Un metodo semi-automatizzato per rilevare differenze di gruppo nei numeri di neuroni dopaminergici del cluster anteriore mediale protocerebrale nel cervello di Drosophila

Sommario

Questo protocollo presenta un metodo semi-automatizzato per quantificare il numero di neuroni dopaminergici nel grande cluster protocerebrale anteriore mediale di Drosophila . Progettato specificamente per rilevare e confrontare le differenze tra gruppi sperimentali e di controllo, questo approccio riduce la dipendenza dal conteggio manuale e fornisce uno strumento pratico per analisi a livello di gruppo.

Abstract

Drosophila melanogaster funge da potente organismo modello per lo studio delle malattie neurodegenerative, inclusa la malattia di Parkinson (PD), principalmente attraverso l'analisi della degenerazione dei neuroni dopaminergici (DA) e dei deficit di locomozione associati. Storicamente, la quantificazione della perdita di neuroni DA nel cervello delle mosche è stata confinata a cluster più piccoli e facilmente numerabili, inclusi cluster protocerebrali posteriori mediali (PPM) e cluster protocerebrali posteriori laterali (PPL). Al contrario, il cluster protocerebrale antero-mediale (PAM) molto più grande, composto da oltre 100 neuroni, rappresenta una sfida significativa per il conteggio manuale, portando alla sua sottorappresentazione negli studi quantitativi. Ad oggi, le indagini riportate si basano ancora su conteggi manuali ad alta intensità di lavoro tramite pile Z confocali, che richiedono molto tempo e sono soggetti alla variabilità. Per colmare questa lacuna metodologica, abbiamo sviluppato una pipeline di analisi delle immagini semi-automatizzata utilizzando lo strumento open-source Labkit. Questo protocollo consente una quantificazione efficiente relativa al gruppo dei neuroni positivi alla tirosina idrossilasi (TH) nel cluster PAM all'interno dello stesso lotto sperimentale. Il metodo inizia con la colorazione standard per immunofluorescenza e l'imaging confocale, seguiti da una guida dettagliata passo dopo passo per segmentazione e analisi. Questo approccio affronta il collo di bottiglia della quantificazione dei cluster PAM e fornisce un flusso di lavoro pratico per rilevare differenze intergruppi nella vulnerabilità dei neuroni DA nei modelli di neurodegenerazione. La relativa scarsità di studi sulla PD sul cluster PAM riflette una barriera tecnica storica piuttosto che una mancanza di rilevanza biologica. Superando questa barriera, il nostro metodo apre la porta a un'indagine sistematica sulla vulnerabilità dei neuroni PAM nella DP e il suo potenziale legame con sintomi non motori.

Introduzione

La mosca dell'aceto, Drosophila melanogaster, è un organismo modello molto apprezzato per indagare le basi genetiche e molecolari delle malattie neurodegenerative, in particolare il morbo di Parkinson (PD)¹. Le sue vie di segnalazione neuronale conservate, il sofisticato kit di strumenti genetici e la breve durata di vita la rendono eccezionalmente adatta allo studio della vulnerabilità neuronale dipendente dall'età e alla conduzione di screening genetici e farmacologici ad alta^{produttività 2,3}. Centrale in queste indagini è l'analisi dei neuroni dopaminergici (DA), la cui degenerazione selettiva è una caratteristica patologica della PD⁴. Nel cervello di Drosophila, i neuroni DA sono organizzati in cluster discreti e geneticamente^{identificabili 5,6}. La perdita progressiva dei neuroni DA all'interno di cluster specifici, visualizzata tramite immunocolorazione TH e quantificata tramite microscopia, funge da lettura funzionale primaria per valutare la progressione della malattia e gli interventi neuroprotettivi nei modelli^{sperimentali 7,8}. Pertanto, una quantificazione affidabile della perdita di neuroni DA è essenziale per tradurre la potenza della genetica di Drosophila in risultati significativi sulla ricerca sulla DP.

Convenzionalmente, l'analisi quantitativa della perdita del neurone DA si è concentrata sull'immunocolorazione da idrossilisi tirosina (TH) di piccoli cluster, inclusi cluster protocerebrali posteriori mediali (PPM) e cluster protocerebrali posteriori laterali (PPL), ciascun gruppo contenente meno di 10 cellule facilmente contabili^{dall'occhio 7}. L'enumerazione manuale tramite stack a Z confocali, sebbene laboriosa, è stata il metodo consolidato per questi cluster in molti studi sulla PD utilizzando Drosophila ^9,10,11. Al contrario, il conteggio manuale del cluster protocerebrale anteriore mediale (PAM), il più grande gruppo di neuroni DA nel cervello delle mosche, composto da oltre 100 cellule, rappresenta un collo di bottiglia metodologico di lunga data e ne impedisce la partecipazione nella maggior parte degli studi sulla PD ^9,10,11. Nonostante il ruolo fondamentale dei neuroni PAM nei circuiti di apprendimento, memoria e motivazione, questa limitazione ha portato alla loro relativa sottorappresentazione nelle analisi quantitative della neurodegenerazione 12,13,14,15. In particolare, anche le indagini recenti continuano a basarsi su questo approccio inefficiente di conteggio manuale, sottolineando una necessità persistente e insoddisfatta di una soluzione standardizzata e automatizzata all'interno del^{campo 13}.

Per colmare questa lacuna critica, abbiamo sviluppato una pipeline di analisi delle immagini semi-automatizzata che consente una quantificazione efficiente relativa al gruppo dei neuroni TH-positivi (TH⁺) nel cluster PAM all'interno di un esperimento. Questo protocollo sfrutta il plugin open source basato su machine learning Labkit nella piattaforma Fiji/ImageJ e il software di elaborazione immagini^{3D 16,17}. Il flusso di lavoro principale richiede all'utente di annotare un sottoinsieme rappresentativo di immagini per addestrare un modello di classificazione dei pixel, che viene poi applicato a dataset sperimentali di TH-colorazione a batch, seguiti dalla creazione e classificazione del nucleus spot rispetto alla regione TH⁺. Questo approccio bilancia l'automazione con la supervisione degli esperti: riduce il carico e la variabilità dei conteggi completamente manuali, mantenendo però i contributi dei ricercatori per guidare l'algoritmo e rivedere i risultati.

L'obiettivo di questo articolo è fornire ai ricercatori un protocollo passo dopo passo per una quantificazione efficiente della relativa neurone DA del cluster PAM per confronti relativi di gruppo all'interno di un esperimento. Dimostriamo l'intero flusso di lavoro, dalla dissezione cerebrale, alla colorazione da immunofluorescenza e all'imaging confocale fino alla pipeline dettagliata di analisi delle immagini utilizzando il metodo semi-automatizzato. Standardizzando questo passaggio quantitativo chiave, questo protocollo mira a dare potere alla comunità di ricerca di incorporare costantemente il grande cluster PAM nelle proprie analisi. Questo metodo semi-automatizzato è specificamente progettato per il cluster PAM e non è applicabile ad altri cluster dopaminergici o ai neuroni TH-positivi nei lobi ottici. Questo metodo può facilitare studi a livello batch sulla vulnerabilità dei neuroni DA del cluster PAM e ulteriori indagini sulla plasticità sinaptica, neurodegenerazione e screening terapeutico utilizzando il modello Drosophila .

