Gestione del tunnel e arricchimento ambientale per la ripetuta pletismografia a tutto il corpo nei topi

Sommario

Questo protocollo descrive le procedure di gestione delle gallerie e di arricchimento ambientale per la pletismografia ripetuta di tutto il corpo per ridurre la variabilità respiratoria associata allo stress durante studi longitudinali su topi.

Abstract

La pletismografia ripetuta a tutto il corpo (WBP) è ampiamente utilizzata per la valutazione longitudinale della funzione respiratoria nei topi. Tuttavia, lo stress indotto dalla gestione può introdurre variabilità fisiologica che confonde gli effetti del trattamento e riduce la riproducibilità sperimentale. I metodi tradizionali di gestione della coda possono produrre risposte di stress sostenute e scarsa abitudiazione durante le sessioni ripetute, potenzialmente influenzando gli esiti sperimentali. Questo protocollo descrive metodi di gestione e alloggiamento perfezionati che integrano la gestione del tunnel e l'arricchimento ambientale per sessioni WBP ripetute. Sei topi selvatici di tipo 129S1/SvImJ (3 maschi, 3 femmine) hanno ricevuto manipolazione di tunnel e arricchimento ambientale continuo durante uno studio di 10 settimane. Gli animali hanno sottoposto ripetute sessioni di WBP e i periodi di acclimatazione sono stati analizzati nei momenti di base, all'inizio, a metà e alla fine dello studio. La frequenza respiratoria durante il posizionamento iniziale della camera (iniziale f, 0–2 min) e la linea di base stabile (basale f, 8–10 min) sono state quantificate per valutare i modelli di acclimatazione longitudinali. Sono stati osservati cambiamenti progressivi lungo tutta la timeline dello studio nelle condizioni implementate. La frequenza respiratoria media iniziale è diminuita da 345 ± 111 respiri SD/min alla linea iniziale a 267 ± 43 respiri DS/min durante le sedute avanzate dello studio, accompagnata da un coefficiente di variazione ridotto (32% - 16%). Anche le misurazioni respiratorie di base sono diminuite da 255 ± 67 a 193 ± 43 respiri/minuto (p = 0,033), coerente con una maggiore stabilità delle misurazioni nelle sedute successive. Le osservazioni comportamentali hanno mostrato un'acclimatazione calma con minima defecazione, minzione o agitazione. Questo protocollo offre un approccio pratico ai laboratori che effettuano ripetute verifiche respiratorie sui topi. La gestione delle gallerie e l'arricchimento ambientale sono stati associati a un'acclimatazione progressiva e a una riduzione della variabilità respiratoria durante gli studi longitudinali WBP.

Introduzione

La pletismografia a tutto il corpo (WBP) consente una valutazione non invasiva della funzione respiratoria in roditori coscienti e non controllati ed è diventata uno strumento indispensabile per studi longitudinali in fisiologia respiratoria, tossicologia inalazione e modellazione delle malattie ^1,2. I principali vantaggi della tecnica, tra cui la natura non invasiva e l'idoneità a misurazioni ripetute, la rendono particolarmente preziosa per monitorare i cambiamenti respiratori durante la progressione della malattia, interventi terapeutici o percorsi di esposizione. Glaab e Braun² hanno evidenziato che la plettristografia non invasiva head-out body è un metodo affidabile per misurazioni ripetute della funzione polmonare in topi coscienti, fornendo strumenti essenziali per la ricerca traslazionale nelle malattie delle vie aeree, comprese le infezioni respiratorie emergenti. Tuttavia, la qualità e la riproducibilità delle misurazioni WBP dipendono in modo critico dal raggiungimento di stati a bassa frequenza respiratoria coerenti con la quiescenza comportamentale, che possono essere compromesse dallo stress indotto dalla gestione. La gestione dello stress rappresenta una fonte ben riconosciuta ma spesso sottovalutata di variabilità sperimentale che può confondere le misurazioni fisiologiche e compromettere la qualità dei dati. La pratica standard di laboratorio prevede tipicamente la manipolazione della coda, in cui i topi vengono afferrati per la coda per il trasporto e la^{manipolazione 3,4}.

