Immunolocalizzazione tridimensionale nei meiociti del mais

Summary

Questo protocollo di immunolocalizzazione nei meiociti maschi del mais mantiene l'integrità tridimensionale delle cellule durante la meiosi. Permette il tracciamento dinamico della localizzazione intracellulare di fino a tre anticorpi indipendenti in materiale conservato con paraformaldeide, oltre al DAPI, che colora il DNA.

Abstract

Durante la profase meiotica I, la configurazione fisica dei cromosomi varia notevolmente tra le fasi di sviluppo; fortunatamente, queste configurazioni specifiche per stadio permettono la corretta identificazione di ciascuno di questi stadi meiotici classici, che sono rispettivamente noti come leptotene (ad esempio i 'fili sottili'), zigotene (ad esempio i 'fili accoppiati'), pachitene (ad esempio i 'fili spessi'), diplotene (ad esempio i 'doppi fili') e diacinesi (ad esempio il 'moto di repulsione'). L'analisi visiva di diversi fenomeni citogenetici che si verificano durante la profase I, come ricombinazione, accoppiamento e sinapsi, richiede tecniche di immunolocalizzazione altamente affidabili. A differenza delle tecniche tradizionali di diffusione e schiacciamento che sopprimono tutte le informazioni subcellulari e subnucleari, la procedura di conservazione 3D descritta qui consente la conservazione delle proteine meiotiche chiave nei loro siti di localizzazione subcellulare nativi (citoplasmatico, nucleare e subnucleare: eucromatina, eterocromatina e nucleolare). Pertanto, questo protocollo descrive come fissare efficacemente le antere meiotiche, sezionare e rilasciare i meiociti dalle antere, ed eseguire l'immunolocalizzazione simultanea di tre proteine chiave nei meiociti maschi del mais.

Introduction

La meiosi è un processo chiave che regola la trasmissione dei tratti nelle piante e colture modello; Pertanto, semplici metodi di microscopia che permettono una visualizzazione coerente e fedele della localizzazione delle proteine facilitano la comprensione di come questi tratti possano essere trasmessi in modo più efficiente. Purtroppo, la visualizzazione della localizzazione delle proteine all'interno dei meiociti è variata molto a seconda della tecnica^{utilizzata 1,2}. Pertanto, l'obiettivo del protocollo è fornire un metodo semplice e riproducibile che elimini artefatti durante l'osservazione dei meiociti. Ad esempio, è da tempo riconosciuto che l'osservazione dei cromosomi meiotici è un processo delicato facilitato schiacciando le cellule tramite semplici schiacciamenti o con tecniche di diffusione ancora più^{dirompenti 3,4,5}. In Arabidopsis thaliana, i ricercatori impiegano comunemente metodi di diffusione che utilizzano il fissativo di Carnoy (una miscela 3:1 di etanolo e acido acetico) insieme a vari detergenti come Lipsol, Tween-20 e TritonX-100, oltre a miscele enzimatiche contenenti cellulasi, pectinasi e citoelicasi, per rompere le cellule e consentire un'efficace immunolocalizzazione sui suoi piccoli^{cromosomi 1,2}. Queste tecniche trasformano una conformazione cromosomica 3D in una 2D, permettendo un'osservazione rapida dell'intero cromosoma artificialmente disperso in un'unica immagine. Alcune caratteristiche dei cromosomi che sopportano questi trattamenti duri possono essere evidenti; Tuttavia, spesso non rappresentano il comportamento tipico delle cellule e dei cromosomi in vivo⁶. È possibile una rilevazione rapida e molto ampia di fino a due anticorpi con tecniche di diffusione 2D in varie specie vegetali, tra cui il mais 7,8,9,10,11.