Protocollo

1. Preparazione del campione e imaging confocale

1. Allevamento e raccolta di mosche
   1. Mosche genitori incrociati dei genotipi desiderati per generare progenie sperimentale. Al momento dell'eclosion, raccogli 20–30 mosche per fiala di cibo fresco. Mantenere le mosche secondo il disegno sperimentale dell'utente fino a raggiungere l'età sperimentale desiderata.
2. Preparazione alla dissezione
   1. Prepara una ciotola di dissezione riempiendo il coperchio di una piastra di Petri da 30 mm fino a metà altezza con elastomero di silicone Sylgard. Riempi la ciotola con 1x Soluzione Salina Tamponata con Fosfato (PBS). Aliquota 450 μL di fissativo contenente 1x PBS e 4% di paraformaldeide (PFA) in un tubo microcentrifuga da 0,6 mL, poi posizionare il tubo sul ghiaccio.
   2. Anestetizzare 10–20 mosche con un impulso di CO₂ di 5–10 s, poi trasferirle immediatamente su una piastra di Petri da 60 mm posta sul ghiaccio per mantenere l'immobilità.
      ATTENZIONE: Il PFA è tossico e sospetto cancerogeno. Maneggia in una cappa con guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza. Smaltire i rifiuti secondo le linee guida istituzionali sui materiali pericolosi.
3. Dissezione e fissazione del cervello delle mosche
   1. Afferra una mosca per la radice dell'ala usando pinze e immergila dal lato ventrale verso l'alto nel piatto di dissezione riempito di PBS. Perfora il torace con un fine perno di sezione per ancorare la mosca al cuscinetto Sylgard.
   2. Orienta il corpo orizzontalmente (ad esempio, testa a sinistra, addome a destra). Tieni la base della proboscide con una pinza mentre con l'altra si rimuove l'intera proboscide, creando un'apertura tra gli occhi composti.
   3. Afferra i bordi esposti dell'occhio con due pinze e separali molto lentamente in modo simmetrico, esponendo il cervello preservando la sua connessione con il cordone nervoso ventrale.
   4. Rimuovi le sacche tracheali e il corpo grasso che circondano il cervello. Recidi il cordone nervoso ventrale per liberare il cervello e lasciarlo sedare sul piatto con il lato anteriore rivolto verso l'alto.
      NOTA: Se il cervello stabilizzato mostra la metà ventrale posizionata più in alto rispetto alla metà dorsale (Figura 1B,C), si usano le pinze per premere delicatamente la parte rialzata.
   5. Preinumidisce una punta di pipetta P10 con 0,1% di Triton X-100 per evitare che il cervello dissezionato aderisca alla parete interna della punta. Usando questa punta preumida, trasferire ogni cervello dissezionato nel tubo contenente il fissativo, poi procedere con la prossima dissezione. Dopo che tutti i cervelli sono stati trasferiti, inverti il tubo 5 volte e posizionalo orizzontalmente sul ghiaccio per 30 minuti. Incubare il tubo a temperatura ambiente (RT) per 1 ora con agitazione.
   6. Lascia che il cervello si depositi sul fondo per 1 minuto. Lava il cervello per 3 x 10 minuti con una soluzione contenente 1x PBS e 0,1% Triton X-100 (PBST) con agitazione. Conservare il cervello in PBS contenente azide di sodio allo 0,1% a 4 °C oppure procedere con l'immunocolorazione.
4. Immunocolorazione
   1. Colorare i cervelli in 300 μL di soluzione primaria antibody colorante contenente 1x PBS, 0,1% Triton X-100, 5% Siero Normale di Capra, 0,1% Azid di Sodio e anticorpo anti-TH del coniglio (diluizione 1:500) per 2 giorni a 4 °C con agitazione. Lava il cervello per 3 x 10 minuti con PBST.
   2. Tingi il cervello con una soluzione secondaria di anticorpi contenente 1x PBS, 0,1% Triton X-100, 5% Siero Normale di Capra, 0,1% Azid di Sodio e Alexa Fluor 635 anti-coniglio per 2 giorni a 4 °C. Lava il cervello una volta con PBST.
   3. Incubare i cervelli con PBST integrato con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (diluizione 1:1.000) per 2 ore a RT, poi lavare i cervelli in PBST per 2 ore. Conserva i cervelli a 4 °C durante la notte o procedi a montarli.
5. Montaggio
   1. Carica 0,5 mL di montante su una siringa da 1 mL dotata di ago di calibro fine. Creare una camera di montaggio fissando due strisce parallele di nastro adesivo trasparente su un vetrino di vetro, lasciando uno spazio di 3 mm (Figura 1A,D).
      ATTENZIONE: Gli aghi affilati rappresentano un rischio di foratura. Maneggiare sempre con attenzione, ricapire con una tecnica a mano sola se necessario e gettare immediatamente gli aghi usati in un contenitore approvato per oggetti taglienti.
   2. Trasferire il cervello in una piastra di Petri pulita usando una punta P200 troncata. Rimuovere il liquido in eccesso che circonda il cervello e somministrare 10 μL di montant sul cervello. Mescola delicatamente il cervello con il montante.
   3. Distribuisci tre gocce di montante lungo la fessura sulla slide e distribuisci uniformemente attraverso la fessura. Trasferire e posizionare i cervelli lungo la linea centrale dello spazio con una pipetta P10 (Figura 1A).
   4. Posiziona il cervello in modo uniforme lungo la linea centrale dello spazio con il lato anteriore rivolto verso l'alto. Copri lentamente lo spazio con una copertura. Premi vicino ai bordi della copertura con i pollici per 3 secondi per assicurare un contatto saldo.
   5. Posiziona il vetrino orizzontalmente in una cartella per vetrini per farlo indurire durante la notte a RT al buio, poi a 4 °C per la conservazione a lungo termine.
6. Imaging confocale
   1. Accendi il microscopio confocale e attendi 15 minuti per la stabilizzazione laser. Localizza i cervelli in campo luminoso con un obiettivo 10x, poi passa a un obiettivo a immersione in olio 100x e naviga fino al cluster PAM sotto visualizzazione live.
   2. Regolare lo stadio XY per localizzare un cluster PAM nel centro di imaging. Visualizza in anteprima fino a Z per confermare i confini e l'orientamento. Regola lo zoom digitale e l'orientamento finché il cluster PAM non si adatta al fotogramma di imaging lungo la diagonale.
   3. Imposta la posizione superiore e inferiore della pila. Imposta la dimensione del passo Z a 0,34 μm e la risoluzione dell'immagine a 512 x 512. Imposta il foro del perno in modalità automatica. Imposta la tabella di ricerca del display (LUT) su indicatore di saturazione.
   4. Regolare la potenza del laser e il guadagno del rilevatore nel canale TH finché una quantità minima di punti discreti e dispersi all'interno dei neuroni PAM non è saturata. Regolare le impostazioni del canale DAPI per ottenere un segnale nucleare brillante e chiaro senza saturazione.
      NOTA: Il fattore di zoom ottimale varia. Differenze nel ritiro tissutale possono verificarsi tra i lotti sperimentali e tra singoli cervelli all'interno dello stesso lotto.
   5. Acquisire e salvare immagini in formato raw con 12 o 16 bit nella cartella di input (ad esempio, D:\Confocal\images). Torna alla visuale in diretta, resetta lo zoom e sfoglia lungo il gap per trovare il cervello successivo senza passare a un ingrandimento più basso.
      NOTA: Non salvare, esportare o convertire i file di dati principali in un formato .tif elaborato in questa fase. Preservare i metadati grezzi originali è essenziale per l'elaborazione successiva delle immagini.