La pratica standard di laboratorio prevede tipicamente la manipolazione della coda, in cui i topi vengono afferrati per la coda per il trasporto e la manipolazione. Gouveia e^{Hurst 3} hanno dimostrato che la manipolazione della coda induce ansia nei topi, con animali maneggiati che mostrano un comportamento più elevato simile all'ansia nel labirinto elevato più rispetto ai controlli con manico a tunnel. Questa risposta d'ansia è associata a parametri fisiologici alterati. Rasid et ^al.4 hanno utilizzato la WBP per quantificare gli effetti respiratori delle procedure di laboratorio di routine, rilevando che la contenzione e la gestione modificano significativamente il volume minuto in modo dipendente dal sesso, con effetti persistenti fino a 24 ore dopo la procedura. L'entità e la durata di questi effetti indotti dalla manipolazione sottolineano che le misurazioni respiratorie ottenute poco dopo la gestione della coda possono riflettere la fisiologia dello stress acuto piuttosto che una funzione di base stabile.

La letteratura più ampia su contenzione e gestione dello stress rivela impatti che vanno oltre le risposte comportamentali immediate. Buynitsky e^{Mostofsky 5} hanno esaminato gli effetti estesi dello stress da contenimento sui processi fisiologici, immunologici, endocrini e dello sviluppo, sottolineando che i confondenti legati allo stress sono spesso documentati in modo insufficiente negli articoli di ricerca. Per gli studi respiratori in particolare, il problema è aggravato dalla necessità di misurazioni ripetute. Ogni evento di gestione può resettare la risposta allo stress, limitando l'abitudine progressiva e producendo misurazioni di base incoerenti nei punti temporali longitudinali. DeLorme e^{Moss 1} hanno confrontato gli approcci di pletismografia con ristrette e non restrizioni in topi con notevoli differenze fisiologiche tra le detensioni, rilevando che, sebbene i sistemi a camera singola non vincolati fornissero un'analisi migliorata della reattività delle vie aeree, la sfida di ottenere misurazioni di base riproducibili rimaneva.

La gestione dei tunnel, in cui i topi entrano volontariamente in un tunnel per il trasporto, è emersa come un'alternativa basata su evidenze che riduce sostanzialmente l'ansia indotta dalla manovramento. L'efficacia del metodo è stata dimostrata in molteplici ceppi e contesti sperimentali. Gouveia e^{Hurst 3} hanno dimostrato che i topi con manico a galleria mostravano una maggiore disponibilità a interagire con i conduttori e un comportamento simile all'ansia nei test elevati più in labirinto rispetto ai topi con manico di coda, con benefici osservati anche quando i tunnel erano sconosciuti. È importante sottolineare che questi benefici vanno oltre il periodo immediatamente successivo alla manipolazione. Sensini et ^al.6 hanno esaminato gli effetti della tecnica di manipolazione e della frequenza di manipolazione tra i sessi, rilevando che la maneggiatura frequente della coda riduceva i comportamenti associati al benessere, come il ricavo, e aumentava il comportamento simile alla disperazione nei maschi, mentre la manipolazione a tunnel era preferita da entrambi i sessi e associata a comportamenti di approccio più positivi e a meno risposte difensive. Inoltre, Davies et ^al.7 hanno dimostrato che i benefici della manipolazione non con la coda persistono durante procedure complesse. I topi esposti alla manipolazione della coda durante tutta la loro esperienza in laboratorio, inclusi i procedimenti di contenzione, hanno mostrato una maggiore reattività agli stimoli ambientali e una minore facilità di maneggiamento rispetto ai topi maneggiati esclusivamente tramite metodi di coppetto o tunnel.

Oltre alla gestione della selezione del metodo, l'abitudine sistematica alle procedure sperimentali può ulteriormente ridurre la variabilità indotta dallo stress. Sorli et ^al.8 hanno indagato i topi per addestrare la pletismografia head-out, un sistema basato su contenzione, e hanno riscontrato che cinque giorni consecutivi di addestramento miglioravano la tolleranza, con i topi che hanno dimostrato una maggiore stabilità comportamentale già al secondo giorno, anche se i parametri respiratori si stabilizzavano entro 5 minuti durante tutte le sedute. Analogamente, Ueno et ^al.9 hanno dimostrato che la manipolazione delicata e ripetitiva dei maschi di topi C57BL/6 prima dei test comportamentali ha ridotto il comportamento ansioso nei test elevati più nel labirinto e ha migliorato la cognizione spaziale, indicando che il contatto ripetuto con i conduttori può produrre effetti di abituazione misurabili. Questi risultati suggeriscono che combinare metodi di gestione non avversiva con protocolli di abitudine sistematica possa fornire benefici cumulativi per ridurre la variabilità fisiologica durante misurazioni ripetute.