Tuttavia, nonostante la comodità delle tecniche 2D tradizionali, ora si riconosce che alcuni fenomeni sono sensibili a metodi dirompenti e non possono essere osservati se la cellula, il nucleo o i cromosomi vengono danneggiati durante la diffusione o la schiacciamento. Ad esempio, il movimento della proteina RAD50 dal citoplasma al nucleo durante la fase leptotenica, o durante l'accoppiamento del centromero (leptonema/zigonema), è stato rilevato solo nei meiociti 3D^{intatti 12}. Qui, ai lettori viene offerto un protocollo 3D dettagliato di 4 giorni che utilizza antere fissate al 4% di paraformaldeide per immunolocalizzare tre proteine chiave nei meiociti maschi del mais, preservandone così l'integrità strutturale. Rispetto a una simile metodologia di immunolocalizzazione 3D del mais^, abbiamo aggiunto note pratiche e consigli per la risoluzione dei problemi per i ricercatori. Questo protocollo sarà utile per il lavoro di biologi vegetali e miglioratori di piante interessati a studiare vari processi meiotici, come il controllo della ricombinazione meiotica da parte del complesso sinaptonemale.

Protocol

ATTENZIONE: Maneggiare formaldeide e acrilammide utilizzando dispositivi di protezione individuale appropriati e un cappuccio chimico; Entrambi sono tossici (l'acrilammide è anche neurotossico prima della polimerizzazione). Tutti i materiali utilizzati nello studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Fissazione delle antere di mais per preservare la struttura intatta dei meiociti