2. Elaborazione e quantificazione delle immagini

1. Conversione del file immagine e suddivisione del canale TH
   1. Converti le immagini grezze situate nella cartella di input in un formato compatibile con il software di analisi delle immagini 3D utilizzando il relativo convertitore di file (Table of Materials). Inserisci i file convertiti nella cartella convertita (ad esempio, D:\Confocal\converted)
   2. Apri Fiji e naviga su File | Nuovo | Copione. Nell'editor di script, clicca su File | Aperto per caricare il file macro ImageFolder_Split_ChannelAndSaveMacro_UltimateDepth.ijm (File Supplementare 1). Clicca su Esegui vicino alla parte inferiore della finestra dell'editor (se il pulsante è nascosto, clicca sulla piccola icona triangolare per mostrarlo).
   3. Nella finestra di configurazione clicca su Sfoglia e seleziona la cartella convertita. Sotto Convenzione di Denominazione, seleziona l'opzione 3. Sotto Canale per esportare, seleziona l'indice del canale corrispondente a TH. Clicca OK per dividere in batch il canale TH; gli stack TH esportati verranno salvati automaticamente in una cartella che termina con ChannelSplitOut.
2. Addestramento del classificatore Labkit
   1. Preparazione del dataset di addestramento
      1. Seleziona 20 stack rappresentativi che catturano una gamma di intensità di segnale e variazioni di sfondo di campioni dalla cartella TH stack. Copia i file selezionati nella cartella di selezione (ad esempio, D:\Confocal\selection).
      2. Esegui la macro delle Fiji ImageFolder_UniCropZStack_ToThinestLayers.ijm (Supplemental File 2). Quando richiesto, seleziona la cartella contenente le immagini di addestramento. La macro riduce ogni stack allo stesso numero di Z-slice e concatena gli stack in un file TIFF time-lapse per l'addestramento.
   2. Addestramento interattivo del classificatore pixel
      1. Avvia Labkit tramite Fiji Plugins | Labkit | Apri l'immagine attuale con Labkit (Tabella dei materiali). Nella barra degli strumenti, clicca sul pulsante 3D Box per passare alla modalità Slice View per la navigazione attraverso Z-slices (cursore a destra) e attraverso i campioni (cursore in basso).
      2. Premi S per aprire il pannello Luminosità e Contrasto e regola il cursore Max per una visualizzazione ottimale dei neuroni TH⁺ . Imposta una dimensione del pennello appropriata (ad esempio, 5 pixel). Clicca su Impostazioni per espandere il pannello degli strumenti. Mantieni le modalità di visualizzazione predefinite (fuso, sorgente, più vicino).
      3. Clicca su Estra. Nel pannello Etichettatura, evidenzia Background e punta su alcune regioni non cellulari; evidenzia il Primo Piano e attingi all'interno di alcuni neuroni ^TH+.
      4. Zooma dentro e fuori dal campo con Ctrl + Shift + Scroll. Naviga verso altre Z-slice usando lo slider verticale e verso altri campioni di addestramento usando quello inferiore. Ripeti il disegno più volte per garantire un addestramento solido del classificatore.
      5. Clicca sulla classificazione dei pixel. Clicca sul triangolo Start Training per avviare l'addestramento e la previsione pigra, che poi fornisce feedback di segmentazione in tempo reale mentre si naviga tra campioni, slice o posizioni (clic destro e trascinamento) in qualsiasi momento.
      6. Clicca su Draw per aggiungere annotazioni correttive dove la previsione è inaccurata, con opzione, la possibilità di disattivare la visibilità di previsione e etichetta nel pannello Sorgenti e ri-allenare. Itera finché il classificatore non distingue in modo affidabile i neuroni ^TH+ dal background, poi salva il classificatore tramite Segmentazione | Salva il classificatore prima di chiudere Labkit.
3. Segmentazione batch Labkit
   1. Apri un'immagine casuale dalla cartella TH stack a Fiji. Avvia Labkit e clicca su Rimuovi tutto, poi carica il classificatore pre-addestrato tramite Segmentation | Open Classificatore per segmentare l'immagine. Ispeziona visivamente la qualità per validare la generalizzazione del classificatore, poi chiudi la finestra.
   2. Ripeti la versione 2.3.1 su diverse altre immagini casuali. Chiudi la finestra dopo ogni ispezione tranne l'ultima.
   3. Crea una cartella di output Labkit (ad esempio, D:\Confocal\LabkitOut). Inizia l'elaborazione batch tramite Altri > Immagini di Segmenti Batch. Imposta Input Directory sulla cartella TH stack e imposta Output Directory sulla cartella Labkit output, poi clicca su OK per iniziare l'elaborazione batch.
   4. Per esperimenti futuri che utilizzano lo stesso anticorpo TH e impostazioni confocali simili, saltare la 2.2 e riutilizzare il classificatore precedente.
      NOTA: Forniamo anche un classificatore pre-addestrato per scopi di test (File Supplementare 3).
4. Creazione di spot DAPI e TH⁺ Quantificazione dei neuroni
   1. Inserisci XT_Jove_Labkit_TH.m (Supplemental File 4) in una cartella script (ad esempio, D:\scripts). Apri il software 3D e naviga su File | Preferenze, poi seleziona Strumenti personalizzati. Nel pannello cartelle XTension, clicca su Aggiungi... per selezionare la cartella script e cliccare OK.
   2. Per ogni file convertito, lo script eseguirà automaticamente le seguenti operazioni sequenziali.
      NOTA: Questa sezione esplicativa non contiene azioni per l'utente ma è essenziale per procedere ai passaggi successivi.
      1. Il canale DAPI viene elaborato tramite Sottrazione di Fondo e Filtro Gaussiano per facilitare l'identificazione ottimizzata dei punti DAPI.
      2. La maschera di segmentazione Labkit viene perfezionata tramite denoising e riempimento dei fori e collegata come canale di maschera al dataset. Un oggetto superficiale TH raffinato viene costruito dal canale della maschera. L'oggetto di superficie TH genera inoltre una maschera raffinata per sovrascrivere il canale della maschera.
      3. Un canale di trasformazione della distanza viene creato dalla superficie TH, dove i voxel all'interno della superficie sono impostati a 0 e i voxel esterni alla superficie sono assegnati con valori in virgola mobile che rappresentano la loro distanza euclidea alla superficie TH più vicina.
      4. Usa il profilo di intensità di ogni punto DAPI nel canale di trasformazione della distanza come metrica per l'identificazione dei neuroni TH⁺ . I punti DAPI situati all'interno o vicino alle regioni TH⁺ hanno valori di distanza bassi. Questo criterio aiuta a salvare falsi negativi, come i nuclei reali dei neuroni DA situati appena all'esterno ma immediatamente adiacenti a una regione imperfetta del primo piano prevista da Labkit.
   3. Ottimizzazione manuale della qualità per la creazione di spot DAPI
      1. Apri un campione casuale dalla cartella convertita in un software 3D. Naviga per modificare | Proprietà dell'immagine e verifica se la dimensione Voxel Z nel pannello Coordinate è 0,340 μm. Se no, cambialo manualmente a 0,340 μm.
      2. Applica la sottrazione di background al canale DAPI cliccando su Elaborazione Immagini | Soglia | Sottrazione di background. Nel dialogo, seleziona solo il canale DAPI, imposta la larghezza del filtro a 3 e clicca OK. Ripeti questo passaggio ancora una volta e poi esegui una terza ripetizione con una larghezza di filtro pari a 1.
      3. Applica la livellatura gaussiana cliccando su Elaborazione immagini | Levigatura | Filtro gaussiano. Seleziona solo il canale DAPI, imposta Filter Width a 0.2 e clicca su OK.
      4. Nella Scena Sopravvivenza, clicca su Aggiungi Nuovi Macchi per avviare la magia di creazione Macchie. Seleziona il canale DAPI e inserisci un diametro stimato XY di 1,2 μm. Seguendo il wizard, aggiungi un filtro "Qualità sopra" e affina la soglia finché non produce in modo robusto un singolo punto accurato per ogni nucleo.
      5. Ripetere i passaggi 2.4.3.1–2.4.3.3.4 su diversi campioni selezionati casualmente e finalizzare/i valore soglia che funzionano in modo affidabile tra i campioni.
   4. Apri lo script XT_Jove_Labkit_TH.m (File Supplementare 4) nell'editor di testo per modificare i seguenti parametri definiti dall'utente.
      1. Imposta ims_Folder sul percorso della cartella convertita; imposta LabkitOut_Folder sul percorso della cartella di output Labkit. Imposta Ch_DAPI all'indice del canale DAPI per tutti i file nella cartella convertita (ad esempio, 1 se DAPI è il primo canale, 2 se DAPI è il secondo).
      2. Set reVoxelSizeX, reVoxelSizeY, reVoxelSizeZ. Se le dimensioni dei voxel sono corrette nelle Proprietà dell'Immagine (vedi passo 2.4.3.1), lasciare le risposte tra parentesi vuote []. Altrimenti, inserisci manualmente i valori appropriati (ad esempio, 0.130, 0.130, 0.340, rispettivamente) che verranno applicati a tutti i file nella cartella convertita.
   5. Finalizza i parametri di creazione spot.
      1. Personalizza più versioni dei parametri nell'array di celle SpotsParameterAss , dove ogni riga specifica una versione. Questo include la definizione del diametro stimato XY (μm) per il rilevamento spot DAPI nella parte sinistra di ogni riga, e la definizione della stringa di filtro composta da filtri criterio nella parte destra di ogni riga, contenente la soglia di qualità del passaggio 2.4.3.4 e/o la soglia di intensità sul canale maschera raffinato del passaggio 2.4.2.2 o il canale con trasformazione a distanza dal passaggio 2.4.2.3.
      2. Imposta "Centro di intensità Ch=aSizeC+1" sopra 0,5 per mantenere solo i punti il cui centro geometrico rientra nel canale TH maschera raffinato da 2.4.2.2 (valore voxel > 0,5). Questo è il criterio più diretto e rigoroso per il filtraggio spot TH⁺ DAPI.
      3. Imposta "Intensity Mean Ch=aSizeC+2" sotto [soglia] per mantenere punti la cui intensità media nel canale della trasformazione della distanza dal passo 2.4.2.3 scende sotto una soglia specificata. Le soglie più basse selezionano punti posizionati all'interno o estremamente vicino alla superficie del Punto Profondo; Soglie più alte includono punti progressivamente più lontani. Questo consente una calibrazione empirica della prossimità accettabile per l'assegnazione TH⁺ .
      4. Esempio preconfigurato:
         SpotsParameterAss = {
         1.2, ['"Qualità" sopra 94.5,"Centro di intensità Ch=aSizeC+1" sopra 0.5'];
         1.2, ['"Qualità" sopra 94.5,"Media di intensità Ch=aDimensioneC+2" sotto 0.0001'];
         1.2, ['"Qualità" sopra 94.5,"Media di intensità Ch=aDimensioneC+2" sotto 0.001'];
         1.2, ['"Qualità" sopra 94.5,"Media di intensità Ch=aSizeC+2" sotto 0.01'];
         ... Altre combinazioni di filtri sono fornite in script.
         };
      5. Per esperimenti futuri che utilizzano gli stessi anticorpi TH e impostazioni confocali, riutilizza le precedenti combinazioni di parametri. Elimina quelle combinazioni scadenti che producono conteggi spot che si discostano sostanzialmente dai numeri reali, riducendo così il carico computazionale inutile.
   6. Creazione di punti batch
      1. Salva tutte le modifiche sopra indicate allo script XT_Jove_Labkit_TH.m. Apri una nuova finestra software 3D. Clicca sul menu Elaborazione immagini | PAM_TH_processing eseguire lo script in batch.
      2. Inizialmente, osserva per qualche minuto che per ogni combinazione di filtri, lo script crea un oggetto Spots chiamato per riflettere i suoi parametri, e che i file dalla cartella convertita vengono elaborati e salvati come copie in una nuova cartella di output con il suffisso "processed". Poi lasciare il computer incustodito.
      3. Al completamento, verrà generato un foglio di calcolo. Osserva la prima colonna contenente i nomi dei file, e le colonne successive contenenti i conteggi di punti DAPI corrispondenti a ogni combinazione di filtri, con le intestazioni delle colonne che indicano il diametro stimato XY e la stringa di filtro utilizzata.
   7. Validazione della post-elaborazione
      1. Dopo il completamento del passaggio 2.4.6, apri manualmente alcuni file casuali dalla cartella "processed" ed esamina i diversi oggetti Spots sovrapposti al canale TH originale. Basandosi sull'ispezione visiva, si seleziona uno o due filtri ottimali che forniscano la rappresentazione più fedele dei veri conteggi dei neuroni TH⁺ . Esporta le colonne corrispondenti dal foglio di calcolo per l'analisi statistica a valle e la preparazione delle figure.
      2. Per correggere gli errori di conteggio di punti nella combinazione/i di filtri preferita, seleziona l'oggetto Spots corrispondente nella scena Surpass e clicca sulla scheda Modifica . Rimuovere manualmente le zone errate o aggiungere quelle mancanti secondo necessità premendo Shift e cliccando sullo schermo. Salva gli aggiornamenti usando Archivia come/Esporta come/Salva come per sovrascrivere il file corrispondente nella cartella "processed" con lo stesso nome file.
         NOTA: Non eliminare, aggiungere, rinominare o trascinare/riposizionare oggetti Spots—modifica solo gli spot preferiti. Non sono necessarie modifiche allo script; Basta rieseguire lo script per generare istantaneamente un foglio di calcolo aggiornato che riflette i raffinamenti manuali. Per coerenza, o non ne lascia nulla modificato, oppure modifica l'oggetto Spots preferito per tutti i campioni in un esperimento.

