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Panoramica del flusso di lavoro di analisi
Il design complessivo dell'analisi trasscrittomica e basata su machine learning di questo studio è illustrato nella Figura 1, che comprende i passaggi chiave: raccolta dei geni relativi al sistema Renina-Angiotensina (RASRG); screening di geni differenzialmente espressi (RASRDEG) correlati alla RAS da dataset sull'ipertensione; analisi dell'arricchimento funzionale (GO/KEGG/GSEA); analisi dell'infiltrazione immunitaria (CIBERSORT); la costruzione di interazioni proteina-proteina (PPI) e reti regolatorie; selezione genica chiave basata su apprendimento automatico (regressione logistica, foresta casuale [RF]); e la valutazione del modello diagnostico dell'ipertensione. Un elenco completo dei software, database e strumenti online utilizzati in questo studio è fornito nella Tabella dei Materiali.
Download dati
I dataset sull'ipertensione GSE753608 e GSE74144 (Homo sapiens) sono stati ottenuti tramite il pacchetto RGEOquery 9 dal databaseGEO 10. GSE75360 derivati da cellule mononucleari del sangue periferico (piattaforma: GPL10558) includevano 10 campioni di ipertensione e 11 campioni di controllo; GSE74144 derivati dai globuli bianchi (piattaforma: GPL13497) includevano 14 campioni di ipertensione e 8 campioni di controllo (Tabella 1). I RASRG codificanti per proteine (1.264) sono stati inizialmente identificati tramite GeneCards11 (parola chiave: "Sistema Renina-Angiotensina") e PubMed (parola chiave: "Sistema Renina-Angiotensina")12,13. L'intersezione di questi RASRG con i geni in GSE75360/GSE74144 ha prodotto 1.159 RASRGfinali 14. I due dataset sono stati elaborati separatamente perché generati su piattaforme microarray diverse. L'annotazione tramite sonda veniva eseguita secondo i corrispondenti file di annotazione della piattaforma GPL, e per le analisi a valle venivano utilizzate matrici di espressione genica normalizzate. I box plot venivano utilizzati per confrontare le distribuzioni di espressione prima e dopo la normalizzazione.
Geni differenzialmente espressi differenzialmente tra renina-angiotensina e correlati all'ipertensione
I campioni nel dataset GSE75360 sono stati categorizzati nel gruppo ipertensione e nel gruppo di controllo. Il software limma è stato impiegato per condurre un'analisi differenziale dell'espressione genica tra i due gruppi14, con geni differenzialmente espressi (DEG) identificati dalla soglia di |logFC| > 0,45 e valore p < 0,05. I risultati di questa analisi differenziale sono stati visualizzati tramite grafici vulcanici (generati usando il pacchetto R ggplot2).
Per ottenere i RASRDEG, i DEG che soddisfano la soglia sopra descritta (|logFC| > 0,45, p-value < 0,05) sono stati incrociati con geni correlati alla RAS (RASRG), e il risultato dell'intersezione è stato presentato tramite un diagramma di Venn. Successivamente, i modelli di espressione degli RASRDEG identificati sono stati visualizzati come una heatmap usando la pheatmap del pacchetto R, e la localizzazione cromosomica degli RASRDEG è stata visualizzata tramite mappe cromosomiche generate con il pacchetto R RCircos15.
Validazione differenzialmente dei geni espressi e analisi della curva ROC
È stato costruito un grafico intergruppo per analizzare le differenze di espressione RASRDEG tra ipertensione/controllo nel16 GSE75360, il pacchetto R pROC è stato utilizzato per tracciare curve ROC e calcolare AUC (0,5–0,7: bassa accuratezza; 0,7–0,9: moderato; >0,9: alto) per l'efficacia diagnostica del RASRDEG.
Analisi di correlazione
L'analisi di correlazione di Spearman è stata condotta sull'espressione RASRDEG in GSE75360; i risultati sono stati visualizzati tramite heatmap (pacchetto R ggplot2) (|r| < 0,3: nessuna correlazione debole; 0,3–0,5: debole; 0,5–0,8: moderato; >0,8: forte).
Analisi di arricchimento di GO e KEGG
GO (Gene Ontology, release 2024, http://geneontology.org/) è una risorsa ampiamente utilizzata per l'arricchimento funzionale su larga scala, che copre tre domini: processi biologici (BP), componenti cellulari (CC) e funzioni molecolari (MF)17. KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Release 109.0, 2024, https://www.genome.jp/kegg/) memorizza dati su genomi, biopathie, malattie e farmaci18.
I RASRDEG sono stati sottoposti ad annotazione GO e analisi di arricchimento dei percorsi KEGG utilizzando il cluster R packageProfiler 19. Metodo di prova di arricchimento: test ipergeometrico; metodo di correzione multipla: metodo Benjamini-Hochberg (BH). Criterio di screening: valore p corretto < 0,05.