1. Usa le piante di mais allo stadio V13 con infiorescenze ancora in crescita all'interno del fusto. Durante la settimana di fissazione per l'altra meiotica, indossa i guanti e premi delicatamente il gambo ingrossato sul rigonfiamento per capire se è abbastanza morbido da poter tagliare.
   NOTA: Questo protocollo per fissazione e immunolocalizzazione può essere utilizzato sia per il mais che per i boccioli meiotici di Arabidopsis thaliana (meno di 400 μm). Ma nel caso del mais, a seconda della varietà utilizzata e del periodo dell'anno (la crescita è più rapida in primavera), per riferimento ci vogliono circa 8 settimane dalla semina B73, ma solo 6 settimane per la linea consanguinea A344 a fioritura precoce.
2. Preparazione dei cuscinetti.
   NOTA: Il giorno prima della fissazione chimica, prepara le seguenti soluzioni funzionanti, procedi con attenzione e etichetta correttamente tutte le bottiglie.
   1. Preparare 100 mL di 10x sali Tamponi A (BA), aggiungendo 4,53 g di PIPES (Piperazina-N, N′-bis (2-etanolosulfonico) a una concentrazione finale di 150 mM), 5,96 g di KCl (concentrazione finale 800 mM), 1,17 g di NaCl (concentrazione finale 200 mM), 0,74 g di EDTA (concentrazione finale 20 mM), 0,19 g di EGTA (concentrazione finale 5 mM) e 90 mL_H2O, prima regolare il pH a 6,8–7 con KOH, poi regolare il volume a 100 mL.
   2. Infine, sterilizza tramite filtro usando un'unità di filtrazione sterile Rapid-Flow usa e getta con PES di 0,45 μm di poro (conserva a 4 °C ma non congelare; puoi conservarla per diversi mesi).
   3. Preparati:
      -50 mM PIPES (pH regolato a 7 con KOH).
      - scorte di spermina a una concentrazione di 0,4 M (precedentemente sciolte in tubi da 50 mM, regolare il pH a 7 con KOH, mantenere aliquote di 50 μL a -20 °C).
      - scorte di spermidina a una concentrazione di 0,4 M (sciolta in 50 mM PIPES, con pH regolato a 7 con KOH, mantenere aliquote congelate di 125 μL a -20°C).
      - stock di Ditiotreitolo (DTT) 1 M (disciolto in acetato di sodio 0,01 M, fino a pH 5,2, mantenere aliquote congelate di 100 μL a -20 °C).
      - sorbitolo 2 M, mantenuto a 4 °C.
3. Prepara 50 mL di 2x Buffer A (BA), sul ghiaccio, utilizzando 10 mL di 10x sali Buffer A (conservati a 4 °C), 50 μL di spermina (0,4 M in 50 mM PIPES, con pH regolato a 7 con KOH), 125 μL di spermidina (0,4 M in 50 mM PIPES, con pH regolato a 7 con KOH), 100 μL di DTT (1 M su 0,01 M acetato di sodio, pH 5,2) vortice si dissolve vigorosamente; e non riscaldare.
   1. Poi aggiungi 16 mL di 2 M sorbitolo. Regola il volume finale a 50 mL con acqua sterile. Filtrare e sterilizzare utilizzando un filtro sterile Rapid-Flow usa e getta e conservare a 4 °C.
4. Prepara una camera umida composta da 5–10 tovaglioli di carta umidificati posti in una scatola di plastica. Verifica che il coperchio sigilli bene. Elimina l'acqua in eccesso.
5. Poi, metti in un vassoio i seguenti oggetti: la camera umida, una lametta, pinze fini (precedentemente sterilizzate con etanolo al 70%), una piccola bottiglia di acqua sterile e nastro adesivo. Porta il vassoio e il suo contenuto alle piante di mais controllate al passo 1.1.
6. Usa una lametta per tagliare il gambo irregolare al livello dell'infiorescenza. I rami principali delle nappe, così come i rami laterali dell'infiorescenza, possono essere utilizzati per la raccolta dei fioretti meiotici.
