Analisi micro-CT quantitativa del parenchima polmonare e del rimodellamento delle vie aeree in un modello Ferret di fibrosi polmonare

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per l'uso della micro-CT per valutare quantitativamente le caratteristiche della fibrosi polmonare indotta dalla bleomicina in un modello a furet. Questo modello del furetto dimostra un forte potenziale traslazionale per comprendere la fibrosi polmonare e testare nuove terapie.

Abstract

La fibrosi polmonare (PF) è una malattia polmonare cronica e progressiva caratterizzata da lesioni alveolari ripetute che portano a ispessimento parenchimante, cicatrici e compromettimenti respiratori. I modelli attuali di roditori, in particolare quelli che utilizzano la bleomicina (BLEO), hanno una rilevanza traslazionale limitata per la fibrosi polmonare idiopatica umana (IPF) a causa di differenze anatomiche come l'assenza di bronchioli respiratori. Per affrontare questa limitazione, abbiamo sviluppato un modello di fibrosi polmonare su grandi animali nei furetti, che possiedono bronchioli respiratori simili a quelli umani. I furetti selvatici di tre mesi hanno ricevuto l'instillazione intratracheale di BLEO. I polmoni sono stati prelevati 8 settimane dopo il trattamento per la tomografia microcomputerizzata (micro-TC) e la valutazione istologica. A causa della limitata risoluzione spaziale della CT multirivelatore (MDCT) nella visualizzazione delle piccole vie aeree del furetto, i polmoni esondati sono stati fotografiati ex vivo utilizzando uno scanner micro-CT a pressioni controllate delle vie aeree (0 cmH₂O e 25 cmH₂O) per simulare condizioni espiratorie e inspiratorie.

L'imaging micro-TC ha rivelato differenze strutturali distinte tra i polmoni dei furetti normali e trattati con BLEO. I polmoni normali hanno mostrato una bassa attenuazione e una conservazione dell'architettura, mentre i polmoni trattati con BLIO hanno mostrato un'attenuazione marcatamente aumentata, compatibile con la fibrosi. Erano evidenti caratteristiche tipiche della malattia polmonare fibrotica umana, tra cui la formazione dei nidoli con spazi cistici, l'ispessimento dei setti interlobolari e le opacità del vetro macinato, indicative di cambiamenti fibrotici o infiammatori precoci. Utilizzando un'analisi micro-CT quantitativa, è stato osservato che le vie aeree nei polmoni dei furetti trattati con BLUO mostravano una riduzione significativa dell'espansione radiale, dello stiramento longitudinale e della variazione di volume a entrambe le pressioni applicate. Inoltre, l'analisi con abbinamento generazionale ha rivelato un significativo ispessimento delle pareti delle vie aeree nelle regioni con fibrosi visivamente evidente. La valutazione istologica, inclusa la colorazione tricroma di Masson, ha confermato una deposizione estesa di collagene e fibrosi.

Questo studio dimostra che i furetti trattati con BLUO sviluppano caratteristiche radiologiche, meccaniche e istopatologiche simili alla fibrosi polmonare umana. Inoltre, la micro-CT consente una valutazione ad alta risoluzione della distribuzione fibrotica, della dinamica delle vie aeree e dei cambiamenti di volume polmonare. Questi risultati evidenziano il potenziale del furetto come modello traslazionale per studiare la patogenesi della fascite plantare e valutare nuove strategie terapeutiche.

Introduzione

La fibrosi polmonare (PF) è una malattia polmonare interstiziale cronica e progressiva in cui una lesione alveolare ripetuta provoca ispessimento parenchimatoso, fibrosi e disfunzione respiratoria^{progressiva 1}. La fibrosi polmonare può essere indotta da varie esposizioni, tra cui farmaci, tossine ambientali, infezioni, disturbi autoimmuni sottostanti, oppure può essere^{idiopatica 1}. Sebbene siano stati sviluppati farmaci per rallentare la progressione della malattia, in particolare per i pazienti con fibrosi polmonare idiopatica (IPF), la fibrosi polmonare rimane incurabile, con un tasso di sopravvivenza di 3–5 anni dopo la^{diagnosi 1,2}. Nella maggior parte dei casi, l'unico trattamento definitivo è un trapianto polmonare; Pertanto, è urgente sviluppare nuove opzioni terapeutiche più efficaci.

La bleomicina è un farmaco comunemente usato nell'uomo per il trattamento delle tumori maligne; tuttavia, il suo utilizzo è limitato dalla tossicità polmonare, che può rapidamente evolvere verso fibrosi^{polmonare 3}. Dopo la scoperta di questo effetto collaterale, la bleomicina è stata utilizzata nella ricerca per sviluppare modelli animali di fibrosi polmonare. I topi sono stati comunemente utilizzati a questo^{scopo 4,5,6} con vari metodi di somministrazione di Bleomicina, inclusi l'instillazione endovenosa e intratracheale ^7,8. Sebbene la fibrosi si sviluppi in questi modelli, nessuno di essi comprende tutte le caratteristiche cardinali della fibrosi polmonare osservata negli esseri^umani. I modelli di fibrosi polmonare nei roditori non riflettono caratteristiche chiave della malattia avanzata, inclusa la formazione di cisti a nido d'ape e la bronchiolizzazione degli alveoli^{distali 9}. Inoltre, studi hanno dimostrato che il danno polmonare indotto dalla bleomicina inizia a risolversi spontaneamente nei roditori circa 28 giorni dopo il trattamento^{con la bleomicina 10}. Inoltre, nessuno degli agenti dimostrati di inibire la fibrosi in questi modelli ha avuto un effetto equivalente negli esseri umani, limitando le nostre opzioni^{terapeutiche 11}.