L'arricchimento ambientale rappresenta un fattore aggiuntivo che può influenzare la reattività allo stress e la fisiologia di base, sebbene i suoi effetti siano complessi e dipendenti dal contesto. Sebbene l'arricchimento generalmente promuova un benessere positivo, un arricchimento eccessivo o imprevedibile può paradossalmente aumentare la variabilità fisiologica e i comportamenti associati allo stress in alcuni contesti sperimentali^10,11. Un approccio equilibrato che mantenga elementi centrali stabili, come il materiale di nidificazione, fornendo al contempo una novità gestibile attraverso la rotazione periodica degli elementi di arricchimento può ottimizzare il benessere senza introdurre la variazione¹² di confusione. L'interazione tra arricchimento, metodo di gestione e protocolli di abituazione rimane poco studiata nel contesto delle ripetute misurazioni respiratorie, evidenziando la necessità di protocolli integrati che affrontino simultaneamente tutti e tre i fattori.

Nonostante il crescente riconoscimento degli effetti della manipolazione sulle misurazioni fisiologiche, i protocolli standardizzati specificamente progettati per minimizzare lo stress durante le sessioni ripetute di WBP rimangono limitati. I protocolli WBP esistenti si basano tipicamente su periodi di acclimatazione estesi (10–30 minuti per seduta) per permettere la tachipnea indotta dallo stress di diminuire, ma raramente affrontano il metodo di gestione sottostante o valutano sistematicamente se si verifica un'abitudine progressiva tra le sedute. Inoltre, la maggior parte degli studi non valuta se gli animali raggiungono stati fisiologici coerenti con la quiescenza comportamentale, come frequenze respiratorie che si avvicinano a intervalli riportati in letteratura come associate a stati di quiete o legati al sonno, o se invece passino da stress acuto a risveglianza cronica a basso livello. Qui presentiamo un protocollo che integra la gestione dei tunnel, l'arricchimento ambientale bilanciato e ripetute sessioni WBP in uno studio longitudinale di 10 settimane. Descriviamo un approccio associato a cambiamenti progressivi nella frequenza respiratoria coerenti con l'abituazione, inclusa la diminuzione delle frequenze respiratorie iniziali tra le sedute e misurazioni di base che si avvicinano a intervalli riportati in letteratura come associati a stati di quiescenza o legati al sonno. È importante sottolineare che questo protocollo viene presentato non solo come un miglioramento del benessere animale, ma anche come una considerazione sperimentale che può aiutare a ridurre la variabilità e migliorare la coerenza durante le misurazioni respiratorie longitudinali.

Protocollo

Eseguire tutte le procedure in conformità con i protocolli approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali (Protocollo IACUC #23-103) presso l'Università di Miami. Topi domestici in un vivario accreditato AAALAC, con condizioni ambientali mantenute secondo gli standard istituzionali.

1. Selezione degli animali e condizioni abitative

1. Selezionare e preparare gli animali per lo studio
   1. Seleziona animali da una colonia riproduttiva consolidata o ottenli da un fornitore commerciale. Per questo studio, si utilizzano sei topi selvatici di tipo 129S1/SvImJ (3 maschi, 3 femmine).
   2. Mantenere gli animali sotto condizioni SPF (specifici patogeni liberi) in una struttura accreditata AAALAC, con monitoraggio sanitario di routine eseguito secondo gli standard istituzionali.
   3. Confermare che gli animali hanno circa 6 mesi di età (giovani adulti) all'inizio dello studio.
      NOTA: I topi in questo studio avevano già esposto alla manipolazione di tunnel come parte dell'allevamento di routine. Per i topi ingenui, implementa un periodo di condizionamento prima di iniziare le sessioni di WBP (vedi Passo 3.2).
2. Iniziare le procedure sperimentali quando i topi raggiungono l'età adeguata agli obiettivi dello studio. In questo studio, i topi avevano circa 6 mesi di età (giovani adulti) all'inizio delle sessioni di WBP. Per la riproducibilità, si utilizzano topi entro una fascia d'età definita (ad esempio, ±1 mese) e riportano le età specifiche utilizzate, poiché l'età può influenzare i parametri respiratori di base e la cinetica dell'abituazione.