   NOTA: Questi rami a nappa contengono i fiori di interesse per raccogliere antere meiotiche. Ogni fiore contiene sei antere, e le 3 superiori più grandi sono tipicamente utilizzate per l'analisi. La dimensione approssimativa e il colore delle antere corrispondono a ciascuna fase meiotica. Antere quasi trasparenti lunghe circa 1 mm si trovano allo stadio leptotene, antere traslucide lunghe 1,5 mm sono allo stadio zigotene, antere biancastre lunghe 2 mm allo stadio pachitene, e antere giallastre lunghe > 2 mm possono contenere meiociti a diplotene, tetradi e granuli di polline che terminano la gametogenesi. Si noti che un'altra correlazione tra stadio di lunghezza può variare tra i background genetici del mais, e che fattori ambientali (ad esempio, alta temperatura) possono accelerare la progressione dei meioti e alterare questa relazione. Si raccomanda ai ricercatori di validare le correlazioni tra dimensioni e stadi di altre per ciascun genotipo specifico di mais e condizioni di crescita (tramite schiacciamento con acetocarmina, cfr. 1.6).
7. Usa pinze fini per sezionare e raccogliere con cura i rami laterali delle infiorescenze e avvolgerli all'interno della carta assorbente della camera umida.
   NOTA: Con un po' di pratica, è necessaria solo una breve incisione lineare di 3–4 cm nel fusto per estrarre i rami della nappa meiotica. Puoi chiudere questa incisione avvolgendola tre o quattro volte con il nastro adesivo standard, che ti permette di raccogliere successivamente la stessa pianta usando l'infiorescenza residua non dissezionata. Il tessuto continuerà a crescere e successivamente potrà essere usato per l'impollinazione.
8. Mantieni la camera a temperatura ambiente. Usa solo quei rami dell'infiorescenza che contengono fiori che portano antere nello stadio meiotico. Assicurati di coprire i rami con metà degli asciugamani umidi, ma non immergerli nell'acqua.
9. Umidifica di nuovo se gli asciugamani si asciugano. Chiudi la scatola fino alla dissezione delle antere, preferibilmente fino a 30 minuti prima dell'inizio della raccolta di un'altra parte.
10. Utilizzando un microscopio stereooculare con scala calibrata, raccogli antere fresche dai fioretti in 2 mL di 1x BA in una piastra di Petri da 35 mm, garantendo un'identificazione accurata degli stadi meiotici tramite il proxy della dimensione e del colore dell'antera.
    NOTA: Per determinare accuratamente lo stadio dei meiociti nelle antere campionate, una delle tre antere sincronizzate per fioreto viene rapidamente analizzata utilizzando fissazione 3:1 di etanolo-acido acetico, colorazione con acetocarminico e microscopia tradizionale^{a zucca 13}.
11. Prepara il fissativo al 4% di formaldeide in 1x BA e 0,0025% Tween-20
    NOTA: Per 3 mL, aggiungere 750 μL di formaldeide 16%, 750 μL di_{H 2}O, 1,5 mL 2x BA e 7,5 μL Tween-20 all'1%.
12. Rimuovere il buffer BA iniziale e aggiungere i 3 mL di questa soluzione fissativa fresca alle antere a stadi e fissarle per 45 minuti all'interno di una nuova piastra di Petri da 35 mm, sigillata con parafilm per evitare l'evaporazione della formaldeide, poi posizionarla su una piastra di Petri più grande posta su uno shaker rotante (impostata a 40–60 giri/min, o 0,2 x g). Fallo a temperatura ambiente. Le antere dovrebbero ruotare leggermente per una buona fissazione. Di solito galleggiano in superficie.
13. Sciacquare con 3 mL di 1x BA, poi trasferire il campione in una piccola piastra di Petri e posizionarlo su un shaker rotante (40–60 rpm) a temperatura ambiente per 45 minuti.
14. Usando pinze pulite, trasferire le antere in una piccola piastra di Petri da 35 mm contenente 3 mL freschi di 1X BA. Sigilla bene la piastra di Petri con parafilm. Poi conserva la piccola piastra di Petri all'interno di una piastra di Petri, coprendola con carta stagnola di alluminio per tenerla al buio, e mettila a 4 °C fino all'uso. Puoi conservarlo per diversi mesi se necessario.