I furetti domestici (Mustela putorius furo) sono sempre più utilizzati nella ricerca biomedica respiratoria a causa delle loro somiglianze anatomiche con il sistema respiratorio^{umano 12}. Inoltre, sono suscettibili a patogeni respiratori simili che infettano l'uomo, tra cui il virus respiratorio sinciziale (RSV) e l'influenza, mostrando le loro somiglianze^{fisiologiche 12}. I modelli di bleomicina di furetto mostrano bronchiolizzazione, la formazione di focolai fibrotici e la presenza di cellule aberranti simili a basaloidi (KRT7⁺/KRT17⁺/KRT5^–/TP63⁺)⁹. Una singola dose di bleomicina ha indotto fibrosi polmonare sostenuta nei furetti, con fisiologia restrittiva e anomalie polmonari fibrose persistenti per almeno 22^{settimane 13}. Questo risultato differisce sostanzialmente dal modello ampiamente utilizzato sulla bleomicina topinosa, dove la fibrosi è generalmente auto-limitante e inizia a risolversi dopo circa 28 giorni, con una regressione sostanziale che si verifica entro 6–8 settimane, suggerendo che il modello del furetto potrebbe riprodurre meglio la natura cronica e progressiva della fibrosi polmonare umana. Inoltre, i furetti sono stati recentemente utilizzati nella ricerca sulla fibrosi cistica, una malattia sistemica che colpisce più comunemente il sistema respiratorio, a causa della loro somiglianza con gli esseri^{umani 14}. Pertanto, questi animali possono servire come modelli migliori per la PF rispetto ai precedenti modelli di roditori.

Questo studio attuale mirava a sviluppare un modello animale di fibrosi polmonare che assomigli maggiormente alla condizione umana. Abbiamo somministrato bleomicina intratracheale a furetti domestici. Dopo 8 settimane, questi furetti hanno mostrato cambiamenti radiografici e istologici simili a quelli osservati negli esseri umani con fibrosi polmonare.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformità con le linee guida e i regolamenti del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) della Michigan State University (Approvazione del protocollo degli animali n. PROTO202300066). I protocolli di cura degli animali e sperimentali sono stati approvati dalla Michigan State University e eseguiti in conformità con gli standard istituzionali per l'uso etico degli animali nella ricerca.

1. Instillazione broncoscopica di bleomicina nei furetti

1. Acquisire furetti maschi che hanno un'età compresa tra i 3 e i 4 mesi. Il peso medio di un furetto maschio a questa età dovrebbe essere di circa 0,9–1,6 kg. Ospita gli animali a 21 °C con umidità del 40%–50%.
2. Somministrare gas isoflurano al furetto al 3%–5% utilizzando una macchina anestesicatrice di precisione con vaporizzatore.
3. Mantieni l'anestesia coprendo il naso del furetto con un cono nasale e continua a somministrare gas isoflurano a una concentrazione del 3%–5%.
4. Quando il furetto è adeguatamente sedato e giacito, si avvia la broncoscopia utilizzando un broncoscopio di diametro esterno di 2,7 mm.
5. Inietta una miscela di bleomicina (2 U/kg di peso corporeo) e soluzione salina tramite il canale di lavoro nella trachea distale per consentire una dispersione diffusa della bleomicina. Assicurarsi che il volume totale instillato non superi 1 mL. Riporta i furetti nelle rispettive unità abitative e monitora per 8 settimane.
   NOTA: L'installazione non dovrebbe richiedere più di due minuti per essere completata.
6. Somministrare isoflurano utilizzando una macchina anestesicatrice a gas vaporizzatore di precisione. Copri il naso del furetto con un cono nasale e somministra isoflurano dall'1%–5% finché il furetto non è riposato. Continuare con l'esposizione ai gas finché non può essere confermata la morte clinica apparente. Somministrare una soluzione di eutanasia endovenosa a una dose di 90 mg/kg e monitorare i parametri vitali fino alla conferma del decesso.
7. Prelevare i polmoni 8 settimane dopo il trattamento per la microtomografia computerizzata (micro-TC) e la valutazione istologica.