Risultati

I dati grezzi raccolti dal software sono stati depositati in un archivio pubblico e sono accessibili al seguente DOI: 10.5281/zenodo.19814348. Per dimostrare l'uso di questa pipeline di quantificazione semi-automatizzata, l'abbiamo applicata a un modello Drosophila ben consolidato di PD utilizzando l'espressione pan-neuronale della α-sinucleina umana (nSyb-QF2>QUAS-SNCA). Le mosche di controllo ospitavano solo il driver nSyb-QF2 . Entrambi i genotipi sono stati invecchiati a 29 °C per 3 settimane, dopo le quali i cervelli sono stati dissezionati, immunocolorati per la TH e immagiati per il cluster PAM. Come mostrato nella Figura 3E, la pipeline semi-automatizzata ha rilevato una significativa riduzione del conteggio dei neuroni PAM TH⁺ nelle mosche che esprimono α-sinucleina rispetto ai controlli (test t di Student, p < 0,0001), dimostrando che il metodo può catturare differenze dipendenti dal genotipo all'interno dello stesso lotto sperimentale. Le sezioni seguenti descrivono la configurazione di montaggio (Figura 1), l'interfaccia di addestramento Labkit (Figura 2) e i passaggi di elaborazione delle immagini (Figura 3) che consentono questa quantificazione.