2. Incorporazione dei meiociti di mais nei pad sandwich in poliacrilammide

GIORNO 1: Preparazione delle diapositive 3D

1. Prepara 2 mL di soluzione di acrilammide mescolando volumi uguali (1:1) di acrilammide e 2x BA. Prima di aggiungere solfito di sodio (NaS) e persolfato di ammonio (APS), degassare la soluzione di acrilammide sotto vuoto per 5–10 minuti.
2. Aliquota, l'acrilammide e il rapporto 1:1 2x BA si mescolano pipettando 100 μL in tubi da 1,5 mL.
   Il numero di tubi che prepari dipende dal numero di diapositive che preparerai.
3. Fai 1 mL 1x BA.
4. Posizionare pezzi di parafilm da 2 cm x 2 cm su una piastra di Petri, poi metterli sotto un microscopio dissezionale. Pipetta 50 μL di soluzione BA con antere su parafilm. Taglia la punta della pipetta con forbici per facilitare l'altra consegna.
   1. Pipetta 25 μL di soluzione BA su parafilm altrove.
5. Usando una pinza per tenere le antere, taglia la punta delle antere con un bisturi e spreme delicatamente i meiociti. Con una pipetta, trasferisci delicatamente i meiociti nella goccia da 25 μL di BA e mescola delicatamente.
6. Pipetta 10 μL dal mix di meiocita su un copritore separato.
7. Rapidamente, pipettare 5 μL di NaS al 20% (0,2g/1 mL) e 5 μL al 20% (0,2g/1 mL) APS in un tubo da 1,5 mL con acrilammide/2x tampone A.
8. Rapidamente, si possono pipettare 5 μL di questi elementi su un coperto e mescolare con i meiociti. Posiziona sopra un copricapo coperto con coprire di poli-L-lisina, ma ruotalo di 45 gradi. L'uso di un solo copertura di poli-L-lisina (ottenuta commercialmente o realizzata immergendo le coperture in una soluzione di poli-L-lisina in una piastra di Petri per alcuni minuti e lasciandole asciugare, sul bordo di una nuova piastra di Petri pulita) aiuta a rilasciare un tampone completo dopo la polimerizzazione. Il coperto viene rapidamente sollevato dalla soluzione e asciugato prima dell'uso. Per la microscopia a super-risoluzione,^{devono essere} usati coverslip ad alte prestazioni con spessore standardizzato (≤170 nm).
9. Si prega di non toccare le coperture per 30–50 minuti per consentire la polimerizzazione completa del campione a temperatura ambiente (un processo di polimerizzazione più rapido riduce il periodo di asciugatura del tampone e la qualità risultante è inferiore alla ottimale).
10. Ripeti i passaggi '2.6–2.9' per ogni diapositiva che desideri preparare.
11. Separati con cura tutte le copertine con una lametta. Posiziona tutti i coperchissi, lato pad verso l'alto, su un pad in poliacrilammide (o sulla maggior parte del pad), in una piastra a 6 pozzi.
12. Lava ogni copertura con un tampone con 2 mL di soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) per 10 minuti. Ripeti questo lavaggio una volta, per un tempo totale di lavaggio di 20 minuti a temperatura ambiente.
13. Preparare 50 mL mescolando 49,4 mL PBS 1x, 100 μL EDTA 0,5 M e 500 μL Triton.
14. Risciacqua ogni copertura con un assorbente in 1 mL di questo PBS 1x integrato con 1 mM di EDTA e 1% di Triton per 2 ore a temperatura ambiente.
15. Prepara un nuovo lotto di tampone bloccante contenente 1x PBS, 1 mM EDTA, 0,1% Tween-20 e 3% BSA (1 mL per vetrina). Per 50 mL di tampone bloccante, miscelare 44 mL di PBS 1x, 100 μL di EDTA 0,5 M, 5 mL di soluzione Tween-20 all'1% e 1,5 g di BSA. La BSA è preferita al siero dell'asino come agente bloccante perché aiuta a minimizzare i segnali non specifici quando si usano più anticorpi primari e secondari.

3. Immunolocalizzazioni

1. Prepara l'anticorpo primario (o gli anticorpi) alla diluizione desiderata usando un buffer bloccante. Combinare anticorpi primari in base alla loro capacità di produrre segnali distinti quando usati insieme. Dovrebbero provenire da organismi diversi, come coniglio, ratto, cavia o pollo, che possono essere riconosciuti da specifici anticorpi secondari marcati fluorescente. L'uso di anticorpi contro asino o capra è evitato perché sono destinati a essere utilizzati come anticorpi secondari. Raccomandiamo l'uso di una singola specie di anticorpo secondario (ad esempio, capra nell'esperimento mostrato nella Figura 1).
2. Aggiungere 50 μL di questo anticorpo primario diluito al centro di ogni copertura con un cuscinetto con un cuscinetto di copertura.
   Aggiungi acqua tra i pozzi e l'altro per rallentare l'evaporazione. Metti la piastra in una camera umida (una scatola di plastica con coperchio). Partire per la notte.

GIORNO 2: Lavaggio

3. Prepara 500 mL di tampone di lavaggio (1x PBS + 0,1% Tween-20 + 1 mM EDTA).
4. Rimuovi la soluzione notturna dai pozzi tramite aspirazione con la tua pipetta.
5. Lava rapidamente ogni copertura con un tampone due volte con 1 mL di buffer di lavaggio, poi rimuovilo dai pozzi.
6. Pipetta un altro 1 mL con il tampone e lascia riposare per 1 ora a temperatura ambiente.
   Ripeti altre 7 volte. (8 h in totale)
7. Dopo il lavaggio finale, aggiungi acqua tra i pozzi, copri la piastra e lasciala tutta la notte in una camera umida.