2. Micro-TC ad alta risoluzione dei polmoni dei furetti

1. Prepara il tessuto polmonare espulso per l'imaging rimuovendo tessuto e sangue estranei tramite l'incisione della vena cava inferiore per permettere il drenaggio del sangue. Esegui la TAC immediatamente dopo aver preparato i polmoni.
2. Ottenere immagini micro-CT tomografiche utilizzando un sistema micro-CT con le seguenti impostazioni di acquisizione dell'immagine: 90 keV, 88 μA, impostazione di potenza con un filtro collimatore a raggi X da 60 μm in rame e alluminio da 500 μm, utilizzando un campo visivo (FOV) di 72 mm a risoluzione isotropa di 144 μm.
3. Acquisire un totale di 5 immagini a tempi standard di gantry di 18 s utilizzando un protocollo di cucitura automatico per sovrapporsi, cucire e rifiutare fette duplicate per creare un'immagine finale cucita per l'analisi delle condotte delle vie aeree; questo porterà a un FOV cilindrico di 68 mm di diametro x 186 mm di profondità totale dell'immagine cucita (piano Z) a risoluzione voxel di 144 μm, permettendo la cattura completa dell'intero blocco polmonare ex vivo del furetto.
   1. Ripeti questo protocollo di imaging per ogni gruppo di polmoni di furetto ex vivo sia a 0 cmH₂O che a 25 cmH₂O pressioni polmonari.
   2. Utilizzare un sistema di monitoraggio della pressione collegato direttamente al polmone per controllare e mantenere con precisione la pressione delle vie aeree durante l'acquisizione di imagin.
   3. Collegare il misuratore di pressione a una fonte di flusso d'aria regolata per consentire una regolazione continua della pressione intrapolmonare.
   4. Prima dell'immagini, imposta il sistema al livello di pressione desiderato (0 cmH₂O o 25 cmH₂O) e gonfia il polmone utilizzando un flusso d'aria costante.
   5. Durante l'immagini, usa il misuratore di pressione per fornire un feedback in tempo reale sulla pressione delle vie aeree e compensare eventuali piccole fluttuazioni di pressione usando la fonte di flusso d'aria.