La Figura 1 illustra la configurazione di montaggio dei cervelli dissezionati di Drosophila e il suo impatto sull'imaging dei cluster PAM. Dopo la dissezione, i cervelli occasionalmente mostrano piegamento o inclinazione verso l'alto del tessuto adiacente al cordone nervoso ventrale reciso. Questo sollevamento nella parte ventrale del cervello altera la prospettiva sotto lo stereoscopio, portando a una proiezione alterata del solco stereotipato nel contorno dorsale e a una differenza nella prospettiva relativa dei punti di riferimento ventrali. (Figura 1B,C). Questa deformazione si verifica spesso nel momento in cui il cervello si stacca dal corpo. Tale deformazione influisce sull'orientamento del cluster PAM durante il montaggio, influenzando di conseguenza la profondità richiesta dello stack Z (Figura 1C,D). In condizioni di montaggio ottimali, il distanziatore a strato singolo crea una compressione adeguata sulla regione centrale del cervello, facendo assumere un orientamento orizzontale immediatamente adiacente al copricapo. Questa configurazione produce pile Z di 15–25 fette a intervalli di 0,34 μm (Figura 1D). Nell'altra condizione, il cluster PAM mantiene una posizione inclinata, richiedendo stack Z più profondi (Figura 1D). Analogamente, l'uso di un distanziatore a nastro a doppio strato non fornisce compressione adeguata, lasciando il cluster PAM nella sua conformazione nativa inclinata e aumentando allo stesso modo la profondità dello stack Z (Figura 1D). La Figura 1E mostra viste rappresentative di proiezione laterale degli stack Z colorati con TH sia in condizioni di posizione ottimale che inclinata.

La Figura 2 presenta l'interfaccia utente Labkit e un flusso di lavoro rappresentativo di addestramento. Con solo poche annotazioni scarabocchiate sparse su un singolo campione (Figura 2A), il classificatore iniziale dei pixel produce già una segmentazione sorprendentemente ragionevole (Figura 2B). Tuttavia, è fondamentale sottolineare che un'annotazione così minima è insufficiente per prestazioni robuste e generalizzabili su un intero dataset. È necessaria un'etichettatura sostanzialmente più iterativa — che copre più Z-slice, campioni e variazioni di colorazione — per generare un classificatore che segmenti in modo affidabile i neuroni ^TH+ nell'intero dataset. In particolare, le immagini di addestramento multiple sono concatenate lungo la dimensione temporale (frame) invece che impilate lungo l'asse Z. Questo design preserva l'integrità spaziale di ogni singolo volume cerebrale, assicurando che i nuclei del filtro 3D operino esclusivamente all'interno — non attraversando — i campioni biologici. Se invece i campioni fossero impilati verticalmente in un unico pila Z spesso, le Z-slice ai confini tra campioni adiacenti diventerebbero spazialmente contigue, causando il trattamento dei voxel provenienti da cervelli diversi come strutture vicine, aumentando il rischio di correzioni manuali inutili (Figura 2C). La concatenazione lungo l'asse temporale evita tale contaminazione incrociata, consentendo comunque un addestramento efficiente e multi-campione in una singola sessione Labkit.

La Figura 3 illustra la pipeline di post-elaborazione e la quantificazione finale. Le maschere di segmentazione grezze Labkit (Figura 3A) contengono numerose piccole macchie falsi positive e fori interni. Dopo l'applicazione di operazioni di denoising morfologico e riempimento dei fori (Figura 3B), viene costruita una superficie TH levigata e utilizzata per generare una maschera binaria raffinata (Figura 3C). Il miglioramento ottenuto da questo raffinamento è visualizzato come una sovrapposizione che confronta le maschere iniziali e finali (Figura 3D, superiore). In particolare, alcune regioni neurite ricche di TH sono occasionalmente trattenute nella maschera finale; tuttavia, queste aree sono quasi sempre prive di nuclei colorati con DAPI e quindi contribuiscono in modo negligente al conteggio finale dei neuroni. Gli utenti avanzati possono adeguare ulteriormente i parametri morfologici nello script di elaborazione batch fornito per perfezionare l'eliminazione di tali artefatti residui. La figura 3D (in basso) mostra le macchie finali DAPI (magenta) sovrapposte sul canale TH (verde) da una proiezione di massima intensità. La Figura 3D rivela anche un raro tipo di falso positivo occasionalmente osservato nella nostra pipeline: un nucleo colorato con DAPI situato in una regione neurite ricca di TH può essere erroneamente classificato come punto TH⁺ quando il segnale della neurite si sovrappone fortemente al nucleo. Tuttavia, come mostrato nella Figura 3C, i nuclei DAPI-positivi nelle vicinanze delle neuriti sono generalmente radi. Inoltre, i pochi segnali DAPI presenti vicino a tali regioni neurite spesso rimangono correttamente classificati come veri negativi (cioè non conteggiati come TH⁺), poiché non vengono identificati erroneamente dalla pipeline. La Figura 3E dimostra l'utilità pratica del metodo: le mosche nSyb-QF2>SNCA di 3 settimane presentano una significativa riduzione del conteggio dei neuroni PAM ^TH+ rispetto ai controlli nSyb-QF2 su più filtri (test t di Student, p < 0,0001). Sebbene i conteggi assoluti di punti possano variare tra diverse combinazioni di filtri e il metodo non raggiunga una precisione perfetta a singolo punto, la differenza relativa tra gruppi sperimentali e di controllo rimane robusta. Per più filtri testati, il risultato statistico del confronto di gruppo è in gran parte preservato tra i filtri all'interno dello stesso lotto sperimentale. Di conseguenza, l'output dovrebbe essere interpretato come una lettura comparativa all'interno del batch piuttosto che come un conteggio assoluto privo di errori dei neuroni PAM.