GIORNO 3: Anticorpi secondari, lavaggi e vetrine di montaggio

8. Prepara gli anticorpi secondari diluendoli ciascuno a un rapporto di 1:50 nel buffer bloccante.
   Aspira la soluzione di lavaggio. Somministrare 50 μL dell'anticorpo secondario diluito al centro di ogni assorbente utilizzando una pipetta.
   NOTA: Ogni anticorpo secondario dovrebbe essere utilizzato in associazione con coloranti fluorescenti distinti con lunghezze d'onda di emissione non sovrapposte. Ad esempio, un anticorpo secondario dovrebbe essere etichettato con AlexaFluor488 (verde), il successivo con AlexaFluor555 (arancione) e il terzo con AlexaFluor647 (rosso lontano), che può essere combinato con DAPI (eccitazione a 461 nM, blu). Anche altri coloranti fluorescenti, come DyLight (di Dyomics GmbH), sono utilizzabili. Inoltre, tutti questi anticorpi secondari non dovrebbero reagire incrociatamente con altre specie utilizzate nella miscela di anticorpi primari. Ad esempio, l'anticorpo secondario anti-coniglio dovrebbe essere incrociato per essere selettivo per gli anticorpi del coniglio e non riconoscere né gli anticorpi di ratto né di porcellini d'India. Lo stesso vale per tutti gli anticorpi secondari. Un esperimento ben progettato dovrebbe essere utilizzato per convalidare tutti questi requisiti contemporaneamente durante l'esecuzione di co-immunolocalizzazioni.
9. Aggiungi acqua tra i pozzi, metti una piastra nella camera umida e lascia lasciare per 2 ore a temperatura ambiente.
10. Aspira la soluzione dai pozzi.
11. Esegui quattro lavaggi utilizzando 1 mL per pozzo, 1 ora ciascuno a temperatura ambiente (4 ore totali).
12. Lava ogni pozzo con 1 mL di 1x PBS per 10 minuti a temperatura ambiente e ripeti questo processo altre due volte. (30 min totale)
13. Diluire DAPI in 1x PBS.
14. Tingere con una concentrazione finale di 1 μg/mL di dapi (polvere di dapi disciolta in acqua) per 30 minuti a temperatura ambiente, e posizionare 500 μL/pozzo.
15. Rimuovi l'antifade ProLong™ Gold dal congelatore a 4 °C per farlo scongelare e raggiungere la temperatura ambiente.
16. Lava le vetrine in 1x PBS per 30 minuti a temperatura ambiente, con 1 mL/pozzo. Fallo due volte ancora. (1 ora e 30 min totale)
17. Rimuovi l'ultimo lavaggio.
18. Poi aggiungi due gocce di ProLong™ Gold antifade al centro di ogni cuscinetto.
19. Attacca le slitte del coperchio su ogni vetrina, etichetta ogni vetrina, solleva le scorrimenti dal pozzo usando pinze fini e posizionale lentamente sulla slitta. Usando le pinze sottili, abbassa lentamente una seconda copertura sulla prima. Utilizzando un aspirapolvere, rimuovere l'eccesso di glicerolo dai bordi delle coperture. Sigilla i bordi delle copertine con due mani di smalto.
20. Se le vetrine non vengono immediatamente esaminate al microscopio fluorescente. Conservale in un congelatore a -20 °C, protette dalla luce, fino all'osservazione. Successivamente, lascia riposare i vetrini a temperatura ambiente per 1 ora in una scatola per slide, orizzontalmente e al buio, per evitare la condensa.

GIORNO 4: Osservazioni microscopiche

21. Osserva la vetrata sotto le lunghezze d'onda di eccitazione e i filtri giusti. La microscopia confocale standard è sufficiente, ma è consigliabile utilizzare un microscopio con obiettivo 60x per consentire l'imaging tridimensionale dell'intera cellula utilizzando uno stack z ogni 0,2 μm, con acquisizioni sequenziali dell'immagine e elaborazione della deconvoluzione tramite il software Applied Precision SoftWoRx^® .