3. Elaborazione e segmentazione delle immagini

1. Carica i volumi di immagini micro-CT ricostruiti in formato DICOM, che vengono convertiti in un formato di iniziativa tecnologica informatica neuroimaging (NIfTI), nella pipeline di segmentazione delle vie aeree.
2. Definire la regione di interesse (ROI) nell'immagine micro-CT ritagliando manualmente le fette assiali all'estremità superiore per escludere il tubo e altri inserti tracheali (vedi Figura 1A).
3. Esegui la segmentazione delle vie aeree utilizzando l'algoritmo automatizzato Freeze-and-Grow^15,16 descritto nei seguenti passaggi principali.
   1. Posizionare un seme all'interno della trachea sulla parte più alta dell'immagine assiale all'interno del ROI; creare un array di immagini vuoto con dimensioni di input per rappresentare il volume iniziale delle vie aeree fiduciose (CAV) con tutti i voxel assegnati a '0'; e aggiungere il voxel seme al CAV impostandone il valore a '1'.
   2. Impostare una soglia di intensità micro-CT conservativa iniziale t = -1000 HU per la segmentazione del lumen delle vie aeree.
   3. Creare un array di immagini vuoto con dimensioni immagini di input per rappresentare il volume proibito (FV) con tutti i voxel inizializzati a '0'.
   4. Ripetere la segmentazione iterativa fino a quando la convergenza della segmentazione dei lumen delle vie aeree è definita da uno dei due flag: 1) l'intero intervallo di soglia (-1000 a -600 HU) viene controllato, oppure 2) tutti i voxel '0' adiacenti a '1' nell'immagine CAV sono segnati come '1' nell'immagine FV.
      1. Calcola l'albero centrale 17 del CAV e identifica i terminali terminali¹⁸.
      2. Applicare una soglia binaria sull'immagine micro-CT al valore attuale di t e calcolare^{il nuovo volume} 18 collegato al lumen con CAV come semi sulla regione soglia (valore voxel ≤ t), escludendo FV.
      3. Per ogni endpoint CAV, si calcola i voxel associati all'interno del nuovo volume di lumen, escludendo i CAV che sono più vicini a quell'endpoint rispetto a qualsiasi altro endpoint CAV.
      4. Rilevare l'estremità CAV con un grande volume di voxel associati (>150 voxel, equivalenti a 0,5 mm³) come potenziali siti di perdita nel nuovo volume di lumen.
      5. Confermare una possibile perdita di lumen utilizzando i criteri automatizzati definiti in Nadeem et ^al.15.
      6. Rimuovere eventuali perdite nel volume di lumen eliminando il volume del sottoalbero distale alle radici di perdita, e aggiungere voxel intorno alle radici di fuga per aumentare la FV usando gli algoritmi descritti^{in precedenza 15}.
      7. Assegnare il volume di lumen rimosso dalla perdita per aggiornare il CAV utilizzando gli algoritmi descritti^{in precedenza 15}.
      8. Incrementa la soglia t di '1'.
      9. Vai al passo 3.3.4.
4. Eseguire il calcolo di un albero centrale delle vie aeree spesso un voxel utilizzando un algoritmo automatizzato precedentemente^{validato 17} descritto nei seguenti passaggi principali.
   1. Inserisci l'albero segmentato delle vie aeree come un'immagine binaria NIfTI.
   2. Calcolare l'albero iniziale della linea centrale delle vie aeree utilizzando un percorso a costo minimo medialmente^{preferito 17} descritto nei seguenti passaggi principali.
      1. Creare un array di immagini scheletriche vuote con dimensioni dell'immagine di input con tutti i voxel assegnati a '0'; Aggiungi il seed automatico del passo 3.3.1 come voxel scheletro iniziale con valore '1'.
      2. Crea un array di immagini vuote con la dimensione dell'immagine di input con tutti i voxel assegnati a '0' per rappresentare l'immagine del volume delle vie aeree segnata.
      3. Identifica il voxel nel volume delle vie aeree non segnalate più lontano dallo scheletro attuale e calcola il percorso a costo minimo medialmente preferito che collega questo punto allo scheletro attuale usando l'algoritmo precedentemente^{descritto 17}.
      4. Aggiungi il percorso risultante come nuovo ramo scheletrico all'array di immagini dello scheletro e aggiorna il volume segnato dalle vie aeree applicando una dilatazione locale adattativa alla scala lungo il ramo, come descritto^{in precedenza 17}.
      5. Ripeti i passaggi 3.4.2.3–3.4.2.2.4 finché il volume delle vie aeree segnato non è riempito.
   3. Potare rami topologici spuri preservando le vere linee centrali delle vie aeree utilizzando una strategia locale di selezione basata sulla scala sulla lunghezza del ramo, come descritto^{in precedenza 17}.
   4. Eliminare i punti^{semplici 19} nella linea centrale delle vie aeree che non sono estremità di ramo (cioè quelli adiacenti a più di un voxel centrale) per garantire la coerenza topologica e mantenere una linea centrale spessa come un singolo voxel.
5. Eseguire segmentazione del parenchima polmonare in microimmagini dei polmoni di furetto a 0_{cmH 2}O.
   1. Delineare manualmente il parenchima polmonare su ogni quinto taglio dell'immagine coronale utilizzando algoritmi computazionali e interfacce grafiche incorporate all'interno di^{ITK-SNAP 20}.
      NOTA: Il contrasto di intensità micro-CT tra il parenchima polmonare e il fondo circostante allo stato di inflazione_{25 cmH 2O}è stato insufficiente, impedendo una segmentazione affidabile del volume polmonare.
   2. Applicare l'interpolazione dell'immagine per generare una segmentazione del parenchima polmonare nelle fette intermedie dell'immagine.
   3. Eseguire una revisione secondaria del controllo qualità per garantire la continuità strutturale della segmentazione parenchimante lungo la direzione assiale e sagittale.
   4. Escludere il lumen delle vie aeree e le regioni della parete dal parenchima polmonare utilizzando una dilatazione locale basata su scala del volume del lumen, e poi sottrai il volume dilatato dal parenchima polmonare.
6. Quantificare le misure meccaniche delle vie^{aeree 21}.
   1. Quantificare l'espansione radiale correlata alla respirazione delle singole vie aeree misurando le variazioni nell'area trasversale del lumen delle vie aeree (CSA) spazialmente corrispondente tra i volumi inspiratori (inflazione₂₅cmH 2 O) ed espiratori (gonfiamento 0 cmH₂O). Calcolare l'espansione radiale in un ramo delle vie aeree b, denotata con_{Δ aria-R}(b), come:
      (1)
      dove CSA_ins(b) e CSA_exp(b) indicano il lumen delle vie aeree CSA ai volumi polmonari inspiratori ed espiratori. La CSA in b viene calcolata utilizzando un tracciamento radiale della linea e metodi localmente adattivi di half-max sulla metà centrale del ramo ^{b 22}.
   2. Quantificare lo stretching longitudinale correlato alla respirazione delle singole vie aeree come segue:
      (2)
      dove L_ins(b) e L_exp(b) indicano lunghezze di percorso geodetiche del ramo delle vie aeree b rispettivamente ai volumi polmonari inspiratori ed espiratorii. La lunghezza del percorso geodetico di un ramo viene calcolata tracciando il percorso centrale dalla carina fino all'estremità distale del^{ramo 21}.
7. Quantificare le misure basate sull'intensità del parenchima polmonare.
   1. Visualizza spazialmente la distribuzione dell'intensità micro-CT del parenchima polmonare nei furetti sani e fibrotici generando una "rendizione volumetrica 3D a guardare" del volume del parenchima polmonare nel contesto dell'albero delle vie aeree. Ottieni l'effetto look-through utilizzando la mappatura di trasparenza definita dall'intensità micro-CT e la codifica colore. Applica la stessa mappatura di trasparenza e la codifica a colori delle scale sia ai polmoni sani che a quelli fibrotici dei furetti. I seguenti passaggi vengono applicati per generare la resa volumetrica 3D con look-through.
      1. Usa il 3D Slicer²³ per aprire l'immagine tridimensionale (3D) del NIfTI della segmentazione delle vie aeree a 0_cmH2 O di inflazione come "Segmentazione".
      2. Genera una rappresentazione 3D delle vie aeree utilizzando il modulo Segmentazioni . Seleziona il volume delle vie aeree come ingresso e, nella scheda Rappresentazioni , clicca su Crea sotto l'opzione Superficie chiusa .
      3. Importa l'immagine di intensità micro-CT con parenchima polmonare separato in 3D Slicer come Volume. In questa immagine, i valori originali di intensità micro-CT sono conservati per i voxel polmonari, mentre tutti i voxel non polmonari sono assegnati a -2000 HU.
      4. Configura la mappatura di colore e trasparenza per le intensità del parenchimante polmonare utilizzando il modulo Volume Rendering . Valori di intensità della mappa da -1500 HU, -600 HU, 0 HU e 1500 HU fino a nero, verde, giallo e rosso, con opacità rispettivamente di 0, 0,15, 0,3 e 1.
   2. Utilizzare l'algoritmo sviluppato in questo studio per stimare la frazione di tessuto malato all'interno del parenchima polmonare analizzando la distribuzione di intensità osservata tramite micro-TC. Il metodo presuppone che i valori di intensità delle regioni parenchimali sane seguano una distribuzione gaussiana. Al contrario, le regioni fibrotiche, con intensità caratteristicamente più elevate, distorcono la gaussianità del lato destro dell'istogramma osservato. Porta a termine questo compito nei passaggi seguenti.
      1. Calcolare l'istogramma per un'immagine isolata del parenchima polmonare nel passo 3.7.1.3 con 50 bins nell'intervallo di intensità da -1500 HU a 500 HU.
      2. Calcola la media della distribuzione gaussiana target come modalità dell'istogramma e deriva il parametro di deviazione standard usando i valori di intensità a sinistra della modalità sull'istogramma.
      3. Quantificare il volume del tessuto fibrotico come l'area in eccesso sul lato destro dell'istogramma osservato che si trova sopra la curva di distribuzione gaussiana attesa definita dai parametri media e deviazione standard ottenuti nel passo 3.7.2.2.
      4. Calcolare la frazione del tessuto malato come il rapporto tra il volume del tessuto fibrotico e il conteggio totale degli istogrammi che rappresenta il volume della regione parenchimatica.