Figura 1. Dissezione cerebrale e configurazione del montaggio di Drosophila. (A) Schema schematico dell'assemblaggio di montaggio del cervello. Le barre gialle rappresentano i distanziatori del nastro Scotch. Uno schema cerebrale ingrandito indica la posizione approssimativa del cluster PAM (viola). (B) Schemi della sezione trasversale laterale corrispondenti al piano tratteggiato in A che rappresentano due morfologie cerebrali comuni dopo la dissezione: posizionata in modo ottimale (superiore) e inclinata (inferiore). (C) Due cervelli mosche dissezionati visti sotto stereoscopio: posizionati in modo ottimale (sinistra) vs inclinati (destra). Le frecce gialle indicano il solco stereotipato lungo il contorno dorsale. Linee tratteggiate blu collegano due punti di riferimento corrispondenti ai lati sinistro e destro della metà ventrale. Le frecce blu evidenziano il conseguente cambiamento nella prospettiva relativa di questi punti di riferimento ventrali. Barra di scala = 500 μm (D) Illustrazione schematica che mostra come la morfologia cerebrale e lo spessore del distanziatore del nastro (singolo vs. doppio strato) influenzino la posizione verticale del cluster PAM e di conseguenza la profondità richiesta dello stack Z. (E) Viste laterali rappresentative (proiezione Y) di stack confocali a Z colorati in TH da condizioni di montaggio posizionate in modo ottimale (superiore) e deformate (inferiori). Barra della scala = 5 μm. Abbreviazione: PAM = protocerebrale antero-mediale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Formazione in Labkit e segmentazione interattiva. (A) Interfaccia grafica Labkit. Le annotazioni (scarabocchi) sono mostrate in due classi: in primo piano (rosso) e sfondo (blu). (B) Risultato di segmentazione generato immediatamente dopo l'addestramento sugli scarabocchi mostrati in A. Il rosso indica il colore in primo piano; Il blu indica il colore di sfondo. Barra di scala = 5 μm. (C) Interferenza tra le fette Z adiacenti. Immagini a singolo taglio di mitocondri fluorescenti marcati da proteine provenienti da diversi cervelli di mosca sono state concatenate lungo l'asse Z. Le fette 1 e 3 sono copie identiche della stessa immagine, mentre le fette 2 e 4 provengono da cervelli diversi. Frecce gialle, previsione che filtra dalla fetta 2 alla fetta 1. Frecce verdi, previsione che filtra dalla fetta 4 alla fetta 3. Barra della scala = 3 μm. Clicca qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3. Post-elaborazione delle maschere di segmentazione Labkit e della quantificazione dei neuroni TH⁺. (A) Maschera binaria Raw Labkit (ciano, superiore) e sovrapposizione con il canale TH originale (inferiore). Si noti abbondanti piccole macchie e un riempimento incompleto dei corpi cellulari neuronali. (B) Maschera dopo la denoising morfologica e il riempimento dei fori (magenta, superiore); sovrapposizione con il canale TH (inferiore). (C) Maschera binaria raffinata (rossa, superiore) da una superficie TH levigata per B e rimascheramento; sovrapposizione con il canale TH (inferiore). (D) Upper: sovrapposizione di maschere grezze (ciano) e raffinate (rosse), evidenziando le regioni corrette tramite post-elaborazione. Inferiore: Proiezione di massima intensità che mostra i punti finali DAPI (magenta) sovrapposti al canale TH (verde). Si noti che i due punti nell'angolo in alto a destra hanno origine dal gruppo controlaterale di PAM. Il filtro 4 veniva usato per illustrazione. (E) Validazione quantitativa in un modello di morbo di Parkinson utilizzando combinazioni di filtri multipli. Le mosche nSyb-QF2>SNCA (modello PD) di tre settimane di vita mostrano una riduzione significativa del conteggio dei neuroni TH⁺ del PAM rispetto ai controlli nSyb-QF2 in filtri multipli (in alto). I dati grezzi sono forniti in un foglio di calcolo (in fondo). filtro 1: 1,2, ['"Qualità" sopra 94,5,"Intensità Media Ch=aDimensioneC+2" sotto 0,0001']; filtro 2: 1,2, ['"Qualità" sopra 94,5, "Media di intensità Ch=aSizeC+2" sotto 0,001']; filtro 3: 1,2, ['"Qualità" sopra 94,5,"Intensità Media Ch=aDimensioneC+2" sotto 0,01']; filtro 4: 1,2, ['"Qualità" sopra 94,5,"Intensità Media Ch=aDimensioneC+2" sotto 0,05']; filtro 5: 0,6, ['"Qualità" sopra 94,5,"Intensità Media Ch=aSizeC+2" sotto 0,001']; filtro 6: 0,6, ['"Qualità" sopra 94,5,"Intensità Media Ch=aDimensioneC+2" sotto 0,01']; filtro 7: 0,9, ['"Qualità" sopra 94,5,"Intensità Media Ch=aDimensioneC+2" sotto 0,01']; n = 57 cervelli (controllo), n = 65 cervelli (PD); Test t dello studente, p < 0,0001 (****). Le mosche venivano alcolte a 29 °C. Barre di scala = 5 μm (A–D). I dati sono presentati come media ± SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fascicolo Supplementare 1. Macro Fiji per separare il canale TH dai file immagine convertiti e salvare gli stack di output.Clicca qui per scaricare questo file.

Fascicolo Supplementare 2. Fiji macro per ritagliare gli stack di addestramento Z a una profondità comune di Z-slice e concatenarli in un file TIFF time-lapse per l'addestramento dei classificatori Labkit.Clicca qui per scaricare questo file.

File Supplementare 3. Classificatore Labkit pre-addestrato utilizzato per testare il flusso di lavoro di segmentazione PAM TH.Clicca qui per scaricare questo file.

Fascicolo Supplementare 4. Script MATLAB per l'elaborazione batch delle maschere Labkit, generazione di spot DAPI, applicazione di combinazioni di filtri ed esportazione dei conteggi di neuroni TH⁺ .Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

La quantificazione dei neuroni DA nel cluster PAM di Drosophila è storicamente stata una sfida formidabile. Qui presentiamo un flusso di lavoro semi-automatizzato che integra la classificazione dei pixel basata su machine learning con software di analisi delle immagini per affrontare questo problema di lunga data. Questo metodo consente la rilevazione a livello di batch delle variazioni nei neuroni ^TH+ nel cluster PAM tra gruppi all'interno dello stesso esperimento, supportando studi comparativi nei modelli¹⁸ per la malattia di Parkinson.

Quando si seleziona il filtro ottimale per un determinato esperimento, gli utenti possono scegliere il filtro che meglio corrisponde all'ispezione visiva delle immagini grezze, oppure fare riferimento all'intervallo e/o alla media riportati dei numeri di neuroni PAM di tipo selvatico nella^{letteratura 12,13}. Tuttavia, è necessaria cautela: solo due studi hanno riportato il conteggio dei cluster di PAM, nessuno dei quali è correlato alla PD, e i valori riportati mostrano notevoli incoerenze. Inoltre, la deviazione standard può aumentare con l'età, complicando ulteriormente i confronti tra gli studi incrociati. Pertanto, il riferimento basato sulla letteratura dovrebbe essere usato solo come guida approssimativa, non come standard assoluto. Riconosciamo che questa pipeline non produce conteggi assoluti privi di errori (Figura 3D). Tuttavia, finché i confronti sono confinati a gruppi all'interno dello stesso lotto sperimentale (cioè, non aggregando dati tra diversi lotti in un unico grafico), il metodo può essere utilizzato per rilevare differenze relative tra genotipi o condizioni di trattamento all'interno di un lotto.

Secondo la nostra esperienza, gli anticorpi secondari coniugati con AF488 dovrebbero essere evitati a causa dell'alto background di fondo, e AF546 dovrebbe essere evitato a causa dell'attenuazione del segnale più elevata lungo l'asse Z. Abbiamo inoltre riscontrato che un'incubazione e un lavaggio approfonditi DAPI sono fondamentali per ottenere un alto rapporto segnale-rumore e segnali nucleari chiari, che influenzano direttamente le prestazioni della segmentazione automatizzata. DAPI è preferibile a Hoechst per questa applicazione, poiché la sua colorazione preferenziale dell'eterocromatina genera macchie nucleari più luminose e definite, facilitando una rilevazione più accurata.