2. Protocollo di Arricchimento Ambientale

1. Fornire materiale di nido costante
   1. Inserire un quadrato di cotone compresso (circa 5 cm × 5 cm, ~2,5 g) in ogni gabbia ad ogni cambio di gabbia.
   2. Trasferisci la maggior parte della struttura del nido esistente intatta nella nuova gabbia durante i cambi di gabbia usando entrambe le mani.
   3. Se il materiale accumulato supera circa 10 g (circa il doppio della massa originale), rimuovere le porzioni più antiche e compatte dal fondo preservando la struttura esterna della cupola.
   4. Aggiungi un quadrato di cotone fresco (5 cm × 5 cm) alla gabbia pulita per supportare la costruzione e la manutenzione del nido.
   5. Sostituire il materiale per il nido solo se visibilmente bagnato (contaminazione da urina che copre >25% della superficie) o se il nido è stato distrutto e non ricostruito entro 48 ore (Figura 1A e 1C).
      NOTA: Preservare la struttura del nido per minimizzare lo stress associato ai cambiamenti della gabbia e mantenere segnali olfattivi e tattili costanti durante lo studio. La qualità del nido funge da indicatore del benessere animale e dello stato^{sanitario 13}.
2. Valuta la costruzione del nido settimanalmente seguendo la seguente procedura standardizzata
   1. Ad ogni cambio di gabbia, trasferisci con cura il nido intatto su una superficie pulita con entrambe le mani senza disturbare la struttura.
   2. Fotografa il nido direttamente dall'alto con la telecamera posizionata a 30–40 cm perpendicolare alla superficie per visualizzare la struttura complessiva e la formazione dei crateri.
   3. Fotografa il nido di lato all'altezza del nido per documentare l'integrità delle pareti e le caratteristiche della cupola.
   4. Valutare il nido usando la scala Deacon standardizzata a 5 punti¹³, dove 1 = materiale per la nidificazione in gran parte intatto e 5 = nido a cupola con cratere chiaro. Consulta la Figura 1A–1C per esempi di nidi con punteggio 5.
   5. Riporta il nido con cura nella gabbia pulita.
      NOTA: Le fotografie settimanali del nido forniscono una documentazione oggettiva della qualità del nido durante tutto lo studio. Il deterioramento nella costruzione del nido può indicare malattie, stress o altri problemi di benessere che richiedono assistenza veterinaria.
3. Fornire arricchimento rotazionato cambiato settimanalmente
   1. Seleziona un elemento di arricchimento e mettilo nella gabbia. Usa carta triturata (carta bianca semplice, porzione da una manciata), asciugamani di carta (2–3 fogli, senza profumo, bianchi, piegati o accartocciati) o rifugi a base di carta (tubi di cartone o piccole scatole).
   2. Ruota gli elementi di arricchimento settimanalmente secondo un programma prestabilito (ad esempio, Settimana 1: carta triturata; Settimana 2: asciugamani di carta; Settimana 3: tubo di cartone; Settimana 4: ripeti) per mantenere una novità gestibile.
      NOTA: La rotazione settimanale offre novità senza sovraccaricare i topi. Evita oggetti di arricchimento in plastica, come capanne di plastica, palline o strutture rigide, che potrebbero aumentare la variabilità^fisiologica. Sostituisci tutti gli oggetti di arricchimento ad ogni cambio di gabbia.

Figura 1. Implementazione del protocollo e indicatori di benessere durante studi longitudinali di pletismografia a tutto il corpo (WBP). (A) Nido rappresentativo di alta qualità (punteggio Deacon 5) da una gabbia femminile che mostra una struttura cupola ben formata con un cratere definito. (B) Tunnel trasparente per la manipolazione in policarbonato (circa 10 cm di lunghezza × 5 cm di diametro interno) integrato con materiale di nidificazione nella gabbia domestica. I tunnel rimasero permanentemente in gabbie come dispositivi di arricchimento e gestione per tutto lo studio. (C) Qualità rappresentativa del nido negli studi tardi (Settimana 10) che mostra una costruzione sostenuta del nido con punteggio 5 sia nelle gabbie maschili che femminili. (D) Punteggi di qualità di Nest durante tutto il periodo di studio di 10 settimane. Ogni punto dati rappresenta il punteggio settimanale del nido di una gabbia usando la scala Deacon standardizzata a 5 punti¹³, dove 1 = materiale di nidificazione intatto e 5 = nido completo a cupola con un cratere. Entrambe le gabbie hanno mantenuto una qualità costante del nido con punteggio 5 in tutte le fasi dello studio. La regione verde ombreggiata indica i punteggi associati a condizioni di benessere ottimali (punteggi 4–5). Le fasi dello studio sono indicate da regioni di fondo colorate corrispondenti a Baseline (Settimana 0), Early-study (Settimane 2–3), Mid-study (Settimane 5–7) e Late-study (Settimane 8–10). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Implementazione della gestione dei tunnel

