Questo protocollo consente la visualizzazione riproducibile delle gocce lipidiche e della dinamica degli organi durante la mitosi utilizzando cellule epatomate sincronizzate.
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Articolo metodologico
Un metodo basato sulla fluorescenza per visualizzare la dinamica delle gocce lipidiche e degli organelli durante la mitosi nelle cellule epatomatose
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le gocce lipidiche intracellulari (LD) sono ubiquitarie in diversi tipi cellulari. I LD immagazzinano lipidi neutri come triacilglicerolo ed estere colesterile e svolgono ruoli importanti nel metabolismo energetico, nella segnalazione e nelle risposte allo stress. Sebbene i LD siano riconosciuti come organelli intracellulari, il loro comportamento durante la progressione del ciclo cellulare rimane poco chiaro. Durante la mitosi, diversi organelli, tra cui i mitocondri e l'apparato di Golgi, subiscono un ampio rimodellamento e successiva riassemblaggio, sollevando la questione se anche i LD subano cambiamenti dipendenti dal ciclo cellulare. Poiché i LD possono fungere da fonti di energia e hub di segnalazione, chiarire la loro dinamica durante la mitosi è di particolare importanza. Per affrontare questo problema, presentiamo un protocollo che combina la sincronizzazione del ciclo cellulare con la colorazione fluorescente LD nelle cellule epatomica. Le cellule vengono sincronizzate al confine G2/M utilizzando un approccio basato su inibitori della chinasi 1 dipendente dalla ciclina, rilasciate nel ciclo cellulare e raccolte in momenti temporali specifici. I LD vengono poi marcati con un colorante lipidico neutro e visualizzati tramite microscopia a fluorescenza. Questo metodo fornisce un approccio riproducibile per esaminare la redistribuzione della LD durante la mitosi e può essere applicato in modo ampio a studi sulla biologia degli organelli, la regolazione metabolica e la fisiologia delle cellule tumorali.
Introduzione
Il ciclo cellulare è un evento altamente orchestrato che garantisce la replicazione e la segregazione accurata del DNAcromosomico 1,2, durante il quale gli organelli intracellulari vengono riorganizzatidinamicamente 3. È composto da quattro fasi principali: G1, S, G2 e M 1,2. Durante la mitosi, i cromosomi duplicati si allineano nel piano equatoriale del fuso bipolare e vengono successivamente trasferiti a due cellulefiglie 4. Organelli come i mitocondri e l'apparato di Golgi subiscono ampi rimodellamenti durante la mitosi 5,6,7,8. Questi organelli si frammentano in piccole vescicole prima di essere distribuiti alle due cellule figlie, dove si ricompongono durante la progressione del successivo ciclocellulare 3.
Le gocce lipidiche (LD) sono organelli neutri contenenti lipidi composti da un nucleo di lipidi neutri circondato da un monostrato fosfolipidico. Sono associate a un insieme diversificato di proteine e si trovano ampiamente in molti tipi di cellule, incluse le celluleproliferanti 9,10. La composizione proteica e lipidica delle LD varia a seconda del tipo cellulare etessutale 11. Tra queste proteine, la famiglia della perilipina (PLIN) è stata ampiamente studiata, e PLIN2 stabilizza le LD negliepatociti 12,13. Oltre alla stabilizzazione strutturale, le proteine della famiglia PLIN sono state implicate nella regolazione della dinamica della LD e nelle interazioni con altri componenticellulari 14. I LD funzionano non solo come depositi di stoccaggio per il triacilglicerolo e l'estere colesterile, ma anche come centri per il metabolismo energetico15, le vie disegnalazione 16 e l'adattamento allo stress17. In condizioni patologiche, come la steatoepatite associata a disfunzione metabolica (MASH, precedentemente nota come NASH), l'accumulo di LD è notevolmente aumentato rispetto al controllo sano18,19, evidenziandone l'importanza nella biologia delle malattie. Tuttavia, solo un'osservazione limitata della localizzazione spaziale delle LD nelle cellule in divisione era disponibile, nonostante ricerche approfondite sulla dinamica dei mitocondri, del reticolo endoplasmatico e dell'apparato di Golgi durante la mitosi. Abbiamo analizzato la localizzazione della LD durante la mitosi, utilizzando il metodo presentato qui. Abbiamo precedentemente riportato che i LD presentavano schemi di distribuzione spaziale distinti da quelli di altri organelliintracellulari 20.