Analisi dell'arricchimento degli insiemi genici (GSEA)
Per il GSEA a livello di coorte, tutti i geni testati nell'analisi di espressione differenziale di GSE75360 sono stati classificati in ordine decrescente da logFC e utilizzati come lista genica di input per clusterProfiler19. Non è stato applicato alcun prefiltraggio DEG prima del GSEA. La raccolta del set di geni C2 da MSigDB20. Parametri: seme = 2022, 10–500 geni per insieme; criteri di screening: p < corretto 0,05 (metodo Benjamini-Hochberg, BH), FDR < 0,2521.
Costruzione del modello diagnostico dell'ipertensione
Per identificare geni chiave associati all'ipertensione, abbiamo impiegato due tipi di algoritmi di apprendimento automatico: regressione logistica e foreste random forest (RF). La regressione logistica (variabile dipendente binaria: ipertensione/controllo) ha selezionato i RASRDEG con p < 0,05. Random Forest (RF, pacchetto R randomForest): parametri set.seed(520), ntree = 1000; MeanDecreaseGini (indicatore di importanza variabile) è stato estratto e sono stati selezionati i primi 15 RASRDEG. I RASRDEG sono stati sottoposti a un valore p < 0,05 come standard.
L'algoritmo RF (Random Forest), un metodo di apprendimento in ensemble sotto la categoria Bagging (integrando alberi decisionali multipli), è stato applicato tramite il pacchetto RrandomForest 22 (parametri: set.seed(520), ntree = 1000). MeanDecreaseGini (che riflette l'importanza variabile in base alla diminuzione media della purezza durante la divisione dei nodi) dei geni delle caratteristiche è stato estratto e sono stati selezionati i primi 15 RASRDEG. Infine, è stato tracciato un diagramma di Venn dei geni selezionati tramite regressione logistica e RF per identificare geni chiave correlati all'ipertensione.
Validazione del modello diagnostico dell'ipertensione
È stato costruito un modello di regressione logistica basato su geni chiave; Il valore lineare previsto (η) è stato calcolato come:
Il pacchetto R pROC16 è stato utilizzato per tracciare le curve ROC e valutare l'efficacia del modello nella previsione del rischio di ipertensione. Un nomogramma è stato costruito tramite il pacchetto R rms23 per visualizzare il contributo di ciascun gene chiave al modello di regressione logistica (riflettendo l'associazione tra geni chiave e rischio di ipertensione). Sono state generate curve di calibrazione per valutare la coerenza tra probabilità di ipertensione prevista e reale; È stata effettuata analisi della curva decisionale (DCA, pacchetto R ggDCA24) per valutare l'utilità clinica del modello (beneficio netto) in GSE75360 e GSE74144.
GSEA a gene singolo
GSEA esplora il ruolo dei geni associati a uno specifico gene nei processi/percorsi biologici/patologie analizzandone la espressione, aiutando a comprendere il ruolo funzionale del gene. Per ogni gene focale in GSE75360, i campioni sono stati suddivisi alla mediana in gruppi ad alta e bassa espressione. Successivamente è stata eseguita un'analisi dell'espressione differenziale su tutti i geni testati, e i valori di logFC a livello genomico sono stati classificati dal più alto al più basso prima del GSEA con clusterProfiler19. Non è stato applicato alcun prefiltraggio DEG prima del GSEA. Parametri: seme = 2020, 10–500 geni per insieme (raccolta c2 del set genico da MSigDB21). Criteri di screening: p < 0,05 (adj. p corretta tramite metodo BH).
Analisi dell'infiltrazione immunitaria (CIBERSORT)
L'algoritmoCIBERSORT 25 (basato sulla regressione lineare del vettore di supporto) ha deconvoluto la matrice trascricomica per stimare la composizione delle cellule immunitarie in campioni misti (sono stati selezionati dati con punteggio di arricchimento delle cellule immunitarie > 0). La matrice finale di infiltrazione delle cellule immunitarie di GSE75360 è stata visualizzata tramite un grafico a barre proporzionale. La correlazione di Spearman è stata utilizzata per analizzare le associazioni chiave tra cellule immuni e cellule immuni e geni-cellule immuni, con risultati presentati rispettivamente come una mappa di calore di correlazione (R package pheatmap) e un grafico di bolle di correlazione (R package ggplot2).
Rete di interazione proteina-proteina (PPI)
Le reti PPI sono sistemi di proteine interconnesse che regolano i processi biologici attraverso interazioni. Utilizzando il databaseSTRING 26, è stata costruita una rete PPI per geni chiave (punteggio minimo di interazione: 0,150, bassa confidenza). I geni hub correlati a renina-angiotensina sono stati selezionati tramite screening dei geni interagenti. Il databaseGeneMANIA 27, che identifica geni funzionalmente simili utilizzando dataset genomici e proteomici, è stato utilizzato per prevedere geni funzionalmente simili di geni chiave del RAS e per costruire una rete di interazione proteica.
Costruzione della rete regolatoria
Rete mRNA-TF: I fattori di trascrizione (TF) regolano l'espressione genica tramite l'interazione post-trascrizionale con i geni bersaglio. I TF che mirano ai geni hub e le loro relazioni regolatorie sono stati recuperati dal databaseChIPBase 28, e la rete mRNA-TF è stata visualizzata utilizzando Cytoscape29.