1. Preparare i tunnel di manutentione
   1. Utilizzare tunnel in policarbonato trasparente (lunghezza 100 mm o 130 mm × diametro interno di 50 mm) con bordi lisci e arrotondati (Figura 1B).
   2. Posiziona un tunnel permanente in ogni gabbia domestica come parte dell'arricchimento della gabbia.
   3. Non rimuovere tunnel tra una gestione e l'altra degli eventi.
      NOTA: Mantenere il tunnel nella gabbia di casa permette che la galleria acquisisca odori familiari e si associi all'ambiente domestico piuttosto che alle procedure di manovraggio. I topi spesso usano i tunnel come rifugi o siti di nido.
   4. Ad ogni cambio di gabbia, pulisci l'interno del tunnel con una piccola quantità di biancheria usata della gabbia precedente prima di metterla nella gabbia pulita.
   5. Autoclave tunnel o lavarli con lo stesso agente disinfettante usato per la sanificazione della gabbia, se è necessaria la disinfezione tra un uso e l'altro. Risciacqua accuratamente e lascia asciugare i tunnel all'aria prima di rimetterli nella gabbia.
      NOTA: Mantenere la continuità olfattiva aiuta a minimizzare lo stress associato a profumi sconosciuti. I tunnel sono autoclavabili e riutilizzabili.
2. Condizioni dei topi per la gestione del tunnel
   1. Per topi adulti ingenui, applicare un periodo di condizionamento di almeno 1–2 settimane prima di iniziare le sessioni^{WBP 14,15}.
   2. Posizionare tunnel in policarbonato trasparenti (vedi Passo 3.1) in modo permanente nella gabbia domestica e lasciare 3–7 giorni per una familiarizzazione passiva.
   3. Dopo l'esposizione passiva, esegui sessioni quotidiane di maneggiamento delicato. Incoraggia i topi a entrare volontariamente nel tunnel, poi solleva il tunnel orizzontalmente per 30–60 secondi prima di riportarlo nella gabbia.
   4. Valutare l'abitudine di successo utilizzando i seguenti criteri: ingresso volontario nel tunnel entro 10–30 s, comportamento calmo all'interno del tunnel senza tentativi di fuga o vocalizzazione, e uso spontaneo del tunnel per riposo o esplorazione durante osservazioni di routine in gabbia^14,15.
   5. Inizia le sessioni WBP una volta soddisfatti tutti i criteri di abituazione.
      NOTA: I topi in questo studio avevano già esposto alla manipolazione di tunnel come parte della gestione di routine prima dell'inizio delle sessioni di WBP.
3. Eseguire la gestione non avversiva
   1. Indossa guanti di nitrile senza polvere per tutte le procedure di manipolazione.
   2. Usa la gestione del tunnel come metodo principale. Se il topo è dentro il tunnel, solleva il tunnel orizzontalmente con una mano che sostiene la base.
   3. Se il topo è fuori dal tunnel, posizionare l'apertura del tunnel entro 5–10 cm dal topo e lasciare 10–30 secondi per l'ingresso volontario senza inseguire o forzare.
   4. Se il topo non entra entro 30 secondi, incoraggia il movimento verso il tunnel usando una mano a coppa posizionata dietro il topo senza entrare in contatto.
   5. Se il mouse non entra dopo due tentativi (massimo totale 60 s), si utilizza il metodo del copping. Metti una mano appiatta vicino al topo, permette l'avvicinamento volontario per 10–20 secondi, poi solleva delicatamente il topo con entrambe le mani evitando di maneggiare la coda.
   6. Usa il metodo di maneggiamento che porta a un comportamento calmo, definito come assenza di vocalizzazione, tentativi di fuga o defecazione associata allo stress.
4. Trasferire i topi nella camera di pletismografia
   1. Trasferisci il topo dal tunnel alle mani a coppa prima di metterlo nella camera.
   2. Tieni il tunnel orizzontalmente e inclina la parte posteriore (lato posteriore) verso l'alto di circa 10–20°.
   3. Lascia che il topo si ritiri fuori dal tunnel, con le zampe posteriori in primo luogo, sulle mani a coppa.
   4. Abbassa entrambe le mani nella camera e lascia che il topo posi volontariamente piede sul pavimento entro 5–10 secondi.
      NOTA: Questo metodo di trasferimento tunnel-a-mani-camera-camera offre un controllo migliorato durante il posizionamento della camera.
   5. In alternativa, trasferire il topo direttamente dal tunnel nella camera inclinando il tunnel sopra l'apertura della camera.
      NOTA: Il trasferimento diretto tunnel-camera-camera offre meno controllo durante il posizionamento ed è stato utilizzato meno frequentemente in questo studio.
   6. Non invertire mai il tunnel verticalmente né scuoterlo.
   7. Sigilla il coperchio della camera subito dopo il posizionamento del topo e riporta il tunnel nella gabbia di casa.
      PASSO CRITICO: Non afferrare mai i topi per la coda in nessun momento dello studio. Se un topo non entra nel tunnel entro 30 secondi o non si avvicina a una mano a coppa, incoraggia il movimento delicato con la biancheria morbida senza inseguire o forzare l'interazione. Permette al mouse di scegliere l'approccio tunnel o manuale in base alle preferenze individuali. La pazienza durante le prime sessioni aiuta a stabilire associazioni positive con la gestione non^{avversiva 3,7}.