Risultati

Dei cinque furetti, i polmoni espulsi di un furetto sano e di un furetto fibrotico sono stati fotografati utilizzando uno scanner micro-TC a pressioni controllate delle vie aeree di 0_{cmH 2}O e 25 cmH₂O per simulare rispettivamente gonfiamenti polmonari espiratorio e inspiratorio.

La Figura 1 illustra i risultati intermedi della pipeline di elaborazione dell'immagine per l'immagine micro-CT (Figura 1A) di un polmone di furetto ex vivo a_{0 cmH}2 O di pressione. La Figura 1B presenta risultati intermedi della segmentazione del volume degli alberi delle vie aeree tra iterazioni e i corrispondenti parametri di soglia su un'immagine micro-CT di un polmone di furetto espulso gonfiato a 0_{cmH 2}O. La Figura 1B dimostra l'efficacia dell'algoritmo FG nel catturare vie aeree più piccole tramite rilassamento dei parametri nelle iterazioni successive. La Figura 1C illustra i risultati della rilevazione dell'albero della linea centrale delle vie aeree prima e dopo la potatura dei rami spuriosi.

È stato osservato che, oltre la quinta generazione, il numero di vie aeree rilevate nei polmoni fibrotici è notevolmente inferiore rispetto a quelle rilevate alla generazione corrispondente nel polmone sano (Figura 2A). In particolare, sono stati rilevati 161 rami delle vie aeree nel polmone sano oltre la quinta generazione, mentre solo 91 vie aeree sono stati rilevati nei polmoni fibrotici nelle generazioni corrispondenti. In generale, le pareti delle vie aeree erano più spesse nei polmoni fibrotici rispetto a quelle in salute (Figura 2B). L'analisi computazionale ha rivelato un aumento significativo dello spessore della parete delle vie aeree normalizzata con diametro del lumen nelle regioni con fibrosi visivamente evidente rispetto alle regioni corrispondenti nel polmone sano.

I polmoni fibrotici hanno mostrato spazi aerei cistici piccoli e a pareti spesse, compatibili con il pettino di miele, ispessimento dei septi interlobulari e regioni di opacità del vetro smerigliato. Le opacità del vetro smerilato si riferiscono a regioni del polmone dove il tessuto polmonare ispessito e gli spazi aerei parzialmente riempiti fanno apparire l'area opaca e grigia nelle immagini TC. È stato osservato che i polmoni fibrotici presentavano valori di intensità CT più elevati nel parenchima corrispondenti alle regioni fibrotiche. La Figura 3A presenta una "rappresentazione 3D del volume" del volume segmentato del parenchima polmonare insieme all'albero segmentato delle vie aeree. I valori di intensità micro-CT sul parenchima nei polmoni fibrotici del furetto (-502 ± 238 HU) erano significativamente più alti (p < 0,001) rispetto a quelli nel polmone sano del furetto (-588 ± 167 HU). L'analisi dell'intensità regionale dell'elevazione (Figura 3B) ha mostrato che il polmone fibrotico ha un volume parenchimante del 27,8% con un'intensità CT elevata (indicata dall'area viola nell'istogramma). In confronto, il polmone sano ha solo l'1,24% del volume parenchimatose con un'intensità CT elevata.

Un confronto visivo della meccanica delle vie aeree tra polmoni normali e malati illustra la distribuzione dei biomarcatori meccanici respiratori delle vie aeree nei polmoni sani e fibrotici dei furetti tra i rami delle vie aeree (Figura 4). È stata osservata un'espansione radiale delle vie aeree del 66,8% ± 9,8% nei polmoni sani dei furetti, significativamente più alta (p < 0,001) rispetto a quella osservata nei polmoni fibrotici dei furetti (32,4% ± 7,6%). È stata inoltre osservata una differenza significativa (p < 0,001) nello stiramento longitudinale delle vie aeree tra polmoni di furetto sani (35,7% ± 5,3%) e fibrotici (16,0% ± 4,9%).

Immagini CT rappresentative sono state acquisite utilizzando uno scanner micro-CT a due diverse pressioni delle vie aeree (0 cmH₂O e 25 cmH₂O) per ciascun polmone. La Figura 5 illustra le differenze tra i polmoni di furetto normali (Figura 5B,C) e quelli trattati con BLUO (Figura 5E,F). Nei polmoni normali, le TAC mostrano una tipica architettura polmonare con bassa attenuazione e nessun segno di fibrosi (Figura 5B, C). Al contrario, i polmoni dei furetti trattati con BLIO mostrano cambiamenti patologici significativi, inclusa un'aumento dell'attenuazione polmonare, indicativa di fibrosi tissutale (Figura 5E,F). Inoltre, si osserva un prominente nido d'ape, caratterizzato da spazi cistici e setti interlobolari ispessiti (Figura 5E,F). Le opacità del vetro smerilato (GGO), che rappresentano aree di infiammazione o di cambiamenti fibrotici precoci, sono anch'esse visibili nei polmoni trattati con BLEO (Figura 5E,F).