Discussione sulla risoluzione dei problemi per le modalità di guasto comuni

Guasti legati alle macchie. L'abilità di dissezione è un fattore determinante importante della qualità dei dati. Il cluster PAM si trova superficialmente ed è facilmente danneggiato rimuovendo le due sacche tracheali e il corpo grasso dorsale a questa regione. Le pinze devono essere maneggiate con attenzione per evitare di perforare o comprimere l'area del PAM. La deformazione ventrale si verifica spesso nel momento in cui il cordone nervoso ventrale viene reciso, causando l'inclinazione o la curvatura del cervello quando viene posizionato su un vetrino di vetro; questa deformazione può fissarsi permanentemente dopo l'incubazione con PFA. Gli utenti dovrebbero sperimentare gli angoli delle pinze durante il taglio per trovare una tecnica ottimale. Se si osserva inclinazione dopo la dissezione, una pressione delicata sulla regione elevata può invertire la deformazione (accettabile se l'area compressa non è la regione di interesse).

Fallimenti di segmentazione. La scarsa segmentazione di solito deriva da dati di addestramento insufficientemente diversi. Il classificatore Labkit deve essere addestrato su un insieme rappresentativo di immagini che coprono l'intera gamma di qualità di colorazione all'interno del lotto, inclusi la migliore, la media e la più scarsa. Durante la correzione iterativa, dai priorità ad annotare i falsi positivi e i falsi negativi di cui sei sicuro. Evita di correggere regioni ambigue o incerte, poiché ciò potrebbe fuorviare il classificatore e degradare le prestazioni.

Guasti nel rilevamento puntuale. L'ottimizzazione dei parametri richiede un'esplorazione sistematica su un piccolo sottoinsieme di campioni rappresentativi. Testare diversi diametri spot stimati e soglia di filtro di qualità, o anche tipi di filtro oltre il filtro "Quality above" usato in questo protocollo. La wizard per la creazione degli spot offre varie opzioni di filtraggio (ad esempio, intensità). Gli utenti sono incoraggiati ad adattare soglie e tipi di filtro al proprio dataset specifico e a effettuare una regolazione empirica prima dell'elaborazione batch.

Perché il conteggio manuale dei neuroni del cluster PAM rimane eccezionalmente difficile? Il cluster PAM presenta caratteristiche anatomiche e di colorazione uniche che rendono inadeguati i metodi tradizionali di conteggio manuale. Innanzitutto, l'immunofluorescenza TH nel citosolo dei neuroni dopaminergici di Drosophila etichetta prevalentemente un sottile anello citoplasmatico che circonda un grande vuoto nucleare non colorato. Di conseguenza, il nucleo colorato con DAPI e il compartimento citoplasmatico ^TH+ mostrano una minima sovrapposizione spaziale. Questa fondamentale mancanza di localizzazione esclude la politica diretta di classificazione "DAPI nella maschera TH". In secondo luogo, il cluster PAM comprende oltre 100 neuroni densamente impacchettati disposti in un'architettura tridimensionale simile a una uva. Man mano che si naviga attraverso gli stack Z confocali, i neuroni appaiono e scompaiono gradualmente—alcuni entrano nel piano, altri ne escono—creando un alto carico cognitivo e una notevole variabilità tra osservatori. Lo studio più recente che quantifica i neuroni PAM DA si basava sul conteggio manuale utilizzando il plugin di conteggio cellulare di ImageJ. Sebbene del tutto appropriato per cluster più piccoli come PPM1/2 o PPL1, questo approccio diventa proibitivamente laborioso quando applicato al cluster PAM, in particolare in studi che richiedono decine o centinaia di campioni.

Perché l'architettura della foresta casuale di Labkit è particolarmente adatta alla segmentazione dei neuroni TH? Labkit implementa un classificatore di pixel basato su foresta casuale, eccezionalmente ben adattato alle sfide specifiche delle immagini di cluster PAM colorate con TH. L'algoritmo calcola un vettore di caratteristiche completo per ogni pixel applicando una cascata di filtri di trasformazione, tra cui sfocatura gaussiana, differenza di gaussiane, grandezza del gradiente gaussiano, laplaciano di Gaussiano e autovalori di Hessia—ciascuno valutato su più scale sigma (1, 2, 4, 8). Questa estrazione di caratteristiche multiscala cattura efficacemente le caratteristiche testurali e di bordo che distinguono l'interno nucleare dal fondo extracellulare. È importante sottolineare che, poiché le foreste casuali richiedono ordini di grandezza meno di dati di addestramento rispetto agli approcci di deep learning, gli utenti possono perfezionare iterativamente il classificatore con annotazioni scarabocchiate scarabocchiate su poche 20–40 immagini rappresentative. Ogni iterazione aggiunge nuovi alberi decisionali all'ensemble, che votano collettivamente per classificare ogni pixel. Questo processo consente intrinsecamente di adattarsi alla variabilità da batch a lotto nelle condizioni di colorazione e imaging — un vantaggio fondamentale data la variabilità biologica insita negli incroci genetici e negli studi sull'invecchiamento di Drosophila . Con questo approccio, si può rilevare la perdita di neuroni ^TH+ nei modelli di Parkinson che esprimono α-sinucleina, e gli effetti di potenziatori genetici e soppressori sul conteggio dei neuroni del cluster PAM possono essere confrontati all'interno di un lotto sperimentale.

È importante sottolineare che, ai fini dell'addestramento, gli stack ritagliati sono concatenati lungo la dimensione temporale invece che impilati lungo l'asse Z. Questa scelta progettuale è fondamentale per un addestramento ottimale dei classificatori. La classificazione 3D dei pixel di Labkit considera le informazioni voxel tra le Z-slice consecutive, essenziale per risolvere con precisione l'anello TH sottile e citoplasmatico che definisce la morfologia dei neuroni PAM. Se invece i singoli campioni venissero impilati verticalmente in un singolo Z-stack ultra-spesso, le Z-slice ai confini tra campioni adiacenti diventerebbero spazialmente contigue nello stack. Di conseguenza, i voxel appartenenti a campioni biologici diversi sarebbero trattati come strutture vicine all'interno dello stesso volume tridimensionale. Durante l'addestramento interattivo, uno scarabocchio disegnato vicino a tale confine può involontariamente catturare caratteristiche di due campioni diversi contemporaneamente, confondendo il classificatore (Figura 2B, frecce). Inoltre, segnali falsi positivi provenienti da un campione potrebbero proiettarsi nel volume del campione adiacente, causando scarabocchi correttivi errati che si propagano attraverso iterazioni di addestramento successive, generando alberi decisionali che codificano regole biologicamente prive di significato. Concatenare campioni lungo l'asse temporale preserva l'integrità spaziale di ogni singolo volume, permettendo ai kernel del filtro 3D di operare esclusivamente all'interno — non attraversando — campioni biologici, consentendo comunque un addestramento efficiente e multi-campione in una singola sessione Labkit.