Qui forniamo un protocollo dettagliato per indagare la distribuzione dei LD e di altri organelli intracellulari durante la mitosi nelle cellule epatomiche. Il metodo include la sincronizzazione del ciclo cellulare e la colorazione fluorescente, consentendo la visualizzazione riproducibile della dinamica LD durante la mitosi. I risultati rappresentativi dimostrano che le LD mostrano cambiamenti nella distribuzione spaziale dipendenti dal ciclo cellulare tra interfase e mitosi, facilitando un'analisi comparativa della localizzazione della LD durante la divisione cellulare. Questo approccio può essere ampiamente applicato allo studio della localizzazione, della dinamica e della regolazione metabolica degli organelli sia in contesti fisiologici che patologici.
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Protocollo
1. Soluzioni standard richieste per questo protocollo
- Prepara una soluzione di albumina sirica (BSA) priva di acidi grassi al 24% (w/v) disciolta in 150 mM di NaCl.
- Preparare 10 mM di RO-3306 (un inibitore selettivo della chinasi dipendente da ciclina 1 (CDK1)) disciolta in DMSO in condizioni sterili.
NOTA: Altre soluzioni comunemente utilizzate, come NaOH, NaCl e soluzione salina tamponata fosfato (PBS), sono state preparate secondo la pratica standard di laboratorio. Il PBS è stato preparato sciogliendo 2,6 g di NaH₂PO₄·2H₂O, 29 g di Na₂HPO₄·12H₂O, 80 g di NaCl e 2,0 g di KCl in acqua distillata e regolando il volume finale a 1 L.
2. Preparazione di acido oleico coniugato con BSA
- Metti 90 mg di acido oleico in un becher da 50 mL e aggiungi 2 mL di etanolo (99,5%) per scioglierlo.
- Aggiungi 100 μL di 5 N NaOH alla soluzione e mescola finché non sono completamente miscelati.
- Evapora etanolo sotto un flusso di gas azoto.
- Aggiungi 10 mL di NaCl da 150 mM e incuba la miscela a 60 °C per 5 minuti.
- Aggiungi lentamente 12,5 mL di soluzione di stock BSA raffreddata al 24% (p/v) alla soluzione di acido oleico (2.4) e mescola delicatamente la miscela continuamente per 10 minuti per permettere una miscela graduale e omogenea a temperatura ambiente.
- Regola il pH a 7,4 e porta il volume finale a 25 mL con 150 mM di NaCl. La concentrazione finale di acido oleico sarà di 12,8 mM.
- Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm in condizioni sterili e conservare le aliquote a 4 °C per un massimo di 2 settimane o a -20 °C per una conservazione più lunga.
3. Sincronizzazione dei confini G2/M delle celle
- Preparate i comandi necessari.
- Preparare cellule asincrone non trattate senza trattamento con RO-3306 come controllo di base.
- Per le condizioni trattate con acido oleico, si prepara le cellule trattate solo con acido oleico senza sincronizzazione come controllo di base.
- Per la colorazione a fluorescenza, eseguire controlli di colorazione singola per ciascun fluoroforio per verificare la specificità del segnale ed escludere la sovrapposizione spettrale tra canali (Figura Supplementare 1).
- Acquisire immagini utilizzando impostazioni di acquisizione sequenziale o configurazioni di filtri appropriate per minimizzare la sovrapposizione spettrale e la diafonia del canale.
NOTA: Questi controlli sono essenziali per distinguere i cambiamenti dipendenti dal ciclo cellulare dalla distribuzione basale degli organelli e per validare la specificità della fluorescenza.
- Mantenere le cellule HuH7 nel mezzo modificato di Eagle di Dulbecco, integrato con siero bovino fetale al 10%, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂.
- Posiziona le coperture di vetro in un piatto di coltivazione da 35 mm. Semina 2 × 105 cellule per piatto da 35 mm nel mezzo descritto sopra e incuba le cellule durante la notte a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂.
- Lavare le cellule due volte con PBS e poi incubare con un mezzo fresco contenente 9 μM RO-3306 e 0,5 mM di acido oleico.
- Incubare le cellule per 20 ore in condizioni standard di coltura.
4. Rimozione del reagente RO-3306 dalle cellule sincronizzate per entrare nella fase mitotica
- Lava le cellule (passo 3.4) da tre a cinque volte con PBS.
- Lava le cellule una volta con un mezzo di coltura fresco.
- Incubare le cellule in un mezzo fresco per 1 ora a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per permettere l'ingresso nella mitosi.
NOTA: La rimozione del RO-3306 permette alle cellule sincronizzate di entrare nella fase mitotica dal confine G2/M. Dopo aver eliminato il reagente, una percentuale significativa di cellule entra in fase mitotica entro circa 1 ora, durante la quale le cellule mitotiche possono essere identificate tramite arrotondamento cellulare e condensazione cromosomica. Il momento ottimale per osservare una fase specifica della mitosi può variare a seconda del tipo cellulare e delle condizioni della coltura.