Rete mRNA-miRNA: i miRNA modulano più geni target (singoli bersagli possono essere co-regolati da più miRNA). StarBase v3.030 è stato utilizzato per identificare i miRNA associati ai RASRDEG, e la rete mRNA-miRNA è stata visualizzata tramite Cytoscape.
Rete mRNA-farmaci: I database tossicogenomici31 sono stati utilizzati per prevedere i target diretti/indiretti dei geni hub dei farmaci. La rete mRNA-farmaco (che mostra le interazioni geni-farmaco) è stata visualizzata con Cytoscape per completare la costruzione della rete.
Modello HUVEC indotto da Ang II
Le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) sono state mantenute a 37°C in un incubatore umidificato con il 5% diCO2. Le cellule sono state mantenute in un mezzo di coltura endoteliale completo, integrato con siero bovino fetale e antibiotici secondo le istruzioni del fornitore. Per stabilire un modello di lesione endoteliale correlata all'ipertensione in vitro, gli HUVEC sono stati trattati con angiotensina II (Ang II; 100 nM) per 48 ore. Cellule trattate con veicoli venivano utilizzate come gruppo di controllo.
Per gli esperimenti di intervento genico, piccoli RNA interferenti che mirano a CST3 o FURIN (si-CST3 e si-FURIN), i corrispondenti plasmidi di controllo negativo (si-NC), CST3 o FURIN (oe-CST3 e oe-FURIN) e il corrispondente controllo a vettore vuoto (oe-NC) sono stati trasfettati negli HUVEC utilizzando un reagente di transfezione commerciale secondo il protocollo del produttore. Dopo la trasfezione, le cellule sono state esposte all'Ang II e poi prelevate per la validazione dell'espressione e i test funzionali. Le efficienze di knockdown e sovraespressione sono state confermate da qRT-PCR e western blotting.
qRT-PCR
L'RNA totale è stato isolato dagli HUVEC con un reagente standard di estrazione di RNA, e il DNA complementare è stato generato utilizzando un kit di trascrizione inversa. SYBR La chimica verde è stata utilizzata per qRT-PCR. I livelli di espressione di LRP1, CTSD, MTHFR, AUTS2, FURIN, CST3, FCER1G, TBXAS1, IL-6, TNF-α, VCAM1, ICAM1 ed eNOS sono stati normalizzati in GAPDH. e calcolati con il metodo 2−ΔΔCt .
Western blotting
Per l'analisi western blot, le proteine sono state estratte con il tampone di lisi RIPA e quantificate utilizzando un saggio BCA. Quantità pari di proteine sono state risolte tramite SDS-PAGE e trasferite alle membrane PVDF. Dopo il blocco, le membrane sono state incubate con anticorpi primari contro CST3, FURIN, TBXAS1 o GAPDH e poi con anticorpi secondari adeguati. Le bande sono state rilevate tramite chemiluminescenza e la densitometria è stata normalizzata a GAPDH. Il CST3 secreto in supernatanti di coltura è stato quantificato con un kit ELISA seguendo il protocollo del produttore.
Vitalità cellulare
La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando il saggio Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Per un breve periodo, HUVEC trasfectati e trattati con Ang II sono stati seminati in piastre da 96 pozzi, e l'assorbenza a 450 nm è stata misurata a 0, 24, 48 e 72 ore dopo l'aggiunta del reagente CCK-8. La migrazione cellulare è stata valutata utilizzando camere Transwell. Dopo gli interventi indicati, le cellule sono state inserite nelle camere superiori e le cellule migrate sulla superficie inferiore della membrana sono state fissate, colorate e contate al microscopio in campi selezionati casualmente.
Test infiammatorio
Valutare l'attivazione infiammatoria, lo stress ossidativo e la funzione endoteliale, IL-6, TNF-α, VCAM1, ICAM1 ed eNOS.I livelli di mRNA sono stati rilevati tramite qRT-PCR. I livelli di ossido nitrico (NO) nel soprandanante della coltura sono stati misurati utilizzando un kit commerciale per il test NO, mentre i livelli di specie reattive intracellulari (ROS) sono stati rilevati tramite fluorescenza DCF secondo le istruzioni del produttore.
Analisi statistica
L'elaborazione e la modellazione trascrivomica sono state eseguite in R. Le variabili continue sono state valutate per la normalità con il test di Shapiro-Wilk. Per i confronti a due gruppi, sono stati utilizzati test t a campioni indipendenti per variabili normalmente distribuite, mentre i test di Wilcoxon a somma di rango sono stati usati per variabili non normali. Per tre o più gruppi, è stata utilizzata un'analisi unidirezionale della varianza con test post hoc appropriati quando sono state soddisfatte le assunzioni di normalità e omogeneità della varianza; altrimenti, veniva applicato il test di Kruskal-Wallis. I dati del corso temporale CCK-8 sono stati analizzati utilizzando un'analisi bidirezionale della varianza. I coefficienti di correlazione di Spearman sono stati calcolati per le analisi di associazione. Salvo diversa indicazione, i risultati sperimentali sono mostrati come media ± SD, e p < a due code 0,05 è stato considerato significativo.