L'analisi istologica (Figura 6) ha confermato un notevole rimodellamento tissutale e fibrosi nei polmoni di furetto trattati con bleomicina. La colorazione di ematossilina ed eosina (HE) ha rivelato un'architettura alveolare preservata nei polmoni normali (Figura 6A, C), mentre i polmoni fibrotici hanno mostrato una distorsione strutturale estesa, aumento della cellularità, ispessimento della parete delle vie aeree e lesioni fibrotiche prominenti (Figura 6B,D). La colorazione tricroma di Masson ha ulteriormente dimostrato una deposizione minima di collagene nelle vie aeree e parenchima dei polmoni normali (Figura 6E,G), mentre i polmoni fibrotici hanno mostrato un marcato accumulo di collagene sia nelle vie aeree (Figura 6F) che nelle regioni parenchimatiche (Figura 6H). L'analisi quantitativa delle immagini (Figura 6I,J) ha confermato un aumento significativo dell'area positiva al collagene nei polmoni fibrotici rispetto ai controlli normali sia nelle vie aeree che nei compartimenti parenchimatici (P < 0,0001), indicando una deposizione estesa della matrice extracellulare e un progressivo rimodellamento dei tessuti.

Figura 1: elaborazione e segmentazione delle immagini CT. (A) Selezione della regione di interesse (ROI) in un'immagine micro-CT. La linea di taglio è stata selezionata manualmente per escludere il tubo e altri inserti tracheali usati per gonfiare i polmoni del furetto scinduti. (B) Risultati intermedi della segmentazione degli alberi delle vie aeree in un'immagine micro-CT di un polmone di furetto estirpato gonfiato a 0_{cmH 2O}utilizzando l'algoritmo freeze-and-grow (FG). (C) Risultati della rilevazione della linea centrale prima e dopo la potatura di rami scheletrici spuri applicati sul volume di segmentazione delle vie aeree da un'immagine micro-CT di un 0_{cmH 2O}. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Analisi computazionale della generazione degli alberi delle vie aeree. (A) Il numero di vie aeree rilevate nei polmoni sani rispetto a quelli fibrotici. (B) Differenze nello spessore della parete delle vie aeree tra polmoni sani e fibrotici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Visualizzazione dell'intensità micro-CT codificata a colori. (A) Una visualizzazione 3D approfondita delle distribuzioni di intensità micro-CT codificate a colori attraverso il parenchima per polmoni di furetto sani e fibrotici a 0 cmH2O di inflazione. (B) Istogrammi di intensità micro-CT dei polmoni sani e fibrotici dei furetti, con l'area dell'istogramma segnata in viola che indica regioni di intensità CT elevate basate sulla modellizzazione gaussiana. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Biomarcatori meccanici delle vie aeree respiratorie per polmoni di furetto sani e fibrotici. Per ogni biomarcatore (A mostra l'espansione radiale delle vie aeree, B mostra l'allungamento longitudinale delle vie aeree), è stato applicato uno schema di codifica colori normalizzato che copre l'intervallo di μ_x ± 3σ_x, dove la media (μ_x) e la deviazione standard (σ_x) di ogni metrica sono state calcolate su tutti i rami del polmone sano del furetto. Vedi il testo per i risultati comparativi quantitativi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: L'imaging micro-CT dimostra un esteso rimodellamento strutturale e la perdita di volume polmonare aerato nei polmoni fibrotici indotti dalla bleomicina. (A–F) Immagini micro-CT rappresentative acquisite a una pressione di gonfiaggio di 25 cm H₂O confrontano furetti controlli sani (A–C) con furetti fibrotici trattati con bleomicina (D–F). Le ricostruzioni tridimensionali (3D) a volume (A,D) mostrano un'architettura polmonare preservata e un'espansione omogenea nei polmoni sani (A), mentre i polmoni fibrotici (D) mostrano una riduzione dell'espansione polmonare e una marcata distorsione parenchimatosa. Le TAC trasversali (B,E) e coronali (C,F) evidenziano ulteriormente le differenze tra i gruppi. I polmoni sani mostrano parenchima uniformemente aerato, con ramificazioni normali delle vie aeree e densità tissutale minima (B,C). Al contrario, i polmoni fibrotici mostrano un'ampia opacizzazione bilaterale sottopleurale e predominante basilare, aumento della densità parenchimatosa, distorsione architettonica e ingrossamento dello spazio aereo cistico coerente con una rimodellazione a nido d'ape (frecce rosse) (E,F). Linee gialle tratteggiate delimitano i confini polmonari. Questi risultati di imaging indicano un grave rimodellamento fibrotico e una sostanziale riduzione del volume polmonare aerato funzionale dopo l'esposizione alla bleomicina ai furetti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Validazione della fibrosi polmonare del furetto indotta da BLEO. (A–H) Le sezioni rappresentative colorate da ematossilina ed eosina (HE) in campo chiaro mostrano differenze tra polmoni normali (A,C) e polmoni fibrotici (B,D). Le immagini HE a basso ingrandimento mostrano un'architettura alveolare preservata nei polmoni normali (A) e un esteso rimodellamento tissutale e lesioni fibrotiche nei polmoni fibrotici (B). Le immagini HE ad ingrandimento superiore mettono ulteriormente in evidenza la struttura alveolare normale nei polmoni normali (C) e l'aumento della cellularità, l'ispessimento delle pareti delle vie aeree e la distorsione architettonica nei polmoni fibrotici (D). Immagini rappresentative in campo chiaro delle sezioni polmonari di furetto colorate con il tricromo di Masson mostrano una deposizione minima di collagene nelle vie aeree polmonari normali (E) e nel parenchima (G), e un aumento della deposizione di collagene (blu) nelle vie aeree polmonari fibrose (F) e nel parenchima (H). (I,J) La quantificazione dell'area positiva al collagene ha rivelato un aumento significativo della deposizione di collagene nei polmoni fibrotici rispetto ai polmoni normali sia nelle vie aeree (I) che nel parenchima polmonare (J). P < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo studio descrive un protocollo che combina l'amministrazione intratracheale di bleomicina nei furetti con la micro-tomografia computerizzata ex vivo ad alta risoluzione (micro-CT) per caratterizzare le caratteristiche strutturali e meccaniche della fibrosi polmonare. La micro-TC può rilevare vie aeree piccole fino a 0,2 mm e misurare volumi, spessore delle vie aeree, densità e morfologia. L'aumento della densità tissutale, la perdita di volume e l'eterogeneità regionale corrispondono strettamente all'istopatologia. L'obiettivo principale era stabilire la fattibilità e dimostrare che questo modello su animali di grandi dimensioni, insieme ad analisi di imaging avanzate, può catturare caratteristiche radiologiche, delle vie aeree e istopatologiche che ricordano la fibrosi polmonare umana. Diversi passaggi del protocollo sono fondamentali per la riproducibilità e l'interpretabilità. Innanzitutto, l'instillazione di bleomicina intratracheale guidata broncoscopicamente consente un'esposizione diffusa ai polmoni minimizzando l'accumulo delle vie aeree prossimali, una limitazione nota dei modelli animali^{di piccole dimensioni 4,7,11}. Questo approccio probabilmente riduce la variabilità nella distribuzione regionale delle lesioni, particolarmente importante nei polmoni più grandi con ramificazioni delle vie aeree più complesse. In secondo luogo, scegliere un periodo di 8 settimane dopo l'instillazione favorisce la fibrosi consolidata rispetto all'infiammazione acuta. Nei modelli murini, la fibrosi indotta dalla bleomicina spesso si risolve parzialmente nel tempo, limitando la rilevanza^{traslazionale 4,8,11}. Al contrario, i polmoni di furetto in questo studio hanno mostrato caratteristiche fibrotiche persistenti radiologiche e istologiche.