Results

Utilizzando questo protocollo, possiamo osservare simultaneamente i modelli di localizzazione delle tre proteine meiotiche chiave nel mais (Figura 1). La proteina meiotica ABSENCE OF FIRST DIVISION 1 (AFD1) è un omologo della subunità alfa-Kleisin REC8 del complesso coesinale meiotica. L'ASINAPTIC 1 (ASY1) è un elemento assiale cruciale, mentre il ZYPPER1 (ZYP1) è l'elemento trasversale del complesso^{sinaptonemale 15}. La colorazione DA...

Discussion

Questo protocollo offre un vantaggio chiave rispetto agli altri preservando dati tridimensionali essenziali sul carico delle proteine cromosomiche meiotiche. Queste caratteristiche non possono essere preservate utilizzando tecniche di espansione^{regolari 1,2}. Tuttavia, questo protocollo presenta due limitazioni: è lento e tecnicamente impegnativo rispetto alle normali tecniche di diffusione eseguite in un solo giorno. Al contrario...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtubes Axygen	Corning	MCT-150-C
15 mL Falcon tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
50 mL Falcon tubes	Thermo Fisher Scientific	339652
6 well plate Falcon polystyrene microplate	Thermo Fisher Scientific	08-772-1B
Acetic acid, 60%	Thermo Fisher Scientific	A38-212
Acrylamide 30%  and bis-acrylamide solution, 29:1	Biorad	1610157
Aluminum fold	Reynolds	U07211R0
Amonium Persulfate (APS)	Merck	A3678
Binocular stereomicroscope	NA	NA
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	A9418
DAPI	Merck	D9542
DelltaVision microscope	Olympus	NA
Distilled H2O	NA	NA
Disposable Filter Units with PES filters of 0.45 μm pore	Thermo Fisher Scientific/Nalgene	09-740-63B
Fine forceps FST Dumont SS	Fine Science Tools	11200-33
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed  anti-rat labelled by AlexaFluor647	Invitrogen	A-21247
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed anti-rabbit labelled by AlexaFluor568	Invitrogen	A-21428
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed anti-guinea pig labelled by AlexaFluor488	Invitrogen	A-11073
Gloves	Merck	Z412392
Growing chambers / greenhouse / or field	NA	NA
DTT	Merck	D0632
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
Masking tape 3M	Fisher Scientific	19-047-259
Maize seeds	NA
Microscope 22 x 22 mm-1,5 glass coverslips	Fisher Scientific	12-542-B
Microscope 22 x 22 mm-H coverslips	Deckgläser, Zeiss	474030-9020-000
Microscopic glass slides	Fisher Scientific	22-230-900
Microscope slide box	Fisher Scientific,	03-448-9
Micropipets P20, P200, P1000	Merck	CLS4069
NaCl	Merck	S7653
Nail polish	Electron Microscopy Science	72180
Paper towels	Merck	Z188956
Parafilm	Merck	P7668
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Grade	15710
PBS	Merck	P4474
Plastic box with lid	Tupperware	NA
Poly-L-Lysine	Merck	P4707
Primary antibodies (rat anti-ZmAFD1, rabbit anti-ZmASY1, guinea-pig anti ZmZYP1)	NA
Prolong Antifading	Molecular Probes	P36934
Petri dish (D x H: 35 mm x 10 mm	Corning	351008
Petri dish regular size	Merck	P5731
PIPES	Merck	P1851
Pipet tips (0.5-10 uL) sterile	Merck/Corning	AXYT300
Pipet tips (200 uL) sterile	Merck/Corning	AXYT200Y
Pipet tips (1000 uL) sterile	Merck/Corning	AXYT1000BRS
Razor blade - single edged	Fisher Scientific	12-640
Rocking platform shaker	NA	NA
Spermine	Merck	85590
Spermidine	Merck	S2626
Sorbitol	Merck	S8143
Tween-20	Merck	P9416
Triton X-100	Fisher Scientific	9002-93-1
Ultra pure Acrylamide	Invitrogen	15512023
Vacuum