5. Preparazione del campione delle cellule mitotiche
- Fissare le cellule con il 4% di paraformaldeide in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.
ATTENZIONE: Le cellule mitotiche tendono a staccarsi dal piatto; Evita di lavare prima della fissazione.
NOTA: Per la colorazione con PLIN3, le cellule sono state fissate con una combinazione di paraformaldeide al 2% e glutaraldeide. - Permeabilizza le cellule fissate con il 0,1% (p/v) di Triton X-100 in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Bloccare cellule con BSA all'1% (w/v) in PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
6. Colorazione dei LD e di altri organelli cellulari
- Rimuovere con cura le coperture di vetro dalla teglia di coltura usando pinze fini e posizionarle con il lato cellulare in una camera umidificata per evitare l'asciugatura.
NOTA: Eseguire tutti i passaggi successivi di colorazione in un ambiente umidificato e protetto dalla luce per preservare i segnali di fluorescenza. - Lavare le cellule due volte con PBS e incubare con anticorpi primari diluiti in PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule due volte con PBS e incubare con anticorpi secondari diluiti in PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lava le cellule due volte con PBS e tingi con un colorante fluorescente a lipidi neutri per 10 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Sono stati selezionati coloranti con proprietà spettrali distinte per consentire immagini multicolore flessibili e minimizzare la sovrapposizione spettrale con altri marcatori degli organelli. - Lavare le cellule due volte con PBS e colorare i nuclei con un colorante fluorescente che lega il DNA (DAPI: eccitazione, 350–410 nm; emissione, 420–450 nm) diluito 1:1.000 in PBS per 5 minuti.
- Lavare due volte le celle con PBS, poi montare le coperture su vetrini di vetro usando un mezzo antisfaccetto per preservare la fluorescenza durante l'imaging.
- Sigilla i bordi delle copertine con smalto trasparente per le unghie per evitare l'asciugatura e il movimento durante l'immagini.
NOTA: Poiché i segnali fluorescenti svaniscono gradualmente, acquisire immagini entro 1 settimana dalla colorazione.
7. Osservazione degli organelli intracellulari e della loro localizzazione subcellulare
- Acquisire immagini di fluorescenza utilizzando microscopia a fluorescenza a campo ampio per selezionare rapidamente più cellule e selezionare cellule rappresentative in interfase e mitotiche, utilizzando bassa intensità di eccitazione e impostazioni di acquisizione rapida per minimizzare il fotosbiancamento.
- Acquisire immagini delle cellule selezionate con il giusto ingrandimento per l'analisi della colorazione a fluorescenza.
NOTA: Le cellule interfase tipicamente mostrano un nucleo singolo intatto posizionato centralmente nel citoplasma. Al contrario, le cellule mitotiche mostrano cromosomi condensati allineati nel piano equatoriale del fuso bipolare. Queste caratteristiche morfologiche possono fungere da criterio visivo per distinguere cellule interfase e mitotiche. - Visualizza le LD e la morfologia nucleare usando set di filtri appropriati per coloranti fluorescenti a lipidi neutri e un colorante fluorescente che lega il DNA tramite microscopia a fluorescenza a campo ampio.
NOTA: Selezionare i set di filtri in base alle specifiche del sistema microscopico utilizzato. - Per una validazione ad alta risoluzione, acquisire immagini di fluorescenza utilizzando microscopia confocale dotata di una lente obiettivo ad alta apertura numerica (ad esempio, 60×, NA ≥1,2). Rilevare segnali di fluorescenza per coloranti fluorescenti a lipidi neutri e un colorante fluorescente che lega il DNA utilizzando laser di eccitazione appropriati e impostazioni di filtro a emissione. Processare le immagini utilizzando software di acquisizione e analisi di immagini comunemente disponibili.
NOTA: A seconda del sistema di microscopio, possono essere utilizzate obiettivi a immersione in acqua o in olio. La scelta del mezzo a immersione deve seguire le raccomandazioni del produttore e lo scopo sperimentale. La microscopia a fluorescenza a campo ampio è adatta per l'osservazione di routine e il confronto della distribuzione LD tra cellule interfase e mitotiche, mentre la microscopia confocale è raccomandata quando è richiesta una risoluzione spaziale più elevata.
8. Quantificazione del numero e della dimensione delle LD
- Acquisire immagini fluorescenti delle cellule sotto impostazioni di imaging identiche per tutte le condizioni.
- Apri le immagini acquisite utilizzando un software di analisi delle immagini.
- Stabilire soglie appropriate per identificare le LD ed eseguire analisi delle particelle per quantificare il numero e l'area delle gocce lipidiche.
NOTA: I parametri di imaging devono essere mantenuti costanti in tutte le condizioni per garantire un confronto accurato tra numero LD e area.