4. Protocollo di sessione WBP

1. Prepara il sistema di pletismografia
   1. Calibrare il pletismografo dell'intero corpo una volta al giorno prima dell'acquisizione dei dati.
   2. Con le camere vuote e sigillate, avviare la sequenza di calibrazione automatica tramite il software di analisi respiratoria FinePointe (bersaglio: 18–22 cm H₂O). Confermare la calibrazione riuscita quando l'intervallo effettivo di flusso della scatola supera i ±40 mL/s per sito.
   3. Imposta il flusso di polarizzazione a 1,0 L/min per camera.
   4. Monitorare continuamente la temperatura della camera (22°C–24°C) e l'umidità tramite sensori digitali.
   5. Posiziona le camere in un luogo tranquillo con illuminazione costante e vibrazioni minime.
      NOTA: Mantieni condizioni costanti della camera in tutte le sessioni. Le fluttuazioni di temperatura modificano i modelli respiratori e confondono i confronti^{longitudinali 1}.
2. Condurre sessioni WBP durante una fase circadiana costante
   1. Esegui tutte le misurazioni durante la stessa finestra temporale del ciclo di luce.
   2. Condurre le sessioni tra le 08:00 e le 10:00 (luci accese alle 06:00) ed evitare le prime 2 ore dopo l'accensione quando i ritmi circadiani stanno cambiando.
3. Trasporta i topi nella sala sperimentale
   1. Trasporta le gabbie a casa nella sala sperimentale su un carrello circa 15 minuti prima dell'inizio della sessione.
   2. Permette ai topi di ambientarsi nell'ambiente sperimentale della stanza restando nella loro gabbia familiare.
   3. Metti le gabbie delle case vicino alle camere della pletismografia.
   4. Utilizzare la manipolazione del tunnel (vedi Passaggi 3.3–3.4) per trasferire ogni topo dalla gabbia di casa alle mani a coppa e poi nella camera.
   5. Maneggia i topi con calma e minimizza i movimenti bruschi durante il trasferimento.
      NOTA: Il trasferimento individuale del mouse richiede solo pochi secondi.
4. Metti il topo nella camera
   1. Trasferire delicatamente il topo dalle mani a coppa nella camera (vedi Passo 3.4).
   2. Sigilla il coperchio della camera entro 5 secondi dalla posizione del mouse.
5. Inizio dell'acclimatazione e della registrazione
   1. Inizia a registrare i segnali respiratori usando il software di analisi respiratoria.
   2. Lascia 10 minuti per l'acclimatamento senza disturbi o interventi.
6. Monitorare la stabilità comportamentale durante l'acclimatazione
   1. Osserva il topo continuamente durante il periodo di acclimatazione.
   2. Registra movimenti eccessivi, immobilità prolungata accompagnata da segni di stress (ad esempio, postura rigida) o tentativi di fuga ripetuti senza periodi di calma nel registro della sessione.
   3. Riconosci che tali sessioni possono comunque fornire dati iniziali validi; tuttavia, le misurazioni di base della Fpossono essere inaffidabili.
   4. Sessioni di segnalazione senza periodi di calma osservabili durante la finestra di acclimatazione per una possibile esclusione dalle analisi di base secondo criteri specifici dello studio.
   5. Mantenere tutte le sessioni di questo studio, poiché nessuna soddisfa i criteri di esclusione basati sul comportamento di acclimatazione.
      PASSO CRITICO: Il periodo di acclimatazione di 10 minuti è essenziale per valutare l'abitudine. Sebbene alcuni protocolli utilizzino periodi di acclimatazione di 20–30 minuti, i topi ben abituati in questo studio hanno raggiunto schemi respiratori stabili entro 8–10 minuti, rendendo un'acclimatazione prolungata inutile e potenzialmente controproducente a causa dell'aumento del movimento.
