione analizzato.

Devono essere considerate diverse limitazioni di questo flusso di lavoro. La fluorescenza Cy5.5 identifica il segnale associato al peptide ma da sola non distingue il peptide interiorizzato dal segnale aderente alla membrana o pericellulare. Anche lo scRNA-seq a frazione accoppiata è influenzato dalla dissociazione tissutale, dal recupero cellulare, dalle soglie di ordinamento e dall'abbondanza relativa di ciascuna popolazione cellulare polmonare. Pertanto, popolazioni rare come cellule basali o ionociti possono essere sottorappresentate o trascurate. La citometria di flusso del topo di riferimento fornisce un'assegnazione più forte dei tipi cellulari ma richiede una linea di segnalazione appropriata o un pannello di anticorpi validato. Inoltre, un controllo del veicolo con topi reporter definirebbe meglio la colocalizzazione di fondo all'interno delle cellule GFP⁺ AT2 negli saghi di imaging. L'interpretazione dovrebbe quindi basarsi su evidenze concordanti tra scRNA-seq, citometria di flusso e imaging confocale piuttosto che su una singola lettura.

Questo flusso di lavoro è modulare e può essere adattato a fluorofori alternativi, linee di topo reporter, regimi di dosaggio o momenti di prelievo. Per studi che sviluppano ulteriori CPP specifiche per cellule o organi, il design scRNA-seq a frazione accoppiata può essere applicato con modifiche ad altri organi (ad esempio, fegato, rene o cervello). Questo protocollo offre un approccio efficiente per confrontare popolazioni associate a peptidi all'interno di un singolo organo dello stesso animale, migliorando così l'interpretabilità e riducendo la variabilità tra animali. Le applicazioni future includono lo screening di ulteriori CPP, il test dei coniugati CPP–cargo, il confronto di progetti peptidici lineari e ciclici, e l'applicazione del flusso di lavoro a modelli di malattie in cui l'architettura tissutale o l'abbondanza cellulare target viene alterata.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anti-mouse CD45-BV605 antibody	BioLegend	103140	Usato per l'identificazione o l'esclusione di cellule CD45+
Topi C57BL/6J	The Jackson Laboratory	Strain #000664	Topi wild-type usati per gli esperimenti
CD45 MicroBeads, topo	Miltenyi Biotec	130-052-301	Usato per la deplezione magnetica delle cellule CD45+
Contatore di cellule	Invitrogen	Countess 3; AMQAX2000	Conteggio cellulare automatizzato
Incubatore CO2	Thermo Scientific	Heracell VIOS 160i; TSH160IDS	Incubazione delle cellule
Microscopio confocale	Zeiss	LSM 980; 1872-551	Usato per l'acquisizione di immagini z-stack
Peptidio cR11A-Cy5.5	Mayo Clinic Proteomics Core	Sintesi personalizzata; nessun numero di catalogo	CPP fluorescentemente marcato usato per la consegna in vivo
Criostati	Leica Biosystems	Leica CM1950	Usato per la sezione dei tessuti
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	Enzima usato per la digestione dei tessuti polmonari
DMEM/F12	Gibco	11330-032	Buffer di dissociazione e lavaggio cellulare
DNase I	Roche	10104159001	Riduce l'aggregazione cellulare mediata dal DNA
Separatore cellulare FACS	BD Biosciences	BD FACSAria II, sistema a 4 laser	Usato per il triage di cellule Cy5.5+ e Cy5.5-
FBS	Gibco	A52567-01	Aggiunto ai buffer per migliorare la vitalità cellulare
Software FlowJo	FlowJo	Versione 10.10.0	Analisi dei dati di citometria a flusso
Software GraphPad Prism	GraphPad Software	Versione 10	Analisi statistica e creazione di grafici
Software Imaris	Oxford Instruments	Versione 9.9.1	Visualizzazione 3D e analisi di colocalizzazione
Agitatore orbitale incubato	Thermo Scientific	Solaris; 01-258-086	Usato per la digestione dei tessuti
Ketamine	WestWard (Hikma)	NDC 0143-9508-01
Colonne LD	Miltenyi Biotec	130-042-901	Usato per la separazione cellulare magnetica (MACS)
Colonne LD	Miltenyi Biotec	130-042-901
Kit di colorazione per cellule morte gialle fissabili Live/dead	Invitrogen	L34968	Usato per la colorazione di vitalità nella citometria a flusso
Kit di colorazione per cellule morte gialle fissabili Live/dead	Invitrogen	L34968
Topi reporter LSL-GFP	The Jackson Laboratory	Strain #007906	Linea reporter GFP inducibile da Cre
Topi reporter LSL-GFP	The Jackson Laboratory	Strain #007906
Microcentrifuga	Eppendorf	EPP-5427R	Centrifugazione del campione
Microcentrifuga	Eppendorf	EPP-5427R
Medium di montaggio con DAPI	Abcam	AB104139	Controcolorazione nucleare per l'imaging
Medium di montaggio con DAPI	Abcam	AB104139
Acqua priva di nucleasi	Qiagen	175034992
Aguja per gavage orale	Braintree Scientific	N-PK 020
PBS	Gibco	10010-023	Buffer di lavaggio generale
PBS	Gibco	10010-023
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140-122	Previene la contaminazione batterica
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140-122
Centrifugatrice refrigerata	Thermo Scientific	ST16R; TSST16R	Pelleccolamento cellulare a temperatura controllata
Centrifugatrice refrigerata	Thermo Scientific	ST16R; TSST16R
Salino	Baxter	2F7124
Topi Sftpc-CreERT2	The Jackson Laboratory	Strain #028054	Linea Cre inducibile specifica AT2
Topi Sftpc-CreERT2	The Jackson Laboratory	Strain #028054
Topi reporter AT2 Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−)	Allevamento interno	Generati incrociando topi Sftpc-CreERT2(+/+) con topi LSL-GFP(+/+)	Usato per l'etichettatura GFP specifica AT2
Topi reporter AT2 Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−)	Allevamento interno	Generati incrociando topi Sftpc-CreERT2(+/+) con topi LSL-GFP(+/+)
Sutura di seta	Look	SP117
Servizio di sequenziamento dell'RNA a singola cellula	Mayo Clinic Genome Analysis Core	https://www.mayo.edu/research/core-resources/genome-analysis-core/services	Preparazione della libreria e sequenziamento
Servizio di sequenziamento dell'RNA a singola cellula	Mayo Clinic Genome Analysis Core	https://www.mayo.edu/research/core-resources/genome-analysis-core/services
Tamoxifene	Sigma-Aldrich	T5648
Incubatore a bagnomaria	Fisherbrand	Isotemp GPD 28	Incubazione a temperatura controllata
Incubatore a bagnomaria	Fisherbrand	Isotemp GPD 28
Xilazina (Rompun)	Dechra	NADA #047-956