Il gonfiamento polmonare controllato durante l'imaging ex vivo rappresenta un altro elemento critico. L'imaging a pressioni standardizzate delle vie aeree (0 cmH₂O e 25 cmH₂O) ha permesso la quantificazione dell'espansione radiale delle vie aeree e dello stiramento longitudinale, riducendo così gli effetti di confusione dovuti alla variabile del volume polmonare e della compliance. Questi biomarcatori meccanici delle vie aeree, derivati tramite algoritmi automatizzati e abbinati a generazioni, forniscono misure oggettive della disfunzione delle vie aeree difficili da valutare solo con l'istologia^{convenzionale 15,21}.

Diverse modifiche al protocollo potrebbero ulteriormente migliorare la robustezza. La dosaggio di bleomicina potrebbe essere titolato o somministrato in dosi ripetute e basse per modellare meglio la lesione epiteliale cronica, centrale nei paradigmi attuali della patogenesi della fibrosi^{polmonare 1,3}. Le strategie di instillazione segmentaria possono permettere confronti all'interno dell'animale tra aree fibrotiche e relativamente conservate. Dal punto di vista dell'imaging, è essenziale un'attenta standardizzazione della pressione delle vie aeree, delle condizioni di fissazione e della temperatura per minimizzare la deformazione tissutale durante la scansione ex vivo. La fibrosi grave può complicare la segmentazione automatica delle vie aeree a causa dell'obliterazione delle vie aeree e dell'elevata densità tissutale; Pertanto, la soglia adattiva e il controllo qualità manuale rimangono accessori essenziali per le pipeline^{automatizzate 15}.

Questo metodo presenta diverse limitazioni. In particolare, il piccolo numero di animali fotografati dalla micro-CT limita l'inferenza statistica, e i risultati devono essere interpretati come descrittivi. Questo lavoro è stato progettato come uno studio pilota per determinare la fattibilità di caratterizzare un modello di fibrosi polmonare indotto dalla bleomicina tramite micro-CT quantitativa. Saranno necessari studi futuri con coorti più ampie per convalidare questi risultati e migliorare la potenza statistica. Tuttavia, la descrizione mostra una differenza evidente nei biomarcatori e nelle misurazioni per l'imaging.

Inoltre, sebbene ampiamente utilizzata, la fibrosi indotta dalla bleomicina rimane un modello di lesione guidato dalle tossine e non ricapitola pienamente l'eziologia multifattoriale della fibrosi polmonare idiopatica, inclusi l'invecchiamento, la suscettibilità genetica e le esposizioni^{ambientali 3,6,11}. L'imaging è stato eseguito ex vivo, escludendo la valutazione diretta dello scambio gassoso, dei contributi vascolari e della progressione longitudinale della malattia. Tuttavia, la micro-CT ex vivo offre una risoluzione spaziale superiore e consente un'analisi tridimensionale dettagliata delle vie aeree piccole, cosa attualmente non possibile con la TAC clinica multirivelatore nei furetti.