7. Osserva il comportamento del topo durante l'acclimatazione
   1. Osserva i topi in modo continuo durante i 10 minuti di acclimatazione attraverso il monitoraggio visivo delle camere.
   2. Nota indicatori evidenti di stress, tra cui defecazione, minzione, tentativi di fuga prolungati o immobilità prolungata.
   3. Registra la presenza e la quantità approssimativa di pellet fecali e urina nella camera dopo ogni sessione.
      NOTA: Queste osservazioni forniscono una valutazione qualitativa dei livelli di stress e del progresso dell'abituazione, ma non sono state formalmente valutate utilizzando un etogramma standardizzato in questo studio.
8. Analizza le metriche respiratorie della fase di acclimatazione
   1. Utilizza il software di analisi respiratoria per calcolare automaticamente la frequenza respiratoria dai segnali di pressione utilizzando l'algoritmo predefinito di rilevamento del respiro e le impostazioni di soglia predefinite in questo software.
   2. Acquisire segnali respiratori in condizioni di flusso d'aria stabili (vedi Passo 4.1) utilizzando parametri di acquisizione standard.
   3. Calcola la frequenza respiratoria media per due periodi: finiziale (0–2 min), che rappresenta la risposta iniziale allo stress e la fisiologia immediatamente post-manipolazione, e fdi base (8–10 min), che rappresenta la frequenza respiratoria stabilizzata di base.
   4. Escludere i periodi con artefatti di movimento visibili, definiti come deviazioni di pressione non respiratorie o forme d'onda irregolari associate a movimenti animali o disturbi della camera.
      NOTA: Ispezionare visivamente un sottoinsieme di registrazioni (circa il 10%) per confermare la rilevazione accurata del respiro tramite l'algoritmo automatizzato. La validazione manuale ha confermato l'accordo tra rilevamento automatico e schemi respiratori osservati.
9. Procedere con il protocollo sperimentale se applicabile
   1. Continuare con interventi sperimentali dopo il periodo di acclimatazione di 10 minuti secondo il disegno dello studio (ad esempio, somministrazione di farmaci in aerosol, sfida ipossica, test da sforzo).
      NOTA: Non sono stati eseguiti interventi sperimentali durante le sessioni di valutazione dell'abituazione in questo studio. Le metriche respiratorie riportate (finiziale e fbaseline) sono state ottenute durante sessioni solo di acclimatazione senza procedure aggiuntive.
10. Riporta il topo nella gabbia di casa
    1. Usa il tunnel handling o le mani a coppa per trasferire il topo dalla camera e riportarlo nella gabbia di casa.
    2. Osserva il topo per 5 minuti dopo la sessione per confermare il comportamento normale, inclusi movimenti spontanei, toelettatura, interazione con i compagni di gabbia e indagine su cibo e acqua.
    3. Prolunga l'osservazione e consulta il personale veterinario se il comportamento anomalo persiste oltre i 15 minuti, inclusi immobilità prolungata (>5 minuti), respirazione affannosa, postura curva o incapacità di interagire con i compagni di gabbia.
       NOTA: Non sono stati osservati comportamenti anomali post-sessione in questo studio.
11. Mantieni una frequenza costante delle sessioni
    1. Condurre regolarmente sessioni WBP durante tutto il periodo di studio longitudinale (10 settimane in questo protocollo).
    2. Esegui sessioni a intervalli settimanali per monitorare la progressione dell'abituazione.
    3. Programmare le sessioni in orari regolari della giornata (vedi Passo 4.2) per mantenere la coerenza circadiana e procedurale.