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Risultati
Sincronizzazione delle cellule epatomatose al confine G2/M utilizzando RO-3306
Per indagare la dinamica degli organelli intracellulari durante la mitosi, è stato utilizzato RO-3306, un inibitore selettivo di CDK1, per sincronizzare le cellule al confine G2/M 20,21. Quando le cellule sono state trattate con l'inibitore CDK1 per 20 ore seguite da un'ulteriore ora in un mezzo fresco, oltre il 50% delle cellule è stato sin...
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Discussione
La redistribuzione osservata delle LD durante la mitosi suggerisce che la loro posizione non sia casuale, ma sia in coordinazione con la riorganizzazione del citoscheletro e la progressione del ciclo cellulare. In particolare, l'esclusione delle LD dalla regione del fuso può riflettere vincoli spaziali imposti dall'assemblaggio mitotico del fuso o dai meccanismi di trasporto attivi che mantengono la segregazione degli organi durante la divisione cellulare. In questo studio, presentiamo u...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse riguardo al contenuto di questo articolo.
Ringraziamenti
Questo studio è stato finanziato dalla Showa University Grant for Young Researchers e dal JSPS KAKENHI Grant Number 24K10084.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0.25% Trypsin/EDTA | Wako | 201-16945 | Dissociazione cellulare |
| 10 cm dish | Corning | 430167 | Coltura cellulare |
| 35 mm tissue culture dish | IWAKI | 3000-035 | Coltura cellulare |
| 6 cm tissue culture dish | IWAKI | 3010-060 | Coltura cellulare |
| Anti-PLIN2 (ADRP) antibody | Proteintech | 15294-1-AP | Marcatore di goccioline lipidiche |
| Anti-PLIN3 (TIP47) antibody | Proteintech | 10694-1-AP | Marcatore di goccioline lipidiche |
| Anti-α-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T6199 | Marcatore del fuso mitotico |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Colorazione dei lipidi neutrali |
| Bottle-top filter (0,22 µm) | NEST | WNB343001 | Filtrazione sterile della soluzione OA–BSA |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A8022 | Reagente di blocco |
| Clear nail polish | Disponibile in commercio | Non applicabile | Sigillatura dei vetrini |
| Confocal microscope | Olympus | FV1200 | Immagini ad alta risoluzione |
| DAPI | Dojindo | 340-07971 | Colorazione nucleare |
| D-PBS (–) | Wako | 049-29793 | Coltura cellulare |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Wako | 041-30081 | Medium di coltura cellulare |
| Ethanol (99,5%) | Wako | 057-00456 | Solvente per l'acido oleico |
| Fatty acid–free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | Proteina trasportatrice per l'acido oleico |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Supplemento del medium |
| Fluorescent secondary antibodies (Alexa Fluor–conjugated) | Disponibile in commercio | Non applicabile | Anticorpi secondari specifici per la specie per l'immunofluorescenza |
| FV10-ASW software | Olympus | Non applicabile | Acquisizione e elaborazione delle immagini |
| Glass coverslips (φ15 mm) | Matsunami | 2-176-03 | Seminazione cellulare per microscopia |
| Glass microscope slides | Matsunami | SFF-001 | Vetrini di vetro per il montaggio dei vetrini |
| Glutaraldehyde (25% solution) | Wako | 073-00536 | Fissazione alternativa per PLIN3 |
| HuH7 cells | JCRB Cell Bank | JCRB0403 | Linea cellulare di epatocarcinoma umano |
| LipidTOX Red Neutral Lipid Stain | Invitrogen | H34476 | Colorazione alternativa delle goccioline lipidiche |
| Nitrogen gas (N2) | Disponibile in commercio | Non applicabile | Evaporazione dell'etanolo |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1383 | Per la preparazione di coniugati oleic acid–BSA |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Nacalai Tesque | 09154-85 | Fissazione |
| Penicillin–Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Antibiotici |
| Phosphate-buffered saline (×10) | Non applicabile | Non applicabile | Può essere sostituito con qualsiasi fornitore |
| RO-3306 | Sigma-Aldrich | SML0569 | Inibitore CDK1 per la sincronizzazione G2/M |
| SlowFade Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | S36963 | Medium di montaggio |
| Sodium chloride (NaCl) | Wako | 191-01665 | Preparazione di NaCl 150 mM |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Wako | 080-01061 | Usato per la saponificazione dell'acido oleico |
| Tali Cellular Analysis Slides | Thermo | T10794 | Usato per l'analisi del ciclo cellulare |
| Tali Image-based Cytometer | Thermo | Non applicabile | Usato per l'analisi del ciclo cellulare |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizzazione cellulare |
| Widefield fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | Rapida selezione delle cellule mitotiche |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