Nonostante queste limitazioni, questo protocollo offre diversi vantaggi rispetto ai modelli esistenti. I furetti possiedono bronchioli respiratori e schemi di ramificazione delle vie aeree che somigliano più a quelli umani che a quelli dei roditori, rendendoli particolarmente adatti allo studio degli aspetti centrati sulle vie aeree della^{fibrosi 6,12}. La combinazione di un'anatomia delle vie aeree rilevante per l'uomo con l'imaging quantitativo basato su micro-TC consente una valutazione simultanea della densità parenchimata, dello spessore della parete delle vie aeree, della perdita delle vie aeree e della meccanica compromessa delle vie aeree. Queste caratteristiche rispecchiano i modelli radiologici osservati nella malattia polmonare fibrotica umana, tra cui il pettinicolamento, l'ispessimento del setto e l'eterogeneità^{regionale 1,2}.

La tomografia computerizzata ad alta risoluzione (HRCT) è una modalità di imaging fondamentale per la diagnosi e il monitoraggio longitudinale della fibrosi polmonare idiopatica (IPF) nella pratica clinica. La HRCT si basa su principi simili alla micro-tomografia computerizzata (micro-CT) ed è stata ottimizzata per rilevare anomalie polmonari parenchimate minimizzando l'esposizione alle radiazioni nei^{pazienti 24}. È importante sottolineare che i progressi nella HRCT hanno migliorato la precisione diagnostica al punto che la biopsia polmonare chirurgica spesso non è più necessaria per la diagnosi IPF quando sono presenti caratteristiche di imaging²⁵. I reperti radiografici distintivi dell'IPF, inclusa distorsione architettonica, bronchiectasi di trazione, honeycombg e spazi aerei cistici, possono essere identificati tramite HRCT nei pazienti. In linea con queste osservazioni cliniche, il nostro modello del furetto dimostra la distorsione delle vie aeree e la formazione dello spazio aereo cistico rilevabili tramite micro-CT, fornendo un fenotipo di imaging che si avvicina molto alle malattie umane.

Oltre all'HRCT, la tomografia di coerenza ottica endobronchiale (EB-OCT) si è emersa come un prezioso approccio di imaging per la valutazione^{IPF 26}. EB-OCT è una tecnica minimamente invasiva che utilizza onde luminose per generare immagini ad alta risoluzione e tridimensionali del polmone periferico in vivo tramite un broncoscopio^{standard 26}. Simile all'HRCT, l'EB-OCT ha dimostrato il potenziale per identificare il rimodellamento fibrotico senza la necessità di una biopsia chirurgica. La capacità del nostro modello di furetto di sviluppare anomalie strutturali rilevabili tramite imaging basato su TC suggerisce che possa essere anche molto adatto per future valutazioni utilizzando nuove modalità di imaging clinico emergenti come EB-OCT.

È importante sottolineare che molte terapie che attenuano la fibrosi nei modelli con roditori non hanno dimostrato un'efficacia simile negli esseri^{umani 11}. L'approccio descritto qui può aiutare a colmare questo divario traslazionale fornendo biomarcatori di imaging sensibili e risolti spazialmente che riflettono sia la struttura che la funzione. Tali biomarcatori potrebbero essere utilizzati per valutare la risposta terapeutica oltre il carico globale di collagene, catturando miglioramenti regionali nella meccanica delle vie aeree o nel rimodellamento parenchimatoso.

In conclusione, questo studio stabilisce un protocollo praticabile per modellare la fibrosi polmonare nei furetti e per valutare quantitativamente i cambiamenti strutturali e meccanici correlati alla malattia tramite micro-TC. Sebbene preliminare, l'approccio evidenzia il potenziale di combinare modelli di grandi animali con analisi avanzate di imaging per aumentare la rilevanza traslazionale, migliorare la comprensione meccanicistica della fibrosi polmonare e supportare la valutazione preclinica di nuove strategie terapeutiche.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1 mL Luer locking syringe	BD	309628
10 mL Luer locking syringe	BD	303134
24 G ´ 3/4" Exel safelet catheter	EXELINT INTERNATIONAL CO.	26751
3 mL Luer locking syringe	BD	309657
30 mL Luer locking syringe	BD	302832
5 mL Luer locking  syringe	BD	309647
BD Precision glide needle 18 G ´ 1 1/1"	BD	305196
BD Precision glide needle 20 G ´ 1"	BD	305175
BD Precision glide needle 23 G ´ 1"	BD	305145
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS -/-)	Gibco	14190250
Endotracheal intubation tubes with cuff oxygen catheter	Caphstion	2.0MM
ET Tube, Uncuffed, 2.0	Teleflex	5-10404
Ethicon Permahand silk suture, Size 2-0, No Needle, 18", 36/Box, A185H	Fisher Scientific	50-209-2809
Invitrogen RNAlater stabilization solution	Fisher Scientific	AM7021
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Lubricant PM ointment	AACE Pharmaceuticals	71406-124-35	Pomata per gli occhi
MADgic 700 atomizer	Teleflex	MAD700
Manometer, Professional air pressure meter	Leaton	T168
Rodent ventilator model 683	Harvard Apparatus, Inc.	55-3438
Sterile saline, 0.9%	CellPro	DS0329
Veterinary pulse oximeter	uPM60V	UVMI