Considerazioni metodologiche e limitazioni

Meritano di discutere diverse avvertenze importanti. Innanzitutto, questo protocollo è ottimizzato specificamente per il cluster PAM e potrebbe non generalizzare ad altri cluster DA (ad esempio, PPM1/2/3, PPL1) o ai neuroni ^TH+ nei lobi ottici. La regione PAM beneficia di una densità DAPI relativamente scarsa, con nuclei ben separati nello spazio tridimensionale, permettendo una rilevazione robusta e inequivocabile del punto DAPI. Al contrario, questo flusso di lavoro non è facilmente trasferibile ad altri cluster DA come PPL1 o PPM1/2. In quelle regioni, le neuriti sono più propense a essere messe a confronto o sovrapporsi ai nuclei colorati da DAPI delle cellule non DA. Dato il numero molto basso di neuroni DA in questi piccoli cluster (spesso meno di 10 cellule per cluster), anche alcune classificazioni errate possono portare a errori proporzionalmente grandi, rendendo il metodo meno affidabile per tali applicazioni. In secondo luogo, l'immunocolorazione TH etichetta anche neuriti e proiezioni assonali all'interno del neuropilo. Nonostante le annotazioni correttive durante l'addestramento, questi tratti a fibre producono occasionalmente forti segnali TH e possono essere erroneamente classificati come in primo piano dal classificatore. Tuttavia, queste regioni nel cluster PAM sono quasi sempre prive di nuclei colorati con DAPI; quindi, i voxel falsi positivi nella regione ricca di neuriti del cluster PAM contribuiscono minimamente al conteggio finale dei neuroni. In terzo luogo, la classificazione dei pixel di Labkit si basa su caratteristiche di texture locali all'interno di un vicinado finito (i kernel dei filtri predefiniti rispondono a circa 16 × 16 finestre di pixel). Questo design garantisce efficienza computazionale e consente la segmentazione interattiva in tempo reale, ma significa anche che il classificatore non può sfruttare il contesto anatomico globale. Di conseguenza, rari artefatti o irregolarità di colorazione che si discostano sostanzialmente dal set di addestramento possono richiedere una cura caso per caso. Infine, la pipeline di elaborazione batch descritta qui—che integra la segmentazione Labkit con il rilevamento spot DAPI e la trasformazione della distanza—genera molteplici canali di uscita e combinazioni di filtri. Gli utenti dovrebbero validare sistematicamente i parametri ottimali del filtro per le proprie condizioni sperimentali specifiche, piuttosto che adottare acriticamente le soglie predefinite presentate in questo protocollo.

Applicazioni future

Oltre al modello PD qui dimostrato, questa pipeline semi-automatizzata può essere applicata direttamente a qualsiasi modello Drosophila che coinvolga la quantificazione dei neuroni DA del cluster PAM, inclusi studi su apprendimento e memoria, motivazione, regolazione del sonno e neurodegenerazione legata all'età. In particolare, la capacità di elaborazione batch di questo metodo può renderlo adatto per: (1) screening di farmaci a media o alta produttività: testare più composti neuroprotettivi tra dosi diventa più fattibile senza un aumento proporzionale dello sforzo manuale di conteggio. (2) Screening genetici modificatori: Quantificazione del conteggio dei neuroni PAM in centinaia di incroci genetici (ad esempio, linee RNAi, linee di sovraespressione) per identificare potenziatori o soppressori della tossicità α-sinucleina. (3) Studi sull'invecchiamento longitudinale: monitoraggio della perdita di neuroni PAM su più punti temporali con una riduzione del carico di conteggio manuale. Inoltre, il flusso di lavoro di segmentazione basato su Labkit non si limita alla colorazione TH; con un adeguato riallenamento, può essere adattato per quantificare altre popolazioni neuronali nel cervello di Drosophila , a condizione che condividano due caratteristiche chiave con il cluster PAM: una densità relativamente bassa di nuclei colorati con DAPI e interferenze minime dovute alla colorazione di neuriti. Oltre a Labkit e al software 3D qui utilizzato, la logica complessiva di questa pipeline—classificazione dei pixel basata su machine learning seguita da rilevamento spot e trasformazione della distanza—può essere implementata in altre piattaforme supportate per l'analisi delle immagini 3D, aumentando così la sua accessibilità e flessibilità per la comunità di ricerca più ampia.

In sintesi, presentiamo un flusso di lavoro semi-automatizzato per rilevare differenze di gruppo nei numeri di neuroni TH⁺ del cluster PAM. Combinando la classificazione dei pixel basata su Labkit con il rilevamento spot e la trasformazione della distanza, questo metodo consente il confronto del numero di neuroni TH⁺ tra gruppi sperimentali e di controllo all'interno dello stesso lotto, riducendo al contempo il peso del conteggio manuale man mano che la dimensione del campione aumenta. La scalatura da decine a centinaia di campioni aumenta proporzionalmente il tempo di calcolo, ma lo sforzo manuale aggiuntivo è principalmente limitato all'organizzazione dei file e al controllo puntuale della qualità. Sebbene il cluster PAM abbia ricevuto poca attenzione nella ricerca sulla PD finora, ciò è dovuto in gran parte a limitazioni tecniche piuttosto che a irrilevanza biologica. Fornendo uno strumento pratico di quantificazione, il nostro protocollo faciliterà in futuro l'indagine su se e come i neuroni PAM degenerino nei modelli di PD ed esplorerà il loro potenziale contributo ai sintomi non motori, come deficit olfattivi e declino motivazionale. Prevediamo che questo protocollo faciliterà studi comparativi a livello di batch sulla neurodegenerazione dopaminergica, la plasticità sinaptica e lo screening neuroprotettivo dei farmaci nel sistema modello di Drosophila .

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Software per l'elaborazione immagini 3D - Bitplane Imaris 8.0+	Oxford Instruments	http://www.bitplane.com/	Software di analisi delle immagini 3D utilizzato in questo studio
4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	62248
D. melanogaster: nSyb-QF2	Centro Stock Drosophila di Bloomington	51960
D. melanogaster: nSyb-QF2>QUAS-SNCA	Centro Stock Drosophila di Bloomington	600605
DOWSIL SYLGARD 184	Tat Lee Engineering Pte Ltd	https://www.tatlee.com.sg/
Pinza Dumont Styple 3C Dumoxel, 0,04/0,08 mm	Scienze della microscopia elettronica	72680-D(0203-3C-PO)
FV3000 confocale	Olympus	https://www.olympus-global.com/
Anticorpo secondario anti-coniglio IgG (H+L) adsorbito incrociato per capra, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244
ImageJ/Fiji (1.53q)	Fiji/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/
Labkit	Fiji/ImageJ	https://imagej.net/plugins/labkit/
Perni Minutien, acciaio inossidabile, diametro 0,15 mm	Austerlitz	https://mothandbeetle.com/products/austerlitz-stainless-steel-minutens.html
Siero normale per capra, solido liofilizzato	Sigma-Aldrich	566380
Software di calcolo numerico - Python	Python	3.8+
Software di calcolo numerico - Matlab	Lavoro matematico	R2016a+	Software di calcolo numerico utilizzato in questo studio
Etossilato di Octilfenolo (Triton X-100)	Bio-rad	1610407
Soluzione di paraformaldeide 4% in PBS	Santa Cruz Biotecnologia	SC-281692
Piatto per colture cellulari di polistirene	Nest Scientific	706001
Supporto antifade d'oro ProLong	Thermo Fisher Scientific	P36934
Coniglio anti-tirosina idrossilasi (TH)	Pel Freeze	P40101-0
Azida di sodio	Sigma-Aldrich	S2002
Stereoscopio	Olympus	SZ51
Einmalkan Stericanoü len 27 G grau 0,40 x 12 mm	Sterican	D-34209
Siringa, 1 mL	Terumo	DVR-5175
Nastro adesivo trasparente	3M Scotch 600, libero	600