Risultati

L'applicazione di questo protocollo di gestione delle gallerie e arricchimento ambientale a sei topi selvatici di tipo 129S1/SvImJ (3 maschi, 3 femmine) durante uno studio longitudinale WBP di 10 settimane ha fornito evidenze di abitudine progressiva e di una maggiore stabilità fisiologica. Le misurazioni della frequenza respiratoria sono state ottenute durante sessioni ripetute di WBP condotte a intervalli longitudinali regolari, con dati analizzati da quattro fasi di studio: Baseline (...

Discussione

Questo protocollo descrive un approccio integrato che combina la gestione del tunnel, l'arricchimento ambientale e l'esposizione ripetuta nel contesto della WBP longitudinale. In queste condizioni, le misurazioni della frequenza respiratoria hanno mostrato una stabilizzazione progressiva attraverso sessioni ripetute, coerente con una riduzione dell'eccitazione e un'abitudine progressiva. Diversi fattori di implementazione sembrano importanti per una performance efficace del protocollo. I...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Aspen Chip Bedding	Fornitura laboratorio	Aspen 323	Lettiera di trucioli di legno di Aspen. Autoclavata prima dell'uso; posizionata a una profondità di circa 1 cm sul pavimento della gabbia.
Acqua autoclavata	Fornita dalla struttura	Non applicabile	Acqua municipale autoclavata fornita ad libitum tramite bottigliette standard.
Tubo di cartone	Prodotto in struttura	Non applicabile	Rotolo di carta igienica di cartone semplice. Utilizzato come arricchimento e rifugio ruotato.
Crink-I-Nest (Irradiato)	The Andersons / Fornitura laboratorio	CNKR	Materiale di arricchimento di carta sminuzzata. Gamma irradiato. Fornito come arricchimento ruotato su base settimanale alternata.
Software FinePointe	Data Sciences International	Nessun numero di catalogo	Software per l'acquisizione e l'analisi dei dati respiratori, versione 3.0. Utilizzato per la raccolta dati WBP e il calcolo dei parametri.
Scaffale per gabbie ventilate individualmente (IVC)	Allentown	EP5000E	Scaffale IVC con pacchetto di scarico, capacità di 140 gabbie. Sistema a doppia faccia ad alta densità con connessioni di ventilazione automatica.
Cibo per roditori irradiato	Envigo	T.2918.15	Dieta standard irradiata per roditori. Fornito ad libitum tramite topo a barre di filo.
Tunnel di trasferimento per topi	Braintree Scientific	TRANS-TUBE 100X50MM	Tunnel in policarbonato trasparente, lunghezza 100 mm × diametro interno 50 mm. Autoclavabile e riutilizzabile. Utilizzato per procedure di trasferimento degli animali a basso stress.
Nestlets (Irradiati)	Fornitura laboratorio	IRR	Quadrati di nidificazione in cotone compresso (~5 cm × 5 cm, ~2,5 g ciascuno). Gamma irradiati. Fornito come arricchimento costante; uno per gabbia.
Guanti in Nitrile, Senza Polvere	Kimberly-Clark	KC500	Guanti esaminativi in nitrile viola senza polvere. Indossati durante tutte le procedure di contatto con gli animali.
Spugna di garza non tessuta	Pivetal	21295040	Spugna di garza non sterile e non tessuta, 4 strati, 4 pollici × 4 pollici (10,16 cm × 10,16 cm). Utilizzata come materiale di arricchimento.
Asciugamano di carta	Tork (Essity)	MB 540A	Asciugamano multiplo bianco. Utilizzato come materiale di arricchimento ruotato.
Fotocamera per smartphone	Apple	Nessun numero di catalogo	Fotocamera per smartphone iPhone. Utilizzata per la documentazione settimanale del punteggio del nido.
Sistema di pletismografia del corpo intero	Data Sciences International	10222C (2 posti); 770621 (4 posti)	Sistema di pletismografia del corpo intero senza restrizioni FinePointe FP Series per topi. Disponibile in configurazioni a 2 e 4 posti.